CN110055333B

CN110055333B - Rp11-116o18.1作为分子标志物在肺癌中的应用

Info

Publication number: CN110055333B
Application number: CN201910472069.7A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 魏琳
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110055333A

Abstract

本发明公开了RP11‑116O18.1作为分子标志物在肺癌中的应用。具体地，本发明涉及RP11‑116O18.1用于制备诊断肺腺癌的产品，和用于制备治疗肺腺癌的药物组合物。此外，本发明还提供了RP11‑116O18.1在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用。

Description

RP11-116O18.1作为分子标志物在肺癌中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及RP11-116O18.1作为分子标志物在肺癌中的应用。

背景技术

肺癌目前仍是最普遍和最致命的恶性肿瘤(Siegel R L,Miller K D,JemalA.Cancer statistics,2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29)。肺腺癌是最主要的肺癌类型。目前肺癌发生的机制尚不完全清楚，肺癌治疗效果和预后仍然较差(ChheangS,Brown K.Lung cancer staging:clinical and radiologic perspectives[J].SeminIntervent Radiol,2013,30(2):99-113)。因此，进一步深入研究肺癌发生和发展的分子机制，并在此基础上寻找新的早期诊断和预后预测的分子标志物及有效的治疗靶标，是提高其预防和治疗效果的当务之急。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,1ncRNA)是一类转录本长度大于200nt的功能性RNA分子(Gunman M,Rinn J L.Modular regulatory principles of large non-coding RNAs[J].Nature 2012,482(7385):339-346.)。lncRNAs具有类似mRNA的结构，但不能编码蛋白(Chen J,Wang R,Zhang K,et al.Long non-coding RNAs in non-small celllung cancer as biomarkers and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med,2014,18(12):2425-2436.)。研究发现，在哺乳动物基因组中，只有不到2％的转录产物具有蛋白编码功能，其余98％均为非编码RNA(ncRNA)。它们广泛存在于基因间、内含子以及蛋白质编码基因的反义链中，有些可与蛋白质编码基因相重叠(Derrien T,Johnson R,Bussotti G,etal.The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs:analysis of their genestructure,evolution,and expression[J].Genome Res,2012,22(9):1775-1789.)。

研究发现1ncRNAs可能在肿瘤中的发生发展中起重要作用。lncRNAs的异常表达被认为是许多疾病的一个特征，尤其是癌症相关1ncRNAs可作为癌症诊断和预测标志物，可以影响肿瘤细胞凋亡、增殖以及肿瘤转移和浸润等(Shi X,Sun M,Liu H,et al.Long non-coding RNAs:a new frontier in the study of human diseases[J].Cancer Lett,2013,339(2):159-166.)。例如HOTAIR在大部分常见癌症中均表达上调，包括乳腺癌、食管癌、肺癌和胃癌，HOTAIR表达较高的患者预后差，同时也参与了肿瘤细胞凋亡、增殖、转移等细胞生物学功能调控。MALATI也与几种常见的癌症预后有着密切的关联。目前，已经发现了多种肺癌相关的1ncRNAs，但是，更多的肺癌相关1ncRNAs还有待进一步的发掘，大多数1ncRNAs在肺癌中的作用和机制尚不清楚。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肺腺癌发生发展相关的lncRNA生物标志物及其在肺腺癌诊断和治疗中的应用，以及筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测样本中RP11-116O18.1基因的水平。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别RP11-116O18.1的探针；或

特异性扩增RP11-116O18.1的引物。

进一步，所述特异性扩增RP11-116O18.1的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。

本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括的RP11-116O18.1的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为降低RP11-116O18.1表达水平的试剂。

进一步，所述抑制剂选自：以RP11-116O18.1或其转录本为靶序列、且能够抑制RP11-116O18.1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～12所示。

更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明的第四方面提供了一种筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RP11-116O18.1基因的体系；和

检测所述体系中RP11-116O18.1基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以降低RP11-116O18.1基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗肺腺癌的候选药物。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对RP11-116O18.1基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明的第五方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

c.RP11-116O18.1在构建诊断肺腺癌的计算模型中的应用；

d.RP11-116O18.1在制备治疗肺腺癌的药物中的应用；

e.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肺腺癌的药物中的应用；

f.RP11-116O18.1在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测RP11-116O18.1基因在肺腺癌组织中的表达情况图；

