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CN110023321A - 多核苷酸构建体 - Google Patents

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CN110023321A
CN110023321A CN201780063963.8A CN201780063963A CN110023321A CN 110023321 A CN110023321 A CN 110023321A CN 201780063963 A CN201780063963 A CN 201780063963A CN 110023321 A CN110023321 A CN 110023321A
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S.萨卡穆里
C.W.布拉肖
L.埃尔特普
B.R.米德
S.林
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Jingyin Pharmaceutical Co ltd
Qingkong Biotechnology Co ltd
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Sol Justice Biological Ltd
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Abstract

公开了具有链的多核苷酸构建体，所述链与携带一个或更多个辅助部分连接的部分。还公开了被糖类似物中断的多核苷酸构建体，以及具有立体化学富集的硫代磷酸酯的多核苷酸构建体。所述多核苷酸构建体可作为杂交的多核苷酸构建体提供。特征还在于通过将细胞与所公开的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体接触来将多核苷酸构建体递送至细胞的方法和降低细胞中的蛋白表达的方法。

Description

多核苷酸构建体
发明领域
本发明涉及用于转染细胞的组合物和方法。
背景
已使用各种重组病毒载体、脂质递送系统和电穿孔进行体外和体内向细胞的核酸递送二者。此类技术试图通过敲除基因表达和提供用于基因疗法的基因构建体来治疗各种疾病和病症，或试图研究各种生物系统。
RNA干扰(RNAi)作为选择性地降解mRNA的细胞机制的发现允许在细胞培养中靶向操纵细胞表型以及可能开发定向治疗剂二者(Behlke，Mol.Ther.13，644-670，2006；Xie等人，Drug Discov.Today 11，67-73，2006)。然而，由于它们的尺寸和带负电荷(阴离子)的性质，siRNA是不能进入细胞的大分子。确实，siRNA超过通常将尺寸限制至小于500Da的用于膜可扩散分子的细胞递送的Lipinski“5s法则”25倍。因此，在不存在递送媒介物或转染剂的情况下，即使在毫摩尔浓度下，裸siRNA也不会进入细胞(Barquinero等人，Gene Ther.11Suppl 1，S3-9，2004)。显著注意力集中于使用阳离子脂质，所述阳离子脂质既使siRNA缩合，又在细胞膜中穿孔，以解决siRNA递送问题。尽管广泛使用，但转染试剂未能实现有效递送到许多细胞类型中，尤其是原代细胞和造血细胞谱系(T细胞和B细胞、巨噬细胞)。此外，脂质转染试剂经常导致从在肿瘤细胞中轻度到在原代细胞中高度的范围内的不同程度的细胞毒性。
因此，对于具有增加的转染细胞能力的多核苷酸构建体存在需要。特别合意的是能够靶向预定细胞群体的多核苷酸构建体。
发明内容
一般而言，本发明提供多核苷酸构建体。某些构建体具有与携带一个或更多个辅助部分(例如，靶向部分)的支链部分连接的多核苷酸。所述多核苷酸构建体可作为杂交的多核苷酸构建体提供。本文中描述了其它构建体。
在一个方面，本发明提供多核苷酸构建体。
本发明的多核苷酸构建体可含有与至少一个式(I)的基团键合的多核苷酸：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-(例如，至少一个包括与T键合的-C(O)-N(H)-的多价连接子))；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数。
本发明的多核苷酸构建体可含有被至少一个式(III)的核苷间脱碱基间隔子中断的链：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
在一些实施方案中，t为1。在另外的实施方案中，R9是H。在还有另外的实施方案中，X4是O或S。在再有另外的实施方案中，X5是O。在特别的实施方案中，(x)是2、3、4或5。在某些实施方案中，(x)是13、14、15或16。在其它实施方案中，所述构建体含有仅1个核苷间脱碱基间隔子或仅2个核苷间脱碱基间隔子。在某些实施方案中，所述糖类似物为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷烃-1，3-二基、任选取代的C5环烯烃-1，3-二基、任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基、任选取代的四氢呋喃-2，5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。在某些实施方案中，所述糖类似物选自：
其中
R12是与式(III)中的-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
R13是与式(III)中的另一-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
各R14和R15独立地为H、任选取代的C1-6烷基或-(CH2)t1-ORZ，其中n是1至6的整数，且RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基。
在一些实施方案中，R14和R15中的至少一个不是H。
本发明的多核苷酸构建体可含有包含至少一个2’位修饰的核苷的链。
在其它实施方案中，所述链中全部核苷均独立地为2’位修饰的核苷。在某些实施方案中，所述链中至少80％的核苷为2’位修饰的核苷。在另外的实施方案中，各2’位修饰的核苷独立地为2’-烷氧基核苷(例如，2’-甲氧基核苷)。在还有另外的实施方案中，所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷中的至少一个为2’-氟代核苷。在再有另外的实施方案中，所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷或第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。在另外的实施方案中，所述链中的第七、第九和/或第十一核苷为2’-氟代核苷。在一些实施方案中，剩余的核苷为2’-烷氧基核苷(例如，2’-甲氧基核苷)。
本发明的多核苷酸构建体可含有包括种子区的链，所述种子区包括含次黄嘌呤核碱基的核苷(例如，肌苷)。在某些实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第二核苷。在另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第三核苷。在还有另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第四核苷。在再有另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第五核苷。在特别的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第六核苷。
本发明的多核苷酸构建体可含有包括至少一个立体化学富集的硫代磷酸酯的链。在一些实施方案中，所述链包括仅1个、2个、3个或4个立体化学富集的硫代磷酸酯。在另外的实施方案中，至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷中的两个。在还有另外的实施方案中，至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间。所述两个连续核苷为所述链的六个3’-末端核苷中的两个。在再有另外的实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第一核苷和第二核苷之间。在再有另外的实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二核苷和第三核苷之间。在一些实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十一核苷和第二十二核苷之间。在某些实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十二核苷和第二十三核苷之间。在特别的实施方案中，所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有RP立体化学构型(identity)。在某些实施方案中，所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有SP立体化学构型。
在另外的实施方案中，所述链含有19个或更多个核苷。在还有另外的实施方案中，所述链包含少于100个核苷(例如，少于50个核苷或少于32个核苷)。
本发明还提供了含有过客链和可加载到RISC复合体中的引导链的杂交的多核苷酸。
在所述杂交的多核苷酸中，至少一个所述链可与至少一个式(I)的基团键合。在一些实施方案中，所述过客链是本发明的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体；其中所述至少一个式(I)的基团与所述过客链的5’-末端、3’-末端、核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合。在其它实施方案中，至少一个所述链与至少一个式(I)的基团键合：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数。
式(I)的基团可与本发明的多核苷酸构建体或本发明的杂交的多核苷酸构建体中的链(例如，过客链)的5’-末端、3’-末端、核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯和/或核苷间二硫代磷酸酯键合。在一些实施方案中，式(I)的基团与过客链的3’-末端键合。当式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q可为0。
所述多核苷酸构建体含有不超过一种Sol。类似地，所述杂交的多核苷酸构建体含有不超过一种Sol。
在某些实施方案中，R1和R2与MOIETY中的同一原子相连。在另外的实施方案中，MOIETY、R1和R2组合形成：
其中
R7是连接靠近R4的氧原子的键，
R8是连接靠近所述链的氧原子的键，且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，
条件是式(Ia)中的季碳与0或1个不同于碳和氢的原子键合，且条件是m1、m2、m3和m4的总和小于10。
在一些实施方案中，各X2独立地为O、S或NH(例如，各X2独立地为O或S)。
在特别的实施方案中，当至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
在某些实施方案中，所述链含有至少一个在2位被任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C2-12烷氧基烷基、卤素或氰基取代的核苷。
本发明的杂交的多核苷酸可含有被至少一个式(III)的核苷间脱碱基间隔子中断的链：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
在一些实施方案中，t为1。在另外的实施方案中，R9是H。在还有另外的实施方案中，X4是O或S。在再有另外的实施方案中，X5是O。在特别的实施方案中，(x)是2、3、4或5。在某些实施方案中，(x)是13、14、15或16。在其它实施方案中，所述构建体含有仅1个核苷间脱碱基间隔子或仅2个核苷间脱碱基间隔子。在某些实施方案中，所述糖类似物为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷烃-1，3-二基、任选取代的C5环烯烃-1，3-二基、任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基、任选取代的四氢呋喃-2，5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。在某些实施方案中，所述糖类似物选自：
其中
R12是与式(III)中的-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
R13是与式(III)中的另一-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
各R14和R15独立地为H、任选取代的C1-6烷基或-(CH2)t1-ORZ，其中n是1至6的整数，且RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基。
在一些实施方案中，R14和R15中的至少一个不是H。
本发明的杂交的多核苷酸可含有包含至少一个2’位修饰的核苷的链。在其它实施方案中，所述链中全部核苷均独立地为2’位修饰的核苷。在某些实施方案中，所述链中至少80％的核苷为2’位修饰的核苷。在另外的实施方案中，各2’位修饰的核苷独立地为2’-烷氧基核苷(例如，2’-甲氧基核苷)。在还有另外的实施方案中，所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷中的至少一个为2’-氟代核苷。在再有另外的实施方案中，所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷或第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。在另外的实施方案中，所述链中的第七、第九和/或第十一核苷为2’-氟代核苷。在一个实施方案中，在一个链中，所述链中的第二、第十二、第十四和/或第十六核苷为2’-氟代核苷，并且在另一链中，所述链中的第七、第九和/或第十一核苷为2’-氟代核苷。在一些实施方案中，剩余的核苷为2’-烷氧基核苷(例如，2’-甲氧基核苷)。
本发明的杂交的多核苷酸可含有包括种子区的链，所述种子区包括含次黄嘌呤核碱基的核苷(例如，肌苷)。在某些实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第二核苷。在另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第三核苷。在还有另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第四核苷。在再有另外的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第五核苷。在特别的实施方案中，所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第六核苷。
本发明的杂交的多核苷酸可含有包括至少一个立体化学富集的硫代磷酸酯的链。在一些实施方案中，所述链包括仅1个、2个、3个或4个立体化学富集的硫代磷硫酸酯。在另外的实施方案中，至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷中的两个。在还有另外的实施方案中，至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间，所述两个连续核苷为所述链的六个3’-末端核苷中的两个。在再有另外的实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第一核苷和第二核苷之间。在再有另外的实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二核苷和第三核苷之间。在一些实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十一核苷和第二十二核苷之间。在某些实施方案中，一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十二核苷和第二十三核苷之间。在特别的实施方案中，所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有RP立体化学构型。在某些实施方案中，所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有SP立体化学构型。
在另外的实施方案中，所述链含有19个或更多个核苷。在还有另外的实施方案中，所述链包含少于100个核苷(例如，少于50个核苷或少于32个核苷)。
在一些实施方案中，所述链含有1至5个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。在某些实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二核苷和第三核苷。在特别的实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第五核苷和第六核苷。在另外的实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十七核苷和第十八核苷。在还有另外的实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十九核苷和第二十核苷。在再有另外的实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二十核苷和第二十一核苷。在其它实施方案中，至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。在还有其它实施方案中，所述链含有一个或更多个核苷间膦酸酯。在再有其它实施方案中，所述一个或更多个核苷间膦酸酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
在特别的实施方案中，所述链含有10个或更多个核苷(例如，15个或更多个核苷或者19个或更多个核苷)。在某些实施方案中，所述链含有少于100个核苷(例如，50个或更少个核苷、40个或更少个核苷或者32个或更少个核苷)。在另外的实施方案中，所述链含有15个至50个核苷(例如，15个至40个核苷、19个至40个核苷、15个至32个核苷或19个至32个核苷)。
在一些实施方案中，所述链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。
在某些实施方案中，所述链含有至少一个2’位修饰的核苷(例如，所述链中所有的核苷独立地为2’位修饰的核苷)。
在一些实施方案中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
在特别的实施方案中，至少一个所述链含有至少一个二硫代磷酸酯或至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，至少一个所述链含有至少一个为2’位修饰核苷的核苷。
在另外的实施方案中，至少一个-LinkA(-T)p具有式(II)(例如，各-LinkA(-T)p独立地具有式(II))：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子；
若p为1，则Q2是直链基团，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链。
在某些实施方案中，各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基。在特别的实施方案中，式(II)中存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。在其它实施方案中，Q1是-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C1-12亚烷基或-(任选取代的C1-6亚烷基)-(任选取代的C6-10亚芳基)-(例如，任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-12亚烷基)；且QC为(i)任选取代的C2-12亚杂烷基，其含有-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-；(ii)任选取代的C1-12亚杂环基；(iii)任选取代的C1-12亚硫代杂环基；(iv)环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基；或(v)吡啶-2-基腙。在再有其它实施方案中，QL为任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C1-12亚烷基。在还有其它实施方案中，Q1含有：
在再有其它实施方案中，p为1，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-的直链基团。
在一些实施方案中，p为2至6的整数，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2的支链基团，其中Q7为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
在某些实施方案中，至少一个T是靶向部分。在特别的实施方案中，至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体、甘露糖、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗体或抗原结合片段。在另外的实施方案中，至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体(例如，至少一个T是N-乙酰半乳糖胺)。在还有另外的实施方案中，N-乙酰半乳糖胺含有与LinkA键合的异头碳，其中所述异头碳是半缩醛胺基团的一部分。在再有另外的实施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺的异头碳与酰胺氮原子键合。在一些实施方案中，至少一个T是细胞穿透肽。在某些实施方案中，至少一个T是内体逃逸部分。
在特别的实施方案中，所述至少一个式(I)的基团与为五个5’-末端核苷或五个3’-末端核苷之一的核苷连接。在其它实施方案中，所述链与1个、2个、3个或4个式(I)的基团键合，其中所述式(I)的基团相同或不同。
在另外的实施方案中，所述链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
在一些实施方案中，所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L是C2-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
在其它实施方案中，所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：
C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为含有1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为含有1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
在一些实施方案中，所述杂交的多核苷酸构建体含有1至6个式(I)的基团，其中所述式(I)的基团相同或不同。在某些实施方案中，所述过客链含有至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。在特别的实施方案中，所述引导链含有至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。在另外的实施方案中，所述引导链含有1至5个所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯。在还有另外的实施方案中，所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述引导链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。在再有另外的实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二核苷和第三核苷。在其它实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第五核苷和第六核苷。在还有其它实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十七核苷和第十八核苷。在再有其它实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十九核苷和第二十核苷。在某些实施方案中，所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二十核苷和第二十一核苷。在特别的实施方案中，所述过客链含有1至5个所述非生物可逆性磷酸三酯。在一些实施方案中，所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述过客链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
