CN110121354A

CN110121354A - 靶向卵泡刺激素受体(fshr)的最优化的合成共有免疫原性组合物

Info

Publication number: CN110121354A
Application number: CN201780063689.4A
Authority: CN
Inventors: 大卫·韦纳; 阿尔弗雷多·佩拉莱斯·普查尔特; 严健; 安娜·玛丽亚·斯莱格
Original assignee: Study On Anatomy And Biology Of Wistar; University of Pennsylvania Penn; Inovio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Study On Anatomy And Biology Of Wistar; University of Pennsylvania Penn; Wistar Institute of Anatomy and Biology; Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2019-08-13
Also published as: US20190192644A1; US20240115680A1; CA3035524A1; WO2018044929A1; KR20190082195A; EP3503910A1; AU2017319312A1; MX2019002424A; BR112019004146A2; US11865166B2; JP2019529383A

Abstract

本文提供一种免疫原性组合物，其包含在许多卵巢癌亚型中丰富的卵泡刺激素受体(FSHR)蛋白的合成共有抗原。本文还公开一种治疗有需要的受试者的肿瘤相关病变的方法，所述方法通过向所述受试者施用所述免疫原性组合物。

Description

靶向卵泡刺激素受体(FSHR)的最优化的合成共有免疫原性组合物

相关申请的交叉引用

本申请享有2016年8月29日提交的美国临时申请号62/380,766的优先权，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及靶向卵泡刺激素受体(FSHR)的免疫原性组合物，以及施用所述免疫原性组合物的方法。

背景技术

上皮性卵巢癌是最致命的肿瘤之一，在美国造成每年>14,000名女性死亡。尽管外科方法和化学疗法已有进步，但是在过去40年的五年存活率几乎没有变化。卵巢癌为免疫原性肿瘤，并且T细胞浸润反复地与较好的预后相关联(Zhang等,N Engl J Med.2003,348:203-213)。但是，仅约50％的肿瘤存在浸润的T细胞(Zhang等,N Engl J Med.2003,348:203-213)。因此，目的为增强卵巢癌T细胞浸润的免疫疗法可在逆转这种不良预后的方面产生巨大的影响。

卵泡刺激素受体(FSHR)为在女性体内在卵巢颗粒细胞中(Simoni等,EndocrRev.1997,18:739-773)并且以低水平在卵巢内皮中(Vannier等,Biochemistry,1996,35:1358-1366)选择性表达的抗原。最重要的是，这种表面抗原在50-70％的卵巢癌中表达(Perales-Puchalt等,Clin Cancer Res.2016；Zhang等,Cancer Res.2009,69:6506-6514；Al-Timimi等,Br J Cancer,1986,53:321-329；Minegishi等,Clin Cancer Res.2000,6:2764-2770；Zheng等,Gynecol Oncol.2000,76:80-88)并且不在无性腺健康组织(包括负反馈取决于雌激素的脑部)中表达。考虑到卵巢切除术为治疗卵巢癌的标准程序，重定向针对FSHR的免疫提供不应对健康组织造成伤害。先前的研究已在没有明显毒性的情况下利用针对FSHR的嵌合受体重定向T细胞。因此，FSHR可为产生可重定向针对卵巢癌的T细胞的合成共有DNA的理想治疗靶标。

在历史上，肽疫苗接种已显示良好的细胞应答，尤其是在鼠类模型中(Parmiani等,J Natl Cancer Inst.2002,94:805-818)。但是，最近在质粒设计和递送方面的改善已经从人体内新合成DNA方法得到令人印象深刻的CD8和CD4T细胞应答(Bagarazzi等,SciTransl Med.2012,4:155ra38；Kalams等,J Infect Dis.2013,208:818-829；Morrow等,MolTher.2015,23:591-601)。合成DNA疫苗不同于肽疫苗，其不受HLA限制且在MHCI和MHCII尚稳健地呈现，并且可以被设计成渠道II类应答且因此破坏耐受性(Flingai等,FrontImmunol.2013,4:354；Sardesai和Weiner,Curr Opin Immunol.2011,23:421-429)。

破坏对FSHR的免疫耐受性有可能改善癌症疗法。因此，本领域中需要开发出能够破坏耐受性的指向FSHR的疫苗。本发明满足这种尚未满足的需求。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下的氨基酸序列的肽：a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQID NO:10组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子为DNA分子或RNA分子。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下的核苷酸序列：a)在选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列，或d)选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方案中，编码核苷酸序列可操作地连接至至少一个选自由起始密码子、编码IgE前导序列的核苷酸序列和终止密码子组成的组的调控序列。

在一个实施方案中，核酸分子编码包含以下的氨基酸序列的肽：a)在选自由SEQID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)选自由SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下的核苷酸序列：a)在选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)选自由SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列，或d)选自由SEQ ID NO:3、SEQID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子为表达载体。

在一个实施方案中，核酸分子为病毒颗粒。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含佐剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，其编码包含以下的氨基酸序列的肽：a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。

在一个实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至起始密码子、编码IgE前导序列的核苷酸序列和终止密码子中的至少一个。

在一个实施方案中，核酸分子为表达载体。

在一个实施方案中，核酸分子为病毒颗粒。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含肽的免疫原性组合物，其中所述肽包含以下的氨基酸序列：a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)如选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含以下的氨基酸序列的肽：a)在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列，或d)包含在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，本发明涉及一种诱导有需要的受试者的针对卵泡刺激素受体(FSHR)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下的氨基酸序列的肽：a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。在一个实施方案中，所述使用方法包括电穿孔和注射中的至少一种。

在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者的肿瘤相关病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下的氨基酸序列的肽：a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，或d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。在一个实施方案中，所述使用方法包括电穿孔和注射中的至少一种。

在一个实施方案中，肿瘤相关病变为肿瘤生长、肿瘤转移和血管生成中的至少一种。

在一个实施方案中，受试者已被诊断有癌症。

在一个实施方案中，癌症为卵巢癌。

在一个实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用包含一种或多种卵巢癌抗原的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，受试者处于发展癌症的高风险。

在一个实施方案中，癌症为卵巢癌。

附图说明

结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。出于说明本发明的目的，附图示出了当前优选的实施方案。然而，应理解，本发明不限于图中所示实施方案的精确的布置和仪器。

图1，包括图1A至图1C，描绘说明FSHR在大约50％卵巢癌中表达但不在无性腺健康成人组织中表达的结果。图1A描绘癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据集的404例卵巢癌的FSHR表达。图1B描绘针对FSHR染色的粘液性卵巢癌的代表性免疫组织化学图像。图1C描绘人健康组织中FSHR表达的归一化实时定量PCR(Perales-Puchalt等,Clin Cancer Res.2016)。

图2描绘说明共有FSHR疫苗体外表达的示例性实验结果。

图3，包括图3A至图3C，描绘说明FSHR疫苗产生强IFNg反应的示例性实验结果。图3A描绘实验设计图。各组中疫苗接种五只小鼠。图3B描绘说明用syncon FSHR进行免疫与用天然FSHR进行免疫相比诱导较大的针对共有FSHR肽的IFNγ应答的示例性实验结果。图3C描绘说明用syncon FSHR进行免疫与用天然FSHR进行免疫相比诱导较大的针对天然FSHR肽的IFNγ应答的示例性实验结果。

图4描绘说明syncon FSHR所诱导的IFNγ应答主要是针对肽池2(重叠FSH结合结构域的一部分和跨膜结构域的一部分)和肽池3(重叠跨膜结构域的一部分和细胞内结构域)的示例性实验结果。

图5描绘说明用共有FSHR DNA疫苗进行免疫破坏对FSHR的耐受性并且诱导有效的IFNγ应答的示例性实验结果。

图6描绘说明用共有FSHR DNA疫苗进行免疫诱导强的CD8和CD4 T细胞应答的示例性实验结果。

图7描绘说明与用天然FSHR进行免疫相比，用共有FSHR DNA疫苗进行免疫诱导较强的CD8T细胞应答的示例性实验结果。

图8描绘说明用共有FSHR DNA疫苗进行免疫引发显著的CD8应答(包括与用天然FSHR序列进行免疫相比TNFα CD8 T细胞的百分比较大)的示例性实验结果。

图9描绘说明与用天然FSHR进行免疫相比，用共有FSHR DNA疫苗进行免疫诱导较强的CD4 Th1细胞应答的示例性实验结果。

图10描绘说明用共有FSHR DNA疫苗进行免疫引发显著的CD4 Th1应答(包括与用天然FSHR序列进行免疫相比IFNγ/TNFα/IL2 CD4 T细胞的百分比较大)的示例性实验结果。

图11描绘说明FSHR疫苗产生抗体应答的示例性实验结果。

图12，包括图12A至图12C，描绘说明FSHR疫苗能够以预防性方式延缓肿瘤进展的示例性实验结果。图12A描绘实验设计图。图12B描绘评估在肿瘤移植之后免疫小鼠的总肿瘤相关荧光的示例性实验的结果。图12C描绘在肿瘤移植之后免疫小鼠中肿瘤生长的图像。

图13描绘说明用FSHR DNA疫苗进行免疫可增加小鼠的存活的示例性实验结果。

具体实施方式

在一个方面中，本发明提供一种靶向FSHR抗原的免疫原性组合物。本发明的另外方面为单独或以与其他癌症疫苗或治疗剂组合的方式使用所公开的免疫原性组合物来治疗和/或预防癌症生长或转移。

编码本发明的FSHR抗原的序列一般来源于编码天然FSHR蛋白的序列，并且因此，本发明的抗原是独特的。本发明的免疫原性组合物可广泛适用于破坏对天然抗原的耐受性以及由于所编码抗原的独特序列而减少或预防肿瘤生长或转移。这些独特序列使免疫原性组合物保护免受多种类型的癌症。

免疫原性组合物可用于保护免受并且治疗任何数目的癌症。免疫原性组合物可引发靶向抗原的体液和细胞免疫应答。免疫组合物可引发与抗原反应的中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体。免疫原性组合物还可引发对抗原具有反应性的CD8⁺T细胞应答并且产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)中的一种或多种。在一个实施方案中，免疫原性组合物还可引发对抗原具有反应性的CD4⁺T细胞应答并且产生IFN-γ和TNF-α中的一种或多种。

定义

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。下文描述优选的方法和材料，但是在实践或测试本发明时可使用与本文所述的那些类似或等效的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献都以全文以引用方式并入。本文所公开的材料、方法和实施例仅是例示性的，并且不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。

如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的免疫原性组合物中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')₂、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于对特定抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成核酸序列或相应多肽序列。序列可用于诱导针对特定抗原的多个亚型、血清型或菌株的广泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可被操纵以产生共有序列(或共有抗原)。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的术语“可表达形式”是指以下基因构建体，其含有可操作地连接于编码靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列的必要调控元件，使得当存在于所述个体的细胞中时，所述编码序列可得以表达。

如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引起免疫应答的多肽的核苷酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所列出的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长内源性抗原交叉反应的哺乳动物中引发免疫应答的多肽。共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达的形式”是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然与合成的修饰或组合。

