CN110066314A - 一种高效提高多聚体分离分辨率的亲和纯化工艺 - Google Patents
一种高效提高多聚体分离分辨率的亲和纯化工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种新型有效的提高多聚体分离分辨率的亲和纯化工艺，其具体步骤包括：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用洗2和淋洗3缓冲液淋洗层析柱；步骤3、洗脱，使用pH2.8～5.7的洗脱缓冲液或者含有添加剂的洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品；4、洗脱方法的开发除了洗脱pH条件及添加剂之外，还通过从线性梯度洗脱到一步洗脱的优化。本发明突破了传统思维，即仅将亲和步骤作为粗纯步骤，所发明的工艺，能够通过亲和步骤有效去除多聚体，从而起到精纯目的蛋白的作用，且该工艺已经通过15‑200L工艺放大以及除病毒工艺验证，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质，从而为有效控制抗体类药物中多聚体的含量提供强有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提高多聚体分离分辨率和多聚体去除效率的亲和纯化工艺。
背景技术
抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)中的多聚体(HighMolecularWeight)，是抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)过程中需要监控和去除的杂质，因为有可能会引起受体的免疫原反应，被相关的法规机构乃至整个抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)行业认为是产品的一个重要质量指标(CQA)。
多聚体指的是抗体蛋白以二聚体或者多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养，蛋白纯化，制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺条件，纯化工艺条件以及制剂储存过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分解折叠或者错误的折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)多聚体的产生，不仅有可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康，因而多聚体的含量是评估一个抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)的主要质量因素之一。
在生产的过程中，虽然我们可以通过改变操作条件，例如通过用去污剂灭活病毒来代替低pH灭活病毒，通过在亲和洗脱液加入添加剂提高洗脱pH，通过开发避开蛋白等电点的精纯操作条件，通过降低操作过程的剪切力等来控制多聚体的产生，但是我们没有办法达到完全的控制多聚体的产生，所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。目前有报道已经尝试了多种去除多多聚体的方法，主要有通过蛋白质工程改造优化基因，对表达系统进行筛选和优化，对制剂缓冲液筛选和优化以及通过下游工艺的分离纯化。其中，由于下游分离纯化工艺对于去除和控制多聚体的含量具有更高的灵活性和可操作空间，使得其成为去除多聚体的主要方法。
目前抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)纯化工艺，主要包括澄清，亲和层析，中间品深层过滤，阴离子层析，阳离子层析，纳滤和超滤浓缩换液。为了降低抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)多聚体的含量，目前主要是通过过滤和层析工艺，并结合一定的检测定量手段(SEC-HPLC，UV280)，来监控抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)生产过程中多聚体的动态变化过程。其中去除多聚体的纯化工艺主要包括：阴离子交换层析，阳离子交换层析和中间品深层过滤等。亲和层析作为在抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)制备过程中的关键工艺步骤，目前主要认为其功能是从发酵液中对产品实行直接捕获，然而由于过低的pH洗脱条件，有可能导致蛋白不稳定，从而使得蛋白质形成多聚体。但是对于抗体纯化而言，如果亲和捕获这一步骤能够去除部分的多聚体，将会使得后面的精纯步骤降低纯化压力。
为了克服这一技术难题，最大限度的在捕获步骤降低多聚体的含量，从而减轻后续纯化步骤的压力，本发明对亲和纯化工艺进行了系统优化，在洗脱步骤中考察是否通过各种添加试剂，通过线性梯度洗脱，筛选出合适的添加剂种类，添加剂浓度和洗脱pH值，最终摸索合适的一步洗脱条件，从而使得亲和捕获对于多聚体的去除具有更高的效率，打破了传统的观念，从而使得蛋白多聚体在亲和步骤得到去除，极大的降低了后续精纯工艺的开发难度，该方法工艺已经经过15-200L生产和除病毒验证，适用于了抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)的生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，打破传统观念，在亲和步骤提供一种新的提高多聚体去除分辨率和多聚体去除效率的亲和纯化工艺。该工艺能够提高抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)制备过程中亲和层析去除多聚体的效率，为抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)亲和纯化工艺提供更加可靠的选择。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种去除多聚体含量的亲和纯化工艺，通过改变洗脱步骤中缓冲液配方，例如，通过调高pH，或者通过加入氯化钠、组氨酸和精氨酸中的至少一种作为洗脱过程的添加剂，使得单体和多聚体与填料及其基质间的相互作用差异化，从而起到去除多聚体的作用。其具体步骤包括：
步骤1、处理亲和填料，上样；
步骤2、淋洗，使用pH 4.1～5.7的醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液的淋洗缓冲液2淋洗柱层析；
步骤3、洗脱，使用含有不同添加剂的洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品。
具体的，所述步骤1具体操作方法是：
1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