在另外的实施方案中，所述过客链或所述引导链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。在还有另外的实施方案中，所述引导链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。在再有另外的实施方案中，所述过客链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。
在一些实施方案中，所述引导链或所述过客链含有一个或更多个膦酸酯。
在特别的实施方案中，所述引导链含有10个或更多个核苷(例如，15个或更多个核苷或者19个或更多个核苷)。在某些实施方案中，所述引导链含有少于100个核苷(例如，50个或更少个核苷、40个或更少个核苷或者32个或更少个核苷)。在另外的实施方案中，所述引导链含有15个至50个核苷(例如，15个至40个核苷、19个至40个核苷、15个至32个核苷或19个至32个核苷)。
在另外的实施方案中，所述过客链含有10个或更多个核苷(例如，15个或更多个核苷或者19个或更多个核苷)。在还有另外的实施方案中，所述过客链含有少于100个核苷(例如，50个或更少个核苷、40个或更少个核苷或者32个或更少个核苷)。在再有另外的实施方案中，所述过客链含有15个至50个核苷(例如，15个至40个核苷、19个至40个核苷、15个至32个核苷或19个至32个核苷)。
在某些实施方案中，所述过客链的3’端与所述引导链的5’端杂交，以形成平末端。
本发明进一步提供了将多核苷酸构建体递送至细胞的方法，其通过使所述细胞与本发明的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与本发明的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述多核苷酸构建体驻留在所述细胞内。
本发明还提供了降低细胞中的蛋白表达的方法，其通过使所述细胞与本发明的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与本发明的杂交的多核苷酸构建体或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述蛋白在所述细胞中的表达降低。
本发明提供式(IV)的化合物：
其中
各R1和R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基或共轭部分；
各R16独立地为二烷基氨基、2-氰乙基或共轭部分，条件是至少一个R16是二烷基氨基；
R17是羟基保护基团；且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，条件是m1和m2的总和不为0；
其中，当R1和R2二者均为含有任选取代的C2-16炔基的共轭部分时，R16是二烷基氨基或共轭部分。
在某些实施方案中，R1和R2中的至少一个是共轭部分。
在一些实施方案中，m1是0或1。在另外的实施方案中，m2是0或1。
在特别的实施方案中，R1是H或所述共轭部分，
其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，
其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
在某些实施方案中，R1中的Q3是-O-。在另外的实施方案中，R1中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R1中的Q5不存在。
在还有另外的实施方案中，R2是H或所述共轭部分，其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
在再有另外的实施方案中，R2中的Q3是-O-。在特别的实施方案中，R2中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R2中的Q5不存在。
定义
如本文中所使用的术语“约”代表为所列举值的±10％的值。
如本文中所使用的术语“活化的羰基”代表式-C(O)RA的官能团，其中RA是卤素、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C6-10芳氧基、任选取代的C2-9杂芳氧基(例如，1H-苯并三唑-1-基氧基)、任选取代的C2-C9杂环氧基(例如，-OSu)、任选取代的吡啶鎓(例如，4-二甲基氨基吡啶鎓)或-N(OMe)Me。
如本文中所使用的术语“活化的磷中心”代表三价磷(III)或五价磷(V)中心，其中取代基中的至少一个是卤素、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C6-10芳氧基、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、任选取代的吡啶鎓(例如，4-二甲基氨基吡啶鎓)或任选取代的铵。
如本文中所使用的术语“活化的硅中心”代表四取代的硅中心，其中取代基中的至少一个是卤素、任选取代的C1-6烷氧基或氨基。
如本文中所使用的术语“活化的硫中心”代表四价硫，其中取代基中的至少一个是卤素、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C6-10芳氧基、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、任选取代的吡啶鎓(例如，4-二甲基氨基吡啶鎓)或任选取代的铵。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“烷烃-四基”代表具有1至16个碳原子的四价、无环的、直链或支链饱和烃基团。烷烃-四基可如针对烷基所描述任选被取代。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“烷烃-三基”代表具有1至16个碳原子的三价、无环的、直链或支链饱和烃基团。烷烃-三基可如针对烷基所描述任选被取代。
如本文中所使用的术语“烷酰基”代表通过羰基与母体分子基团连接的氢或烷基(例如，卤代烷基)，并且实例有甲酰基(即，甲醛基团)、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等。示例性未取代的烷酰基包括1至7个碳。在一些实施方案中，烷基进一步被如本文中所述的1、2、3或4个取代基取代。
如本文中所使用的术语“(Cx1-y1芳基)-Cx2-y2-烷基”代表通过具有x2至y2个碳原子的亚烷基与母体分子基团连接的具有x1至y1个碳原子的芳基。示例性未取代的(Cx1-y1芳基)-Cx2-y2-烷基为7至16个碳。在一些实施方案中，亚烷基和芳基各自可进一步被如本文中针对相应基团所定义的1、2、3或4个取代基取代。以相同方式定义后接“烷基”的其它基团，其中除非另外指出，否则“烷基”是指C1-6亚烷基，并且所连接的化学结构如本文中所定义。
如本文中所使用的术语“烯基”代表含有一个、两个或三个碳-碳双键的无环一价直链或支链烃基团。烯基的非限制性实例包括乙烯基、丙-1-烯基、丙-2-烯基、1-甲基乙烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、1-甲基丙-1-烯基、2-甲基丙-1-烯基以及1-甲基丙-2-烯基。烯基可任选地被独立地选自以下的1、2、3或4个取代基取代：如本文中所定义的芳基、环烷基、杂环基(例如，杂芳基)，以及针对烷基描述的取代基。
如本文中所使用的术语“亚烯基”是指直链或支链烯基，其中去除一个氢从而使该基团为二价的。本文中所定义的亚烯基的化合价不包括任选的取代基。亚烯基的非限制性实例包括乙烯-1，1-二基；乙烯-1，2-二基；丙-1-烯-1，1-二基，丙-2-烯-1，1-二基；丙-1-烯-1，2-二基，丙-1-烯-1，3-二基；丙-2-烯-1，1-二基；丙-2-烯-1，2-二基；丁-1-烯-1，1-二基；丁-1-烯-1，2-二基；丁-1-烯-1，3-二基；丁-1-烯-1，4-二基；丁-2-烯-1，1-二基；丁-2-烯-1，2-二基；丁-2-烯-1，3-二基；丁-2-烯-1，4-二基；丁-2-烯-2，3-二基；丁-3-烯-1，1-二基；丁-3-烯-1，2-二基；丁-3-烯-1，3-二基；丁-3-烯-2，3-二基；丁-1，2-二烯-1，1-二基；丁-1，2-二烯-1，3-二基；丁-1，2-二烯-1，4-二基；丁-1，3-二烯-1，1-二基；丁-1，3-二烯-1，2-二基；丁-1，3-二烯-1，3-二基；丁-1，3-二烯-1，4-二基；丁-1，3-二烯-2，3-二基；丁-2，3-二烯-1，1-二基；和丁-2，3-二烯-1，2-二基。如针对烯基所描述，亚烯基可为未取代的或取代的(例如，任选取代的亚烯基)。
如本文中所使用的术语“烷氧基”代表式-OR的化学取代基，其中除非另外说明，R是C1-6烷基。在一些实施方案中，烷基可进一步以针对烷基描述的方式被取代。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“烷基”是指具有1至16个碳的无环直链或支链饱和烃基团。烷基的实例有：甲基；乙基；正丙基和异丙基；正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；新戊基等，并且可任选地被独立地选自以下的一个、两个、三个或(在具有两个碳或更多个碳的烷基的情况下)四个取代基取代：(1)烷氧基；(2)烷基亚磺酰基；(3)氨基；(4)芳基烷氧基；(5)(芳基烷基)氮杂；(6)叠氮基；(7)卤代；(8)(杂环基)氧基；(9)(杂环基)氮杂；(10)羟基；(11)硝基；(12)氧代；(13)芳氧基；(14)二价硫(sulfide)；(15)硫代烷氧基；(16)硫醇；(17)烷酰基；(18)-CO2RA，其中RA选自(a)烷基、(b)芳基、(c)氢和(d)芳基烷基；(19)-C(O)NRBRC，其中RB和RC各自独立地选自(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基亚烷基；(20)-SO2RD，其中RD选自(a)烷基、(b)芳基和(c)芳基亚烷基；(21)-SO2NRERF，其中RE和RF各自独立地选自(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基；(22)甲硅烷基；(23)氰基；和(24)-S(O)RH，其中RH选自(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基。在一些实施方案中，这些基团各自可进一步如本文中所描述被取代(例如，被未取代的取代基取代)。
如本文中所使用的术语“烷基氨基”是指基团-N(RN1)2，其中各RN1独立地为H或烷基，条件是至少一个RN1是烷基。烷基氨基可任选被取代；在任选取代的烷基氨基中的各烷基如针对烷基所描述独立地且任选地被取代。
如本文中所使用的术语“亚烷基”是指通过去除两个氢原子而衍生自直链或支链饱和烃的饱和的二价烃基团。本文中定义的亚烷基的化合价不包括任选的取代基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基、乙烷-1，2-二基、乙烷-1，1-二基、丙烷-1，3-二基、丙烷-1，2-二基、丙烷-1，1-二基、丙烷-2，2-二基、丁烷-1，4-二基、丁烷-1，3-二基、丁烷-1，2-二基、丁烷-1，1-二基以及丁烷-2，2-二基、丁烷-2，3-二基。术语“Cx-y亚烷基”代表具有x至y个碳的亚烷基。x的示例性值是1、2、3、4、5和6，并且y的示例性值是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施方案中，亚烷基可以进一步被如本文中针对烷基所定义的1、2、3或4个取代基取代。在一些实施方案中，亚烷基可进一步被如本文中针对烷基定义的1、2、3或4个取代基取代。类似地，后缀“ene”指代如本文中所定义的相应一价基团的二价基团。例如，亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳基烷基、亚环烷基、亚环烷基烷基、亚环烯基、亚杂芳基、亚杂芳基烷基、亚杂环基、以及亚杂环基烷基是烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基以及杂环基烷基的二价形式。对于亚芳基烷基、亚环烷基烷基、亚杂芳基烷基以及亚杂环基烷基，该基团中的两个化合价可以仅位于无环部分中，或一个位于环状部分中、一个位于无环部分中。例如，芳基-C1-亚烷基或杂环基-C1-亚烷基的亚烷基可进一步被氧代基团代替，以得到对应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文中所使用的术语“亚烷氧基”是指二价基团-R-O-，其中R是亚烷基。亚烷氧基中的亚烷基可如针对烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的亚烷氧基)。
如本文中所使用的术语“炔基”代表具有2至16个碳原子的含有至少一个碳-碳三键的一价直链或支链烃基团，并且实例有乙炔基、1-丙炔基等。炔基可任选地被独立地选自以下的1、2、3或4个取代基取代：如本文中所描述的芳基、烯基、环烷基和杂环基(例如，杂芳基)以及针对烷基描述的取代基。
如本文中所使用的术语“亚炔基”是指包括一个或两个碳-碳三键且在未取代时仅含有C和H的直链或支链二价取代基。除非另外说明，否则未取代的亚炔基含有2至16个碳原子。本文中定义的亚炔基的化合价不包括任选的取代基。亚烯基的非限制性实例包括乙炔-1，2-二基；丙-1-炔-1，3-二基；丙-2-炔-1，1-二基；丁-1-炔-1，3-二基；丁-1-炔-1，4-二基；丁-2-炔-1，1-二基；丁-2-炔-1，4-二基；丁-3-炔-1，1-二基；丁-3-炔-1，2-二基；丁-3-炔-2，2-二基；和丁-1，3-二炔-1，4-二基。如针对炔基所描述，亚炔基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的亚炔基)。
如本文中所使用的术语“氨基”代表-N(RN1)2，其中若氨基是未取代的，则RN1均为H；或者，若氨基是取代的，则各RN1独立地为H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基，条件是至少一个RN1不是H，并且其中各RN2独立地为H、烷基或芳基。各取代基可本身是未取代的或被本文中针对各相应基团定义的未取代的取代基取代。在一些实施方案中，氨基是未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(例如，-NHRN1)，其中RN1独立地为-OH、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、任选取代的烷基或任选取代的芳基，并且各RN2可以是任选取代的烷基或任选取代的芳基。在一些实施方案中，取代的氨基可为烷基氨基，其中烷基为如本文中针对烷基所描述任选被取代。在某些实施方案中，氨基是-NHRN1，其中RN1为任选取代的烷基。-NHRN1(其中RN1为任选取代的烷基)的非限制性实例包括：任选取代的烷基氨基、蛋白原氨基酸、非蛋白原氨基酸、蛋白原氨基酸的C1-6烷基酯以及非蛋白原氨基酸的C1-6烷基酯。
如本文中所使用的术语“氨基烷基”代表式-R’-R”的化学取代基，其中R’是亚烷基，且R”是氨基。氨基烷基可如针对两个部分各自所定义任选被取代。
如本文中所使用的术语“芳烃-四基”代表通过将芳基中的三个氢原子替换为化合价而形成的四价基团。芳烃-四基可如针对芳基所描述任选被取代。
如本文中所使用的术语“芳基”代表具有一个或两个芳环的单环、双环或多环碳环体系，并且实例有：苯基、萘基、1，2-二氢萘基、1，2，3，4-四氢萘基、芴基、茚满基、茚基等，并且可任选被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的取代基取代：(1)烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基等)；(2)烷基(例如，烷氧基烷基、烷基亚磺酰基烷基、氨基烷基、叠氮基烷基、酰基烷基、卤代烷基(例如，全氟烷基)、羟基烷基、硝基烷基或硫代烷氧基烷基)；(3)烯基；(4)炔基；(5)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(6)烷基亚磺酰基；(7)芳基；(8)氨基；(9)芳基烷基；(10)叠氮基；(11)环烷基；(12)环烷基烷基；(13)环烯基；(14)环烯基烷基；(15)卤代；(16)杂环基(例如，杂芳基)；(17)(杂环基)氧基；(18)(杂环基)氮杂；(19)羟基；(20)硝基；(21)硫代烷氧基；(22)-(CH2)qCO2RA，其中q是0至4的整数，并且RA选自：(a)烷基、(b)芳基、(c)氢和(d)芳基烷基；(23)-(CH2)qCONRBRC，其中q是0至4的整数并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基；(24)-(CH2)qSO2RD，其中q是0至4的整数并且其中RD选自：(a)烷基、(b)芳基和(c)芳基烷基；(25)-(CH2)qSO2NRERF，其中q是0至4的整数并且其中RE和RF各自独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基；(26)巯基；(27)芳氧基；(28)环烷氧基；(29)芳基烷氧基；(30)杂环基烷基(例如，杂芳基烷基)；(31)甲硅烷基；(32)氰基；和(33)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基。在一些实施方案中，这些基团各自可进一步如本文中所描述被取代(例如，被未取代的取代基取代)。
如本文中所使用的术语“芳基烷基”代表被芳基取代的烷基。所述芳基部分和烷基部分各自可独立地如针对单独基团所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的芳基烷基)。
如本文中所使用的术语“辅助部分”是指可与本文中公开的多核苷酸构建体共轭的部分，其为靶向部分(例如，细胞表面受体配体)、肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物或内体逃逸部分。虽然特定辅助部分的名称可能暗示游离分子，但是将理解特定辅助部分的名称包括一价基团。本领域技术人员将容易地理解特定辅助部分与多核苷酸构建体的适当连接点。
如本文中所使用的术语“氮杂”代表二价-N(RN1)-基团或三价-N＝基团。氮杂基团可以是未取代的，其中RN1是H或不存在；或取代的，其中RN1如针对“氨基”所定义。氮杂也可被称为“N”，例如，“任选取代的N”。两个氮杂基团可连接以形成“二氮杂”。
如本文中所使用的术语“叠氮基”代表N3基团。
如本文中所使用的术语“碳环”代表任选取代的C3-12单环、双环或三环结构，其中所述环(可以是芳族或非芳族的)由碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基和芳基。
如本文中所使用的术语“碳水化合物”代表具有1至7个碳原子的单糖(其可为直链、支链或环状的)，有氧、氮、卤素或硫原子与各碳原子键合。碳水化合物的非限制性实例包括甘露糖、半乳糖、半乳糖胺和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
如本文中所使用的术语“羰基”代表C(O)基团。含有“羰基”的官能团的实例包括酯、酮、醛、酸酐、乙酰氯、酰胺、羧酸和羧酸酯。
如本文中所使用的关于多核苷酸的术语“互补”意指沃森-克里克互补(Watson-Crick complementary)。
如本文中所使用的术语“环加成反应”代表两种组分的反应，其中当不存在活化、通过化学催化剂活化或者使用热能活化时，[4n+2]π电子参与键形成，并且n是1、2或3。环加成反应还是两种组分的反应，其中涉及[4n]π电子，存在光化学活化并且n是1、2或3。合意地，[4n+2]π电子参与键形成，并且n＝1。代表性环加成反应包括烯烃与1，3-二烯的反应(狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应)、烯烃与α，β-不饱和羰基的反应(杂狄尔斯-阿尔德反应)以及炔烃与叠氮化合物的反应(例如，胡伊斯根(Hüisgen)环加成)。
如本文中所使用的术语“环烷烃-四基”代表通过将环烷基中的三个氢原子替换为化合价而形成的四价基团。环烷烃-四基可如针对环烷基所描述任选被取代。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“环烯基”是指具有3至10个碳的非芳族碳环基团(例如，C3-C10亚环烷基)。环烯基的非限制性实例包括环丙-1-烯基、环丙-2-烯基、环丁-1-烯基、环丁-1-烯基、环丁-2-烯基、环戊-1-烯基、环戊-2-烯基、环戊-3-烯基、降冰片烯-1-基、降冰片烯-2-基、降冰片烯-5-基以及降冰片烯-7-基。环烯基可如针对环烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的环烯基)。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“亚环烯基”是指具有3至10个碳的二价碳环非芳族基团(例如，C3-C10亚环烯基)。亚环烯基的非限制性实例包括：环丙-1-烯-1，2-二基；环丙-2-烯-1，1-二基；环丙-2-烯-1，2-二基；环丁-1-烯-1，2-二基；环丁-1-烯-1，3-二基；环丁-1-烯-1，4-二基；环丁-2-烯-1，1-二基；环丁-2-烯-1，4-二基；环戊-1-烯-1，2-二基；环戊-1-烯-1，3-二基；环戊-1-烯-1，4-二基；环戊-1-烯-1，5-二基；环戊-2-烯-1，1-二基；环戊-2-烯-1，4-二基；环戊-2-烯-1，5-二基；环戊-3-烯-1，1-二基；环戊-1，3-二烯-1，2-二基；环戊-1，3-二烯-1，3-二基；环戊-1，3-二烯-1，4-二基；环戊-1，3-二烯-1，5-二基；环戊-1，3-二烯-5，5-二基；降冰片二烯-1，2-二基；降冰片二烯-1，3-二基；降冰片二烯-1，4-二基；降冰片二烯-1，7-二基；降冰片二烯-2，3-二基；降冰片二烯-2，5-二基；降冰片二烯-2，6-二基；降冰片二烯-2，7-二基；和降冰片二烯-7，7-二基。亚环烯基可如针对环烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的亚环烯基)。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“环烷基”是指具有3至10个碳的环状烷基(例如，C3-C10环烷基)。环烷基可以是单环的或双环的。双环环烷基可为双环[p.q.0]烷基类型的，其中p和q各自独立地是1、2、3、4、5、6或7，条件是p和q的总和为2、3、4、5、6、7或8。或者，双环环烷基可包括桥联的环烷基结构，例如，双环[p.q.r]烷基，其中r是1、2或3，p和q各自独立地是1、2、3、4、5或6，条件是p、q以及r的总和为3、4、5、6、7或8。环烷基可以是螺环基团，例如螺[p.q]烷基，其中p和q各自独立地是2、3、4、5、6或7，条件是p和q的总和是4、5、6、7、8或9。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-双环[2.2.1.]庚基、2-双环[2.2.1.]庚基、5-双环[2.2.1.]庚基、7-双环[2.2.1.]庚基以及十氢萘基。环烷基可如本文中所定义是未取代的或取代的(例如，任选取代的环烷基)。本公开的环烷基可任选被以下取代基取代：(1)烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基等)；(2)烷基(例如，烷氧基烷基、烷基亚磺酰基烷基、氨基烷基、叠氮基烷基、酰基烷基、卤代烷基(例如，全氟烷基)、羟基烷基、硝基烷基或硫代烷氧基烷基)；(3)烯基；(4)炔基；(5)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(6)烷基亚磺酰基；(7)芳基；(8)氨基；(9)芳基烷基；(10)叠氮基；(11)环烷基；(12)环烷基烷基；(13)环烯基；(14)环烯基烷基；(15)卤代；(16)杂环基(例如，杂芳基)；(17)(杂环基)氧基；(18)(杂环基)氮杂；(19)羟基；(20)硝基；(21)硫代烷氧基；(22)-(CH2)qCO2RA，其中q是0至4的整数并且RA选自：(a)烷基、(b)芳基、(c)氢和(d)芳基烷基；(23)-(CH2)qCONRBRC，其中q是0至4的整数并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基；(24)-(CH2)qSO2RD，其中q是0至4的整数并且其中RD选自：(a)烷基、(b)芳基和(c)芳基烷基；(25)-(CH2)qSO2NRERF，其中q是0至4的整数并且其中RE和RF各自独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基；(26)巯基；(27)芳氧基；(28)环烷氧基；(29)芳基烷氧基；(30)杂环基烷基(例如，杂芳基烷基)；(31)甲硅烷基；(32)氰基；和(33)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基烷基。在一些实施方案中，这些基团各自可进一步如本文中所描述被取代(例如，被未取代的取代基取代)。
如本文中所使用的术语“亚环烷基”是指如本文中所定义的为环烷基的二价基团，其中将一个氢原子替换为化合价。亚环烷基可如针对环烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的亚环烷基)。