如本文所用的“启动子”意指能够赋予、活化或增强细胞中核酸的表达的合成或自然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的肿瘤微环境蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解，所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端。

如本文所用的“受试者”可以意指能够施用本文所述的免疫原性组合物的哺乳动物。哺乳动物可以是例如人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。大致上相同的还可以意指第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护受试者免于疾病或完全消除疾病。在一个实施方案中，预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的免疫原性组合物。在一个实施方案中，预防疾病涉及在治疗之后向受试者施用本发明的免疫原性组合物，以便预防疾病的复发或进一步进展。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向受试者施用本发明的免疫原性组合物。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向受试者施用本发明的免疫原性组合物。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核苷酸序列。核苷酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

关于对本文数值范围的叙述，明确涵盖在其之间的具有相同精度的各插入数值。例如，对于6-9的范围来说，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0来说，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

描述

本发明提供一种最优化的共有序列，其编码FSHR抗原。在一个实施方案中，所述最优化的共有序列所编码的FSHR抗原能够引发哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，最优化的共有序列所编码的FSHR抗原可包含使其作为可诱导免疫应答的免疫原尤其有效的表位。

最优化的共有序列可以是来源于两种或更多种天然FSHR蛋白的共有序列。最优化的共有序列可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、加入kozak序列以便增加翻译起始和/或加入免疫球蛋白前导序列以提高免疫原性。最优化的共有序列所编码的FSHR抗原可包含信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施方案中，最优化的共有序列所编码的抗原可包含血凝素(HA)标签。最优化的共有序列所编码的抗原可被设计成引发比对应的天然抗原强的细胞和/或体液免疫应答。由最优化的共有序列编码的抗原可被设计成破坏耐受性并且与抗癌免疫疗法协同。

在一个实施方案中，最优化的共有FSHR被设计成破坏对天然人类FSHR的耐受性。在一个实施方案中，人最优化共有FSHR编码序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所列出。在一个实施方案中，人最优化的共有FSHR编码抗原具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，最优化的共有FSHR被设计成破坏对天然小鼠FSHR的耐受性。在一个实施方案中，小鼠最优化共有FSHR编码序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所列出。在一个实施方案中，小鼠最优化的共有FSHR编码抗原具有如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中所列出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，最优化的共有FSHR被设计成破坏对天然犬科动物FSHR的耐受性。在一个实施方案中，犬科动物最优化共有FSHR编码序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中所列出。在一个实施方案中，犬科动物最优化的共有FSHR编码抗原具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，最优化的共有编码FSHR抗原可操作地连接至一个或多个调控元件。在一个实施方案中，调控元件为前导序列。在一个实施方案中，可操作地连接至IgE前导编码序列的最优化的共有DNA序列列出于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11中。在一个实施方案中，可操作地连接至IgE前导序列的最优化的共有编码FSHR抗原如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12中所列出。

在一个实施方案中，调控元件为起始密码子。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9中所列出的核酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至包含在5'端的起始密码子的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至在N端的起始密码子编码的氨基酸(例如，甲硫氨酸)。

在一个实施方案中，调控元件为至少一个终止密码子。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中所列出的核酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至包含至少一个在3'端的终止密码子的核苷酸序列。在一个实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至两个终止密码子以增加翻译终止的效率。

在一个实施方案中，编码FSHR抗原的最优化的共有序列可编码具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，最优化的共有序列可具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中所列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述序列可为在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11中所列出的核苷酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在其他实施方案中，序列可为编码在SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，最优化的共有FSHR抗原可由以下RNA编码，所述RNA为来自在SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中所列出的核酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的DNA序列的转录物。在一些实施方案中，最优化的共有FSHR抗原可由以下RNA编码，所述RNA编码在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

最优化的共有编码FSHR抗原可为具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述抗原可具有在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

可以提供SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

在一个实施方案中，核酸序列包含编码本文所述的共有FSHR免疫原序列的RNA序列。例如，核酸可包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12中的一个或多个的RNA序列、其变体、其片段或其任何组合。

可以提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的免疫原性片段同源的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有95％同源性的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有90％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的免疫原性片段。免疫原性片段可为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的片段具有至少97％、至少98％或至少99％同源性。在一些实施方案中，免疫原性片段包括编码前导序列的序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

免疫原性组合物

本文提供免疫原性组合物，诸如疫苗，其包含最优化的共有序列、最优化的共有编码抗原、其片段、其变体或其组合。免疫原性组合物可用于减少肿瘤生长或转移或预防肿瘤发展，从而治疗、预防基于癌症的病变和/或保护免受基于癌症的病变。免疫原性组合物可显著诱导施用免疫原性组合物的受试者的免疫应答。

在一个实施方案中，免疫原性组合物可显著诱导施用免疫原性组合物的受试者的免疫应答，从而保护受试者的基于癌症的病变并且治疗受试者的基于癌症的病变。

免疫原性组合物可为DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或组合疫苗。疫苗可包括编码抗原的最优化的共有核苷酸序列。所述核苷酸序列可为DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核苷酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列、前导序列或标签序列的另外序列。肽疫苗可包含抗原、其变体、其片段或其组合。组合DNA和肽疫苗可包含上文所述的最优化的共有核苷酸序列和编码抗原。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可用于针对例如卵巢癌或特征在于携带FSH受体的肿瘤细胞(例如前列腺癌细胞和转移性肿瘤病灶)的其他癌症的保护性抗肿瘤免疫性并且防止其发生或复发。

疫苗可为减毒活疫苗、使用重组载体递送外来抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于美国专利号4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529中所述的疫苗，所述专利各自以引用的方式并入本文。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，诸如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护免受疾病；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞应答；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗癌细胞和肿瘤细胞，即恶性肿瘤和良性肿瘤，只要待治疗的细胞表达FSHR即可。因此，在本文所述的方法和组合物的各种实施方案中，癌症可包括但不限于乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、肝癌，甲状腺癌、卵巢癌和睾丸癌。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含FSHR抗原和一种或多种另外的癌症抗原。

用于治疗特定癌症的组合免疫原性组合物

免疫原性组合物可以为如上所述的抗原与一种或多种癌症抗原的各种组合的形式来治疗特定癌症或肿瘤。根据一种或多种癌症抗原的组合，用免疫原性组合物可以靶向各种癌症或其他肿瘤类型。这些癌症可包括但不限于卵巢癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌和睾丸癌。

癌症抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如WT1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型(Idiotype)、MAGE A3、p53(非突变体)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras-突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、周期素B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原1，以治疗或预防肿瘤相关病变。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原WT1、MUC1、LMP2、HPVE6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53(非突变体)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras-突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、周期素B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原1与最优化的共有编码FSHR抗原组合以用于治疗或预防肿瘤相关病变。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防肿瘤相关病变。

卵巢癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如CA-125、β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、尿促性腺激素片段、甲胎蛋白(AFP)、抑制素、癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌(SCC)抗原、缪勒氏管抑制物质(Müllerian inhibiting substance；MIS)、拓扑异构酶II、糖类抗原19-9、癌症抗原27-29、人端粒酶逆转录酶(hTERT)和铁蛋白，以治疗或预防卵巢癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原CA-125、β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、尿促性腺激素片段、甲胎蛋白(AFP)、抑制素、癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌(SCC)抗原、缪勒氏管抑制物质(MIS)、拓扑异构酶II、糖类抗原19-9、癌症抗原27-29、人端粒酶逆转录酶(hTERT)和铁蛋白与FSHR抗原组合，以用于治疗或预防卵巢癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防卵巢癌。

前列腺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如PSA、PSMA或STEAP以治疗或预防前列腺癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原PSA、PSMA或STEAP与FSHA抗原组合以用于治疗或预防前列腺癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防前列腺癌。示例性PSA、PSMA和STEP抗原以及编码此类抗原的核酸分子公开于PCT申请号PCT/US11/60592和对应的美国专利号8,927,692中，所述专利以引用的方式并入本文。

乳癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如HER2、MUC-1、CEA、MAGE-3和NY-ESO-1以治疗或预防乳癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原HER2、MUC-1、CEA、MAGE-3和NY-ESO-1与FSHA抗原组合以用于治疗或预防乳癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防乳癌。

胰腺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如MUC-1、CEA、HER2、间皮素、生存素和VEGFR2以治疗或预防胰腺癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原MUC-1、CEA、HER2、间皮素、生存素和VEGFR2与FSHA抗原组合以用于治疗或预防胰腺癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防胰腺癌。

肺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如TERT、CD22、MAGE-3和NY-ESO-1以治疗或预防肺癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原TERT、CD22、MAGE-3和NY-ESO-1与FSHA抗原组合以用于治疗或预防肺癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防肺癌。

黑素瘤抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2以治疗或预防黑素瘤。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2与FSHA抗原组合以用于治疗或预防黑素瘤。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防黑素瘤。

肝癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B以治疗或预防肝癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCVNS5B或HCVNS4B与FSHA抗原组合以用于治疗或预防肝癌。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防肝癌。

成胶质细胞瘤抗原

免疫原性组合物可包含CMV以治疗或预防成胶质细胞瘤。免疫原性组合物可进一步将CMV与FSHA抗原组合以用于治疗或预防成胶质细胞瘤。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防成胶质细胞瘤。

血癌抗原(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原诸如PRAME、WT-1、hTERT以治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原PRAME、WT-1、hTERT与FSHA抗原组合以用于治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。还可以应用癌症抗原的其他组合以用于治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤癌症。

免疫应答

免疫原性组合物可诱导施用所述组合物的受试者的免疫应答。所诱导的免疫应答可对天然抗原具有特异性。所诱导的免疫应答可与与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原反应。在各种实施方案中，相关抗原包括具有与最优化的共有编码抗原的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的氨基酸序列。在各种实施方案中，相关抗原包括由与本文所公开的最优化的共有核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列所编码的抗原。

免疫原性组合物可诱导施用免疫原性组合物的受试者的体液免疫应答。所诱导的体液免疫应答可对天然抗原具有特异性。所诱导的体液免疫应答可与与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原反应。体液免疫应答可在施用免疫原性组合物的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，体液免疫应答可在施用免疫原性组合物的受试者中被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

与不施用免疫原性组合物的受试者相比，由免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可包括与施用免疫原性组合物的受试者相关联的中和抗体的水平增加。中和抗体可特异于与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原。中和抗体可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。中和抗体可在施用免疫原性组合物的受试者中提供针对肿瘤生长、转移或肿瘤相关病变的保护和/或治疗肿瘤生长、转移或肿瘤相关病变。

与不施用免疫原性组合物的受试者相比，由免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可包括与施用免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体的水平增加。这些IgG抗体可特异于通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原。这些IgG抗体可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。与不施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体的水平可增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体的水平可增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

免疫原性组合物可诱导施用免疫原性组合物的受试者的细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可特异于与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原。所诱导的细胞免疫应答可对与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原具有反应性。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答。所引发的CD8⁺T细胞应答可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD8⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答，其中CD8⁺T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。