1b、然后用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
1c、用3-7倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；
1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟。
具体的，所述亲和填料配基为Protein A。所述亲和填料包括但不限于GEhealthcare的MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。
具体的，所述步骤2的具体操作方法是：
2a、用3-7倍平衡缓冲液淋洗层析柱；
2b、用3-7倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱。
2c、用3-7倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。
具体的，所述步骤3的具体操作方法是：
用3-25倍洗脱缓冲液梯度洗脱产品；所述洗脱缓冲液为pH为2.8～5.7、浓度为20-50mM的Tris-盐酸、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液。所述洗脱缓冲液还含有氯化钠、组氨酸、或精氨酸盐酸中的至少一种作为添加剂，其中，氯化钠的浓度为0-1M，组氨酸浓度为0-1M，精氨酸盐酸的浓度为0-1M。所述洗脱缓冲液pH从5.7到2.8拉线性梯度，筛选最适合的洗脱盐浓度，然后通过一步洗脱筛选出最适合的洗脱pH，再通过一步洗脱洗脱产品并收集产品。
具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。
步骤4中，优选采用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤5：对层析柱进行平衡和保存。
步骤5的具体操作方法是：
5a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5b、用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
5c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5d、用2-5倍柱体积的保存液保存层析柱。
优选的，所述1a、1c、2a、5a、5c步骤中所用的平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-醋酸，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M的。
优选的，所述1b、5b步骤中所用的NaOH溶液的浓度为0.1M。
优选的，所述淋洗2缓冲液为Tris-盐酸、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，其pH为4.1～5.7、浓度为20-50mM。所述淋洗2缓冲液还可以含有氯化钠、组氨酸、咪唑和/或精氨酸盐酸作为添加剂，其中，氯化钠的浓度为0-1M，组氨酸、咪唑的浓度为0-0.5M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。所述淋洗2缓冲液的pH优选为4.0～4.5。
优选的，所述淋洗3缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7。
优选的，所述保存液为20％乙醇。
本发明的亲和纯化工艺所使用的方法去除多聚体效果显著，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白等)亲和纯化工艺中，从而为有效控制抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)中多聚体的含量提供技术支持。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可市场购得。
附图说明
图1为实施例1中在洗脱溶液中加入和未添加盐离子的线性梯度洗脱亲和层析图谱。
图2为图1的局部放大图。
图3为实施例1中不同浓度NaCL添加剂的线性梯度亲和层析图谱。
图4为图3的局部放大图。
图5为实施例1在洗脱液中加入盐离子一步洗脱条件摸索的亲和层析图谱。
图6为图5的局部放大图。
图7为为实施例1中200L放大的亲和层析图谱。
图8为实施例2pH线性梯度洗脱亲和层析图谱。
图9为图8的局部放大图。
图10为实施例2中不同pH单步洗脱的亲和层析图谱。
图11为图10的局部放大图。
图12为实施例2中15L放大的亲和层析图谱。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了对本发明所公开的新的亲和纯化工艺进行进一步阐述，现结合抗体类药物(包括单抗，FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)制备过程中实施的亲和层析案例进行详细说明。
亲和层析在GE的AKTA pureM仪器上完成，涉及的各项检测包括有：
1)蛋白质浓度：通过UV280的吸收值来检测；
2)单体纯度：通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测。
本发明所用的亲和介质是Protein A配基交联到包括但不限于琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。优选的亲和填料有GE healthcare的MabSelectSuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。
层析具体步骤如下：
步骤1a，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱。
步骤1b，然后用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱。
步骤1c，用3-7倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱。
步骤1d，上样，让样品在柱上保留2-10分钟。
步骤2a，用3-7倍平衡缓冲液淋洗层析柱。
步骤2b，然后用3-7倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱。
步骤2c，用3-7倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。
步骤3，用3-25倍洗脱缓冲液洗脱产品。
步骤4，用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
步骤5a，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱.