如本文中所使用的术语“环烷基烷基”代表被环烷基取代的烷基。所述环烷基部分和烷基部分各自可独立地如针对单独基团所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的环烷基烷基)。
如本文中所使用的术语“二烷基氨基”代表基团-N(RN1)2，其中各RN1独立地为烷基。二烷基氨基可任选被取代；在任选取代的二烷基氨基中的各烷基如针对烷基所描述独立地且任选地被取代。
如本文中所使用的术语“亲电试剂”或“亲电基团”代表被吸引至富电子中心并且能够接受来自一个或更多个亲核试剂的电子对以便形成一个或更多个共价键的官能团。亲电试剂包括但不限于：阳离子；极化中性分子；叠氮化物；活化的硅中心；活化的羰基；烷基卤；烷基拟卤化物；环氧化物；缺电子芳基；活化的磷中心；以及活化的硫中心。通常遇到的亲电试剂包括极化中性分子，例如烷基卤；酰基卤；含羰基化合物，例如醛；以及与良好离去基团例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和甲苯磺酸酯连接的原子。
如本文中所使用的术语“内体逃逸部分”代表，与仅有的区别在于其缺少内体逃逸部分的参照分子相比较，增强内体内容物的释放，或者促进分子从内部细胞区室(例如，内体)逃逸的部分。
如本文中所使用的术语“卤代”代表选自溴、氯、碘和氟的卤素。
如本文中所使用的术语“卤代烷基”代表被卤素基团(即，F、Cl、Br或I)取代的如本文中所定义的烷基。卤代烷基可被一个、两个、三个或(在具有两个碳或更多个碳的烷基的情况下)四个卤素取代，或者当卤素基团是F时，卤代烷基可以是全氟烷基。在一些实施方案中，卤代烷基可进一步任选地被如本文中针对烷基所描述的1、2、3或4个取代基取代。
如本文中所使用的术语“杂烷烃-四基”是指被一个杂原子中断一次、两次(每次独立地被一个杂原子中断)、三次(每次独立地被一个杂原子中断)或四次(每次独立地被一个杂原子中断)的烷烃-四基。各杂原子独立地为O、N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。未取代的CX-Y杂烷烃-四基含有X至Y个碳原子以及如本文中所定义的杂原子。杂烷烃-四基可如针对杂烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷烃-四基)。
如本文中所使用的术语“杂烷烃-三基”是指被一个杂原子中断一次、两次(每次独立地被一个杂原子中断)、三次(每次独立地被一个杂原子中断)、或四次(每次独立地被一个杂原子中断)的烷烃-三基。各杂原子独立地为O、N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。未取代的CX-Y杂烷烃-三基含有X至Y个碳原子以及如本文中所定义的杂原子。杂烷烃-三基可如针对杂烷基所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷烃-三基)。
如本文中所使用的术语“杂烷基”是指被一个杂原子中断一次、两次(每次独立地被一个杂原子中断)、三次(每次独立地被一个杂原子中断)或四次(每次独立地被一个杂原子中断)的烷基、烯基或炔基。各杂原子独立地为O、N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。未取代的CX-Y杂烷基含有X至Y个碳原子以及如本文中所定义的杂原子。杂烷基可为未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷基)。当杂烷基被取代且取代基与杂原子键合时，所述取代基根据该杂原子的性质和化合价来选择。因此，与杂原子键合的取代基(若存在)在化合价允许的情况下，选自＝O、-N(RN2)2、-SO2ORN3、-SO2RN2、-SORN3、-COORN3、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基或氰基，其中各RN2独立地为H、烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基，且各RN3独立地为烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基。这些取代基各自可本身为未取代的或被本文中针对各相应基团定义的未取代的取代基取代。当杂环基被取代且取代基与碳键合时，所述取代基选自针对烷基描述的那些，条件是与杂原子键合的碳原子上的取代基不是Cl、Br或I。应理解碳原子出现在杂烷基的末端。
如本文中所使用的术语“杂芳基”代表如本文中所定义的杂环基的子集，其包括含有至少一个杂原子的芳环体系。因此，杂芳基在单环体系或多环体系内含有4n+2个π电子。杂芳基可为未取代的或被1、2、3或4个如针对杂环基所定义的取代基取代(例如，任选取代的杂芳基)。
如本文中所使用的术语“杂芳基烷基”代表被杂芳基取代的烷基。因此，杂芳基烷基是杂环基烷基，其中所述杂环基包括至少一个包括杂原子的芳环体系。所述杂芳基部分和烷基部分各自可独立地如针对单独基团所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的杂芳基烷基)。
如本文中所使用的术语“杂环-四基”代表通过将杂环基中的三个氢原子替换为化合价而形成的四价基团。杂环-四基可如针对杂环基所描述任选被取代。
除非另外说明，否则如本文中所使用的术语“杂环基”代表5-、6-或7元环或两个、三个或四个环(其各自独立地为5-、6-或7元环)的稠环体系，条件是所述环中的至少一个含有独立地选自氮、氧和硫的一个、两个、三个或四个杂原子。5元环具有0至2个双键，并且6-和7元环具有0至3个双键。除非另外说明，否则未取代的杂环基含有1至12个碳原子。在一些实施方案中，未取代的杂环基含有至少两个碳原子。在某些实施方案中，未取代的杂环基含有至多9个碳原子。稠合“杂环基”为桥联的多环结构，其中一个或更多个碳和/或杂原子桥联单环的两个非相邻成员，例如，如在奎宁环基中所见的。在一些实施方案中，稠合“杂环基”包括双环基团、三环基团和四环基团，其中所述环中的至少一个包括一个或更多个如本文中所定义的杂原子，并且剩余的环是碳环，例如芳环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环。此类稠合杂环基的非限制性实例包括吲哚基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、莨菪烷和1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪。杂环基的非限制性实例包括吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、吡嗪基、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑烷基、异噻唑基、异吲唑基、三唑基、四唑基、噁二唑基、嘌呤基、噻二唑基(例如，1，3，4-噻二唑)、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等。还有其它示例性杂环基为：2，3，4，5-四氢-2-氧代-噁唑基；2，3-二氢-2-氧代-1H-咪唑基；2，3，4，5-四氢-5-氧代-1H-吡唑基(例如，2，3，4，5-四氢-2-苯基-5-氧代-1H-吡唑基)；2，3，4，5-四氢-2，4-二氧代-1H-咪唑基(例如，2，3，4，5-四氢-2，4-二氧代-5-甲基-5-苯基-1H-咪唑基)；2，3-二氢-2-硫代-1，3，4-噁二唑基(例如，2，3-二氢-2-硫代-5-苯基-1，3，4-噁二唑基)；4，5-二氢-5-氧代-1H-三唑基(例如，4，5-二氢-3-甲基-4-氨基5-氧代-1H-三唑基)；1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代吡啶基(例如，1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代-3，3-二乙基吡啶基)；2，6-二氧代-哌啶基(例如，2，6-二氧代-3-乙基-3-苯基哌啶基)；1，6-二氢-6-氧代嘧啶基；1，6-二氢-4-氧代嘧啶基(例如，2-(甲硫基)-1，6-二氢-4-氧代-5-甲基嘧啶-1-基)；1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代嘧啶基(例如，1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代-3-乙基嘧啶基)；1，6-二氢-6-氧代-哒嗪基(例如，1，6-二氢-6-氧代-3-乙基哒嗪基)；1，6-二氢-6-氧代-1，2，4-三嗪基(例如，1，6-二氢-5-异丙基-6-氧代-1，2，4-三嗪基)；2，3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基(例如，3，3-二甲基-2，3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基和2，3-二氢-2-氧代-3，3’-螺环丙烷-1H-吲哚-1-基)；1，3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚基；1，3-二氢-1，3-二氧代-2H-异吲哚基；1H-苯并吡唑基(例如，1-(乙氧基羰基)-1H-苯并吡唑基)；2，3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基(例如，3-乙基-2，3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基)；2，3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基(例如，5-氯-2，3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基)；2，3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基；2-氧代-2H-苯并吡喃基；1，4-苯并二噁烷基；1，3-苯并二噁烷基；2，3-二氢-3-氧代，4H-1，3-苯并噻嗪基；3，4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基(例如，2-甲基-3，4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基)；1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代-3H-喹唑啉基(例如，1-乙基-1，2，3，4-四氢-2，4-二氧代-3H-喹唑啉基)；1，2，3，6-四氢-2，6-二氧代-7H-嘌呤基(例如，1，2，3，6-四氢-1，3-二甲基-2，6-二氧代-7H-嘌呤基)；1，2，3，6-四氢-2，6-二氧代-1H-嘌呤基(例如，1，2，3，6-四氢-3，7-二甲基-2，6-二氧代-1H-嘌呤基)；2-氧代苯并[c，d]吲哚基；1，1-二氧代-2H-萘并[1，8-c，d]异噻唑基；以及1，8-亚萘基二甲酰胺基。杂环基团还包括下式的基团：
其中
F′选自-CH2-、-CH2O-和-O-，并且G′选自-C(O)-和-(C(R’)(R”))v-，其中R’和R”各自独立地选自：氢或具有1至4个碳原子的烷基，并且v为1至3，并包括诸如1，3-苯并间二氧杂环戊烯基、1，4-苯并二噁烷基等的基团。本文中提及的任何杂环基可任选被独立地选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：(1)烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基等)；(2)烷基(例如，烷氧基亚烷基、烷基亚磺酰基亚烷基、氨基亚烷基、叠氮基亚烷基、酰基亚烷基、卤代亚烷基(例如全氟烷基)、羟基亚烷基、硝基亚烷基或硫代烷氧基亚烷基)；(3)烯基；(4)炔基；(5)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(6)烷基亚磺酰基；(7)芳基；(8)氨基；(9)芳基-亚烷基；(10)叠氮基；(11)环烷基；(12)环烷基-亚烷基；(13)环烯基；(14)环烯基-亚烷基；(15)卤代；(16)杂环基(例如，杂芳基)；(17)(杂环基)氧基；(18)(杂环基)氮杂；(19)羟基；(20)氧代；(21)硝基；(22)硫化物；(23)硫代烷氧基；(24)-(CH2)qCO2RA，其中q是0至4的整数，且RA选自：(a)烷基、(b)芳基、(c)氢和(d)芳基-亚烷基；(25)-(CH2)qCONRBRC，其中q是0至4的整数并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基-亚烷基；(26)-(CH2)qSO2RD，其中q是0至4的整数并且其中RD选自：(a)烷基、(b)芳基和(c)芳基-亚烷基；(27)-(CH2)qSO2NRERF，其中q是0至4的整数并且其中RE和RF各自独立地选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基-亚烷基；(28)巯基；(29)芳氧基；(30)环烷氧基；(31)芳基烷氧基；(31)杂环基-亚烷基(例如，杂芳基-亚烷基)；(32)甲硅烷基；(33)氰基；和(34)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢、(b)烷基、(c)芳基和(d)芳基-亚烷基。在一些实施方案中，这些基团各自可独立地如本文中针对各列举基团所描述为未取代的或被未取代的取代基取代。例如，芳基-C1-亚烷基或杂环基-C1-亚烷基的亚烷基可进一步被氧代基团代替，以得到对应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文中所使用的术语“杂环基烷基”代表被杂环基取代的烷基。所述杂环基部分和烷基部分各自可独立地如针对单独基团所描述为未取代的或取代的(例如，任选取代的杂环基烷基)。
如本文中可互换使用的术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”代表-OH基团。
如本文中所使用的术语“核苷间脱碱基间隔子”代表缺少核碱基并由此缺少参与碱基配对相互作用的能力的二价基团。
如本文中所使用的术语“中断”是指对链的结构修饰，其中将一个或更多个核苷替换为核苷间脱碱基间隔子，条件是所替换的核苷既不是链中的第一核苷，也不是链中的最末核苷，并且条件是核苷间脱碱基间隔子中的糖类似物的数目与所替换的核苷的数目相同。如本文中所使用的术语“LNA”是指锁核酸，其是本领域中已知的。参见例如WO 1999/014226。
如本文中所使用的术语“可加载到RISC复合体中”是指将引导链加载到RISC复合体中的能力和与引导链杂交的过客链的RISC介导的降解。例如，该多核苷酸包括未取代的或生物可逆地被取代的磷酸酯基团，其在包括天然RISC介导的切割位点的三个连续核苷酸之间。某些可加载到RISC复合体中的引导链包括与5’-末端或核苷间磷酸酯或硫代磷酸酯(其是未取代的或生物可逆地被取代)键合的5’-末端核苷。优选的天然RISC介导的切割位点位于与引导链的第十和第十一核苷酸互补的两个核苷之间的过客链上。
如本文中所使用的术语“多价连接子”代表包括两个或更多个化合价(例如，两个至七个化合价或两个至四个化合价)的连接基团。
如本文中所使用的术语“硝基”代表-NO2基团。
如本文中所使用的术语“非生物可逆性连接子”是指并非生物可逆的并因此不包括二硫化物或硫酯的多价部分。因此，与第二基团非生物可逆地连接的第一基团通过非生物可逆性连接子连接。
“非蛋白原氨基酸”是非天然地产生或发现于哺乳动物的氨基酸。非蛋白原氨基酸是本领域中已知的。非蛋白原氨基酸是市售可得的，例如，来自Merck KGaA，Darmstadt，Germany。
如本文中所使用的术语“核碱基”代表在核苷酸或核苷的糖部分的1’位置处发现的含氮杂环。核碱基可以是未修饰的或修饰的。如本文中所使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基以及其它8位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代、特别是5-溴、5-三氟甲基以及其它5位取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些；在The Concise Encyclopedia of Polymer Science andEngineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编著，John Wiley&Sons，1990中公开的那些；由Englisch等人，Angewandte Chemie，国际版，1991，30，613中公开的那些；以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，(Crooke等人编著，CRC Press，1993)公开的那些。某些核碱基特别可用于提高本发明的聚合物化合物(包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)的结合亲和力。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃。(Sanghvi等人编著，Antisense Research and Applications 1993，CRC Press，Boca Raton，第276-278页)。在特别的实施方案中，这些可与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合。教导这些修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基中的某些的制备的美国专利包括但不限于，上述美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；以及5,681,941。出于本公开的目的，如本文中所使用的“修饰的核碱基”进一步代表天然或非天然的核碱基，其包括如本文中所描述的一个或更多个保护基团。
如本文中所使用的术语“亲核试剂”代表通过从电子对或π键供电子而参与共价键的形成的任选取代的官能团。亲核试剂可选自烯烃、炔烃、芳基、杂芳基、二氮杂基团、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、烷基氨基、苯胺基、硫代基团以及硫代苯氧基。
如本文中所使用的术语“核苷”代表糖-核碱基组合。糖是在异头碳处含有核碱基的修饰的糖，或在异头碳处含有核碱基并在3位和5位各处含有与另一基团连接的键的任选修饰的3，5-二脱氧戊呋喃糖。戊呋喃糖可以是3，5-二脱氧核糖或2，3，5-三脱氧核糖或其2位修饰形式，其中2位被OR、R、卤代(例如，F)、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN取代，其中R是任选取代的C1-6烷基(例如，(C1-6烷氧基)-C1-6-烷基)或任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基。所述修饰的糖是非核糖的糖，例如甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4-硫代核糖以及其它糖、杂环或碳环。在一些实施方案中，术语“核苷”是指具有以下结构的二价基团：
其中B1是核碱基；Y是H、卤素(例如，F)、羟基、任选取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基或甲氧基乙氧基)或受保护的羟基；Y1是H或C1-6烷基(例如，甲基)并且3′和5′各自表示与另一基团连接的键的位置。核苷还包括锁核酸(LNA)、甘油核酸、吗啉代核酸以及苏糖核酸。
如本文中所使用的术语“核苷酸”是指进一步包括磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯或核苷间非生物可逆性基团的核苷。在某些核苷酸(例如，基于任选修饰的3，5-二脱氧戊呋喃糖的那些)中，磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯或核苷间非生物可逆性基团与核苷的3位或5位键合。
如本文中可互换使用的术语“氧杂”和“氧基”代表与两个基团连接的二价氧原子(例如，氧基的结构可显示为-O-)。
如本文中所使用的术语“氧代”代表与一个基团连接的二价氧原子(例如，氧代的结构可显示为＝O)。
如本文中所使用的术语“膦酸酯”是指具有结构-O-P(＝O)(-A)-O-B的一价或二价基团或其盐，其中A是烷基或芳基，并且若膦酸酯是二价的，则B是化合价，或者，若膦酸酯是一价的，则B是H。
如本文中所使用的术语“磷酰胺酯”是指具有结构-O-P(＝X)(-A)-O-B的一价或二价基团或其盐，其中A是氨基，X是O或S，并且若磷酰胺酯是二价的，则B是化合价，或者，若磷酰胺酯是一价的，则B是H。
如本文中所使用的术语“磷酸三酯”是指磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中所有三个化合价均被取代。
如本文中所使用的术语“肽”代表通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基。此外，出于本公开的目的，术语“肽”和术语“蛋白”在所有情况下在本文中可互换使用。多种肽可在本文中提供的方法和组合物的范围内使用。合成制备的肽可包括本领域中已知的非由DNA天然编码的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)的取代。
如本文中所使用的术语“光解活化”或“光解”代表通过用光照射反应物促进或引发化学反应。适合于光解活化的光的波长在200-500nm之间的范围内，并且包括200-260nm和300-460nm范围内的波长。其它有用的范围包括200-230nm、200-250nm、200-275nm、200-300nm、200-330nm、200-350nm、200-375nm、200-400nm、200-430nm、200-450nm、200-475nm、300-330nm、300-350nm、300-375nm、300-400nm、300-430nm、300-450nm、300-475nm以及300-500nm。
如本文中所使用的术语“保护基团”代表旨在保护官能团(例如，羟基、氨基或羰基)免于参与化学合成(例如，多核苷酸合成)过程中的一种或更多种不希望的反应的基团。如本文中所使用的术语“O-保护基团”代表旨在保护含氧(例如，苯酚、羟基或羰基)基团免于参与化学合成过程中的一种或更多种不希望的反应的基团。如本文中所使用的术语“N-保护基团”代表旨在保护含氮(例如，氨基或肼)基团免于参与化学合成过程中的一种或更多种不希望的反应的基团。通常使用的O-保护基团和N-保护基团在Greene，“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”，第3版(John Wiley&Sons，New York，1999)中公开，该文献通过引用并入本文中。示例性O-保护基团和N-保护基团包括烷酰基、芳酰基或氨基甲酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻-硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三-异丙基甲硅烷基氧基甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、异丁酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、二甲基亚胺甲基氨基以及4-硝基苯甲酰基。可用于保护核碱基中的胺的N-保护基团包括苯氧基乙酰基和(4-异丙基)苯氧基乙酰基。
如本文中所使用的术语“吡啶-2-基腙”代表具有以下结构的基团：
其中各R’独立地为H或任选取代的C1-6烷基。吡啶-2-基腙可为未取代的(即，各R’是H)。
用于保护含羰基的基团的示例性O-保护基团包括但不限于：缩醛、缩羰基酯、1，3-二噻烷、1，3-二噁烷、1，3-二氧戊环以及1，3-二硫戊环。
其它O-保护基团包括但不限于：取代的烷基、芳基和芳基-亚烷基醚(例如，三苯甲基；甲硫基甲基；甲氧基甲基；苄氧基甲基；甲硅烷氧基甲基；2，2，2，-三氯乙氧基甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧基乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁醚；对-氯苯基、对-甲氧基苯基、对-硝基苯基、苄基、对-甲氧基苄基以及硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基；二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；以及二苯基甲基甲硅烷基)；碳酸酯(例如，甲基、甲氧基甲基、9-芴基甲基；乙基；2，2，2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基、烯丙基、硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3，4-二甲氧基苄基；以及硝基苄基)。