与不施用免疫原性组合物的受试者相比，所诱导的细胞免疫应答可包括与施用免疫原性组合物的受试者相关联的增加的CD8⁺T细胞应答。与不施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD8⁺T细胞应答可增加约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与不施用免疫原性组合物的受试者或使用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD8⁺T应答可增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原具有反应性的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原具有反应性的CD107a/IFNγ/双阳性CD8T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。

由免疫原性组合物诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答。所引发的CD4⁺T细胞应答可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD4⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答，其中CD4⁺T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ和TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD4⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-α的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD4⁺IFN-α⁺T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性组合物的受试者或施用非最优化的FSHR抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺的出现率可增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。

本发明的免疫原性组合物可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

当施用至不同组织(诸如肌肉或皮肤)时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。当经由电穿孔或注射或皮下或肌内施用时，免疫原性组合物可进一步诱导免疫应答。

片段

在一个实施方案中，免疫原性片段为本发明的全长抗原的免疫原性片段。如本文所用，免疫原性片段为全长核酸或氨基酸序列的片段，其可以诱导与全长序列的免疫应答显著类似的免疫应答。在一个实施方案中，免疫原性片段包含全长序列的免疫原性表位。在一个实施方案中，与全长序列相比，免疫原性诱导至少约0.7倍、至少约0.8倍、至少约0.9倍、至少约1.0倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍或大于2.0倍的免疫应答。

免疫原性片段可诱导施用免疫原性片段的受试者的体液免疫应答。体液免疫应答可在施用免疫原性片段的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。与不施用免疫原性片段的受试者相比，体液免疫应答可在施用免疫原性片段的受试者中被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

与不施用免疫原性片段的受试者相比，由免疫原性片段诱导的体液免疫应答可包括与施用免疫原性片段的受试者相关联的IgG抗体的水平增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的IgG抗体的水平可增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的IgG抗体的水平可增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

免疫原性片段可诱导施用免疫原性片段的受试者的细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可特异于与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原。所诱导的细胞免疫应答可对与最优化的共有编码抗原相关的天然抗原具有反应性。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答。所引发的CD8⁺T细胞应答可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD8⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺T细胞应答，其中CD8⁺T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。

与不施用免疫原性片段的受试者相比，所诱导的细胞免疫应答可包括与施用免疫原性片段的受试者相关联的增加的CD8⁺T细胞应答。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD8⁺T细胞应答可增加约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD8⁺T细胞应答可增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原具有反应性的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原具有反应性的CD107a/IFNγ/双阳性CD8T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。

由免疫原性片段诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答。所引发的CD4⁺T细胞应答可与通常与最优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD4⁺T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺T细胞应答，其中CD4⁺T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ和TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD4⁺IFN-γ⁺T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-α的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD4⁺TNF-α⁺T细胞的出现率可增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α的CD4⁺T细胞的出现率增加。与不施用免疫原性片段的受试者相比，与施用免疫原性片段的受试者相关联的CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺的出现率可增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。

本发明的免疫原性片段可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

当施用至不同组织(诸如肌肉或皮肤)时，免疫原性片段可以进一步诱导免疫应答。当经由电穿孔或注射或皮下或肌内施用时，免疫原性片段可进一步诱导免疫应答。

载体

载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等等。“载体”包含可以感染、转染、短暂或永久转导细胞的核酸。应当理解，载体可以是裸核酸或者与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于DNA片段可以链接并且被复制的复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)。因此载体包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见例如美国专利号5,217,879)并且包括表达和非表达质粒。当重组微生物或细胞培养物被描述为容纳“表达载体”时，其包括染色体外环状和线性DNA以及已掺入一个或多个宿主染色体中的DNA。当载体由宿主细胞维持时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制或者掺入宿主的基因组内。

一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。

载体可具有表达信号(如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含感兴趣的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。

(2)RNA载体

在一个实施方案中，核酸为RNA分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种编码一种或多种MAYV抗原的RNA分子。RNA可为正链的。因此，在一些实施方案中，RNA分子可由细胞翻译而无需任何插入复制步骤诸如逆转录。可用于本发明的RNA分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。这种帽可增强RNA的体内翻译。可用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸酯基团。在加帽的RNA中，这可以经由5'-至-5'桥来连接至7-甲基鸟苷。RNA分子可具有3'聚-A尾。其还可以包括在其3'端附近的聚-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。在一些实施方案中，RNA分子为裸RNA分子。在一个实施方案中，RNA分子包含在载体内。

在一个实施方案中，RNA具有5'UTR和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度是零与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'UTR序列和3'UTR序列的长度可通过不同的方法来改变，包括但不限于设计用于进行PCR的退火到不同的UTR区域的引物。使用这种方法，本领域的普通技术人员可在转染转录的RNA之后修改实现最优的翻译效率所需要的5'UTR和3'UTR长度。

5'UTR和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'UTR和3'UTR。可替代地，对于感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可通过将UTR序列掺入到正向和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰来添加。使用对于感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可降低RNA的稳定性。因此，基于本领域中熟知的UTR的特性，3'UTR可被选择或设计来增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方案中，5'UTR可包含内源性基因的Kozak序列。可替代地，当对于感兴趣的基因不是内源性的5'UTR通过如上所述的PCR进行添加时，共有Kozak序列可通过添加5'UTR序列来重新设计。Kozak序列可增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎对于实现高效翻译并非对于所有RNA均是需要的。对于许多RNA而言需要Kozak序列是本领域中已知的。在其他实施方案中，5'UTR可来源于其RNA基因组在细胞中是稳定的RNA病毒。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3'UTR或5'UTR中来阻止RNA的外切核酸酶降解。

在一个实施方案中，RNA具有在5'端的帽和3'聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和细胞中RNA的稳定性。

在一个实施方案中，RNA为核苷修饰的RNA。核苷酸修饰的RNA具有优于未修饰的RNA的特别优点，包括例如增加的稳定性、低或不存在的先天免疫原性和增强的翻译。

(3)环状载体和线性载体

载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

本文也提供一种能够通过电穿孔高效递送至受试者中且表达一种或多种所需抗原的线性核酸免疫原性组合物或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不含有与所需抗原基因表达无关的其他核苷酸序列。

LEC可来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(4)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是为通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核苷酸序列。启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。

载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。

多种载体

免疫原性组合物可包含单一核酸分子(诸如单一质粒)的多个拷贝或两种或更多种不同的核酸分子(诸如两种或更多种不同的质粒)的多个拷贝。例如，免疫原性组合物可包含更多个两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种不同的核酸分子。此类组合物可包含多个两种、三种、四种、物种、六种或更多种不同的质粒。.

免疫原性组合物可包含共同含有FSHR抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。免疫原性组合物可包含共同含有多种抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。在一个实施方案中，抗原为FSHR抗原和一种或多种另外的癌症抗原。免疫原性组合物可包含共同含有一种或多种抗原和一种或多种癌症抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。

免疫原性组合物的赋形剂和其他组分

免疫原性组合物可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。

所述转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂为聚-L-谷氨酸盐，并且更优选地，聚-L-谷氨酸盐以小于6mg/ml的浓度存在于免疫原性组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。在一些实施方案中，基于DNA质粒的免疫原性组合物还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。免疫原性组合物中转染剂的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可为一种或多种佐剂。佐剂可以是从相同质粒或从替代性质粒中表达的或在免疫原性组合物中作为蛋白质与以上质粒组合递送的其他基因。所述一种或多种佐剂可为选自由以下组成的组的蛋白质和/或编码蛋白质的核酸分子：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-lα、MIP-1β、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2和其功能片段、或其组合。在一些实施方案中，佐剂可为一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质和/或编码蛋白质的核酸分子：RANTES、IL-12、IL-15、IL-23、IL-28、CTACK、TECK、MEC、OX40和DR5。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US12/69017和对应的美国专利号9,272,024，所述专利以引用的方式并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US04/18962和对应的美国专利号8,173,786，所述专利各自以引用的方式并入本文。IL-23构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US14/25348和对应的美国申请序列号14/775,087，所述专利各自以引用的方式并入本文。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和对应的美国申请序列号12/936,192，所述专利各自以引用的方式并入本文。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和对应的美国申请序列号12/936,192，所述专利各自以引用的方式并入本文。RANTES和其他构建体以及序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1999/004332和对应的美国专利号8,119,395，所述专利各自以引用的方式并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098和对应的美国专利号9.034,313，所述专利以引用的方式并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体以及序列的实例公开于PCT申请号PCT/US2005/042231和对应的美国申请序列号11/719,646，所述专利各自以引用的方式并入本文。OX40和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号10/560,653中，其以引用方式并入本文。DR5和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号09/622,452中，其以引用方式并入本文。

免疫原性组合物可包含以约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克、或优选地约0.1微克至约10毫克、或更优选地约1毫克至约2毫克的量的共有抗原和质粒。在一些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克、约0.1微克至约10毫克、约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克共有抗原或其质粒。

在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗DNA。

在其他实施方案中，药物组合物可包含多达并包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含多达并包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含多达并包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg疫苗DNA。

可以根据待使用的施用方式来配制免疫原性组合物。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。免疫原性组合物可还包含稳定剂，其包括明胶和白蛋白。稳定化可允许制剂在室温下或环境温度下稳定延长的时间段，如向疫苗制剂中加入LGS或聚阳离子或聚阴离子。

免疫原性组合物可在室温(25℃)下稳定超过一周，在一些实施方案中超过2周，在一些实施方案中超过3周，在一些实施方案中超过4周，在一些实施方案中超过5周，并且在一些实施方案中超过6周。在一些实施方案中，疫苗稳定超过一个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过7个月、超过8个月、超过9个月、超过10个月、超过11个月或超过12个月。在一些实施方案中，疫苗稳定超过1年、超过2年、超过数年或超过5年。在一个实施方案中，免疫原性组合物在冷藏(2-8℃)下稳定。因此，在一个实施方案中，免疫原性组合物不需要冷冻冷链。如果免疫原性组合物保持其生物活性持续足以允许其预期用途(例如，在受试者中产生免疫应答)的时间，那么其为稳定的。例如，对于待储存、运输等的免疫原性组合物，可能期望免疫原性组合物保持稳定持续数月至数年。

疫苗接种方法

本文还提供一种通过向有需要的受试者施用免疫原性组合物来在受试者中治疗疾病、保护免受疾病和/或预防疾病的方法。向受试者施用免疫原性组合物可在所述受试者中诱导或引发免疫应答。所诱导的免疫应答可用于治疗疾病、预防疾病和/或保护免受疾病，例如一种或多种肿瘤相关病变。

所诱导的免疫应答可包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。体液免疫应答可被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。所诱导的体液免疫应答可包括对抗原具有反应性的IgG抗体和/或中和抗体。所诱导的细胞免疫应答可包括CD8⁺T细胞应答，其被诱导约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。

免疫原性组合物剂量可为在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用免疫原性组合物。用于有效治疗的免疫原性组合物剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

可以根据制药领域中的技术人员所熟知的标准技术来配制免疫原性组合物。这类组合物可通过医学领域技术人员熟知的技术以考虑到如具体受试者的年龄、性别、体重和条件及施用途径的剂量来施用。