步骤5b，然后用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱.
步骤5c，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱.
步骤5d，用2-5倍柱体积保存液保存层析柱。
步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c，所用的平衡缓冲液为包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris-醋酸，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M。
步骤1b、步骤5b，所使用的消毒剂包括但不局限于0.1M的NaOH溶液。
步骤2b、淋洗2缓冲液包括但不限于Tris-盐酸，醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液，其浓度为20-50Mm，pH为4.1～5.7。所述淋洗2缓冲液还可以加入包括但不限于NaCl、组氨酸，咪唑和精氨酸盐酸，其中，NaCl的浓度为0-1M，组氨酸和咪唑的浓度为0-0.5M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。
步骤2c的淋洗3缓冲液包括但不限于醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7。
步骤3的洗脱缓冲液包括但不限于Tris-盐酸，醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为2.8～5.7。所述洗脱缓冲液还可以加入包括但不限于NaCl、组氨酸和精氨酸盐酸，其中，NaCl的浓度为0-0.1M，组氨酸的浓度为0-0.05M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.05M。
步骤3的洗脱方法包括但是不限于线性梯度洗脱和一步洗脱。
步骤5d的保存液包括但不限于乙醇和苯甲醇盐溶液。
具体实施过程举例说明如下：
实施例1洗脱溶液中加入盐离子添加剂在Fc融合蛋白亲和层析工艺中的作用
用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c的平衡缓冲液；醋酸-醋酸钠体系，50mM的NaAc-HAc、0.5M Imidazole、pH 5.5(加盐的洗脱条件)作为步骤2b的淋洗2缓冲液；50mM的NaAc-HAc、pH 5.5，作为步骤2c的淋洗3缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为步骤1b、步骤5b的消毒剂；20％的乙醇作为步骤5d的保存液；醋酸-醋酸钠体系(50mM NaAc-HAc)，pH从5.7到2.8拉线性梯度，并且从0.05MNaCl、0.05M组氨酸或0.05M精氨基中筛选出最适合的盐做为添加剂，然后评估洗脱缓冲液中0.025M，0.05M和0.1M的氯化钠、组氨酸或精氨基对于分辨率的影响，筛选最适合的洗脱盐浓度，最后通过一步洗脱筛选出最适合的洗脱pH；开发的结果通过200L生产得以验证。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe)，上样载量为10mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤1a)后用3-5倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤1b)；用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱(步骤1c)；上样，让样品在柱上保留5分钟(步骤1d)；用平衡缓冲液淋洗层析柱(UV<25mAu/mm)，冲洗出未结合的发酵液(步骤2a)；然后用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱(步骤2b)；用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱(步骤2c)；洗脱缓冲液从pH5.7到2.8拉线性梯度，梯度洗脱间隔20倍柱体积，一步洗脱洗脱产品基于UV280收集产品(步骤3)；用3-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理(步骤4)。
针对于不同的对比实验，步骤3中的醋酸体系洗脱缓冲液中不有不含盐的，还有分别含有0.05M和0.1M的氯化钠、或0.05M组氨酸或0.05M精氨基。
分管收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品质量(SEC-HPLC)。由图1和2可以明显看到在步骤3的洗脱阶段，随着添加剂的加入，洗脱出现明显的肩峰。从图3和图4可以发现随着盐浓度的升高，洗脱峰的体积越来越大，结合SEC-HPLC检测结果，这说明盐溶液的加入，使得分辨率越来越多高。通过表1可以看出，随着添加剂的加入和浓度的上升，洗脱产品中单体先出来，高聚体在峰尾出来(图3和4)。这说明，在洗脱步骤中使用低盐作为添加剂可以有效的增加分辨率，其中，最合适的盐浓度为100mM NaCl，它的效果要优于50mM或25mMNaCl。一步洗脱评估最适合的洗脱pH值，由图5和6及表2可知，pH为3.7～3.9时两个峰能完全分离，最优的pH为3.7，此时收率最高。最后将确定的工艺用于200L生产进一步验证(图7，表3)。
表1.Fc融合蛋白在洗脱溶液中加入盐离子的亲和层析图谱
表2.Fc融合蛋白在一步洗脱溶液pH评估
表3.Fc融合蛋白在200L生产质量数据
实施例2提高亲和洗脱液pH值在抗体蛋白亲和层析工艺中的作用
用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c的平衡缓冲液；醋酸-醋酸钠体系，50mM的NaAc-HAc、1M NaCl、pH 5.5(不加盐的洗脱条件时，15L用0.5M His-HCL)作为步骤2b的淋洗2缓冲液；50mM的NaAc-HAc、pH 5.5，作为步骤2c的淋洗3缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为步骤1b、步骤5b的消毒剂；20％的乙醇作为步骤5d的保存液；醋酸-醋酸钠体系(50mM NaAc-HAc)，pH从5.7到2.8拉线性梯度，再通过一步洗脱筛选最适合的洗脱条件，开发的结果通过15L生产得以验证。上样用Protein A层析柱(GEMabselect SuRe LX)，上样载量为20-45mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤1a)后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤1b)；用3-7倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱(步骤1c)；上样，让样品在柱上保留大于5分钟(步骤1d)；用平衡缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液(步骤2a)；然后用3-7倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱(步骤2b)；用3-7倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱(步骤2c)；洗脱缓冲液从pH5.7到2.8拉线性梯度，梯度洗脱间隔20倍柱体积，一步洗脱洗脱产品基于UV280收集产品(步骤3)；用3-7倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理(步骤4)。