其它N-保护基团包括但不限于，手性助剂，例如保护的或未保护的D、L或D，L-氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含磺酰基的基团，例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，例如苄氧羰基、对-氯苄氧羰基、对-甲氧基苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基、2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2，-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；芳基-亚烷基，例如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；以及甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。有用的N-保护基团是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁氧基羰基(Boc)以及苄氧基羰基(Cbz)。
如本文中所使用的术语“立体化学富集的”是指对于所列举基团的一种对映异构体的局部立体化学优选于同一基团的相对的对映异构体。因此，含有立体化学富集的硫代磷酸酯的链是以下链：其中，预定立体化学的硫代磷酸酯优选于与预定立体化学相对的立体化学的硫代磷酸酯而存在。该优选可使用预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比例用数字表达。该预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比例是具有预定立体化学的确定的硫代磷酸酯的非对映异构体相对于具有与预定立体化学相对的立体化学的确定的硫代磷酸酯的非对映异构体的摩尔比。预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比例可大于或等于1.1(例如，大于或等于4、大于或等于9、大于或等于19或大于或等于39)。
如本文中所使用的术语“链”代表含有11个或更多个通过磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯、核苷间脱碱基间隔子和/或核苷间非生物可逆性基团及其组合共价结合在一起的连续核苷的结构，条件是两个连续核苷通过选自磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯、核苷间脱碱基间隔子以及核苷间非生物可逆性基团的一个且仅一个基团连接。链包括5’-末端和3’-末端。本文中公开的在链中的核苷从该链的5’-末端开始编号。当将核苷替换为糖类似物作为核苷间脱碱基间隔子的一部分时，编号的核苷是指替换此编号的核苷的糖类似物。链可任选在5’-末端和/或3’-末端用磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、二(硫代磷酸酯)、三(硫代磷酸酯)、二硫代磷酸酯、二(二硫代磷酸酯)(disphorodithioate)、三(二硫代磷酸酯)、膦酸酯、磷酰胺酯或式(I)的基团封端。链含有0至4个核苷间脱碱基间隔子。通常，链可含有一个或更多个在六个末端核苷的序列内的选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯和核苷间非生物可逆性基团的核苷间基团。链可包括11至100个(例如，19至50个或19至32个)核苷。
如本文中所使用的术语“受试者”代表人或非人动物(例如，哺乳动物)。
如本文中所使用的术语“糖类似物”代表为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如，甘油)的二价基团或三价基团，其经修饰以用连接与式(III)中的基团-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子的键来替换羟基。糖类似物不含能够参与氢与互补链中的核碱基键合的核碱基。糖类似物是环状或无环的。包括在糖类似物中的其它任选的修饰为：用H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p、共轭部分、-(CH2)t1-ORZ(其中t1是1至6的整数，且RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基)替换剩余的羟基中的一个、两个或三个或与碳键合的氢原子；引入一个或两个不饱和基(例如，一个或两个双键)；以及用如针对烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义的取代基替换一个、两个或三个氢或羟基。糖类似物的非限制性实例为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷烃-1，3-二基、任选取代的C5环烯烃-1，3-二基、任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基、任选取代的四氢呋喃-2，5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。
如本文中所使用的术语“二价硫(sulfide)”代表二价-S-或＝S基团。
如本文中所使用的术语“靶向部分”代表与受体或其它接受性部分特异性地结合或反应性地缔合或复合的部分(例如小分子，例如碳水化合物)，所述受体或其它接受性部分与给定靶细胞群体结合。本发明的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体含有一个或更多个配体(例如，1至6个配体、1至3个配体或1个配体)。该配体可为抗体或抗原结合片段或其工程化衍生物(例如，Fcab或融合蛋白(例如，scFv))。或者，所述配体为小分子(例如，N-乙酰半乳糖胺、甘露糖或叶酸)。包括一个或更多个配体的本发明的杂交的多核苷酸构建体可表现出对该配体结合的靶小于100nM的Kd。使用本领域中已知的方法来测量Kd，例如使用表面等离子体共振(SPR)，例如使用BiacoreTM系统(GE Healthcare，Little Chalfont，the United Kingdom)。
如本文中所使用的术语“末端核苷”是指位于六个连续核苷内的核苷，包括含有一个且仅一个将其与另一核苷通过磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺酯、核苷间脱碱基间隔子或核苷间非生物可逆性基团连接的键的一个核苷。
如本文中所使用的术语“治疗有效剂量”代表根据本发明的siRNA或多核苷酸的用于改善、治疗疾病或病症或至少部分地阻止疾病或病症的症状(例如，抑制细胞增殖)所需的量。对于这种用途有效的量当然将取决于疾病的严重程度以及受试者的体重和总体状态。通常，在体外使用的剂量可提供可用于体内给予药物组合物的量的有用指导，并且动物模型可用于确定用于治疗特定病症的有效剂量。
如本文中所使用的术语“硫代羰基”代表C(＝S)基团。含有“硫代羰基”的官能团的非限制性实例包括硫酯、硫酮、硫醛、硫代酸酐、硫代酰基氯化物、硫代酰胺、硫代羧酸以及硫代羧酸酯。
如本文中所使用的术语“亚硫代杂环基”代表二价基团-S-R’-，其中R’是如本文中所定义的亚杂环基。
如本文中所使用的术语“巯基”代表-SH基团。
如本文中所使用的术语“病症”旨在总体上是与术语“疾病”、“综合征”以及“病状”(如在医学病状中)同义的并且可与其互换使用，因为它们都反映由受试者或其一部分呈现的损伤正常功能且通常表现为有区别的病征和症状的异常状况。
如关于受试者的病症所使用的术语“治疗”旨在是指通过向所述受试者给予治疗剂(例如，本发明的核苷酸构建体)来减少该病症的至少一种症状。
附图简述
图1是显示在以单次0.7mg/kg皮下给予小鼠测试组合物6天之后测量的小鼠中的mTTR血清水平的图。数据归一化至在皮下给予盐水之后观察到的mTTR血清水平。
图2是显示在以单次0.7mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的mTTR血清水平的图。数据归一化至在皮下给予盐水之后观察到的mTTR血清水平。
图3是显示在皮下给予小鼠预定量的测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的mTTR血清水平的图。数据归一化至在皮下给予盐水之后观察到的mTTR血清水平。在该图中，剂量标示为(a)、(b)和(c)，其中(a)代表0.5mg/kg剂量，(b)代表1.0mg/kg剂量，且(c)代表0.25mg/kg剂量。
图4是显示在以单次0.4mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。数据归一化至在皮下给予盐水之后在小鼠中观察到的AT3活性。
图5是显示在以单次0.5mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。数据归一化至在皮下给予盐水之后在小鼠中观察到的AT3活性。
图6是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物7天之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图7是显示在以单次0.125mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图8A是显示在Z40、Z52、Z53和Z54中的过客链的共轭位点的结构的图。
图8B是显示P1、p2、P3和p4的结构以及在配体共轭之前X1、X2、X3、X4、X5和X2-NH2的结构的图。
图9是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图10是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图11是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图12是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图13是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图14是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图15是显示在以单次0.25mg/kg或0.5mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图16是显示在以单次0.5mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图17是显示在以单次0.25mg/kg或0.5mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。
图18是显示在以单次0.25mg/kg皮下给予小鼠测试组合物预定时间段之后测量的小鼠中的AT3活性的图。使用NAG40的两种等效物来制备Z92-2。使用NAG40的三种等效物来制备Z92-3。
图19是显示在用Z67、Z237或Z238培养后Heb3b肝细胞活力的图。
图20是显示在用Z67、Z237或Z238培养后原代小鼠肝细胞中的TTR表达的图。Z67的IC50＝2.020x10-12M。Z237的IC50＝2.196x10-12M。Z238的IC50＝2.286x10-12M。TTR表达水平归一化至PPIB表达水平。
详述
一般而言，本发明提供多核苷酸构建体，例如，其具有与携带一个或更多个辅助部分的支链部分连接的多核苷酸。所述多核苷酸构建体可作为杂交的多核苷酸构建体提供。
本发明的多核苷酸构建体可表现出优异的活性、延长的作用时间和/或降低的脱靶效应(例如，降低的脱靶细胞毒性)。特别地，本发明的多核苷酸构建体中包含至少一个式(I)的基团；一个或更多个核苷间脱碱基间隔子；立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯；和/或2’-取代模式可提供这些效应中的一种或更多种。
本发明的多核苷酸构建体可含有与至少一个式(I)的基团键合的链：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-(例如，至少一个包括与T键合的-C(O)-N(H)-的多价连接子))；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数。
所述至少一个式(I)的基团可与所述多核苷酸的5’-末端、3’-末端、核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合。当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。所述多核苷酸构建体含有不超过一种Sol。
本发明的多核苷酸构建体可含有核苷间脱碱基间隔子。所述核苷间脱碱基间隔子可具有式(III)：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
当含有核苷间脱碱基间隔子的多核苷酸构建体是siRNA中的引导链时，所述多核苷酸构建体可表现出降低的脱靶效应。特别地，核苷间脱碱基间隔子(例如，式(III)的核苷酸间脱碱基间隔子，其中t是1)可被包括在引导链中(例如，在引导链的种子区中)。在一些实施方案中，核苷间脱碱基间隔子(例如，式(III)的核苷酸间脱碱基间隔子，其中t是1)可与引导链的第二、第三、第四或第五核苷的3’位碳原子键合。在某些实施方案中，核苷间脱碱基间隔子(例如，式(III)的核苷酸间脱碱基间隔子，其中t是1)可与引导链的第十三、第十四、第十五或第十六核苷的3’位碳原子键合。
本发明的多核苷酸构建体可包括高含量的2’-烷氧基核苷(例如，所述多核苷酸构建体中至少80％的核苷可独立地为2’-烷氧基核苷)。本发明的此类多核苷酸构建体可包括2’-取代模式，其中第二、第十二、第十四和第十六核苷中的至少一个是2’-氟代核苷，且剩余的核苷独立地为2’-烷氧基核苷。在一些实施方案中，第二、第十二、第十四和第十六核苷或第十二、第十四和第十六核苷独立地为2’-氟代核苷，且剩余的核苷独立地为2’-烷氧基核苷。在其它实施方案中，所述链中的第七、第九和/或第十一核苷是2’-氟代核苷。当具有高含量的2’-烷氧基核苷的本发明的多核苷酸构建体(例如，本文中描述的具有2’-取代模式的那些)是siRNA中的引导链时，所述多核苷酸构建体可表现出优异的功效和/或延长的作用时间。
在组合物中，本发明的多核苷酸构建体可含有一个或更多个(例如，1至20个、1至10个或1至5个)立体化学富集的(例如，核苷间)硫代磷酸酯(例如，对于P-立体基因中心而言，具有至少10％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％(例如，至多约99％)的非对映体过量)。本发明的多核苷酸构建体可含有一个或更多个(例如，1至20个、1至10个或1至5个；例如，核苷间)二硫代磷酸酯。所述二硫代磷酸酯在本发明的多核苷酸构建体中可为非P-立体基因的。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯可提高多核苷酸构建体对血清的外切核酸酶活性的稳定性。非P-立体基因的二硫代磷酸酯可通过减少可能的非对映异构体的数目而简化本发明的多核苷酸构建体的合成。通常，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯可连接在本发明的多核苷酸构建体的六个3’-末端核苷和六个5’-末端核苷内的两个连续核苷。在多核苷酸构建体中，所述链可具有19个或更多个核苷。所述链可具有少于100个核苷(例如，少于50核苷或少于32个核苷)。当所述多核苷酸构建体是引导链时，所述立体化学富集的硫代磷酸酯(例如，RP-富集的硫代磷酸酯)可与第一核苷(例如，第一核苷的3’位碳原子)和第二核苷(例如，第二核苷的5’位碳原子)共价键合。额外地或替代地，当所述多核苷酸构建体是引导链时，所述立体化学富集的硫代磷酸酯(例如，RP-富集的硫代磷酸酯)可与第二核苷(例如，第二核苷的3’位碳原子)和第三核苷(例如，第三核苷的5’位碳原子)共价键合。额外地或替代地，当所述多核苷酸构建体是引导链时，所述立体化学富集的硫代磷酸酯(例如，SP-富集的硫代磷酸酯)可与第二十一核苷(例如，第二十一核苷的3’位碳原子)和第二十二核苷(例如，第二十二核苷的5’位碳原子)共价键合。另外，额外地或替代地，当所述多核苷酸构建体是引导链时，所述立体化学富集的硫代磷酸酯(例如，SP-富集的硫代磷酸酯)可与第二十二核苷(例如，第二十二核苷的3’位碳原子)和第二十三核苷(例如，第二十三核苷的5’位碳原子)共价键合。引导链中5’RP-富集的硫代磷酸酯(例如，与第一核苷(例如，第一核苷的3’位碳原子)和第二核苷(例如，第二核苷的5’位碳原子)共价键合的RP-富集的硫代磷酸酯)和3’SP-富集的硫代磷酸酯(例如，与第二十一核苷(例如，第二十一核苷的3’位碳原子)和第二十二核苷(例如，第二十二核苷的5’位碳原子)共价键合的SP-富集的硫代磷酸酯)的组合可产生优异的功效和/或作用时间，例如，如通过相对于缺少5’RP-富集的硫代磷酸酯和3’SP-富集的硫代磷酸酯的组合的参照引导链的靶活性降低所测量的。本发明还提供含有过客链和可加载到RISC复合体中的引导链的杂交的多核苷酸。所述链中的至少一个可与式(I)的基团键合。此类多核苷酸构建体可表现出相对于具有相同数目的辅助部分的多核苷酸构建体更有效的活性。例如，如图1中所例示，每给予单元的杂交的多核苷酸构建体Z18和Z19相对于杂交的多核苷酸构建体Z7和Z9更有效地抑制基因表达。此类多核苷酸构建体还可表现出相对于具有相同数目的辅助部分的多核苷酸构建体延长的活性。例如，如在图1中所例示，每给予单元的杂交的多核苷酸构建体Z18和Z19相对于杂交的多核苷酸构建体Z7和Z9持续更长时间段地抑制基因表达。
所述杂交的多核苷酸构建体可包括具有19个或更多个核苷的引导链。所述引导链可具有少于100个核苷(例如，少于50个核苷或少于32个核苷)。所述杂交的多核苷酸构建体可包括具有19个或更多个核苷的过客链。所述过客链可具有少于100个核苷(例如，少于50个核苷或少于32个核苷)。在一些实施方案中，过客链和引导链各自将独立地包括19个至50个核苷(例如，19个至32个核苷)。所述过客链和引导链可在至少8个连续核苷上(例如，在至少12个连续核苷上或在至少15个连续核苷上)彼此互补。
除了上文描述的部分之外，所述多核苷酸构建体还可含有非生物可逆性磷酸三酯、生物可逆性磷酸三酯、磷酰胺酯、膦酸酯中的一种或更多种。可用于本发明的多核苷酸构建体的生物可逆性磷酸三酯描述于例如WO 2015/188197中。
MOIETY
本发明的多核苷酸构建体可含有至少一个(例如，1个、2个、3个或4个)式(I)的基团，其包括为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-的MOIETY，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基。在式(I)中，MOIETY、R1和R2可组合形成：
其中
R7是连接靠近R4的氧原子的键，
R8是连接靠近所述链的氧原子的键，且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，
条件是式(Ia)中的季碳与0或1个不同于碳和氢的原子键合，且条件是m1、m2、m3和m4的总和小于10。
特别地，MOIETY、R1和R2可组合形成：
由MOIETY、R1和R2的组合形成的基团的非限制性实例为：
辅助部分和LinkA
本发明的多核苷酸构建体可包括与MOIETY非生物可逆性连接的辅助部分(例如，靶向部分)。所述辅助部分为基团-LinkA(-T)p中的T。基团-LinkA(-T)p可与MOIETY或-X2p(X1)(-)2键合，其中X1是O或S，且X2是O、S、NH或键。在一些实施方案中，X1是O。在某些实施方案中，X2是O或S(例如，X2是O)。
基团-LinkA-可包括0至3个多价单体(例如，任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基或三价氮原子)和一个或更多个二价单体(例如，1至40个)，其中各二价单体独立地为任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；亚氨基；任选取代的N、O或S(O)m，其中m是0、1或2。在一些实施方案中，各单体独立地为任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；亚氨基；任选取代的N、O或S(O)m，其中m是0、1或2(例如，m是2)。在某些实施方案中，各单体独立地为任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；任选取代的N、O或S(O)m，其中m是0、1或2(例如，m是2)。将辅助部分与共轭部分或其反应产物连接的非生物可逆性连接子可包括2至500个(例如，2至300个或2至200个)此类单体。基团-LinkA-可包括聚环氧烷(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚(氧杂环丁烷)、聚环氧丁烷、聚(氧杂环戊烷)、及其二嵌段或三嵌段共聚物)。在一些实施方案中，所述非生物可逆性连接子包括聚环氧乙烷(例如，具有小于1kDa的分子量的聚环氧乙烷)。
式(I)中的基团-LinkA(-T)p可通过在以下部分中描述的方法来制备。在一些情况下，-LinkA(-T)p具有式(II)：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数(例如，0至10)，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-QC-，其中QC为任选取代的C2-12亚杂烷基(例如，含有-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-的亚杂烷基)、任选取代的C1-12亚硫代杂环基(例如， 任选取代的C1-12亚杂环基(例如，1，2，3-三唑-1，4-二基或环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基或吡啶-2-基腙)；
若p为1，则Q2是直链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-)，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中p1是0或1，p2为0、1、2或3)；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；
各Q7独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
在一些实施方案中，各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基。在某些实施方案中，s是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
因此，在式(II)中，若各p1是0，则LinkA可包括单一支化点，或若至少一个p1是1，则LinkA可包括多个支化点。
在式(II)中，Q1可为-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C1-12亚烷基或-(任选取代的C1-6亚烷基)-(任选取代的C6-10亚芳基)-。在一些实施方案中，QL为任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-12亚烷基。在式(II)中，QC可为：
在式(II)中，Q2可为式[-Q3-Q4-Q5]s-的直链基团，其中Q3、Q4和Q5如针对式(II)所定义。或者，Q2可为支链基团[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中各Q7独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
在某些实施方案中，p1是0。
在一些实施方案中，Q7是：
本文以及WO 2015/188197中描述了可用于制备式(I)中的基团-LinkA(-T)p的化合物。-LinkA的非限制性实例包括：
其中
R18为连接MOIETY的键，
各R19独立地为连接辅助部分的键，
各m5独立地为1至20的整数，
各m6独立地为1至10的整数，
m7是1至6的整数，且
各X6独立地为O或S。
在式(II)中，当共轭连接子具有式[-Q3-Q4-Q5]s-QC-时，-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p可为：
其中
R20是连接Q1中的QC的键，
各R19独立地为连接辅助部分的键，
各m5独立地为1至20的整数，
各m6独立地为1至10的整数，
m7是1至6的整数，且
各X6独立地为O或S。
各种辅助部分可共轭至本发明的多核苷酸构建体，并且所述辅助部分可提供合意的生物效应或化学效应。生物效应包括，但不限于诱导细胞内化、结合至细胞表面、靶向特定细胞类型、允许内体逃逸、体内改变多核苷酸的半衰期以及提供治疗效果。化学效应包括，但不限于改变溶解度、电荷、尺寸和反应性。本文以及WO 2015/188197中描述了可用于制备式(I)中的基团-LinkA(-T)p的辅助部分
靶向部分
本发明的多核苷酸构建体和本发明的杂交的多核苷酸构建体可包括一个或更多个靶向部分作为辅助部分。靶向部分基于其将本发明的构建体靶向至表达选定的靶向部分的相应结合配偶体(例如，相应受体或配体)的期望或选定的细胞群体的能力来选择。例如，本发明的构建体可通过选择含有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的靶向部分作为该靶向部分而靶向表达去唾液酸糖蛋白(ASGP-R)的肝细胞。靶向细胞内的期望位点(例如，内质网、高尔基体、细胞核或线粒体)的靶向部分(即，细胞内靶向部分)可包括在本文中描述的杂交的多核苷酸构建体中。WO 2015/069932和WO 2015/188197中提供了细胞内靶向部分的非限制性实例；WO 2015/069932和WO 2015/188197中的细胞内靶向部分的公开内容通过引用并入本文中。