可以预防性地或治疗性地施用免疫原性组合物。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用免疫原性组合物。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用免疫原性组合物。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于(例如)所施用的免疫原性组合物方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、受试者的总体健康状况以及处方医师的判断。

所述免疫原性组合物可通过如下文献中所述本领域中公知的方法来施用：Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利号5,580,859，1996年12月3日授权)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日授权)；以及Carson等人(美国专利号5,679,647，1997年10月21日授权)，所有文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用疫苗枪将免疫原性组合物的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。

可以经由多种途径来递送免疫原性组合物。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于免疫原性组合物的DNA来说，可以将免疫原性组合物递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以全文引用的方式并入本文)。还可以将免疫原性组合物施用至肌肉，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用免疫原性组合物的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等,美国专利号5,679,647，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文)。

还可以配制免疫原性组合物，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含免疫原性组合物的水性溶液或油性溶液。

免疫原性组合物可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。免疫原性组合物还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。

免疫原性组合物可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I卷至第III卷(第二版，1993)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。

可以经由电穿孔，如通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用免疫原性组合物，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可经由微创设备来进行电穿孔。

微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的免疫原性组合物和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。

MID可在不使用针的情况下将免疫原性组合物注射至组织中。MID可将免疫原性组合物作为小的流或射流以使得免疫原性组合物穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7,171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6,009,347、美国专利号6,120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。可在本文中利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；及4,342,310中所述的那些，这些专利的内容各自以引用的方式并入本文。

可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的免疫原性组合物引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致免疫原性组合物渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。

无针注射器非常适合于将免疫原性组合物递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有免疫原性组合物的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改善的结果。例如于题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开针阵列，其中可在治疗性处理过程中对多对针产生脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。

MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送免疫原性组合物和电穿孔脉冲的两个或更多个针免疫原性组合物注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的免疫原性组合物)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。

此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。

应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。

可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。

装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。

用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。

感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。可以根据需要进一步记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。

装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以(例如)通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的的封闭容器来代替注射管和活塞系统。

以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。电穿孔在传统上存在的问题在于很难使电极与先前注射的流体准确对准，且因此使用者已倾向于在较大区域注射体积大于所需的流体且在较大区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。

抗原的体外和离体产生

在一个实施方案中，体外或离体产生最优化的共有FSHR抗原。例如，在一个实施方案中，可以在体外或离体细胞中引入并且表达编码最优化的共有FSHR抗原的核酸。

将基因引入到细胞中并表达基因的方法是本领域中已知的。在表达载体的情况下，所述载体可易于通过本领域的任何方法引入到宿主细胞(例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域中熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2012，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)。用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选的方法是磷酸钙转染。

用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入到哺乳动物(例如，人类细胞)中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统(诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒)和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂以用于将核酸引入到宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液形式含于脂质中、含于胶束中或与胶束复合、或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双层结构中、以胶束形式存在、或具有“塌陷的”结构。它们也可仅散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，它们可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

制备DNA质粒的方法

本文提供用于制备DNA质粒的方法，所述DNA质粒包含本文中讨论的基于DNA的免疫原性组合物。所述DNA质粒在最终亚克隆步骤进入哺乳动物表达质粒之后，可用于在大型发酵罐中使用本领域已知的方法接种细胞培养物。

可以使用已知的装置和技术的组合来配制或制造用于本发明的EP装置的DNA质粒。在一些实例中，在这些研究中使用的DNA质粒可以按大于或等于10mg/mL的浓度来配制。制造技术还包括或并入本领域普通技术人员普遍已知的各种装置和方案，除在美国序列号60/939792中所述的那些外，还包括2007年7月3日公告的许可专利、美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别以全文引用的方式并入本文。

治疗方法

免疫原性组合物可用于在哺乳动物中产生或引发对有需要的受试者的FSHR具有反应性或针对有需要的受试者的FSHR的免疫应答。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防或治疗受试者的癌症。在一个实施方案中，癌症表达FSHR。因此，免疫原性组合物可以用于治疗和/或预防施用免疫原性组合物的受试者的表达FSHR的癌症的方法。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防受试者的表达FSHR的癌症的初期或初始发生。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防受试者的表达FSHR的癌症的复发。

在一些实施方案中，免疫应答可产生体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，其不对施用免疫原性组合物的受试者的各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)造成伤害或炎症。

在一些实施方案中，施用的免疫原性组合物可在受试者中增加癌症的存活、减小肿瘤大小或其组合。施用的免疫原性组合物可在受试者中增加癌症的存活5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。施用的免疫原性组合物可在免疫之后在受试者中减小肿瘤大小5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。

施用的免疫原性组合物可增加受试者的细胞免疫应答约5倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用的免疫原性组合物可增加受试者的细胞免疫应答约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

施用的疫苗可增加受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平约5倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用的疫苗可增加受试者的IFN-γ水平约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

施用途径

所述免疫原性组合物或药物组合物可以通过不同的途径来施用，所述途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、粘膜、局部地、经由吸入、经由颊施用、胸腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻囊内以及关节内或其组合。对于兽医使用，所述组合可以根据标准的兽医规范而作为适当可接受制剂来施用。兽医可以轻易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。所述疫苗可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其他物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波来施用。

疫苗的载体可以通过若干熟知的技术来向哺乳动物施用，所述技术包括在有和没有体内电穿孔、脂质体介导的纳米颗粒促进的重组载体情况下的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种)，所述重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。本发明的最优化的共有FSHR抗原可以经由DNA注射连同体内电穿孔一起施用。

药盒

本文提供一种药盒，其可用于使用如上所述的疫苗接种方法治疗受试者。药盒可包括免疫原性组合物。

药盒还可包括用于进行如上所述的疫苗接种方法和/或如何使用药盒的说明书。药盒中所包括的说明书可附于包装材料或可作为包装插页包括在内。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此类。本公开涵盖能够存储说明书并且将它们传达给最终使用者的任何媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒)、光学媒介(例如，CD ROM)等等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网网站的地址。

本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。

实验实施例

参考以下实验实施例对本发明进行进一步详述。提供这些实施例的目的只为了说明而并非意图进行限制，除非另外指明。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述的描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方案，并且不应当被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：最优化的共有FSHR免疫原性组合物

DNA疫苗在人体中具有有效的抗肿瘤活性。已设计出合成共有DNA疫苗以破坏耐受性并将免疫系统重定向至FSHR蛋白。基于共有序列的DNA疫苗已在临床中显示出前景，实现宫颈上皮内瘤变的清除。这种方法优于肽疫苗的优点是它可以引发针对源自蛋白质的内源性天然切割的多种肽的免疫应答，并且可以在MHC I类和II类的所有不同变体中递呈。

已经证明DNA癌症疫苗对于具有病毒抗原的肿瘤是成功的，然而，这种成功尚未转变成针对侵袭性和常见癌症诸如卵巢癌的有效应答。限制之一是缺乏肿瘤细胞选择性表达但健康组织不表达的可靶向抗原，这可能导致致命的不利影响。本文所述的最优化的共有序列被设计成引发针对FSHR的免疫应答，FSHR为50-70％卵巢癌中存在可靶向抗原(图1)。

通过最优化的共有FSHR DNA疫苗进行触发增强靶向FSHR⁺肿瘤细胞的T细胞的数目并且增加肿瘤浸润T细胞的量。此外，在卵巢癌微环境中起作用的抑制性网络的组合靶向将肿瘤浸润淋巴细胞从可抑制其保护活性的致耐受性途径解放出来，因此解决实体瘤中T细胞活性的已知的限制。

现在描述这些方法。

最优化的共有FSHR DNA疫苗

已经开发出靶向FSHR的最优化的共有DNA疫苗。通过使用从GenBank收集的55个FSHR序列来产生共有FSHR。引入激素活性和G蛋白活化所必需的突变。最优化的FSHR DNA被设计成包括以下特征：RNA变化，以改善核糖体负载、mRNA稳定性、增加的GC含量；重新聚焦密码子使用，以便改善翻译；最小化非常高和非常低的GC区域；去除顺式作用基序、重复序列、不稳定序列和RNA结构基序；引入有效Kozak序列；添加IgE前导序列；以及掺入突变，以使受体活性失活并且破坏耐受性。最优化的共有FSHR的表达显示在图2中。

使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验或威尔科克森(Wilcoxon)检验，每组五只小鼠提供5％显著性水平和95％功效(power)以检测20％或更大的差异。除非另有说明，否则实验使用至少5只小鼠/组(加上重复)并且根据这些统计参数进行分析。

通过将约20ug DNA注射到胫骨前肌中，接着用CELLECTRA装置进行电穿孔来进行小鼠的疫苗接种。将初始小鼠每间隔两周疫苗接种小鼠最优化的共有FSHR三次。对照小鼠接受天然小鼠FSHR或空pVax载体。在最后一次疫苗接种后一周处死小鼠以检查体液和细胞免疫应答(图3A)。为了确定体液应答，使用针对重组FHSR蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量小鼠血清中抗FSHR抗体的滴度。为了确定细胞应答，用鼠FSHR蛋白刺激分离的脾细胞，并且在对CD107a、IFNγ、TNFα、CD40L、CD44、CD69和CD62L染色的情况下进行小鼠IFNγ和粒酶B酶联免疫吸附斑(ELISpot)测定。检查效应记忆(CD44⁺/CD62L-)和中枢记忆(CD44int-hi/CD62Lhi)CD8T细胞的出现率。最后，检查抑制调控T细胞(CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg)的出现率。使用体内细胞毒性测定评估细胞溶解性CD8⁺应答。简而言之，从同类系(CD45.1⁺)初始小鼠中分离脾细胞，用高剂量或低剂量的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色，并且加载相关的(FSHR)或不相关的肽。然后将这些细胞注射到初始或免疫小鼠中48小时，再次分离并且通过流式细胞术测量出现率。可以基于CFSEhi和CFSElo群体的剩余出现率来计算杀伤百分比。

现在描述结果

共有FSHR免疫诱导有效的IFNγ应答

为了确定小鼠共有FSHR DNA疫苗是否能够破坏对天然FSHR的耐受性，每间隔两周用3个剂量的FSHR DNA疫苗对初始小鼠进行免疫小鼠，并且在最后一次免疫后一周处死。用源自免疫小鼠的脾细胞进行干扰素-γELISPOT，所述脾细胞用源自鼠FSHR的肽冲激(pulse)。与pVax处理的小鼠相比，观察到针对源自疫苗蛋白的肽的强细胞应答(图3至图5)。

共有FSHR免疫诱导强CD8和CD4T细胞应答

为了确定导致IFNg诱导的具体细胞型，用FSHR肽冲激脾细胞进行细胞内流式细胞术。CD4和CD8T细胞均被小鼠共有FSHR疫苗刺激(图6至图10)。不仅增加了IFNγ的产生，而且增加了TNFα的产生(图7和图8)。