分管收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品质量(SEC-HPLC)。由图8和9，表4可以明显看到在步骤3的洗脱阶段，单体在峰前出来。一步洗脱评估最适合的洗脱pH值(图10和11，表5)，后确定的工艺用于15L生产进一步验证(图12，表6)。
表4.单抗在洗脱溶液中加与未加盐离子的亲和层析图谱
表5.单抗在一步洗脱溶液pH评估
表6.Fc单抗在15L生产质量数据
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (16)
1.一种有效提高多聚体分离分辨率和多聚体去除效率的亲和纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、处理亲和填料，上样；
步骤2、淋洗，使用淋洗2和淋洗3缓冲液淋洗柱层析；所述淋洗2缓冲液为Tris-盐酸、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，其pH为4.1～5.7、浓度为20-50mM；所述淋洗3缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7；
步骤3、洗脱，用3-25倍洗脱缓冲液梯度洗脱产品；所述洗脱缓冲液为pH为2.8～5.7、浓度为20-50mM的Tris-盐酸、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液；所述洗脱缓冲液还含有氯化钠、组氨酸、或精氨酸盐酸中的至少一种作为添加剂，其中，氯化钠的浓度为0-1M，组氨酸浓度为0-1M，精氨酸盐酸的浓度为0-1M。
2.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤1具体操作方法是：
1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
1b、然后用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
1c、用3-7倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；
1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟。
3.如权利要求1或2所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和填料配基为ProteinA；所述亲和填料包括GE healthcare的Prism A,MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。
4.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤2的具体操作方法是：
2a、用3-7倍平衡缓冲液淋洗层析柱；
2b、用3-7倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱；
2c、用3-7倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。
5.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤3的具体操作方法是：所述洗脱缓冲液pH从5.7到2.8拉线性梯度，筛选最适合的洗脱盐浓度，然后通过一步洗脱筛选出最适合的洗脱pH，再通过一步洗脱洗脱产品并收集产品。
6.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。
7.如权利要求6所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤4中的具体操作方法是：采用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
8.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和纯化工艺还包括步骤5：对层析柱进行平衡和保存。
9.如权利要求8所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤5的具体操作方法是：
5a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5b、用3-7倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
5c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5d、用2-5倍柱体积的保存液保存层析柱。
10.如权利要求2、4或9所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-醋酸，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M的。
11.如权利要求2或9所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述NaOH溶液的浓度为0.1M。
12.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述淋洗2缓冲液的pH为4.1～5.7。
13.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述淋洗2缓冲液还含有氯化钠、组氨酸，咪唑和精氨酸盐酸作为添加剂。
14.如权利要求13所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述淋洗2缓冲液中，pH的范围在4.1～5.7，氯化钠的浓度为0-0.1M，组氨酸的浓度为0-0.5M和精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。
15.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，先通过梯度洗脱筛选具有高分辨率的添加剂或者具有高分辨率的pH值，再进一步开发一步洗过模式。
16.如权利要求8所述的亲和纯化工艺，其特征在于，保存液为乙醇或者苯甲醇盐溶液。
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