因此，本发明的构建体可以包括选自细胞内靶向部分、细胞外靶向部分及其组合的一个或更多个靶向部分。因此，在本发明的多核苷酸构建体中包含一个或更多个靶向部分(例如，包括独立地选自叶酸、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺和前列腺特异性膜抗原的靶向部分的细胞外靶向部分)和一个或更多个细胞内靶向部分(例如，靶向内质网、高尔基体、细胞核或线粒体的部分)可促进所述多核苷酸递送至特定细胞群体内的特定位点。在一些实施方案中，靶向部分含有一个或更多个甘露糖碳水化合物。甘露糖靶向甘露糖受体，其是在肝窦细胞和抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞和树突细胞)上表达的175KDa膜相关受体。它是高效的内吞/再循环受体，其结合并内化甘露糖化病原体和蛋白(Lennartz等人，J.Biol.Chem.262：9942-9944，1987；Taylor等人，J.Biol.Chem.265：12156-62，1990)。
本文中描述了本发明的一些靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分含有或特异性地结合选自以下的蛋白：胰岛素、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、IGF2R、胰岛素样生长因子(IGF；例如，IGF 1或2)、间质上皮转化因子受体(c-met；也称为肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、调节蛋白(heregulin)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸、转铁蛋白、转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整合蛋白(例如，α4整合蛋白或β-1整合蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1))、CD166(活化的白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞源性因子-1(SDF-1))、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、肝配蛋白(Eph)受体、粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原及其片段。在另外的实施方案中，靶向部分含有成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体以及ErbB4受体)。在一些实施方案中，靶向部分含有一个或更多个(例如，1至6个)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分含有一个或更多个(例如，1至6个)甘露糖。在其它实施方案中，靶向部分含有叶酸配体。所述叶酸配体具有以下结构：
某些靶向部分可包括铃蟾肽、胃泌素、胃泌素释放肽、肿瘤生长因子(TGF)(例如，TGF-α或TGF-β)或牛痘病毒生长因子(VVGF)。非肽基靶向部分也可用于靶向部分并且可包括，例如，类固醇、碳水化合物、维生素以及凝集素。一些靶向部分可包括多肽，例如生长激素抑制素或生长激素抑制素类似物(例如，奥曲肽或兰瑞肽)、铃蟾肽或其抗体或抗原结合片段。抗体可为任何公认类别或亚类，例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。典型的是落入IgG类中的那些抗体。依照本领域中已知的技术，抗体可源自任何物种。然而，通常，抗体具有人、小鼠或兔来源。此外，抗体可以是多克隆的或单克隆的，但通常是单克隆的。人或嵌合(例如，人源化)抗体可用于靶向部分。靶向部分可包括抗体的抗原结合片段。此类抗体片段可包括，例如，Fab’、F(ab’)2、Fv或Fab片段、单结构域抗体、ScFv或其它抗原结合片段。Fc片段也可用于靶向部分。此类抗体片段可例如通过蛋白水解酶消化(例如，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、还原烷基化或重组技术来制备。用于制备抗体片段的材料和方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Parham，J.Immunology，131：2895，1983；Lamoyi等人，J.Immunological Methods，56：235，1983。
用作本发明的核苷酸构建体中的靶向辅助部分的其它肽可选自KiSS肽和类似物、尾加压素II肽和类似物、GnRH I和II肽和类似物、地普奥肽、伐普肽、血管活性肠肽(VIP)、缩胆囊素(CCK)、含RGD肽、促黑素细胞激素(MSH)肽、神经降压素、降钙素、谷胱甘肽、YIGSR(白细胞亲合肽，例如，P483H，其含有血小板因子-4(PF-4)的肝素结合区和富含赖氨酸的序列)、心房钠尿肽(ANP)、β-淀粉样肽、δ-阿片类拮抗剂(例如ITIPP(psi))、膜联蛋白-V、内皮素、白三烯B4(LTB4)、趋化肽(例如，N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸-赖氨酸(fMLFK)、GP IIb/IIIa受体拮抗剂(例如，DMP444)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(EPI-HNE-2和EPI-HNE-4)、纤溶酶抑制剂、抗微生物肽、apticide(P280和P274)、血小板反应蛋白受体(包括类似物例如TP-1300)、bitistatin、垂体腺苷酸环化酶I型受体(PAC1)、纤维蛋白α-链、源自噬菌体展示文库的肽以及其保守置换。
一个或更多个(例如，1至6个)靶向部分可通过-LinkA-与式(I)中的MOIETY或X2连接。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括一个或更多个(例如，1至6个或1至3个)去唾液酸糖蛋白受体配体(例如，GalNAc)。在一些实施方案中，去唾液酸糖蛋白受体配体(例如，GalNAc)配体通过异头碳(例如，其中该异头碳是缩醛或半缩醛胺中的碳)与-LinkA-连接。通过半缩醛胺与连接子连接的去唾液酸糖蛋白受体配体(例如，GalNAc)可产生与具有通过缩醛与连接子连接的去唾液酸糖蛋白受体配体(例如，GalNAc)的杂交的多核苷酸构建体相比，在基因沉默中具有优异的功效的杂交的多核苷酸构建体。
内体逃逸部分
一个或更多个内体逃逸部分(例如1至6个或1至3个)可作为辅助部分与本文中公开的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体连接。示例性内体逃逸部分包括化学治疗剂(例如，喹诺酮类，如氯喹)；融合脂质(例如，二油酰磷脂酰基-乙醇胺(DOPE))；以及聚合物，例如聚乙烯亚胺(PEI)；聚(β-氨基酯)；多肽，例如聚精氨酸(例如，八聚精氨酸)和聚赖氨酸(例如，八聚赖氨酸)；质子海绵、病毒衣壳以及如本文中所描述的肽转导结构域。例如，融合肽可源自甲型流感病毒的M2蛋白；流感病毒血凝素的肽类似物；丙型流感病毒的HEF蛋白；线状病毒的跨膜糖蛋白；狂犬病毒的跨膜糖蛋白；水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白(G)；仙台病毒的融合蛋白；塞姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白；人呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白；麻疹病毒的融合蛋白；鸡新城疫病毒的融合蛋白；绵羊髓鞘脱落病毒的融合蛋白；鼠白血病病毒的融合蛋白；HTL病毒的融合蛋白；以及猿免疫缺陷病毒(SIV)的融合蛋白。可以用于促进内体逃逸的其它部分描述于Dominska等人，Journal of Cell Science，123(8)：1183-1189，2010中。内体逃逸部分(包括适合于共轭至本文中公开的杂交的多核苷酸构建体的部分)的具体实例提供在例如WO 2015/188197中；这些内体逃逸部分的公开内容通过引用并入本文中。
如本文中所描述，一个或更多个内体逃逸部分(例如1至6个或1至3个)可通过-LinkA-与式(I)中的MOIETY或X2连接。
细胞穿透肽
一个或更多个细胞穿透肽(例如1至6个或1至3个)可作为辅助部分与本文中公开的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体连接。如本文中所公开，CPP可通过二硫键与杂交的多核苷酸生物可逆性地连接。因此，在递送至细胞后，CPP可例如通过胞内酶(例如，蛋白二硫键异构酶、硫氧还蛋白或硫酯酶)在细胞内切割并由此释放多核苷酸。
CPP在本领域中是已知的(例如，TAT或Arg8)(Snyder和Dowdy，2005，ExpertOpin.Drug Deliv.2，43-51)。CPP(包括适合于共轭至本文中公开的杂交的多核苷酸构建体的部分)的具体实例提供在例如WO 2015/188197中；这些CPP的公开内容通过引用并入本文中。
CPP是能够促进将生物货物递送至细胞的带正电荷的肽。认为CPP的阳离子电荷对于它们的功能是必需的。此外，这些蛋白的转导似乎不受细胞类型影响，并且这些蛋白可有效转导几乎所有的培养细胞而无明显毒性(Nagahara等人，Nat.Med.4：1449-52，1998)。除了全长蛋白外，CPP也已成功地用于诱导DNA(Abu-Amer，如上)、反义多核苷酸(Astriab-Fisher等人，Pharm.Res，19：744-54，2002)、小分子(Polyakov等人，Bioconjug.Chem.11：762-71，2000)以及甚至无机40nm铁颗粒(Dodd等人，J.Immunol.Methods 256：89-105，2001；Wunderbaldinger等人，Bioconjug.Chem.13：264-8，2002；Lewin等人，Nat.Biotechnol.18：410-4，2000；Josephson等人，Bioconjug.Chem.10：186-91，1999)的细胞内摄取，表明了在该过程中颗粒尺寸存在相当大的灵活性。
在一个实施方案中，可用于本发明的方法和组合物的CPP包括特征为显著的α-螺旋度的肽。已发现当CPP表现出显著的α-螺旋度时，转染被优化。在另一实施方案中，CPP包括含有沿着肽的至少一个面显著取向的碱性氨基酸残基的序列。可用于本发明的CPP可为天然存在的肽或合成肽。
如本文中所描述，一个或更多个细胞穿透肽(例如1至6个或1至3个)可通过-LinkA-与式(I)中的MOIETY或X2连接。
聚合物
本文中公开的多核苷酸构建体和杂交的多核苷酸构建体还可包括共价连接的中性聚合物基辅助部分。中性聚合物包括聚(C1-6环氧烷)，例如，聚乙二醇和聚丙二醇及其共聚物，例如，二嵌段共聚物和三嵌段共聚物。聚合物的其它实例包括酯化的聚丙烯酸、酯化的聚谷氨酸、酯化的聚天冬氨酸、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酸烷基酯、聚丙烯酰胺、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-丙烯酰基吗啉)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚二氧环己酮、聚己内酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚氨酯、N-异丙基丙烯酰胺聚合物以及聚(N，N-二烷基丙烯酰胺)。示例性聚合物辅助部分可具有小于100、300、500、1000或5000Da(例如，大于100Da)的分子量。其它聚合物是本领域中已知的。
如本文中所描述，一种或更多种聚合物(例如1至6种或1至3种)可通过-LinkA-与式(I)中的MOIETY或X2连接。
固体支持体
本文中公开的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体可包括基团-Sol，其中Sol是固体支持体。可与多核苷酸构建体一起使用的可切割的固体支持体是本领域中已知的。固体支持体的非限制性实例包括，例如，通过本领域中已知的可切割连接子(例如，琥珀酸酯基连接子)(例如，UnyLinkerTM)与链结合的可控多孔玻璃或大孔聚苯乙烯。
共轭部分
本文中公开的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体可包括共轭部分，其可与-LinkA(-T)p前体反应。共轭部分包括至少一个能够进行共轭反应(例如，环加成反应(例如，偶极环加成)、酰胺化反应、亲核芳族取代)的官能团。例如，共轭部分可包括叠氮基、任选取代的C2-12炔基、-COOR21、-CHO、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、或-NHRN1；其中RN1是H、N-保护基团或任选取代的C1-6烷基；各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基；且R22是卤素(例如，F)。所述共轭部分可受到保护直至辅助部分共轭至多核苷酸构建体。例如，受保护的共轭部分可包括-COORPGO或-NHRPGN，其中RPGO是O-保护基团(例如，羰基保护基团)，且RPGN是N-保护基团。在一些实施方案中，共轭部分是基团[-Q3-Q4-Q5]a-QC1，
其中
QC1为任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、-NHRN1或含有-COOR21或-CHO的任选取代的C1-16烷基；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；
各s独立地为0至20的整数；
RN1为H、N-保护基团或任选取代的C1-6烷基；
各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基；且
R22是卤素(例如，F)。
核苷间脱碱基间隔子
在设想将杂交的多核苷酸构建体用作siRNA的那些情况下，类miRNA脱靶效应降低是合意的。在杂交的多核苷酸构建体中包含一个或更多个(例如，一个或两个)核苷间脱碱基间隔子可降低或甚至消除类miRNA脱靶效应，因为所述核苷间脱碱基间隔子缺少能够参与碱基配对相互作用的核碱基并减轻位阻。因此，本文中公开的多核苷酸构建体和杂交的多核苷酸构建体可包括一个或更多个(例如，一个或两个)核苷间脱碱基间隔子。当所述多核苷酸构建体包括两个或更多个核苷间脱碱基间隔子时，它们的结构可相同或不同。在某些实施方案中，过客链含有一个核苷间脱碱基间隔子(例如，引导链可不含核苷间脱碱基间隔子)。在其它实施方案中，引导链含有一个核苷间脱碱基间隔子(例如，过客链可不含核苷间脱碱基间隔子)。在还有其它实施方案中，引导链含有一个核苷间脱碱基间隔子，且过客链含有一个核苷间脱碱基间隔子。在另外的实施方案中，过客链包括介于核苷数(x)和核苷数(x+t+1)之间的核苷间脱碱基间隔子，其中x是2至7的整数。在还有另外的实施方案中，引导链包括介于核苷数(x)和核苷数(x+t+1)之间的核苷间脱碱基间隔子，其中x是2至7的整数。
核苷间脱碱基间隔子可具有式(III)：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
在一些实施方案中，各X4是O。在特别的实施方案中，各X5是O。在某些实施方案中，各R9是H。在其它实施方案中，所述糖类似物被独立地选自-LinkA(-T)p和共轭部分的一个或两个基团取代。
糖类似物
糖类似物是为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如，甘油)的二价基团或三价基团，其经修饰以用与式(III)中的基团-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键来替换羟基。糖类似物是环状或无环的。包括在糖类似物中的其它任选的修饰为：用H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p、共轭部分、-(CH2)t1-ORZ(其中t1是1至6的整数，且RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基)替换剩余的羟基中的一个、两个或三个或与碳键合的氢原子；引入一个或两个不饱和基(例如，一个或两个双键)；以及用如针对烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义的取代基替换一个、两个或三个氢或羟基。糖类似物的非限制性实例为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷烃-1，3-二基、任选取代的C5环烯烃-1，3-二基、任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基、任选取代的四氢呋喃-2，5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。糖类似物的非限制性实例为：
其中
R12是与式(III)中的-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
R13是与式(III)中的另一-P(X4)(-X5R9)-键合的氧原子连接的键；
各R14和R15独立地为H、任选取代的C1-6烷基或-(CH2)t1-ORZ，其中n是1至6的整数，且RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基。
在一些实施方案中，R14和R15中的至少一个不是H。
非生物可逆性磷酸三酯
本发明的多核苷酸构建体还可包括非生物可逆性磷酸三酯(例如，被不包括二价硫(disulfide)或硫酯的基团取代的磷酸酯或硫代磷酸酯)。所述非生物可逆性磷酸三酯可为核苷间非生物可逆性磷酸三酯(例如，位于杂交的多核苷酸构建体的种子区外部的非生物可逆性磷酸三酯)。引导链中的核苷间非生物可逆性磷酸三酯的优选位置是介于第二核苷和第三核苷之间、第五核苷和第六核苷之间、第十七核苷和第十八核苷之间、第十九核苷和第二十核苷之间或第二十核苷和第二十一核苷之间的那些(在引导链的5’-末端开始计数)。过客链中的非生物可逆性磷酸三酯的优选位置是不连接在天然RISC介导的切割位点处的两个连续核苷的那些。
所述非生物可逆性磷酸三酯可为被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L是C2-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
所述非生物可逆性磷酸三酯可为被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：
C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为含有1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为含有1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
多核苷酸构建体的制备
本发明进一步提供用于制造本发明的多核苷酸构建体的方法。用于制备核苷酸和多核苷酸的方法是本领域中已知的。例如，用于制备多核苷酸的亚磷酰胺化学的实践是从Caruthers和Beaucage及其他人的出版作品。参见，例如，美国专利号4,458,066；4,500,707；5,132,418；4,415,732；4,668,777；4,973,679；5,278,302；5,153,319；5,218,103；5,268,464；5,000,307；5,319,079；4,659,774；4,672,110；4,517,338；4,725,677；以及RE34,069(其各自通过引用并入本文中)描述多核苷酸合成的方法。此外，亚磷酰胺化学的实践已由Beaucage等人，Tetrahedron，48：2223-2311，1992；和Beaucage等人，Tetrahedron，49：6123-6194，1993，以及其中引用的参考文献进行了系统性综述，其全部通过引用并入本文中。可用于本发明的多核苷酸构建的合成的合成原理公开于PCT/US2014/064401和PCT/US2015/034749中；PCT/US2014/064401和PCT/US2015/034749中的多核苷酸构建体合成的公开内容通过引用并入本文中。
核酸合成器是市售可得的，并且其用途通常由本领域普通技术人员理解为有效地产生具有可能需要的合理长度的几乎任何多核苷酸。
在实践亚磷酰胺化学中，有用的5’OH糖封闭基团是三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基以及三甲氧基三苯甲基，尤其是二甲氧基三苯甲基(DMTr)。在实践亚磷酰胺化学中，有用的亚磷酸酯活化基团是二烷基取代的氮基团和氮杂环。一种方法包括使用二-异丙基氨基活化基团。
多核苷酸可通过Mermade-6固相自动多核苷酸合成器或任何常规可得的自动多核苷酸合成器来合成。三酯、亚磷酰胺或氢磷酸酯偶联化学(描述于例如，M.Caruthers，Oligonucleotides：Antisense Inhibitors of Gene Expression，第7-24页，J.S.Cohen编著(CRC Press，Inc.Boca Raton，Fla.，1989)；Oligonucleotide synthesis，a practicalapproach，M.J.Gait编著，IRL Press，1984；和Oligonucleotides and Analogues，APractical Approach，F.Eckstein编著，IRL Press，1991)通过这些合成器用于提供期望的多核苷酸。Beaucage试剂(如例如，Journal of American Chemical Society，112：1253-1255，1990中所描述的)或元素硫(如Beaucage等人，Tetrahedron Letters 22：1859-1862，1981中所描述的)与亚磷酰胺或氢磷酸酯化学一起用于提供取代的硫代磷酸酯多核苷酸。
例如，含有本文中所列举的保护基团的试剂可用于其中期望保护的众多应用中。此类应用包括但不限于，固相和液相多核苷酸合成二者等。
例如，将结构基团任选地添加至核苷的核糖或碱基以并入多核苷酸中，例如在核糖上的2’-O位置处的甲基、丙基或烯丙基，或取代2’-O基团的氟代基团，或核糖核苷碱基上的溴代基团。对于与亚磷酰胺化学一起使用，各种亚磷酰胺试剂是市售可得的，包括2’-脱氧亚磷酰胺、2’-O-甲基亚磷酰胺以及2’-O-羟基亚磷酰胺。还可采用用于此类合成的任何其它方式。所述多核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的才能范围内。使用类似技术来制备其它多核苷酸(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及烷基化衍生物)也是熟知的。还熟知使用类似技术和市售可得的修饰的亚磷酰胺和可控多孔玻璃(CPG)产品(例如生物素、Cy3、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的亚磷酰胺和/或CPG(可从Glen Research，SterlingVa.获得))来合成荧光标记的、生物素化的或其它共轭的多核苷酸。
用于本发明的多核苷酸构建体的合成的亚磷酰胺可具有式(IV)：
其中
各R1和R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基或共轭部分(例如，包括任选取代的N-受保护的氨基、含有-COOR21或-CHO的任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16炔基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素(例如，F))；
各R16独立地为二烷基氨基、2-氰乙基或共轭部分，条件是至少一个R16是二烷基氨基；
R17是羟基保护基团；且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，条件是m1和m2的总和不为0。
在式(IV)的一些情况下，当R1和R2二者均为包括任选取代的C2-16炔基的共轭部分时，剩余的R16是二烷基氨基或共轭部分。
在式(IV)的某些情况下，各R1和R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基或[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，
其中
QC1为任选取代的C2-12炔基或任选取代的N-受保护的氨基；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
共轭
本发明的多核苷酸构建体的制备可包括使辅助部分共轭至与多核苷酸构建体中的磷酸酯或硫代磷酸酯连接的非生物可逆性连接子(non-bioreversible)。所述辅助部分和连接子包括互补的共轭部分。多核苷酸构建体中的连接位置通过携带连接子的磷酸酯或硫代磷酸酯的定位来确定。因此，含有一个或更多个共轭部分的多核苷酸构建体将在适当条件下与辅助部分上的一个或更多个互补的共轭部分反应。辅助部分可本征具有共轭部分，例如肽中的末端或赖氨酸胺基团和硫醇基团，或其可被修饰成包括小的连接基团以引入共轭部分。此类连接基团的引入是本领域熟知的。将理解，与本发明的核苷酸构建体连接的辅助部分包括任何必要的连接基团。