疫苗佐剂增加共有FSHR疫苗对FSHR的免疫应答。

已经显示在疫苗接种部位处存在的树突细胞的数目是疫苗引发有效免疫应答的能力的限制因素(Kutzler和Weiner,J Clin Invest.2004,114:1241-1244)。与DNA疫苗同时注射的不同佐剂能够增加其免疫原性(Villarreal等,Mol Ther.2015,23:1653-1662；Villarreal等,Vaccine,2015,33:4313-4320；Villarreal等,Cancer Res.2014,74:1789-1800)并根据具体需要将免疫应答偏向Th1或Th2应答。连同最优化的共有FSHR DNA疫苗共转染的(IL-124,11,15、GM-CSF15,21和IL-15/IL-15Ra10,13,14)不同佐剂显示增加的细胞免疫应答以及在其临床应用中更有效的抗肿瘤作用。

免疫活性宿主中最优化的共有FSHR DNA疫苗对卵巢癌的有效性

使用卵巢癌细胞系ID8-Defb29/Vegf-a1限定最优化的共有FSHR DNA疫苗在卵巢癌中的抗肿瘤活性(Rutkowski等,Cancer Cell,2015:27:27-40；Cubillos-Ruiz等,Cell,2015,161:1527-1538；Stephen等,Immunity,2014,41:427-439)。为了确定最优化的共有FSHR疫苗是否能够延缓卵巢癌进展，每间隔两周用共有FSHR疫苗或pVax空载体免疫小鼠三次。第三次免疫后一周，用200万个ID8-Defb29/Vegf-a-Fshr卵巢癌细胞对小鼠进行腹膜内攻击。跟踪小鼠的存活，并且在用共有FSHR疫苗处理的小鼠中观察到卵巢癌进展的延缓(图11至图13)。比较存活(作为有效性的读出)，以确定T细胞抗肿瘤活性。从淋巴隔室分选T细胞，并且与用相同FSHR⁺卵巢肿瘤细胞系冲激的树突细胞共温育，以用于IFN-γELISpot测定。最优化的共有FSHR通过抗原扩展(antigen spreading)影响进行多克隆免疫应答的抗肿瘤免疫应答。即使肿瘤细胞失去FSHR，这对于预防肿瘤复发也是至关重要的。在处理后第14天，最用优化的共有FSHR对比来自肿瘤和淋巴位置的模拟和FACS分选T细胞处理携带肿瘤的小鼠，并且用FSHR-肿瘤冲激树突细胞进行ELISpot(Perales-Puchalt等,Clin CancerRes.2016)。

已经在卵巢癌中对免疫检查点抑制剂派姆单抗(αPD-1)、纳武单抗(αPD-1)和伊匹单抗(αCTLA-4)进行测试，结果令人满意(Hamanishi等,J Clin Oncol.2015,33:4015-4022；Brahmer等,N Engl J Med.2012,366:2455-2465)。已与照射的卵巢癌冲激树突细胞疫苗组合对伊匹单抗进行测试，显示协同作用(Hodi等,Proc Natl Acad Sci U.S.A.2003,100:4712-4717)。与αCTLA-4(克隆9D9)或αPD-1(克隆RMP1-14)组合的最优化的共有FSHRDNA疫苗显示对小鼠肿瘤生长的协同作用。

FSHR疫苗在肿瘤微环境中的作用。

在肿瘤攻击后第20天和第34天评估卵巢肿瘤中具有建立的FSHR⁺的小鼠的肿瘤微环境的组成，以确定CD4+、CD8+T细胞和Treg的百分比和数目(Perales-Puchalt等,ClinCancer Res.2016)。包括了来自脾、引流(纵隔)淋巴结、骨髓和瘤床(腹膜洗涤灌洗液)的样品。活化(例如，CD44、CD69、CD27、CD25)对比耗竭(例如，PD-1、Lag3)的详尽分析显示肿瘤特异性活化模式。此外，分析了BM和淋巴结中T细胞的中枢记忆分化。还分析了树突细胞(例如，CD80、CD86、CD40、CD70)髓样隔室(myeloid compartment)的数目和活化状态，包括巨噬细胞和髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cell)的浸润。

确定不同免疫隔室对最优化的共有FHSR DNA抗肿瘤应答的相对贡献。

通过用抗CD8或抗CD4耗尽抗体处理携带FSHR⁺肿瘤的小鼠来测试细胞免疫隔室对最优化的共有FSHR抗肿瘤应答的相对贡献。通过在肿瘤攻击后添加抗CD20耗尽抗体来测试抗体应答的贡献。总之，这建立了最优化的共有DNA疫苗可破坏对自身抗原的耐受性并促进其治疗具体实施的未来改善的机制。

与对照相比，最用优化的共有FSHR DNA疫苗处理的携带卵巢癌的小鼠显示出显著增加的存活(在一些情况下甚至是肿瘤排斥)，其在检查点抑制剂的存在下进一步增强。另外，鉴定了通过肿瘤裂解物ELISpot测量的增加的特异性抗肿瘤活性。类似于使用嵌合抗原受体重定向T细胞所说明，多克隆免疫应答由于抗原扩展而存在可测量的增加(Perales-Puchalt等,Clin Cancer Res.2016)。总之，这些结果为靶向FSHR的最优化的共有DNA疫苗的治疗潜力提供了证据，并为随后的临床测试铺平了道路。多克隆应答的构建对于引发患者的长期治疗尤其重要。

用最优化的共有FSHR免疫小鼠导致浸润肿瘤微环境的CD8和CD4T细胞增加、CD8⁺/Treg比率较高和活化树突细胞(CD11c⁺MHCII⁺)数目增加以及肿瘤微环境和引流淋巴结中共刺激分子(例如CD80、CD86、CD40)的表达。抗肿瘤应答在不存在CD8⁺T细胞的情况下被取消，并且在不存在CD4⁺T细胞的情况下减少。总之，这些数据说明最优化的共有FSHR DNA疫苗的活性机制，并且表征在卵巢癌患者治疗中的预期效果。

卵巢癌的预后不良主要是由于其在晚期时被诊断出。多次针对开发卵巢癌筛查的尝试(使用CA125和/或超声)已经显示出非常差的阳性预测值并且每年挽救生命的成本高，使其不适用于卵巢癌的早期检测。类似地，卵巢癌风险增加的患者(患有BRCA突变、Lynch综合征的患者)无法从严格的随访来获得早期检测，使得这些患者仅依靠卵巢切除术来预防卵巢癌。

诊断的中值年龄为63岁，其中大多数癌症是在绝经后被诊断出来。由于缺乏有效的筛查，所以针对FSHR的预防性疫苗接种将是预防50-70％的表达FSHR的卵巢癌的可行方法。在这个年龄，FSHR的再生活性不再起作用，因此我们不预期这种应用有可能产生不利影响。如图13所示，预防性疫苗接种的小鼠在后来用FSHR卵巢肿瘤攻击时显示出非常重要的存活增加。值得注意的是，在这些实验中没有看到任何不利影响。因此，合成共有FSHR疫苗具有多个优于卵巢癌的标准治疗的优点。此外，FSHR疫苗的预防性施用因此有可能应用于保护处于发展卵巢癌风险的女性，包括绝经后女性和具有高风险综合征的女性。

应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

对公开的实施方案的各种变化和修改将为本领域技术人员显而易知。在不偏离其本质和范围的前提下，可进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类改变和改进。

序列表

<110> 大卫·B·韦纳

阿尔弗雷多·佩拉莱斯·普查尔特

严健

安娜·玛丽亚·斯莱格

<120> 靶向卵泡刺激素受体(FSHR)的最优化的合成共有免疫原性组合物

<130> 206108-0070-00-WO.606651

<150> US 62/380,766

<151> 2016-08-29

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最优化的共有人FSHR抗原

<400> 1

tgtcatcata ggatttgtca ttgctctaat agggtgttcc tgtgccagga gtccaaggtc 60

actgaaatcc catctgacct gccccggaat gctgtggagc tgagatttgt cctgaccaag 120

ctgagagtga tccctaaagg cgcattcagt ggctttgggg acctggagaa aatcgaaatt 180

tcacagaacg atgtgctgga ggtcatcgaa gctaacgtgt tcagcaacct gccaaagctg 240

cacgagatcc gcattgaaaa agctaacaat ctgctgtaca ttgatcccga agcatttcag 300

aatctgccta acctgcgata tctgctgatc agcaataccg gcattaagca cctgcccgcc 360

gtgcataaga ttcagtccct gcagaaagtc ctgctggaca tccaggataa tatcaacatt 420

cacacagtgg agagaaacag cttcatgggg ctgtcctttg aatctgtcat cctgtggctg 480

aataagaacg gcatccagga gattcataat tgcgcattca acgggacaca gctggacgaa 540

ctgaatctgt ccgataacaa taacctggag gaactgccta acgacgtgtt tcagggggcc 600

agcggaccag tcatcctgga tatttcccga acaagaatcc acagtctgcc ttcatacggc 660

ctggagaatc tgaagaaact gagagccagg tcaacttata acctgaagaa actgccaagc 720

ctggagaagt tcgtggccct gatggaagct tcactgacct accccagcca ctgctgtgct 780

tttgcaaatt ggcggagaca gatctccgag ctgcatccaa tctgtaacaa atctattctg 840

cggcaggaag tggacgatat gacccaggca cgcgggcagc gagtctccct ggccgaggac 900

gatgaaagct cctactctag aggattcgac atgatgtata gtgagttcga ctttgatctg 960

tgcaatgaag tggtcgatgt gacttgttct cccaagcctg acgccttcaa tccctgcgag 1020

gatatcatgg gctataacat tctgagggtg ctgatctggt ttatctctat tctggctatc 1080

accgggaata tcattgtgct ggtcatcctg attactagtc agtacaagct gaccgtgcct 1140

cgcttcctga tgtgcaacct ggcctttgct gacctgtgca tcgggatcta cctgctgctg 1200

attgccagtg tggatatcca cacaaaatca cagtaccata actatgccat cgactggcag 1260

acaggagctg gctgtgatgc cgctggattc tttaccgtgt tcgccagcga gctgtccgtc 1320

tacaccctga cagctattac tctggcaaga gcccacacta tcacccatgc catgcagctg 1380

gactgcaagg tgcagctgag gcacgcagcc agcgtgatgc tggtcggatg gatcttcgct 1440

tttgcagtgg ccctgttccc aatctttggc atttctagtt acatgaaagt gagcatttgt 1500

ctgcctatgg acatcgattc tccactgagt cagctgtatg tgatgtccct gctggtgctg 1560

aacgtcctgg cttttgtggt catttgcggc tgttacaccc atatctatct gacagtgcga 1620

aatcccaaca tcgtctcaag ctcctctgac accaagattg caaaacggat ggccatgctg 1680

atcttcacag attttctgtg catggccccc attagcttct ttgctatctc tgcaagtctg 1740

aaggtgcctc tgattacagt ctcaaagagc aaaatcctgc tggtgctgtt ctacccaatt 1800

aattcttgcg ctaacccctt tctgtatgca atcttcacta agaactttag gcgcgacttc 1860

tttattctgc tgagcaaatt cggatgttac gagatgcagg cacagatcta taggacagaa 1920

actagttcaa ccgcccacaa tagccatcct cgcaacggcc actgcagctc cgccccaaga 1980

gtcactaatg gaagcaacta caccctggtc ccactgtctc acctggctca gaac 2034

<210> 2

<211> 678

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有人FSHR抗原

<400> 2

Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln

1 5 10 15

Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Val

20 25 30

Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn Asp

50 55 60

Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asn Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys Leu