图2是检测siRNA对RP11-116O18.1的沉默效果图；

图3是CCK8法检测RP11-116O18.1对肺腺癌细胞增殖的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序以及生物信息学分析方法，检测肺腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与肺腺癌的发生发展之间的关系，从而为肺腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肺腺癌中RP11-116O18.1显著性上调，同时根据RP11-116O18.1与肺腺癌之间的关系，通过设计针对RP11-116O18.1的siRNA来确定其与肺腺癌增殖之间的相关性。为肺腺癌的早期诊断及治疗提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA、miRNA、lncRNA、circRNA)。在本发明的特定的实施方式中，“表达的基因”是指转录成RNA但不翻译成多肽的基因。

增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

RP11-116O18.1

转录RP11-116O18.1的基因是位于人1号染色体上，本发明中的RP11-116O18.1包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的RP11-116O18.1可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的RP11-116O18.1即可。在本发明的实施例中，一种代表性的转录RP11-116O18.1基因的核苷酸序列如ENST00000590535.1所示。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

试剂盒、芯片、试纸

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RP11-116O18.1的表达。所述试剂盒包括用于扩增RP11-116O18.1的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。

作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

本发明提供了一种芯片，所述芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RP11-116O18.1所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种试纸，所述试纸可用于检测RP11-116O18.1的表达；所述试纸包括特异性识别RP11-116O18.1的探针或特异性扩增RP11-116O18.1的引物对。

作为一种优选的实施方案，所述试纸还包括纤维膜，纤维膜包括但不限于硝酸纤维素膜或尼龙膜。

在一个更为优选的实施方案，纤维膜上还设有检测线和质控线。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括RP11-116O18.1基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平，将肺腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肺腺癌诊断的准确率。

在本发明中，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于肺腺癌的风险或与有助于评估肺腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有肺腺癌风险的个体、具有肺腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估肺腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

抑制剂和药物

基于发明人的发现，本发明提供了一种RP11-116O18.1的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要降低RP11-116O18.1基因的表达水平即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以RP11-116O18.1基因为靶序列、且能够抑制RP11-116O18.1基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调RP11-116O18.1有用的物质，可用于治疗肺腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述RP11-116O18.1的抑制剂是一种RP11-116O18.1特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的lncRNA为靶目标降解特定的lncRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肺腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，在本发明的具体实施例中，该siRNA的序列如SEQ IDNO.7～8所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中RP11-116O18.1基因的表达水平，以及肺腺癌细胞的增殖。本领域技术人员可以认识到，选择效果最佳的siRNA进行后续的实验并不意味着其他的siRNA不能起到相似的效果，进行siRNA干扰实验的目的是为了证明RP11-116O18.1的表达水平确实与肺腺癌细胞的增殖及侵袭和迁移相关，为了减少成本，通常会选择具有代表性的siRNA进行实验。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在本发明中，“药物”、“药物组合物”可以通用。作为可选择的实施方案中，药物组合物包括RP11-116O18.1基因的抑制剂以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括(但并不限于)粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、肺腺癌给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与肺腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集35例肺腺癌组织以及相应的癌旁组织，全部患者在手术前均未接受其他治疗，从中任选4例肺腺癌组织及相应的癌旁组织进行高通量测序。

2、RNA样品的制备及定量分析

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体操作按说明书进行。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、构建cDNA文库及测序

cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：

1)去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；

2)片段化RNA

对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

3)反转合成cDNA

利用Illumina的TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以lncRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

4)连接adaptor

加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

5)UNG酶消化cDNA二链

用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

6)使用Illumina X-Ten测序平台，进行2*150bp测序。

4、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的lncRNA(即该lncRNA的read count值在case中为0的样本数大于总的case样本量的20％或该lncRNA的read count值在normal中为0的样本数大于总的normal样本量的20％)后，使用R-3.3.3工具的DESeq2进行差异表达分析，差异表达lncRNA筛选标准：FDR<0.05，abs(log₂FC)>2。

5、结果

结果显示，与癌旁组织相比，RP11-116O18.1在肺腺癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2 QPCR测序验证RP11-116O18.1基因的差异表达

1、对收集的35例组织样本进行RP11-116O18.1基因差异表达的验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用天根公司的FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加RnaseFree ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min.