各种键形成方法可用于将辅助部分共轭至本文中描述的核苷酸构建体。示例性反应包括：叠氮化物与炔烃之间形成三唑的环加成反应；二烯亲和物与二烯/杂二烯之间的狄尔斯-阿尔德反应；经由其它周环反应例如烯反应的键形成；酰胺或硫代酰胺键形成；磺酰胺键形成；醇或酚烷基化(例如，用重氮化合物)；缩合反应以形成肟、腙或氨基脲基团；通过亲核试剂(例如，胺和硫醇)进行的共轭加成反应；二硫键形成；以及在羧酸官能团处的亲核取代(例如，被胺、硫醇或羟基亲核试剂取代)。键形成的其它示例性方法在本文中描述并且是本领域中已知的。
亲核试剂/亲电试剂反应
亲核试剂和亲电试剂可参与键形成反应，所述键形成反应选自但不限于：通过亲电试剂净插入C-H键中；通过亲电试剂净插入O-H键中；通过亲电试剂净插入N-H键中；在烯烃上加成亲电试剂；在炔烃上加成亲电试剂；加成至亲电羰基中心；在亲电羰基中心处取代；加成至烯酮；亲核加成至异氰酸酯；亲核加成至异硫氰酸酯；在活化的硅中心处亲核取代；烷基卤的亲核置换；在烷基拟卤化物处的亲核置换；在活化的羰基处亲核加成/消除；亲核试剂1，4-共轭加成至α，β-不饱和羰基；环氧化物的亲核开环；缺电子芳族化合物的亲核芳族取代；亲核加成至活化的磷中心；在活化的磷中心处亲核取代；亲核加成至活化的硫中心；以及在活化的硫中心处亲核取代。
亲核共轭部分可选自任选取代的烯烃、任选取代的炔烃、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、羟基、氨基、烷基氨基、苯胺基以及硫代基团。
亲电共轭部分可选自叠氮化物、活化的硅中心、活化的羰基、酸酐、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、烷基卤、烷基拟卤化物、环氧化物、环硫化物、氮丙啶、缺电子芳基、活化的磷中心以及活化的硫中心。
例如，共轭可经由缩合反应发生以形成为腙键的键合。在另一非限制性实例中，共轭可通过皮克特-施彭格勒反应(Pictet-Spengler reaction)来进行。或者，共轭可通过取代方酸酯、2-磺酰基-1，3-苯并噻唑、5-磺酰基-1，2，3，4-四唑、2-磺酰基-1，3，4-噁二唑或4-卤代苯并呋咱中的离去基团来进行。
经由形成酰胺键进行的共轭可通过活化基于羧基的共轭部分且随后与基于伯胺的共轭部分反应来介导。活化剂可以是各种碳二亚胺，例如：EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、EDAC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、DCC(二环己基碳二亚胺)、CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺)、DIC(二异丙基碳二亚胺)或伍德沃德氏试剂K(N-乙基-3-苯基异噁唑鎓-3′-磺酸盐)。基于活化的NHS-酯的共轭部分与基于伯胺的共轭部分的反应也导致酰胺键的形成。
醚形成也可用于将辅助部分共轭至本发明的核苷酸构建体。经由醚键合进行的共轭可通过基于环氧化物的共轭部分与基于羟基的共轭部分的反应来介导。
经由形成硫醚键合进行的共轭可通过使基于巯基的共轭部分与基于马来酰亚胺的共轭部分反应或通过与基于环氧化物的共轭部分反应来进行。基于马来酰亚胺的共轭部分可通过SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-磺基羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯)或磺基GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁酰基-氧基磺基琥珀酰亚胺酯)来引入。
经由形成氨基甲酸酯键合进行的共轭可通过基于羟基的共轭部分与CDI(N，N’-羰基二咪唑)或DSC(N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯的反应且随后与基于胺的共轭部分反应来进行。
光解和热解共轭
或者，共轭部分可采用光解或热解活化，以便形成所需的共价键。包括叠氮基官能团的共轭部分是一个实例。因此，共轭还可通过引入光反应性共轭部分来实现。光反应性共轭部分是芳基叠氮化物、卤化芳基叠氮化物、二苯甲酮、某些重氮化合物以及双吖丙啶衍生物。它们与基于氨基的共轭部分或与具有活化的氢键的共轭部分反应。
基于叠氮基的共轭部分是UV不稳定的，并且在光解时可导致氮烯亲电试剂的形成，所述氮烯亲电试剂可与亲核共轭部分例如基于芳基的共轭部分或基于烯基的共轭部分反应。或者，这些叠氮化合物的加热也可导致氮烯形成。
环加成反应
环加成反应可用于形成所需的共价键。代表性的环加成反应包括但不限于，基于烯烃的共轭部分与基于1，3-二烯的共轭部分的反应(狄尔斯-阿尔德反应)、基于烯烃的共轭部分与基于α，β-不饱和羰基的共轭部分的反应(杂狄尔斯-阿尔德反应)以及基于炔烃的共轭部分与基于叠氮基的共轭部分的反应(胡伊斯根环加成反应)。包括用于环加成反应的反应物的共轭部分的选定的非限制性实例是：烯烃、炔烃、1，3-二烯、α，β-不饱和羰基以及叠氮化物。例如，叠氮化物与炔烃之间的胡伊斯根环加成反应(点击反应)已用于各种生物实体的官能化。
药物组合物
本发明的杂交的多核苷酸构建体的递送可通过使用本领域技术人员已知的各种方法使细胞与该构建体接触来实现。在特别的实施方案中，本发明的核苷酸构建体与各种赋形剂、媒介物和载体等一起配制，如本文中其它地方更充分地描述的。
可将根据本发明的药物组合物制备为包括本文中公开的杂交的多核苷酸构建体，使用载体、赋形剂和媒介物制备成适合于给予受试者的形式。经常使用的赋形剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物油和植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇、甘油以及多元醇。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体。其它药学上可接受的媒介物包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro编著，Lippencott Williams&Wilkins (2005)和2013年出版的The United States Pharmacopeia：The NationalFormulary)(USP 36 NF31)中所描述的。药物组合物的pH和各种组分的确切浓度根据本领域中的常规技能来调节。参见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis forTherapeutics。
根据本发明的药物组合物可局部或全身给予。治疗有效量将根据以下因素而变化：例如受试者中的感染程度、个体的年龄、性别和体重。可对给药方案进行调节以提供最佳治疗反应。例如，可每日给予若干分开剂量或可如治疗情况的紧急程度所指示按比例减少剂量。
药物组合物可按方便的方式给予，例如通过注射(例如，皮下、静脉内、眼眶内等)、口服给予、眼部施用、吸入、局部施用或直肠给予。取决于给予途经，药物组合物可用材料包覆以保护该药物组合物免受可使该药物组合物失活的酶、酸和其它天然条件的作用。药物组合物还可经胃肠外或腹膜内给予。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。该组合物通常将为无菌和流体至存在易注射性的程度。通常，该组合物将是在制造和储存的条件下稳定的，并且抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行保存。媒介物可以是含有以下的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，在组合物中使用等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的吸收延长。
根据需要，可通过将所需量的药物组合物与以上列举的成分中的一种或组合一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将药物组合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其它成分。
尤其有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物以便于给予和剂量统一。如本文中所使用的剂量单位形式是指适合作为针对待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；含有预定量的药物组合物的各单位经计算以产生与所需药物媒介物相关的所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格与药物组合物的特征和待实现的特定治疗作用相关。将主要药物组合物以有效量与合适的药学上可接受的媒介物以可接受的剂量单位混合以用于方便且有效的给予。在组合物含有补充活性成分的情况下，通过参考各成分的常用剂量和给予方式来确定剂量。
对于局部制剂，可用任何溶剂系统(例如由美国食品与药品管理局(U.S.Food&Drug Administration，FDA)通常视为安全(Generally Regarded as Safe，GRAS)的那些)来制备基础组合物。GRAS溶剂系统包括作为递送媒介物的许多短链烃，例如丁烷、丙烷、正丁烷或其混合物，其由FDA批准用于局部使用。局部组合物可使用任何皮肤病学上可接受的媒介物来配制。示例性媒介物包括固体媒介物，例如氧化铝、粘土、微晶纤维素、二氧化硅或滑石；和/或液体媒介物，例如醇、二醇或水-醇/二醇掺混物。所述化合物还可以允许化合物进入皮肤的脂质体制剂给予。此类脂质体制剂描述于美国专利号5,169,637；5,000,958；5,049,388；4,975,282；5,194,266；5,023,087；5,688,525；5,874,104；5,409,704；5,552,155；5,356,633；5,032,582；4,994,213；以及PCT公开号WO 96/40061中。其它适当的媒介物的实例描述于美国专利号4,877,805、U.S.4,980,378、U.S.5,082,866、U.S.6,118,020以及EP公开号0586106 A1中。本发明的适合的媒介物还可包括矿物油、凡士林、聚癸烯、硬脂酸、肉豆蔻酸异丙酯、聚乙二醇40硬脂酸酯、硬脂醇或植物油。
局部组合物可以任何有用的形式提供。本发明的组合物可与载体一起被配制为例如，溶液、乳剂(包括微乳剂)、混悬剂、乳膏、泡沫、洗剂、凝胶、散剂、香膏或用于施用至可使用所述组合物的皮肤或其它组织的其它典型的固体、半固体或液体组合物。此类组合物可含有通常用于此类产品中的其它赋形剂，例如着色剂、芳香剂、增稠剂、抗菌剂、溶剂、表面活性剂、洗涤剂、胶凝剂、抗氧化剂、填充剂、染料、粘度控制剂、防腐剂、湿润剂、润肤剂(例如，天然或合成油、烃油、蜡或硅酮)、水合剂、螯合剂、镇痛剂、增溶赋形剂、佐剂、分散剂、皮肤渗透增强剂、增塑剂、防腐剂、稳定剂、破乳剂、润湿剂、防晒剂、乳化剂、保湿剂、收敛剂、除臭剂，且任选地包括麻醉剂、止痒活性物质、植物提取物、调理剂、增深剂或增亮剂、闪光剂、湿润剂、云母、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、防晒霜、维生素以及植物药。
在一些制剂中，组合物被配制用于眼部施用。例如，用于眼部施用的药物制剂可包括与生理学上可接受的眼用载体介质(vehicle medium(例如水、缓冲液、盐水、甘氨酸、透明质酸、甘露醇等混合的例如高达99重量％的量的如本文中所描述的多核苷酸构建体。对于眼部递送，如本文中所描述的多核苷酸构建体可与眼科学上可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或水组合以形成水性、无菌眼用混悬剂或溶液。可通过将所述多核苷酸构建体溶解在生理学上可接受的等渗的水性缓冲液中来制备眼用溶液制剂。此外，该眼用溶液可包含眼科学上可接受的表面活性剂，以有助于溶解抑制剂。可将增粘剂例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等添加至本发明的组合物，以改善化合物的停留。
根据有经验的临床医生的常规酌情决定，将局部组合物例如，每天一至四次或按延长的递送时间表(例如每日、每周、每两周、每月或更长)递送至眼睛表面。该制剂的pH可在约4至约9或约4.5至约7.4的范围内。
所述药物组合物可例如在载体中，例如以包有肠溶衣的单位剂型口服给予。所述药物组合物和其它成分还可被封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，或压成片剂。对于口服治疗性给予，可将药物组合物与赋形剂合并，并以可摄入片剂、锭剂、胶囊、丸剂、薄片(wafer)等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少1重量％的活性化合物。当然，所述组合物和制剂的百分比可改变并可合宜地在单位重量的约5％至约80％之间。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可含有以下：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香精。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可含有液体载体。可存在各种其它材料作为包衣或以其它方式改变剂量单位的物理形式。例如，可用紫胶、糖或两者包覆片剂、丸剂或胶囊。糖浆剂或酏剂可含有药剂、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料以及调味剂(例如樱桃或橙香料)。在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应当具有药学上可接受的纯度并且在所采用的量下基本上无毒。此外，可将药物组合物并入持续释放制剂(preparation和formulation)中。
对于本发明的核苷酸构建体，合适的药学上可接受的盐包括(i)与阳离子例如钠、钾、铵、镁、钙、聚胺(例如精胺和亚精胺)等形成的盐；(ii)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等形成的酸加成盐；以及(iii)与有机酸，如，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐。
虽然本文中描述的杂交的多核苷酸构建体可能不需要使用赋形剂用于递送至靶细胞，但赋形剂的使用在一些实施方案中可能是有利的。因此，为了递送至靶细胞，本发明的杂交的多核苷酸构建体可非共价地结合赋形剂以形成复合物。所述赋形剂可用于在递送之后改变生物分布，以增强吸收、增加杂交的多核苷酸构建体中的链的半衰期或稳定性(例如，改善核酸酶抗性)和/或增加靶向至特定细胞或组织类型。
示例性赋形剂包括缩合剂(例如，能够通过离子或静电相互作用吸引或结合核酸的试剂)；融合剂(例如，能够融合和/或转运通过细胞膜的试剂)；用于靶向特定细胞或组织类型的蛋白(例如，促甲状腺素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A或任何其它蛋白)；脂质；脂多糖；脂质微胶粒或脂质体(例如，由磷脂如磷脂酰胆碱、脂肪酸、糖脂、神经酰胺、甘油酯、胆固醇或其任何组合形成)；纳米颗粒(例如，二氧化硅、脂质、碳水化合物或其它药学上可接受的聚合物纳米颗粒)；由阳离子聚合物和阴离子试剂(例如，CRO)形成的多聚物，其中示例性阳离子聚合物包括聚胺(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺基胺以及聚乙烯亚胺)；胆固醇；树枝状聚合物(例如，聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物)；血清蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)或低密度脂蛋白(LDL))；碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰糖、甲壳素、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；脂质；合成聚合物(例如，聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺、聚-L-天冬氨酸、聚-L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、伪肽-聚胺、肽模拟物聚胺或聚胺)；阳离子部分(例如，阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α-螺旋肽)；多价糖(例如，多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖或多价岩藻糖)；维生素(例如，维生素A、维生素E、维生素K、维生素B、叶酸、维生素B12、核黄素、生物素或吡哆醛)；辅因子；或用于破坏细胞骨架以增加摄取的药物(例如，紫杉酚、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林(latrunculin)A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin)。
如本文中所描述的其它治疗剂可与本发明的核苷酸构建体组合包含于本发明的药物组合物中。
杂交的多核苷酸构建体的细胞内活性
本发明提供用于递送本文中公开的杂交的多核苷酸构建体的组合物和方法。因此，本发明提供可用于递送通过RNA干扰(RNAi)对基因或蛋白表达施加调节作用的非编码核苷酸构建体的方法和组合物。RNA干扰(RNAi)是一种过程，借此信使RNA(mRNA)通过源自双链RNA(dsRNA)的含有与待沉默的靶基因的核苷酸序列相同或非常相似的核苷酸序列的小干扰RNA(siRNA)降解。该过程通过转录后、翻译前操纵防止由靶向基因编码的蛋白产生。因此，可完成显性疾病基因或其它靶基因的沉默。
体内RNAi通过以下过程进行：在所述过程中dsRNA通过被称为Dicer的酶(dsRNA核糖核酸内切酶)裂解成短干扰RNA(siRNA)(Bernstein等人，2001；Hamilton&Baulcombe，1999，Science 286：950；Meister和Tuschl，2004，Nature 431，343-9)，从而从原始单一dsRNA产生多个分子。将siRNA加载到多聚RNAi沉默复合物(RISC)中，导致催化活化和mRNA靶特异性两者(Hannon和Rossi，Nature 431，371-378，2004；Novina和Sharp，Nature 430，161-164，2004)。在siRNA加载到RISC中期间，将反义链或引导链与siRNA分开，并且保持驻留在Argonaute-2(Ago2)(RISC催化亚基)中(Leuschner等人，EMBO Rep.7，314-320，2006)。某些细胞区室例如内质网(ER)、高尔基体、ER-高尔基中间区室(ERGIC)、P-小体以及早期内体富含Ago2。从细胞核输出至细胞质中的mRNA被认为在核糖体到达之前通过活化的RISC，从而允许基因表达的定向、转录后、翻译前调节。理论上，每一个细胞mRNA都可通过选择性RNAi反应的诱导来调节。
siRNA在哺乳动物细胞中体外有效诱导RNAi反应的能力是已知的(Sontheimer，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.6，127-138，2005)。通常，siRNA的IC50在10-100pM范围内，显著低于具有在1-10nM范围内的IC50值的最佳药物。因此，由于其精确选择性，RNAi已成为细胞表型的定向操纵的基石，从而绘制遗传途径的图谱，发现且确认治疗靶点，并且具有显著治疗潜力。
RNAi的各方面包括：(1)dsRNA是干扰剂；(2)该过程可以是序列特异性的并且是显着有效的(每个细胞仅需要少许dsRNA分子以用于有效干扰)；(3)干扰活性(且可能dsRNA)可以导致细胞和组织中的干扰远离引入位点除去。然而，dsRNA的有效递送是困难的。例如，具有13,860道尔顿分子量的21bp dsRNA不能穿过细胞膜进入细胞质，这归因于(1)RNA分子的尺寸和(2)在生理学上相关的pH水平下、RNA分子上的负电荷积累。本发明的方法和组合物提供核苷酸构建体(例如dsRNA)通过电荷中和和改善的摄取递送到细胞中。
包括与靶基因的核苷酸序列互补的siRNA序列的dsRNA可按任何数目的方法(例如，本文中描述的那些)来制备。用于鉴别siRNA序列的方法和技术是本领域中已知的。siRNA核苷酸序列可在从国家生物技术信息中心网站(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov上获得)提供登录号或GI号之后，从siRNA Selection Program，Whitehead Institute forBiomedical Research，Massachusetts Institute of Technology，Cambridge，Mass.(当前可在http:[//]sirna.wi.mit.edu获得；注意已添加括号来去除超链接)获得。或者，含有适当siRNA序列的dsRNA可使用Miyagishi和Taira(2003)的策略来确定。还存在市售可得的RNAi设计算法(http:[//]rnaidesigner.invitrogen.com/maiexpress/)。订购制备售RNA也是市售可得的。
本发明的核苷酸构建体还可充当miRNA以诱导mRNA的切割。或者，本发明的核苷酸构建体可充当反义试剂以结合mRNA，以通过RNA酶诱导切割或者空间上阻断翻译。
本文中描述本发明的核苷酸构建体可借以被转运到细胞中的示例性方法。
以下实施例意在例示本发明。它们不意欲以任何方式限制本发明。
实施例
前体
可用于制备本发明的多核苷酸的前体在WO 2015/188197中提供(例如，亚磷酰胺、靶向部分和含有PEG链的生物可逆性基团)。
亚磷酰胺和其它单体
可用于本发明的多核苷酸合成的含有核苷的中间体公开于WO 2015/188197中(例如，WO 2015/188197中的化合物U1-U54、A1-A15、C1-9和G1-G12)。
市售可得的亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，VA)或ChemGenes(Wilmington，MA)。需要时，使用此处或在其它地方描述的标准反应条件由适当保护的核苷来制备其它亚磷酰胺。
实施例1.中间体的合成
X1和X2连接子合成-方案1：
在氩气下、在0℃下向NaH(13.2g，在矿物油中60％，230.0mmol)在THF(40mL)中的悬浮液中逐滴添加二醇(S109，4.92g，22.0mmol)在THF(20mL)中的溶液；将所得的混合物升温至室温并搅拌1h。将反应混合物冷却至0℃，缓慢添加炔丙基溴(18.6g，158.4mmol)在THF(25mL)中的溶液，并将所得的混合物升温至室温，并在40℃下搅拌过夜。在产物消耗掉(如通过TLC所观察的)之后，通过逐滴添加0℃的水淬灭反应，并用二氯甲烷(50mL x 2)萃取所得的混合物。合并的有机层用盐水洗涤并用无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发以得到残余物，使用ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，0-30％)通过快速硅胶柱对其纯化，以得到5.92g(89.5％)油状化合物S110。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49-7.47(dd，J 8.0，1.5Hz，2H)，7.38-7.34(m，3H)，5.43(s，1H)，4.21(d，J 2.5Hz，2H)，4.12(t，J 2.5Hz，4H)，4.10(s，1H)，3.91(s，1H)，3.89(s，1H)，3.37(s，2H)；C18H20O4的ESI MS：计算值：300.34，观察值：[M+H]+301.3。
化合物S111
将双炔丙基化合物S110(5.9g，19.64mmol)溶解在乙酸/水混合物(60mL，75∶25)中，并在50℃下继续反应2h。在反应完成之后，蒸发溶液并与甲苯(2 x 20mL)共蒸发。使用ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，20-80％)通过快速硅胶色谱直接纯化残余物，而不经任何后处理(workup)，以得到3.02g(72.5％)油状化合物S111。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ4.15(d，J 2.5Hz，4H)，3.68(s，4H)，3.59(s，4H)，2.44(t，J 2.5Hz，2H)，2.30-2.40(br，2H)；C11H16O4的ESI MS：计算值：212.24，观察值：[M+H]+ 213.2。
化合物S112
在0℃下，向二醇S111(3.0g，14.2mmol)、N，N-二异丙基乙胺(3.15mL，17.0mmol)和DMAP(0.36g，2.83mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中逐滴添加二甲氧基三苯甲基氯(4.8g，14.2mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液，并在室温下继续反应过夜。用二氯甲烷稀释混合物，并用水、接着用盐水洗涤之，并将有机层用无水Na2SO4干燥、过滤和蒸发。使用ISCOcompanion(己烷/乙酸乙酯，0-40％)通过快速硅胶柱纯化所得的残余物，以得到5.29g(73％)白色固体状单DMT保护的化合物S112。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.4-7.42(m，2H)，7.32-7.31(m，4H)，7.28-7.25(m，2H)，6.84-6.81(m，4H)，4.09(d，J 2.5Hz，4H)，3.79(s，6H)，3.67(d，J 6.0Hz，2H)，3.64-3.56(m，4H)，3.13(s，2H)，2.39(t，J 2.5Hz，2H)；C32H34O6的ESI MS：计算值：514.6，观察值：[M+Na]+ 537.4。