65 70 75 80

His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Arg Tyr Leu Leu Ile Ser Asn

100 105 110

Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser Leu Gln

115 120 125

Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr Val Glu

130 135 140

Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu Trp Leu

145 150 155 160

Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly Thr

165 170 175

Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu Leu

180 185 190

Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp Ile

195 200 205

Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Glu Lys Phe Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro Ser

245 250 255

His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu His

260 265 270

Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Asp Met Thr

275 280 285

Gln Ala Arg Gly Gln Arg Val Ser Leu Ala Glu Asp Asp Glu Ser Ser

290 295 300

Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Phe Asp Leu

305 310 315 320

Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala Phe

325 330 335

Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu Ile

340 345 350

Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Val Leu Val

355 360 365

Ile Leu Ile Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met

370 375 380

Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Leu

385 390 395 400

Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr Ala

405 410 415

Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe Thr

420 425 430

Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr Leu

435 440 445

Ala Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys Lys Val

450 455 460

Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Leu Val Gly Trp Ile Phe Ala

465 470 475 480

Phe Ala Val Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met Lys

485 490 495

Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln Leu

500 505 510

Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val Ile

515 520 525

Cys Gly Cys Tyr Thr His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn Ile

530 535 540

Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala Met Leu

545 550 555 560

Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile

565 570 575

Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ser Lys Ile

580 585 590

Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu

595 600 605

Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu Leu

610 615 620

Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr Glu

625 630 635 640

Thr Ser Ser Thr Ala His Asn Ser His Pro Arg Asn Gly His Cys Ser

645 650 655

Ser Ala Pro Arg Val Thr Asn Gly Ser Asn Tyr Thr Leu Val Pro Leu

660 665 670

Ser His Leu Ala Gln Asn

675

<210> 3

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列(pGX1424)的最优化的共有人FSHR抗原

<400> 3

atggactgga cttggattct gtttctggtc gccgccgcta cacgagtgca tagttgtcat 60

cataggattt gtcattgctc taatagggtg ttcctgtgcc aggagtccaa ggtcactgaa 120

atcccatctg acctgccccg gaatgctgtg gagctgagat ttgtcctgac caagctgaga 180

gtgatcccta aaggcgcatt cagtggcttt ggggacctgg agaaaatcga aatttcacag 240

aacgatgtgc tggaggtcat cgaagctaac gtgttcagca acctgccaaa gctgcacgag 300

atccgcattg aaaaagctaa caatctgctg tacattgatc ccgaagcatt tcagaatctg 360

cctaacctgc gatatctgct gatcagcaat accggcatta agcacctgcc cgccgtgcat 420

aagattcagt ccctgcagaa agtcctgctg gacatccagg ataatatcaa cattcacaca 480

gtggagagaa acagcttcat ggggctgtcc tttgaatctg tcatcctgtg gctgaataag 540

aacggcatcc aggagattca taattgcgca ttcaacggga cacagctgga cgaactgaat 600

ctgtccgata acaataacct ggaggaactg cctaacgacg tgtttcaggg ggccagcgga 660

ccagtcatcc tggatatttc ccgaacaaga atccacagtc tgccttcata cggcctggag 720

aatctgaaga aactgagagc caggtcaact tataacctga agaaactgcc aagcctggag 780

aagttcgtgg ccctgatgga agcttcactg acctacccca gccactgctg tgcttttgca 840

aattggcgga gacagatctc cgagctgcat ccaatctgta acaaatctat tctgcggcag 900

gaagtggacg atatgaccca ggcacgcggg cagcgagtct ccctggccga ggacgatgaa 960

agctcctact ctagaggatt cgacatgatg tatagtgagt tcgactttga tctgtgcaat 1020

gaagtggtcg atgtgacttg ttctcccaag cctgacgcct tcaatccctg cgaggatatc 1080

atgggctata acattctgag ggtgctgatc tggtttatct ctattctggc tatcaccggg 1140

aatatcattg tgctggtcat cctgattact agtcagtaca agctgaccgt gcctcgcttc 1200

ctgatgtgca acctggcctt tgctgacctg tgcatcggga tctacctgct gctgattgcc 1260

agtgtggata tccacacaaa atcacagtac cataactatg ccatcgactg gcagacagga 1320

gctggctgtg atgccgctgg attctttacc gtgttcgcca gcgagctgtc cgtctacacc 1380

ctgacagcta ttactctggc aagagcccac actatcaccc atgccatgca gctggactgc 1440

aaggtgcagc tgaggcacgc agccagcgtg atgctggtcg gatggatctt cgcttttgca 1500

gtggccctgt tcccaatctt tggcatttct agttacatga aagtgagcat ttgtctgcct 1560

atggacatcg attctccact gagtcagctg tatgtgatgt ccctgctggt gctgaacgtc 1620

ctggcttttg tggtcatttg cggctgttac acccatatct atctgacagt gcgaaatccc 1680

aacatcgtct caagctcctc tgacaccaag attgcaaaac ggatggccat gctgatcttc 1740

acagattttc tgtgcatggc ccccattagc ttctttgcta tctctgcaag tctgaaggtg 1800

cctctgatta cagtctcaaa gagcaaaatc ctgctggtgc tgttctaccc aattaattct 1860

tgcgctaacc cctttctgta tgcaatcttc actaagaact ttaggcgcga cttctttatt 1920

ctgctgagca aattcggatg ttacgagatg caggcacaga tctataggac agaaactagt 1980

tcaaccgccc acaatagcca tcctcgcaac ggccactgca gctccgcccc aagagtcact 2040

aatggaagca actacaccct ggtcccactg tctcacctgg ctcagaac 2088

<210> 4

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列(pGX1424)的共有人FSHR抗原

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu

20 25 30

Cys Gln Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn

35 40 45

Ala Val Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys

50 55 60

Gly Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln

65 70 75 80

Asn Asp Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asn Val Phe Ser Asn Leu Pro

85 90 95

Lys Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile

100 105 110

Asp Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Arg Tyr Leu Leu Ile

115 120 125

Ser Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser

130 135 140

Leu Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr

145 150 155 160

Val Glu Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu

165 170 175

Trp Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn

180 185 190

Gly Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu

195 200 205

Glu Leu Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu

210 215 220

Asp Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu

225 230 235 240

Asn Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu

245 250 255

Pro Ser Leu Glu Lys Phe Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr

260 265 270

Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu

275 280 285

Leu His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Asp

290 295 300

Met Thr Gln Ala Arg Gly Gln Arg Val Ser Leu Ala Glu Asp Asp Glu

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Phe

325 330 335

Asp Leu Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp

340 345 350

Ala Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val

355 360 365

Leu Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Val

370 375 380

Leu Val Ile Leu Ile Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe

385 390 395 400

Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu

405 410 415

Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn

420 425 430

Tyr Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe

435 440 445

Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile

450 455 460

Thr Leu Ala Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys

465 470 475 480

Lys Val Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Leu Val Gly Trp Ile

485 490 495

Phe Ala Phe Ala Val Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr

500 505 510

Met Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser

515 520 525

Gln Leu Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val

530 535 540

Val Ile Cys Gly Cys Tyr Thr His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro

545 550 555 560

Asn Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala

565 570 575

Met Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe

580 585 590

Ala Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ser

595 600 605

Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro

610 615 620

Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile

625 630 635 640

Leu Leu Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg

645 650 655

Thr Glu Thr Ser Ser Thr Ala His Asn Ser His Pro Arg Asn Gly His

660 665 670

Cys Ser Ser Ala Pro Arg Val Thr Asn Gly Ser Asn Tyr Thr Leu Val

675 680 685

Pro Leu Ser His Leu Ala Gln Asn

690 695

<210> 5

<211> 2025

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最优化的共有小鼠FSHR抗原

<400> 5

tgccaccact ggctgtgcca ctgttctaac agggtgttcc tgtgccagga cagcaaggtg 60

accgagatcc ctcccgatct gccccggaac gccatcgagc tgcgcttcgt gctgacaaag 120

ctgagagtga tccctaaggg ctccttctct ggctttggag atctggagaa gatcgagatc 180

tcccagaacg acgtgctgga agtgatcgag gccgacgtgt tcagcaacct gcctaagctg 240

cacgagatcc ggatcgagaa ggccaacaac ctgctgtaca tcaaccccga ggctttccag 300

aacctgccta gcctgcgcta cctgctgatc tccaacaccg gcatcaagca cctgccagcc 360

gtgcacaaga tccagagcct gcagaaggtg ctgctggaca tccaggataa catcaacatc 420

cacatcatcg ctagaaactc cttcatggga ctgtcttttg agagcgtgat cctgtggctg 480

aacaagaacg gcatccagga gatccacaac tgtgccttta acggaacaca gctggacgag 540

ctgaacctgt ctgataacaa caacctggag gagctgccta acgacgtgtt ccagggcgcc 600

agcggaccag tgatcctgga tatctccagg accaaggtgc actctctgcc caaccacggc 660

ctggagaacc tgaagaagct gagggccaga tccacataca gactgaagaa gctgccttct 720

ctggacaagt tcgtgaccct gatggaggct tctctgacat acccaagcca ctgctgtgcc 780

tttgctaact ggaggagaca gatcagcgag ctgcacccaa tctgtaacaa gtccatcctg 840

cggcaggaca tcgacgatat gacccagatc ggagatcagc gcgtgagcct gatcgacgat 900

gagccctcct acggcaaggg atctgacatg atgtacagcg agttcgactt tgatctgtgc 960

aacgaggtgg tggatgtgac atgttcccca aagcccgacg ccttcaaccc ctgcgaggat 1020

atcatgggct acaacatcct gcgggtgctg atctggttta tctccatcct ggctatcacc 1080

ggaaacacca cagtgctggt ggtgctgacc acatctcagt acaagctgac agtgcctcgc 1140

ttcctgatgt gcaacctggc ctttgctgac ctgtgcatcg gcatctacct gctgctgatc 1200

gcctctgtgg atatccacac caagagccag taccacaact acgccatcga ctggcagacc 1260

ggcgctggat gtgatgctgc cggattcttt acagtgttcg cctccgagct gagcgtgtac 1320

accctgacag ctatcaccct ggccagggct cacaccatca cacacgccat gcagctggag 1380

tgcaaggtgc agctgagaca cgctgcctct atcatggtgc tgggctggac attcgctttt 1440

gctgccgctc tgttcccaat ctttggaatc agctcctaca tgaaggtgtc catctgtctg 1500

cctatggaca tcgatagccc actgtcccag ctgtacgtga tggccctgct ggtgctgaac 1560

gtgctggcct tcgtggtcat ctgcggctgt tacacccaca tctacctgac agtgcggaac 1620

cccaacatcg tgtctagctc ctctgacacc aagatcgcca agcgcatggc taccctgatc 1680

ttcacagatt ttctgtgcat ggccccaatc agcttctttg ccatcagcgc ctccctgaag 1740

gtgcccctga tcaccgtgag caaggctaag atcctgctgg tgctgttcta cccaatcaac 1800

tcctgcgcca acccctttct gtacgctatc ttcacaaaga actttcggcg cgacttcttt 1860

atcctgatga gcaagttcgg atgttacgag atgcaggccc agatctaccg gaccgagaca 1920

agctccgcca cccacaactt tcacgctagg aagtcccact gcagcagcgc ccccagggtg 1980

acaaactctt acgtgctggt gcctctgaac cacagcgtgc agaac 2025

<210> 6

<211> 675

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有小鼠FSHR抗原

<400> 6

Cys His His Trp Leu Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln

1 5 10 15

Asp Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Pro Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile

20 25 30

Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys Gly Ser

35 40 45

Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn Asp

50 55 60

Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asp Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys Leu

65 70 75 80

His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn Pro

85 90 95

Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Leu Ile Ser Asn

100 105 110

Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser Leu Gln

115 120 125

Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Ile Ile Ala

130 135 140

Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu Trp Leu

145 150 155 160

Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly Thr

165 170 175

Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu Leu

180 185 190

Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp Ile

195 200 205

Ser Arg Thr Lys Val His Ser Leu Pro Asn His Gly Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Leu Lys Lys Leu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Asp Lys Phe Val Thr Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro Ser

245 250 255

His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu His

260 265 270

Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Asp Ile Asp Asp Met Thr

275 280 285

Gln Ile Gly Asp Gln Arg Val Ser Leu Ile Asp Asp Glu Pro Ser Tyr

290 295 300

Gly Lys Gly Ser Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Phe Asp Leu Cys

305 310 315 320

Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala Phe Asn

325 330 335

Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu Ile Trp

340 345 350

Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Thr Thr Val Leu Val Val

355 360 365

Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met Cys

370 375 380

Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Leu Ile

385 390 395 400

Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr Ala Ile

405 410 415

Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe Thr Val

420 425 430

Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr Leu Ala

435 440 445

Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Glu Cys Lys Val Gln

450 455 460

Leu Arg His Ala Ala Ser Ile Met Val Leu Gly Trp Thr Phe Ala Phe

465 470 475 480

Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met Lys Val

485 490 495

Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln Leu Tyr

500 505 510

Val Met Ala Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val Ile Cys

515 520 525

Gly Cys Tyr Thr His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn Ile Val

530 535 540

Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala Thr Leu Ile

545 550 555 560

Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile Ser

565 570 575

Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys Ile Leu

580 585 590

Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr

595 600 605

Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu Met Ser

610 615 620

Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr Glu Thr

625 630 635 640

Ser Ser Ala Thr His Asn Phe His Ala Arg Lys Ser His Cys Ser Ser

645 650 655

Ala Pro Arg Val Thr Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Leu Asn His Ser

660 665 670

Val Gln Asn

675

<210> 7

<211> 2079

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的最优化的共有小鼠FSHR抗原

<400> 7

atggactgga cctggattct gttcctggtg gccgctgcca caagggtgca ctcctgccac 60

cactggctgt gccactgttc taacagggtg ttcctgtgcc aggacagcaa ggtgaccgag 120

atccctcccg atctgccccg gaacgccatc gagctgcgct tcgtgctgac aaagctgaga 180

gtgatcccta agggctcctt ctctggcttt ggagatctgg agaagatcga gatctcccag 240

aacgacgtgc tggaagtgat cgaggccgac gtgttcagca acctgcctaa gctgcacgag 300

atccggatcg agaaggccaa caacctgctg tacatcaacc ccgaggcttt ccagaacctg 360

cctagcctgc gctacctgct gatctccaac accggcatca agcacctgcc agccgtgcac 420

aagatccaga gcctgcagaa ggtgctgctg gacatccagg ataacatcaa catccacatc 480

atcgctagaa actccttcat gggactgtct tttgagagcg tgatcctgtg gctgaacaag 540

aacggcatcc aggagatcca caactgtgcc tttaacggaa cacagctgga cgagctgaac 600

ctgtctgata acaacaacct ggaggagctg cctaacgacg tgttccaggg cgccagcgga 660

ccagtgatcc tggatatctc caggaccaag gtgcactctc tgcccaacca cggcctggag 720

aacctgaaga agctgagggc cagatccaca tacagactga agaagctgcc ttctctggac 780

aagttcgtga ccctgatgga ggcttctctg acatacccaa gccactgctg tgcctttgct 840

aactggagga gacagatcag cgagctgcac ccaatctgta acaagtccat cctgcggcag 900

gacatcgacg atatgaccca gatcggagat cagcgcgtga gcctgatcga cgatgagccc 960

tcctacggca agggatctga catgatgtac agcgagttcg actttgatct gtgcaacgag 1020

gtggtggatg tgacatgttc cccaaagccc gacgccttca acccctgcga ggatatcatg 1080

ggctacaaca tcctgcgggt gctgatctgg tttatctcca tcctggctat caccggaaac 1140

accacagtgc tggtggtgct gaccacatct cagtacaagc tgacagtgcc tcgcttcctg 1200

atgtgcaacc tggcctttgc tgacctgtgc atcggcatct acctgctgct gatcgcctct 1260

gtggatatcc acaccaagag ccagtaccac aactacgcca tcgactggca gaccggcgct 1320

ggatgtgatg ctgccggatt ctttacagtg ttcgcctccg agctgagcgt gtacaccctg 1380

acagctatca ccctggccag ggctcacacc atcacacacg ccatgcagct ggagtgcaag 1440

gtgcagctga gacacgctgc ctctatcatg gtgctgggct ggacattcgc ttttgctgcc 1500

gctctgttcc caatctttgg aatcagctcc tacatgaagg tgtccatctg tctgcctatg 1560

gacatcgata gcccactgtc ccagctgtac gtgatggccc tgctggtgct gaacgtgctg 1620

gccttcgtgg tcatctgcgg ctgttacacc cacatctacc tgacagtgcg gaaccccaac 1680

atcgtgtcta gctcctctga caccaagatc gccaagcgca tggctaccct gatcttcaca 1740

gattttctgt gcatggcccc aatcagcttc tttgccatca gcgcctccct gaaggtgccc 1800

ctgatcaccg tgagcaaggc taagatcctg ctggtgctgt tctacccaat caactcctgc 1860

gccaacccct ttctgtacgc tatcttcaca aagaactttc ggcgcgactt ctttatcctg 1920

atgagcaagt tcggatgtta cgagatgcag gcccagatct accggaccga gacaagctcc 1980

gccacccaca actttcacgc taggaagtcc cactgcagca gcgcccccag ggtgacaaac 2040

tcttacgtgc tggtgcctct gaaccacagc gtgcagaac 2079

<210> 8

<211> 693

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的共有小鼠FSHR抗原

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Cys His His Trp Leu Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu

20 25 30

Cys Gln Asp Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Pro Asp Leu Pro Arg Asn

35 40 45

Ala Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys

50 55 60

Gly Ser Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln

65 70 75 80

Asn Asp Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asp Val Phe Ser Asn Leu Pro

85 90 95

Lys Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile

100 105 110

Asn Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Leu Ile

115 120 125

Ser Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser

130 135 140

Leu Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Ile

145 150 155 160

Ile Ala Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu

165 170 175

Trp Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn

180 185 190

Gly Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu

195 200 205

Glu Leu Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu

210 215 220

Asp Ile Ser Arg Thr Lys Val His Ser Leu Pro Asn His Gly Leu Glu

225 230 235 240

Asn Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Leu Lys Lys Leu

245 250 255

Pro Ser Leu Asp Lys Phe Val Thr Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr

260 265 270

Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu

275 280 285

Leu His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Asp Ile Asp Asp

290 295 300

Met Thr Gln Ile Gly Asp Gln Arg Val Ser Leu Ile Asp Asp Glu Pro

305 310 315 320

Ser Tyr Gly Lys Gly Ser Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Phe Asp

325 330 335

Leu Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala

340 345 350

Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu

355 360 365

Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Thr Thr Val Leu

370 375 380

Val Val Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu

385 390 395 400

Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu

405 410 415

Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr

420 425 430

Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe

435 440 445

Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr

450 455 460

Leu Ala Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Glu Cys Lys

465 470 475 480

Val Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Ile Met Val Leu Gly Trp Thr Phe

485 490 495

Ala Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met

500 505 510

Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln

515 520 525

Leu Tyr Val Met Ala Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val

530 535 540

Ile Cys Gly Cys Tyr Thr His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn

545 550 555 560

Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala Thr

565 570 575

Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala

580 585 590

Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys

595 600 605

Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe

610 615 620

Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu

625 630 635 640

Met Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr

645 650 655

Glu Thr Ser Ser Ala Thr His Asn Phe His Ala Arg Lys Ser His Cys

660 665 670

Ser Ser Ala Pro Arg Val Thr Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Leu Asn