将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中RP11-116O18.1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

RP11-116O18.1基因：

正向引物为5’-ATCTCCTCTCATACAACAC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-ACTCAAGATGAAGCAGAA-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，RP11-116O18.1在肺腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示RP11-116O18.1在肺腺癌的诊断中具有较高的应用价值。

实施例3 RP11-116O18.1基因的沉默

1、细胞培养

人肺腺癌细胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA的设计

针对RP11-116O18.1基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：

阴性对照siRNA-NC的序列：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA1：

正义链：5’-AGGUUUUCAUGCAUCAUGGGA-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链：5’-CCAUGAUGCAUGAAAACCUCU-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA2：

正义链：5’-UAUCCAAAUAGUUUUCCUCUC-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链：5’-GAGGAAAACUAUUUGGAUAUA-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA3：

正义链为5’-UUAGAGAUCUUUUACCUACCC-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-GUAGGUAAAAGAUCUCUAAAC-3’(SEQ ID NO.12)

3、转染

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×10⁵个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。

将实验分为三组：对照组(A549)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1-3)，其中阴性对照组siRNA-NC与RP11-116O18.1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。使用Invitrogen公司的Lipofectamine3000试剂盒进行转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。

4、QPCR检测RP11-116O18.1基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

5、结果

结果如图2显示，与对照组A549和siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～3)能降低RP11-116O18.1的水平，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续实验。

实施例4 RP11-116O18.1对肺腺癌细胞增殖的影响

1、肺腺癌细胞A549接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用脂质体3000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。

2、转染siRNA1后培养24h，将干扰组细胞和对照组细胞消化，在96孔板中接种转染后的A549细胞悬液以及各对照组100μl(1×10⁴个/孔)，在转染12h、24h、48h、72h后进行检测。

3、向每孔加入10μl CCK8溶液。

4、将培养板放在培养箱内培养1-4h。

5、使用酶标仪测定在450nm处的吸光度，以吸光度值为纵轴、时间为横轴，绘制细胞生长活性曲线。

6、结果

结果如图3所示，与对照组相比，随着生长时间的增加，siRNA1转染组细胞活性明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，说明RP11-116O18.1影响肺腺癌细胞的增殖，提示可将其作为可能的潜在靶标应用于肺腺癌的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> RP11-116O18.1作为分子标志物在肺癌中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctcctctc atacaacac 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actcaagatg aagcagaa 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agguuuucau gcaucauggg a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaugaugca ugaaaaccuc u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uauccaaaua guuuuccucu c 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggaaaacu auuuggauau a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uuagagaucu uuuaccuacc c 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

guagguaaaa gaucucuaaa c 21

Claims

1.一种筛选抑制肺腺癌细胞增殖的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RP11-116O18.1 基因的体系；和

检测所述体系中RP11-116O18.1 基因的表达水平；

其中，若所述待筛选的物质可以降低RP11-116O18.1基因的表达水平，则表明该待筛选物质是抑制肺腺癌细胞增殖的候选药物。

2.如下任一项应用：

a.检测RP11-116O18.1的表达水平的试剂在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

b.包含检测RP11-116O18.1的表达水平的试剂的产品在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

c. RP11-116O18.1在构建诊断肺腺癌的计算模型中的应用；

d. RP11-116O18.1的抑制剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂抑制RP11-116O18.1的表达水平；

e. 包含RP11-116O18.1的抑制剂的组合物在制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂抑制RP11-116O18.1的表达水平；

f. RP11-116O18.1在筛选抑制肺腺癌细胞增殖的候选药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a或b中的试剂选自：

特异性识别RP11-116O18.1的探针；或

特异性扩增RP11-116O18.1的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增RP11-116O18.1的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d或e中所述的抑制剂为siRNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~12所示。