化合物S113
在室温下，向DMT-保护的化合物S112(0.5g，0.98mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液中逐滴添加2’-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰胺(0.58g，1.95mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液，接着在氩气气氛下添加5-苄硫基-1H-四唑(BTT；在乙腈中的0.25M溶液，0.78mL，0.18mmol)。继续反应，直至起始材料消失(2h)，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。将溶剂在真空中蒸发，并使用具有3％三乙胺作为共溶剂的乙酸乙酯/己烷(在Combi Flash Rf仪器上为0-30％梯度)通过硅胶柱色谱将粗混合物纯化，以得到0.53g油状化合物S113(75％)。C41H51N2O7P的ESI MS：计算值：714.82，观察值：715.6[M+H]+；31p NMR(202MHz，CDCl3)：(δ147.89。
化合物S114
在氩气气氛下，向DMT-保护的化合物S112(0.98g，1.9mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.09mmol)在8.0mL干燥二氯甲烷中的-78℃溶液中逐滴添加双-(N，N-二异丙基氨基)-氯膦(0.56g，2.09mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液。使反应混合物升温至室温，同时维持搅拌1h。在室温下添加3-丁炔-1-醇(0.14g，1.9mmol)在2.0mL干燥二氯甲烷中的溶液；将所得的混合物搅拌10分钟，此时添加ETT在乙腈中的0.25M溶液(4.6mL，1.15mmol)，并持续搅拌额外3h。在反应完成(如通过TLC观察到起始材料的消失)之后，将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，并依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。将挥发物在真空中蒸发，并使用具有3％三乙胺作为溶剂体系的乙酸乙酯/己烷(在Combi FlashRf仪器上为0-40％梯度)通过硅胶柱色谱将粗混合物纯化，以得到0.33g油状化合物S114(25％)。C42H52NO7P的ESI MS：计算值：713.83，观察值：714.7[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ146.89。
X3和X4连接子合成-方案2：
化合物S116
化合物S116使用针对化合物S110描述的方案作为油状物来制备，产率为91％。1HNMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.51(d，J 7.5Hz，2H)，7.37-7.32(m，3H)，5.56(s，1H)，3.37-3.35(m，4H)，4.10-4.07(dd，J 13.0Hz，J 2.5Hz，2H)，3.65-3.64(m，1H)，2.43-2.42(t，J6.5Hz，1H)；C13H14O3的ESI MS：计算值218.24，观察值：[M+H]+ 219.2。
化合物S117
化合物S117使用针对化合物S111描述的方案作为油状物来制备，产率为91％。1HNMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ4.33(s，2H)，3.83-3.70(m，5H)，2.48(s，1H)，2.04(br，2H)；C6H10O3的ESI MS：计算值：130.14，观察值：[M+Na]+ 153.0。
化合物S118
化合物S118使用针对化合物S112描述的方案作为白色固体来制备，产率为54％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.43(d，J 7.5Hz，2H)，7.37-7.27(m，5H)，7.23-7.16(m，2H)，6.83(d，J 9.0Hz，3H)，6.78-6.76(dd J 8.5Hz，1H)，4.35-4.22(m，2H)，3.77(s，6H)3.76-3.72(m，2H)，3.71-3.64(m，1H)，3.27-3.19(m，2H)，2.48(t，J 4.5Hz，1H)，2.03-1.96(m，1H)；C27H28O5的ESI MS：计算值：432.50，观察值：[M+Na]+ 455.4。
化合物S119
化合物S119使用针对化合物S113描述的方案作为油状物来制备，产率为86％。C36H45N2O6P的ESI MS：计算值：632.7，观察值：633.5[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ149.05，148.96。
化合物S120
化合物S120使用针对化合物S114描述的方案作为油状物来制备，产率为47％。C37H46NO6P的ESI MS：计算值：631.73，观察值：632.5[M+H]+；31p NMR(202MHz，CDCl3)：δ147.80，147.71。
连接子X5和X6的合成
化合物S121
向S115(4.0g，22.2mmol)在二氧六环(25mL)中的溶液中添加KOH(0.12g，2.2mmol)溶解在最少量的水中的溶液，并将所得的混合物在室温下搅拌至少30分钟。将混合物冷却至0℃，逐滴添加丙烯腈(2.35g，44.4mmol)在二氧六环(15mL)中的溶液，并使所得的混合物在室温下反应过夜。在真空中蒸发挥发物，用水稀释残余物，并调节pH至接近中性。用乙酸乙酯(2 x 50mL)萃取粗产物，并将合并的有机层用盐水洗涤并用无水Na2SO4干燥、过滤和蒸发，以得到残余物，使用ISCO companion(二氯甲烷/甲醇，0-5％)通过快速硅胶柱纯化该残余物，以得到3.1g(60％)白色固体状化合物S121。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49(d，J7.0Hz，2H)，7.36-7.34(m，3H)，5.56(s，1H)，3.36(d，J 13.0Hz 2H)，4.10-4.07(dd，J13.0Hz，J 2.0Hz，2H)，3.84(t，J 6.5Hz，2H)，3.42(m，1H)，3.69(t，J 6.5Hz，2H)；C13H15NO3的ESI MS：计算值：233.2，观察值：[M+Na]+ 256.3。
化合物S122
在0℃下，向氢化铝锂(0.83g，4.0mmol)在THF(10mL)中的悬浮液中逐滴添加化合物S121(1.28g，5.5mmol)在THF(15mL)中的溶液，将所得的混合物升温至室温，并继续搅拌3h。在反应完成之后，将反应混合物冷却至0℃，并按需通过逐滴添加冰冷的水(大约2-3mL)进行淬灭。添加额外的大约8mL水，并将粗产物萃取到乙酸乙酯(2 x 25mL)中。用盐水洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发，以得到化合物S122，其用于随后的步骤中，而不经进一步纯化。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49(d，J 7.0Hz，2H)，7.40-7.32(m，3H)，5.55(d，J 5.0Hz，1H)，4.34(d，J 13.0Hz，1H)，4.20-4.11(dd，J 12.0Hz 4H)，4.05-4.03(d，J 13.0Hz，J 2.0Hz，1H)，3.66-3.62(m，2H)，3.27(m，1H)，2.86(t，J 6.5Hz，1H)，2.16(br，2H)；C13H19NO3的ESI MS：计算值：237.2，观察值：[M+H]+ 238.2。
化合物S123
在0℃下，向在二氯甲烷(8mL)中的化合物S122(1.0g，4.2mmol)和N，N-二异丙基乙胺(2.3mL，12.6mmol)中逐滴添加Fmoc-OSu(1.7g，5.0mmol)的溶液，并使所得的混合物在室温下反应3h。在完成之后，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，并用水、接着用盐水洗涤。将有机层分离，用无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发，以得到残余物。使用ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，0-50％)通过快速硅胶柱纯化残余物，以得到0.65g(35％)白色固体状化合物S123。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(d，J 7.5Hz，2H)，7.58(d，J 7.5Hz，2H)，7.51(d，J7.5Hz，2H)，7.37(t，J 7.5Hz，2H)，7.31-7.26(m，5H)，5.57(s，1H)，5.48(br，1H)，4.46-4.32(m，4H)，4.15(d，J 7.0Hz，1H)，4.06(t，J 12.5Hz 2H)，3.67(m，2H)，3.54(m，2H)，3.41(s，1H)，1.88(t，J 6.0Hz，2H)；C28H29NO5的ESI MS：计算值：459.5，观察值：[M+Na]+ 482.5。
化合物S124
化合物S124使用针对化合物S111描述的方案作为油状物来制备，具有定量产率。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.76(d，J 7.5Hz，2H)，7.58(d，J 7.5Hz，2H)，7.39(t，J7.5Hz，2H)，7.32(t，J 7.5Hz，2H)，5.18(br，1H)，4.44(d，J 6.5Hz，2H)，4.21(t，J 6.5Hz，1H)，4.76-4.73(dd，J 11.5，3.5Hz 2H)，3.67-60(m，4H)，3.42(m，1H)，3.37(br，2H)，2.07(m，2H)，1.75(br，2H)；C21H25NO5的ESI MS：计算值：371.4，观察值：[M+Na]+ 394.3。
化合物S125
化合物S125使用针对化合物S112描述的方案作为白色固体来制备，产率为48％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(t，J 7.5Hz，2H)，7.58(t，J 7.5Hz，2H)，7.40-7.38(m，3H)，7.32-27(m，7H)，7.18-7.16(m，3H)，6.83(t，J 7.0Hz，4H)，5.16(br，1H)，4.44(d，J6.5Hz，2H)，4.20(m，1H)，3.80(s，3H)，3.79(m，1H)，3.76(s，3H)，3.74(m，2H)，3.66-3.62(m，4H)，3.43-3.37(m，2H)，2.31(br，1H)，1.76(br，2H)；C42H43NO7的ESI MS：计算值：673.7，观察值：[M+Na]+ 696.7。
化合物S126a
化合物S126a使用针对化合物S131描述的方案作为油状物来制备，产率为40％。31PNMR(202MHz，CDCl3)的ESI MS：δ147.19。C66H74N3O10P的ESI MS：计算值：1100.2，观察值：[M+H]+ 1101.4.
化合物S126
化合物S126使用针对化合物S113描述的方案作为油状物来制备，产率为78％。C51H60N3O8P的ESI MS：计算值：874.0，观察值：896.9[M+Na]+、913.0[M+K]+；31P NMR(202MHz，CDCl3；ppm)：(δ148.90，148.76。
连接子S131和S131a的合成-通用方案：
化合物S127
在氩气下，向S109(10.0g，44.6mmol)在二氯甲烷(180mL)中的溶液中添加溴乙腈(13.0g，108.4mmol)、氧化银(I)(20.7g，89.2mmol)和碘化四丁胺(3.3g，8.92mmol)，并将所得的混合物搅拌过夜。将混合物经过滤，并将滤液蒸发以得到黑色残余物，其在ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，15-90％)上经历快速硅胶柱纯化，以得到5.55g(41％)所需的粘性油状化合物S127。C16H18N2O4的ESI MS：计算值：302.3，观察值：[M+H]+ 303.3。
化合物S128
在氩气下，向化合物S127(5.55g，18.4mmol)在THF(80mL)中的溶液中添加LiAlH4在THF(2M，37.0mL，74.0mmol)中的溶液，并将混合物加热至55℃，持续5h。在反应完成之后，将混合物冷却至0℃，并用酒石酸钾钠的水溶液(1M，20mL)小心淬灭。向该混合物中添加二氯甲烷(30mL)，接着添加Fmoc-OSu(18.6g，55.2mmol)和DIEA(9.6mL，55.0mmol)。将混合物剧烈搅拌1h，并随后用二氯甲烷(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。过滤混合物，并随后蒸发，以得到残余物，该残余物在ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，20-90％)上经历快速硅胶柱纯化，以得到5.04g(36％)白色泡沫状S128。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(4H，dd，J 7.5，4.5Hz)，7.58(4H，t，J 7.0Hz)，7.48(2H，d，J7.0Hz)，7.41-7.34(7H，m)，7.32-7.26(4H，m)，5.44(1H，s)，5.15-5.05(2H，m)，4.44(2H，d，J5.5Hz)，4.38(2H，d，J 6.0Hz)，4.25-4.15(2H，m)，4.10(2H，d，J 11.5Hz)，3.82(2H，d，J11.5Hz)，3.78(2H，s)，3.53(2H，s)，3.42(2H，s)，3.36-3.27(4H，m)，3.25(2H，s)；C46H46N2O8的ESI MS：计算值：754.9，观察值：[M+H]+ 755.3。
化合物S129
将化合物S128(1.1g，1.51mmol)溶解在AcOH/H2O混合物(10mL，3∶1)中，并使反应在55℃下继续5h。在反应完成之后，将挥发物蒸发并与甲苯(2x 20mL)共蒸发，并使残余物在ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，30-100％)上经历快速硅胶柱纯化，以得到0.54g(54％)白色泡沫状S129。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(4H，d，J 7.5Hz)，7.58(4H，d，J7.5Hz)，7.39(4H，t，J 7.5Hz)，7.30(4H，t，J 7.5Hz)，5.20-5.05(2H，m)，4.41(4H，d，J6.5Hz)，4.21(4H，t，J 6.5Hz)，3.64(4H，s)，3.48(8H，s)，3.36(4H，s)；C39H42N2O8的ESIMS：计算值：666.7，观察值：[M+H]+ 667.3。
化合物S130
在0℃下，向二醇(0.73g，1.1mmol)、DIPEA(0.19mL，1.1mmol)和DMAP(0.013g，0.11mmol)在二氯甲烷(6mL)中的溶液中逐滴添加DMTrCl(0.34g，0.99mmol)在二氯甲烷(1.0mL)中的溶液。将所得的混合物升温至室温并搅拌过夜。将混合物蒸发，以得到残余物，该残余物在ISCO(己烷/乙酸乙酯，20-100％)上经历快速硅胶柱纯化，以得到0.47g(44％)白色泡沫状的单二甲氧基三苯甲基保护的化合物S130。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(4H，d，J 7.5Hz)，7.58(4H，d，J 7.5Hz)，7.39(4H，t，J 7.5Hz)，7.32-7.25(8H，m)，7.17(4H，d，J 6.5Hz)，6.83(4H，d，J 6.5Hz)，5.20-5.05(2H，m)，4.41(4H，d，J 6.5Hz)，4.21(4H，t，J6.5Hz)，3.82(6H，s)，3.64(4H，s)，3.48(8H，s)，3.36(4H，s)；C60H60N2O10的ESI MS：计算值：969.1，观察值：[M+Na]+ 991.3。
化合物S131
在-78℃下，将双-(N，N-二异丙基氨基)-氯膦(0.085g，0.32mmol)在干燥CH2Cl2(1.0mL)中的溶液逐滴添加至3-Fmoc-氨基-丙-1-醇(0.090g，0.30mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.18mL，1.05mmol)在干燥CH2Cl2(3.0mL)中的溶液。将反应混合物升温至室温，并搅拌1.5h。添加化合物S130(0.30g，0.30mmol)在1.0mL干燥CH2Cl2中的溶液，并将所得的混合物搅拌10min。将ETT(0.72mL，在乙腈中的0.25M，0.18mmol)的溶液添加至反应混合物中，并将所得的混合物搅拌3h。将混合物用CH2Cl2(20mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，并在真空中蒸发滤液，以产生残余物，该残余物在使用具有3％三乙胺作为共溶剂体系的乙酸乙酯/己烷的ISCO companion(0-30％梯度)上经历快速硅胶柱纯化，以得到0.12g白色泡沫状产物S131(32％)。C84H91N4O13P的ESIMS：计算值：1395.6，观察值：1395.7[M]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ146.41。
手性X-连接子-化合物S138、S139、S146和S147：
连接子S138和S139的合成-通用方案：
化合物S133
在0℃下，向(R)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(S132，4.88g，26.78mmol)、咪唑(3.64g，53.56mmol)在DCM(30mL)中的溶液中逐滴添加TBDMSC1(TBS-Cl，4.44g，29.46mmol)在DCM(15mL)中的溶液。在室温下继续反应2h，在TCL指示反应完成之后，用DCM稀释，并用水洗涤。用盐水洗涤合并的有机层，并用无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发，以得到残余物，使用ISCOcompanion(己烷/乙酸乙酯，0-20％)通过快速硅胶柱纯化该残余物，以得到5.42g(71％)所需的半固体状的化合物S133。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.35-7.7.32(m，5H)，4.55(s，2H)，3.86-3.84(m，1H)，3.69-3.65(m，2H)，3.64-3.50(m，2H)，2.44(br，1H)，0.89(s，9H)，0.07(s，6H)。C16H28O3Si的ESI MS：计算值：296.4，观察值：[M+H]+ 297.3。
化合物S135
在室温下，在H2气氛下将TBDMS保护的化合物(S133，5.6g，18.84mmol)与催化量的Pd在MeOH(40mL)中的溶液搅拌过夜。在TLC指示反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土床快速过滤、用甲醇洗涤、蒸发溶剂、在真空中干燥，以得到具有定量粗产率的S134，其用于下一步骤，而不经进一步纯化。
化合物S135使用针对化合物S112描述的方案作为白色固体来制备，产率为84％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.42(d，2H，J＝7.5)，7.33-7.28(m，5H)，7.26-7.18(m，2H)，6.84-6.80(m，4H)，4.14-4.10(m，2H)，3.82(s，6H)，3.79-3.66(m，2H)，3.20-3.14(m，1H)，2.41(d，1H，J＝5.5)，0.85(s，9H)，0.038(d，6H，J＝3.5)。C30H40O5Si的ESI MS：计算值：508.7，观察值：[M+Na]+ 531.7。
化合物S137
化合物S137以两个步骤程序来制备。使用与针对化合物S110报导的类似方案作来制备半固体状的中间体炔丙基保护的化合物(S136)，88％为产率。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.46(d，2H，J＝7.5)，7.34-7.33(m，3H)，7.32(m，2H)，7.28-7.26(m，2H)，6.82(d，4H，J＝7.0)4.33(t，2H，J＝2.5)，3.80(s，6H)，3.77(m，1H)，3.68-3.67(d，2H，J＝5.5)，3.20-3.18(m，2H)，2.38(m，1H)，0.83(s，9H)，0.02(d，6H，J＝4.0)。C33H42O5Si的ESI MS：计算值：546.7，观察值：[M+Na]+ 569.8。
在0℃下，向S136(1.3g，2.38mmol)在THF(10mL)中的溶液中缓慢添加TBAF(3.56mL，3.56mmol)的1M溶液，并在室温下继续反应3h。在TLC指示反应完成之后，蒸发溶剂，溶解在乙酸乙酯中并用水洗涤。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发，以得到残余物，该残余物使用ISCO companion(己烷/乙酸乙酯，0-40％)通过快速硅胶柱纯化，以得到0.82g(80％)所需的半固体状的化合物S137。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.42(d，2H，J＝7.5)，7.32-7.28(m，5H)，7.18-7.16(m，2H)，6.84(d，4H，J＝7.0)4.33(m，2H)，3.80(s，6H)，3.79-3.74(m，4H)，2.28-3.20(m，1H)，2.69(s，1H)，2.48-2.42(dt，1H，J＝2.5)。C27H28O5的ESI MS：计算值：432.5，观察值：[M+Na]+ 455.5。
化合物S138
化合物S138使用针对化合物S113描述的方案作为白色固体来制备，产率为80％。31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ149.00，148.91。C36H45N2O6P的ESI MS：计算值：632.7，观察值：[M+H]+ 633.6。
连接子S146和S147的合成-通用方案：
化合物S141
化合物S141使用针对化合物S133描述的方案由(S)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(S140)作为白色固体来制备，产率为75％。C16H28O3Si的ESI MS：计算值：296.4，观察值：[M+H]+297.3。
化合物S143
化合物S143使用针对化合物S135描述的方案作为白色固体来制备，产率为76％。C30H40O5Si的ESI MS：计算值：508.7，观察值：[M+Na]+ 531.6。
化合物S145
化合物S145以两个步骤程序来制备。首先，使用针对化合物S136报导的方案来制备半固体状的中间体炔丙基保护的化合物(S144)，产率为84％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.46(d，2H，J＝7.5)，7.34-7.33(m，3H)，7.32(m，2H)，7.28-7.26(m，2H)，6.82(d，4H，J＝7.0)4.33(t，2H，J＝2.5)，3.80(s，6H)，3.78(m，1H)，3.68-3.67(m，2H)，3.20-3.18(m，2H)，2.39(t，1H，J＝2.5)，0.83(s，9H)，0.02(d，6H，J＝4.0)。C33H42O5Si的ESI MS：计算值：546.7，观察值：[M+Na]+ 569.6。
化合物S145使用针对化合物S137描述的方案作为白色固体来制备，产率为86％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.44(d，2H，J＝7.5)，7.31-7.26(m，5H)，7.18-7.16(m，2H)，6.84-6.82(d，4H，J＝7.0)4.33(m，2H)，3.80(s，6H)，3.77-3.72(m，4H)，2.26-3.22(m，1H)，2.69(s，1H)，2.48-2.42(dt，1H，J＝2.5)。C27H28O5的ESI MS：计算值：432.5，观察值：[M+Na]+455.4。
化合物S146
化合物S146使用针对化合物S113描述的方案作为白色固体来制备，产率为86％。31P NMR(202MHz，CDCl3)：31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ149.00，148.90。C36H45N2O6P的ESI MS：计算值：632.7，观察值：[M+H]+ 633.7。