675 680 685

His Ser Val Gln Asn

690

<210> 9

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最优化的共有犬科动物FSHR抗原

<400> 9

tgtcaccaca gaatctgcca ctgcagcaac cgggtgttcc tgtgccaaga gtccaaagtg 60

acagagatcc ccagcgacct gcctcggaat gccgtggaac tgagattcgt gctgaccaag 120

ctgagagtga tccccaaggg cgcctttagc ggcttcggcg acctggaaaa gatcgagatc 180

agccagaacg acgtgctgga agtgatcgag gccaacgtgt tcagcaacct gcctaagctg 240

cacgagatca gaatcgagaa ggccaacaac ctgctgtaca tcgaccccga cgccttccag 300

aacctgccaa acctgagata cctgctgatc tccaacaccg gcatcaaaca tctgcccgcc 360

gtgcacaaga tccagagcct gcagaaagtg ctgctggaca tccaggacaa catcaacatc 420

cacaccgtgg aacggaacag cttcatgggc ctgagcttcg agagcatgat cctgtggctg 480

aacaagaacg gcatccaaga gatccacaac tgcgccttca acggcaccca gctggacgag 540

ctgaacctga gcgacaacaa caatctggaa gaactgccca acgacgtgtt ccagggcgct 600

tctggaccag tgatcctgga catcagccgg accagaatcc acagcctgcc tagctacggc 660

ctggaaaacc tgaagaagct gcgggccaag agcacctaca atctgaaaaa gctgcctagc 720

ctcgagaagt tcgtggccct gatggaagcc agcctgacat accctagcca ctgctgcgcc 780

tttgccaact ggcggagaca gatctctgag ctgcacccca tctgcaacaa gagcatcctg 840

cggcaagagg tggacgacat gacacaggcc agaggccaga gagtgtctct ggccgaggat 900

gacgagagca gctacgccaa gggcttcgac atgatgtact ccgagttcga cgccgacctg 960

tgcaacgagg tggtggatgt gacatgcagc cccaagcctg acgccttcaa tccctgcgag 1020

gacatcatgg gctacgacat cctgagagtg ctgatctggt tcatcagcat cctggccatt 1080

accggcaaca tcatcgtgct ggtcatcctg atcaccagcc agtacaagct gaccgtgcct 1140

cggttcctga tgtgcaatct ggccttcgcc gatctgtgta tcggcatcta cctgctgctg 1200

atcgccagcg tggacattca caccaagagc cagtaccaca actacgccat cgactggcag 1260

acaggcgccg gatgtgatgc cgccggattc tttacagtgt tcgccagcga gctgagcgtg 1320

tacaccctga cagccatcac actggccagg gctcacacaa tcacacacgc catgcagctg 1380

gaatgcaagg tgcagctgag acacgccgcc tctgtgatgc tcgtcggatg gatcttcgcc 1440

ttcgctgtgg ccctgtttcc tatcttcggc atcagcagct acatgaaggt gtccatctgc 1500

ctgcctatgg acatcgacag ccctctgagc cagctgtacg tgatgtctct gctggtgctg 1560

aacgtgctgg cctttgtggt catctgcggc tgctacgccc acatctatct gacagtgcgg 1620

aaccccaaca tcgtgtccag ctccagcgat accaagatcg ccaagcggat ggccatgctg 1680

atcttcaccg actttctgtg tatggccccg atcagcttct ttgccatcag cgcttccctg 1740

aaggtgccac tgatcaccgt gtccaagtcc aagatcctgc tggtcctgtt ctaccccatc 1800

aacagctgcg ccaatccttt cctgtacgcc atcttcacca agaacttccg gcgggacttc 1860

ttcatcctgc tgagcaagtt cggctgttac gagattcagg cccagaccta ccggaccgag 1920

acaagctcta cagcccacaa ctctcacccc agaaacggcc actgtcctcc agctcctaga 1980

gtgaccaacg gcagcaacta caccctggtg cctctgtctc atctggccca gaac 2034

<210> 10

<211> 678

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有犬科动物FSHR抗原

<400> 10

Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln

1 5 10 15

Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Val

20 25 30

Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn Asp

50 55 60

Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asn Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys Leu

65 70 75 80

His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asp Pro

85 90 95

Asp Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Arg Tyr Leu Leu Ile Ser Asn

100 105 110

Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser Leu Gln

115 120 125

Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr Val Glu

130 135 140

Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Met Ile Leu Trp Leu

145 150 155 160

Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly Thr

165 170 175

Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu Leu

180 185 190

Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp Ile

195 200 205

Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Lys Lys Leu Arg Ala Lys Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Glu Lys Phe Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro Ser

245 250 255

His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu His

260 265 270

Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Asp Met Thr

275 280 285

Gln Ala Arg Gly Gln Arg Val Ser Leu Ala Glu Asp Asp Glu Ser Ser

290 295 300

Tyr Ala Lys Gly Phe Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala Phe

325 330 335

Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asp Ile Leu Arg Val Leu Ile

340 345 350

Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Val Leu Val

355 360 365

Ile Leu Ile Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met

370 375 380

Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Leu

385 390 395 400

Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr Ala

405 410 415

Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe Thr

420 425 430

Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr Leu

435 440 445

Ala Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Glu Cys Lys Val

450 455 460

Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Leu Val Gly Trp Ile Phe Ala

465 470 475 480

Phe Ala Val Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met Lys

485 490 495

Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln Leu

500 505 510

Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val Ile

515 520 525

Cys Gly Cys Tyr Ala His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn Ile

530 535 540

Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala Met Leu

545 550 555 560

Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile

565 570 575

Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ser Lys Ile

580 585 590

Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu

595 600 605

Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu Leu

610 615 620

Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Ile Gln Ala Gln Thr Tyr Arg Thr Glu

625 630 635 640

Thr Ser Ser Thr Ala His Asn Ser His Pro Arg Asn Gly His Cys Pro

645 650 655

Pro Ala Pro Arg Val Thr Asn Gly Ser Asn Tyr Thr Leu Val Pro Leu

660 665 670

Ser His Leu Ala Gln Asn

675

<210> 11

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的最优化的共有犬科动物FSHR抗原

<400> 11

atggattgga cctggatcct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagctgtcac 60

cacagaatct gccactgcag caaccgggtg ttcctgtgcc aagagtccaa agtgacagag 120

atccccagcg acctgcctcg gaatgccgtg gaactgagat tcgtgctgac caagctgaga 180

gtgatcccca agggcgcctt tagcggcttc ggcgacctgg aaaagatcga gatcagccag 240

aacgacgtgc tggaagtgat cgaggccaac gtgttcagca acctgcctaa gctgcacgag 300

atcagaatcg agaaggccaa caacctgctg tacatcgacc ccgacgcctt ccagaacctg 360

ccaaacctga gatacctgct gatctccaac accggcatca aacatctgcc cgccgtgcac 420

aagatccaga gcctgcagaa agtgctgctg gacatccagg acaacatcaa catccacacc 480

gtggaacgga acagcttcat gggcctgagc ttcgagagca tgatcctgtg gctgaacaag 540

aacggcatcc aagagatcca caactgcgcc ttcaacggca cccagctgga cgagctgaac 600

ctgagcgaca acaacaatct ggaagaactg cccaacgacg tgttccaggg cgcttctgga 660

ccagtgatcc tggacatcag ccggaccaga atccacagcc tgcctagcta cggcctggaa 720

aacctgaaga agctgcgggc caagagcacc tacaatctga aaaagctgcc tagcctcgag 780

aagttcgtgg ccctgatgga agccagcctg acatacccta gccactgctg cgcctttgcc 840

aactggcgga gacagatctc tgagctgcac cccatctgca acaagagcat cctgcggcaa 900

gaggtggacg acatgacaca ggccagaggc cagagagtgt ctctggccga ggatgacgag 960

agcagctacg ccaagggctt cgacatgatg tactccgagt tcgacgccga cctgtgcaac 1020

gaggtggtgg atgtgacatg cagccccaag cctgacgcct tcaatccctg cgaggacatc 1080

atgggctacg acatcctgag agtgctgatc tggttcatca gcatcctggc cattaccggc 1140

aacatcatcg tgctggtcat cctgatcacc agccagtaca agctgaccgt gcctcggttc 1200

ctgatgtgca atctggcctt cgccgatctg tgtatcggca tctacctgct gctgatcgcc 1260

agcgtggaca ttcacaccaa gagccagtac cacaactacg ccatcgactg gcagacaggc 1320

gccggatgtg atgccgccgg attctttaca gtgttcgcca gcgagctgag cgtgtacacc 1380

ctgacagcca tcacactggc cagggctcac acaatcacac acgccatgca gctggaatgc 1440

aaggtgcagc tgagacacgc cgcctctgtg atgctcgtcg gatggatctt cgccttcgct 1500

gtggccctgt ttcctatctt cggcatcagc agctacatga aggtgtccat ctgcctgcct 1560

atggacatcg acagccctct gagccagctg tacgtgatgt ctctgctggt gctgaacgtg 1620

ctggcctttg tggtcatctg cggctgctac gcccacatct atctgacagt gcggaacccc 1680

aacatcgtgt ccagctccag cgataccaag atcgccaagc ggatggccat gctgatcttc 1740

accgactttc tgtgtatggc cccgatcagc ttctttgcca tcagcgcttc cctgaaggtg 1800

ccactgatca ccgtgtccaa gtccaagatc ctgctggtcc tgttctaccc catcaacagc 1860

tgcgccaatc ctttcctgta cgccatcttc accaagaact tccggcggga cttcttcatc 1920

ctgctgagca agttcggctg ttacgagatt caggcccaga cctaccggac cgagacaagc 1980

tctacagccc acaactctca ccccagaaac ggccactgtc ctccagctcc tagagtgacc 2040

aacggcagca actacaccct ggtgcctctg tctcatctgg cccagaac 2088

<210> 12

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的共有犬科动物FSHR抗原

<400> 12

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu

20 25 30

Cys Gln Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn

35 40 45

Ala Val Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys

50 55 60

Gly Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln

65 70 75 80

Asn Asp Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asn Val Phe Ser Asn Leu Pro

85 90 95

Lys Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile

100 105 110

Asp Pro Asp Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Arg Tyr Leu Leu Ile

115 120 125

Ser Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser

130 135 140

Leu Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr

145 150 155 160

Val Glu Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Met Ile Leu

165 170 175

Trp Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn

180 185 190

Gly Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu

195 200 205

Glu Leu Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu

210 215 220

Asp Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu

225 230 235 240

Asn Leu Lys Lys Leu Arg Ala Lys Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu

245 250 255

Pro Ser Leu Glu Lys Phe Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr

260 265 270

Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu

275 280 285

Leu His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Asp

290 295 300

Met Thr Gln Ala Arg Gly Gln Arg Val Ser Leu Ala Glu Asp Asp Glu

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Ala Lys Gly Phe Asp Met Met Tyr Ser Glu Phe Asp Ala

325 330 335

Asp Leu Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp

340 345 350

Ala Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asp Ile Leu Arg Val

355 360 365

Leu Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Val

370 375 380

Leu Val Ile Leu Ile Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe

385 390 395 400

Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu

405 410 415

Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn

420 425 430

Tyr Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe

435 440 445

Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile

450 455 460

Thr Leu Ala Arg Ala His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Glu Cys

465 470 475 480

Lys Val Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Leu Val Gly Trp Ile

485 490 495

Phe Ala Phe Ala Val Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr

500 505 510

Met Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser

515 520 525

Gln Leu Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val

530 535 540

Val Ile Cys Gly Cys Tyr Ala His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro

545 550 555 560

Asn Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala

565 570 575

Met Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe

580 585 590

Ala Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ser

595 600 605

Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro

610 615 620

Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile

625 630 635 640

Leu Leu Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Ile Gln Ala Gln Thr Tyr Arg

645 650 655

Thr Glu Thr Ser Ser Thr Ala His Asn Ser His Pro Arg Asn Gly His

660 665 670

Cys Pro Pro Ala Pro Arg Val Thr Asn Gly Ser Asn Tyr Thr Leu Val

675 680 685

Pro Leu Ser His Leu Ala Gln Asn

690 695

Claims

1.一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸的肽：

a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。

3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

a)在选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码所述肽的核苷酸序列可操作地连接至至少一个选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组的调控序列。

5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽：

a)在选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

a)在选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含表达载体。

8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子掺入到病毒颗粒中。

9.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。

10.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

11.一种核酸分子，其编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽：

12.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。

13.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

14.如权利要求11所述的核酸分子，其中编码的所述肽可操作地连接至至少一个选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组的调控序列。

15.如权利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽：

16.如权利要求15所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

17.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含表达载体。

18.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含病毒颗粒。

19.一种包含肽的免疫原性组合物，其中所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

20.一种肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

a)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:12中所列出的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:12中所列出的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:12中所列出的氨基酸序列，以及

d)包含在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQID NO:12中所列出的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

21.一种诱导对其有需要的受试者的针对卵泡刺激素受体(FSHR)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的免疫原性组合物。

22.如权利要求21所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

23.一种治疗或预防对其有需要的受试者的肿瘤相关病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的免疫原性组合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤相关病变为肿瘤生长、肿瘤转移和血管生成中的至少一种。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述受试者被诊断有癌症。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用包含一种或多种卵巢癌抗原的免疫原性组合物。

29.如权利要求23所述的方法，其中所述受试者处于发展癌症的高风险。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用包含一种或多种卵巢癌抗原的免疫原性组合物。