连接子S151和S152的合成-通用方案：
连接子S156和S157-通用方案：
可使用此处描述的并且也是本领域中已知的反应条件来制备连接子S151、S152、S156和S157。例如，化合物S140和S132可经历选择性TBS保护、丙烯腈加成、腈还原、Fmoc保护接着苄基去除和DMT保护、TBS去除，以分别得到S150和S155。这些化合物可分别转化成酰胺化物S151、S152和S156、S157，如上所示。
亚磷酰胺合成
方法1
在-78℃下，在氩气下向适当保护的核苷(20.7mmol)和N，N-二异丙基乙胺(22.7mmol)在100mL干燥二氯甲烷中的溶液中缓慢添加双-(N，N-二异丙基氨基)-氯膦(22.7mmol)在20mL二氯甲烷中的溶液。使反应混合物经1小时升温至室温，同时维持搅拌。向该混合物中添加适当的醇(20.7mmol)在15mL干燥二氯甲烷中的溶液，并将所得的混合物搅拌10分钟，此时逐滴添加0.25M ETT在乙腈中的溶液(12.42mmol)。在室温下将反应混合物搅拌额外16h。用200mL二氯甲烷稀释粗混合物，并依次用饱和NaHCO3溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并随后用无水Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，并使用乙酸乙酯/己烷(在CombiFlash Rf仪器上为0-30％梯度)通过硅胶柱色谱纯化所得的混合物，以得到白色粉末状亚磷酰胺的非对映异构体混合物。
方法2
在-78℃下，在氩气下向适当的醇(7.46mmol)和N，N-二异丙基乙胺(7.78mmol)在干燥二氯甲烷(15mL)中的溶液中添加双-(N，N-二异丙基氨基)-氯膦(7.78mmol)在二氯甲烷(5.0mL)中的溶液。使反应混合物经1h升温至室温，并将所得的溶液逐滴添加至适当保护的核苷(3.73mmol)和二异丙基铵四氮唑(7.46mmol)的二氯甲烷(15mL)悬浮液中。在室温下使反应继续额外16h。用15mL二氯甲烷稀释反应混合物，并依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并随后用无水Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，并使用乙酸乙酯/己烷(在Combi Flash Rf仪器上为0-60％梯度)通过硅胶柱色谱纯化混合物，以得到白色粉末状亚磷酰胺的非对映异构体混合物。
使用本文中描述的标准合成程序来合成各种亚磷酰胺。所制备的亚磷酰胺显示于表1中。
表1
靶向部分的合成
GalNAc(NAG)配体合成
D-半乳糖胺五乙酸酯(NAG2)的制备。在惰性气氛下将D-半乳糖胺(25.0g，116mmol)悬浮在无水吡啶(250mL)中并冷却至0℃。经2h期间添加乙酸酐(120mL，1160mmol)。在搅拌过夜之后，在真空中浓缩反应混合物。在添加甲醇之后，沉淀出白色固体，并经由过滤收集，以提供所需产物(42.1g，93％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ5.69(d，1H，J 9.0Hz)，5.40(m，1H)，5.37(d，1H，J 3.0Hz)，5.08(dd，1H，J 3.0Hz，11Hz)，4.44(dt，1H，J 9.5Hz，11Hz)，4.17(dd，1H，J 7.0Hz，11.5Hz)，4.11(dd，1H，，J 7.0Hz，11.5Hz)，4.01(t，1H，J 7.0Hz)，2.17(s，3H)，2.13(s，3H)，2.05(s，3H)，2.02(s，3H)，1.94(s，3H)，1.57(s，3H)。
5-羟基戊酸苄酯(NAG5)的制备。在70℃下，将δ-戊内酯(10.0g，100mmol)和NaOH(4.00g，100mmol)在水(100mL)中的溶液搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，并在真空中浓缩，以得到白色固体NAG4。将该固体悬浮在丙酮(100mL)中，并与苄基溴(20.5g，120mmol)和四丁基溴化铵(1.61g，0.50mmol)一起回流过夜。在真空中除去丙酮，以产生油状残余物，将该残余物溶解在EtOAc中，并用饱和NaHCO3(aq.)和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，以得到油状产物状的NAG5(17.1g，82％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.35(m，5H)，3.64(q，2H，J 6Hz，11.5Hz)，2.41(t，2H，J 7.5Hz)，1.75(m，2H)，1.60(m，2H)，1.44(t，1H，J 6Hz)。
苄氧基羰基丁基2-脱氧-2-N-乙酰基-3，4，6-三O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG7)的制备-方法A。在惰性气氛下，在环境温度下，将TMSOTf(8.56g，38.4mmol)添加至NAG2(10.0g，25.6mmol)在1，2-二氯乙烷(100mL)中的溶液中。在55℃下搅拌混合物2h，移走热源，并搅拌过夜。将反应混合物倒入冰冷的饱和NaHCO3(aq.)中，并用CH2Cl2萃取。将有机层经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，以得到浆状NAG6。在NAG6在1，2-二氯乙烷(60mL)中的溶液中投入醇NAG5(8.00g，38.4mmol)和分子筛。将混合物置于惰性气氛下，用TMSOTf(2.85g，12.8mmol)处理，并在室温下搅拌过夜。将混合物倒入冰冷的饱和NaHCO3(aq.)中，并用CH2Cl2萃取。将有机层经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，以得到浆状物。该粗材料通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生糖苷NAG7(3.3g，24％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.35(m，5H)，5.98(d，1H，J 7.0Hz)，5.57(m，1H)，5.34(d，1H，J 3.0Hz)，5.25(dd，1H，J 3.0Hz，11Hz)，5.10(s，2H)，4.63(d，1H，J 8.5Hz)，4.11(m，2H)，3.95(m，1H)，3.88(m，2H)，3.49(m，1H)，2.37(m，2H)，2.13(s，3H)，2.03(s，3H)，1.99(s，3H)，1.90(s，3H)，1.70(m，2H)，1.61(m，2H)。
苄氧基羰基丁基2-脱氧-2-N-乙酰基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG7)的制备-方法B。向NAG2(5.00g，12.8mmol)和醇NAG5(5.33g，25.6mmol)在1，2-二氯乙烷(50mL)中的溶液中一次性添加Sc(OTf)3(0.44g，0.90mmol)。将混合物置于惰性气氛下并回流3h。冷却之后，将混合物用CH2Cl2稀释、用饱和NaHCO3(aq.)洗涤、经MgSO4干燥并在真空中浓缩。通过SiO2凝胶色谱纯化，产生糖苷NAG7(5.53g，80％产率)。
羧基丁基2-脱氧-2-N-乙酰基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG8)的制备。将糖苷NAG7(1.50g，2.41mmol)在EtOH(25mL)中的溶液在真空中脱气，并用氩气吹扫。一次性添加钯催化剂(在活性炭上为10重量％，0.50g)，并将混合物在真空中脱气并用氩气吹扫。在非均相混合物中投入环己烯(25mL)并回流6h。冷却之后，通过过滤除去催化剂，并在真空中浓缩母液。通过SiO2凝胶色谱纯化粗产物，以产生白色泡沫状NAG8(0.76g，70％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ5.72(d，1H，J 8.5Hz)，5.35(d，1H，J 3.5Hz)，5.26(dd，1H，J3.5Hz，11.5Hz)，4.67(d，1H，J 8.5Hz)，4.17(dd，1H，J 6.5Hz，11.5Hz)，4.12(dd，1H，6.5Hz，11.5Hz)，4.00(dt，1H，J 8.5Hz，11.5Hz)，3.92(m，2H)，3.53(m，1H)，2.39(m，2H)，2.15(s，3H)，2.05(s，3H)，2.01(s，3H)，1.97(s，3H)，1.71(m，2H)，1.65(m，2H)。
氨丙基6-肼基烟酰胺丙酮腙(NAG11)的制备。将在二氯甲烷(20mL)中的Boc-6-肼基烟酸(520mg，2.1mmol)用EDCI(440mg，2.3mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS；260mg，2.3mmol)、Boc-二胺(650mg，2.6mmol)和N，N-二异丙基乙胺(1.1mL，6.2mmol)处理3h。将反应物在真空中浓缩并通过硅胶色谱纯化，以产生NAG10(364mg，43％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ8.55(br，1H)，7.93(d，2H，J 7.5Hz)，7.45(br，1H)，7.12(br，1H)，6.62(d，1H，J8.5Hz)，5.17(br，1H)，3.42(m，2H)，3.13(m，2H)，1.65(m，2H)，1.41(s，18H)。通过用三氟乙酸(9mL)和丙酮(1mL)处理NAG10(160mg，0.4mmol)1h形成HyNic丙酮腙。将反应混合物在真空中浓缩并置于高真空中，以产生NAG11。
三-(羧基乙氧基甲基)-甲基酰胺基-十二烷二酸甲酯(NAG14)的制备。向用HATU(122mg，0.50mmol)和N，N-二异丙基乙胺(218μL，1.25mmol)活化的十二烷二酸甲酯(211mg，0.42mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加三-连接子NAG12。在1h之后，将反应混合物在真空中浓缩并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生NAG13(214mg，70％产率)。C38H69NO12的MALDI-TOF质量计算值：731.48，实测值：755.10[M+Na]。三-叔丁酯NAG13用TFA∶TIPS∶DCM(9∶0.25∶1)混合物(10.25mL)水解4h，并在真空中浓缩，以得到三酸NAG14。C26H45NO12的MALDI-TOF质量计算值：563.29，实测值：565.33[M+H]。
三-(氨基丙酰胺基-乙氧基甲基)-甲基酰胺基-十二烷二酸甲酯(NAG16)的制备。向用HATU(557mg，1.35mmol)和N，N-二异丙基乙胺(470μL，2.70mmol)活化的三酸NAG14(230mg，0.41mmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加单Boc-1，3-二氨基丙烷(250mg，1.44mmol)。在1h之后，将反应混合物在真空中浓缩并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生NAG15(335mg，79％产率)。C50H93N7O15的MALDI-TOF质量计算值：1031.67，实测值：1056.40[M+Na]。化合物NAG15用TFA∶TIPS∶DCM(9∶0.25∶1)混合物(10.25mL)处理1h，并在真空中浓缩，以得到三胺NAG16。C35H69N7O9的MALDI-TOF质量计算值：731.51，实测值：733.18[M+H]。
三-GalNAc(NAG18)的制备。用在DMF(2mL)中的HATU(163mg，0.43mmol)和N，N-二异丙基乙胺(150μL，0.86mmol)处理单糖NAG8(192mg，0.43mmol)。在30min之后，添加NAG16(80mg，0.11mmol)在DMF(1mL)中的溶液，并将混合物搅拌1h。通过SiO2凝胶色谱纯化粗混合物，以产生NAG17(82mg，37％产率)。C92H150N10O39的质量计算值：2019.00，实测值：2041.85[M+Na]。通过用在THF∶H2O(3∶1)溶液(8mL)中的LiOH·H2O(34mg，0.81mmol)处理使全乙酰化的三聚体GalNAc(82mg，0.04mmol)水解，以产生NAG18。C73H130N10O30的MALDI-TOF质量计算值：1626.89，实测值：1634.52[M+Li]。
HyNic三聚体GalNAc(NAG19)的制备。将GalNAc三聚体NAG18(32mg，0.02mmol)和HyNic胺NAG11(20.0mg，0.08mmol)在DMF(1mL)中的溶液用EDCI(16.2mg，0.08mmol)、NHS(2.5mg，0.02mmol)和N，N-二异丙基乙胺(28μL，0.16mmol)处理，并搅拌4h。在真空中浓缩后，将粗产物溶解在DMSO中，并通过反相HPLC纯化，以产生NAG19(12.6mg，35％产率)。C85H147N15O30的MALDI-TOF质量计算值：1858.04，实测值：1859.83[M+H]。
叠氮基-Peg3-三聚体GalNAc(NAG21)的制备。将GalNAc三聚体羧酸NAG18(60mg，0.03mmol)、叠氮基-Peg3-胺NAG20(45.6mg，0.21mmol)、TBTU(23.8mg，0.07mmol)、HOBt(11.5mg，0.03mmol)和N，N-二异丙基乙胺(34μL)溶解在DMSO(0.5mL)中并搅拌2h。在真空中移除碱，并通过反相HPLC纯化粗产物，以产生NAG21(24mg，44％)。C81H146N14O32的AP-ESI+质量计算值：1827.02，实测值：914.8[M+2H]2+。
1-溴-2-脱氧-2-乙酰胺基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG22)的制备。在0℃冰浴中，在氩气球下，伴随搅拌向在DCM(90ml)中的D-半乳糖胺五乙酸酯(NAG2，10.0g，1当量，25.8mmol)悬浮液中逐滴添加三甲基溴硅烷(4.1mL，1.2当量，31mmol)。在10分钟之后移除冰浴，并使反应物在室温下搅拌过夜。使用75％己烷/乙酸乙酯移动相通过TLC(Hanessian染色)监测反应进程。将反应混合物在真空中浓缩，与环己烷(3x50mL)共沸，在高真空下干燥过夜，并按原样使用。
1-叠氮基2-脱氧-2-乙酰胺基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG23)的制备。将NAG22(10.6g，1.0当量，25.8mmol)溶解在DCM(100mL)中。向该溶液中添加在水(100mL)中的叠氮化钠(4.86g，2.9当量，74.8mmol)和四丁基硫酸氢铵(8.32g，0.95当量，24.5mmol)。将反应混合物剧烈搅拌1小时。使用75％己烷/乙酸乙酯移动相通过TLC(Hanessian染色)监测反应进程。用DCM(2x50mL)萃取反应混合物。将有机层经无水MgSO4干燥并在真空中浓缩。随后通过快速硅胶色谱(3∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化所得的残余物。收集的材料的1H NMR与公开的结构一致。观察到的[M+H]＝373.0。
1-氨基-2-乙酰胺基-1，2-二脱氧-3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(NAG24)的制备。通过抽空和用氩气吹扫(重复2x)来使NAG23(1.18g，3.17mmol)在乙酸乙酯(100mL)中的溶液脱气。向该混合物中添加钯催化剂(在活性炭上为10重量％，1/2小刮勺)。将搅拌的非均相反应混合物抽空并用H2(g)吹扫(重复2x)，并在室温下搅拌过夜。HPLC-MS确认产物形成。此时，通过过滤移除催化剂。浓缩流出物，产生NAG24，其按原样用于下一步骤。观察到的[M+H]＝346.6。
1-氨基（15’-叠氮基-四乙氧基-丙酰胺)-2-乙酰胺基-1，2-二脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG26)的制备。向NAG24(3.17mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(0.55mL，3.17mmol)和叠氮基-PEG4-NHS(1.00g，2.57mmol)。在室温下将反应混合物搅拌过夜。反相HPLC揭示水解的NHS酯的存在。添加HATU(0.49g，1.28mmol)和DIEA(0.55mL，3.17mmol)在DMF(2mL)中的溶液以帮助酰化。在1h之后，将反应物用二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO3(aq.)和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥并在真空中浓缩，以产生NAG25。将NAG 25(～2.57mmol)在MeOH(50mL)中的溶液置于Ar(g)下，并添加NaOMe(0.5mL，在MeOH中为25％(w/v))。在2小时之后，HPLC-MS显示所需产物，并用Dowex H+树脂淬灭反应。将树脂过滤掉，并在真空中蒸发溶剂。通过反相HPLC纯化粗产物，以产生NAG26(481mg，39％产率)。M+H＝493.7。
以类似方式合成具有Peg2、Peg6和Peg8的NAG26的Peg变型；参见表2。
表2
1-氨基(3’-丙酰胺-三-乙氧基-丙酰基-五氟苯酯)-2-乙酰胺基-1，2-二脱氧-3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(NAG40)的制备。向NAG24(1.56mmol)在DMSO(4mL)中的溶液中添加双-PFP-PEG4(1.00g，1.59mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.28mL，2.34mmol)。在室温下将反应混合物搅拌1h，并且反相HPLC确认所需产物NAG40的形成。通过反相HPLC纯化粗产物，以产生NAG40(0.33g，27％产率)。C32H41F5N2O15的ESI MS+质量计算值：788.2，实测值：789.3[M+H]。
[5-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氨基)-5-氧代戊酰基]-2-脱氧-2-N-乙酰基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG27)的制备。向NAG8(1.00g，2.24mmol)在THF(8mL)中的溶液中添加N，N’-二异丙基碳二亚胺(0.56g，4.48mmol)和HOBt(0.25g，2.17mmol)。在1h之后，形成白色沉淀物并将反应物冷却至0℃。添加叠氮基-Peg3-胺(0.63g，2.91mmol)在THF(2mL)中的溶液，并将反应物搅拌额外的1h。反相HPLC-MS显示化合物NAG27形成。C27H45N5O13的ESI MS+质量计算值：647.7，实测值：647.8[M+H]。通过过滤除去沉淀物，并在真空中浓缩反应混合物，以得到浓稠的浆状物。
[5-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氨基)-5-氧代戊酰基]-2-脱氧-2-N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG28)的制备。将粗NAG27溶解在无水甲醇(10mL)中，并用在MeOH中的NaOMe(25wt％，250μL)处理。在室温下将反应物搅拌过夜。此时，反相HPLC-MS显示化合物NAG27消耗和化合物NAG28形成。C21H31N5O10的ESI MS+质量计算值：521.6，实测值：522.3[M+H]。添加Dowex H+树脂以中和碱，过滤掉树脂，并将液体在真空中浓缩，以得到粗产物，其通过反相HPLC纯化以产生化合物NAG28(0.42g，经两个步骤的产率为36％)。
([3-(叔丁氧基羰基氨基)丙氨基])-5-氧代戊酰基]-2-脱氧-2-N-乙酰基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG29)的制备。用HATU(0.25g，0.65mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.34mL，1.95mmol)处理NAG8(0.29g，0.65mmol)在DMF(3mL)中的溶液。在10min之后，添加NH-Boc-1，3-二氨基丙烷(0.13g，0.72mmol)，并将所得的混合物搅拌2h。将混合物在真空中浓缩，并通过SiO2色谱纯化，以提供化合物NAG29(0.30g，77％产率)。C27H45N3O12的ESI MS+质量计算值：603.7，实测值：626.8[M+Na]。
([3-(氨基)丙氨基])-5-氧代戊酰基]-2-脱氧-2-N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG31)的制备。用在MeOH中的NaOMe(25wt％，50μL)处理NAG29(0.30g，0.50mmol)在无水甲醇中的溶液。在20min之后，TLC显示NAG29完全消耗。添加Dowex强H+树脂以酸化反应物，并搅拌30min。过滤掉树脂并用在MeOH中的1％TEA和1M NaOH(aq)洗涤。将滤液用1M HCl(aq)中和并在真空中浓缩，以产生NAG31(0.052g，28％产率)。C16H31N3O7的ESI MS+质量计算值：377.4，实测值：377.6[M+H]。
({3-[6-(亚异丙基肼基)-烟酰氨基]丙氨基}-5-氧代戊酰基)-2-脱氧-2-N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG32)的制备。用HyNic-磺基-NHS(0.007g，18μmol)和N，N-二异丙基乙胺(9.4μL，54μmol)将NAG31(0.009g，22μmol)在DMSO(1mL)中的溶液处理1h，并通过反相HPLC纯化，以产生NAG32TFA盐(0.010g，68％产率)。C25H40N6O8的ESI MS+质量计算值：552.6，实测值：554.0[M+H]。
1-氨基-(15’-叠氮基-二乙二醇丙酰基)2-乙酰胺基1，2-二脱氧3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖苷(NAG33)的制备。在氩气球下，伴随搅拌向NAG24(2.3g，6.7mmol)在乙酸乙酯(90mL)和N，N-二异丙基乙胺(1.7mL，9.9mmol)中的溶液中逐滴添加在乙酸乙酯(10mL)中的叠氮基-PEG2-NHS(1.0g，3.3mol)。在室温下使反应混合物搅拌过夜。通过LC-MS确认反应完成。ESI MS+。通过反相HPLC纯化粗产物，以产生NAG33(1.2g)。C21H33N5O11的质量计算值：531.22，实测值：532.3[M+H]+。
1-氨基-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基]-2-乙酰胺基-1，2-二脱氧-3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖(NAG34)的制备。向溶解在乙酸乙酯(25mL)中的NAG33(1.2g，2.3mmol)中添加钯(在活性炭上的10％Pd，122mg)。接下来插入氢气球和真空管线。将反应容器抽空并用氢气吹扫(三次循环)。在室温下搅拌1h之后，反相HPLC-MS确认产物形成。将反应物经床过滤，并用EtOAc(3x10mL)洗涤。在真空中浓缩，以定量产率产生NAG34。C21H35N3O11的ESI MS+质量计算值：505.23，实测值：506.3[M+H]+。
全乙酰化叠氮基-Peg2-N-GalNAc三聚体(NAG36)的制备。向三酸连接子M13(52.5mg，0.07mmol)和N，N-二异丙基乙胺(73.2μL，0.42mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加在DMF(2mL)中的HATU(119.8mg，0.32mmol)。使反应物在室温下搅拌10min。接下来，添加在DMF(1mL)中的NAG34(159mg，0.32mmol)，并在室温下将混合物搅拌过夜。18h后LC-MS确认产物形成。添加水(10mL)，并用DCM(3 x 5mL)洗涤所得的混合物。将合并的有机层经Na2SO4干燥、过滤并在真空中除去挥发物，以产生NAG35(155mg)。C96H158N14O44的ESI MS+质量计算值：2210.5，实测值：1106.8[M+2H]2+。向NAG35(155mg，70μmol)在MeOH(5mL)中的溶液中添加甲醇钠(25重量％MeOH，100μL)。在室温下，在氩气球下将反应混合物搅拌1h。1h后LC-MS显示产物形成以及起始材料消失。添加Dowex H+树脂以中和反应混合物。过滤掉树脂，并在真空中除去挥发物。通过反相HPLC纯化粗产物，以产生NAG36(10mg)。C78H140N14O35的ESI MS+质量计算值：1832.96，实测值：917.7[M+2H]2+。
叶酸配体的合成
N-Boc-Peg11叶酸(F2)的制备。向叶酸(225mg，0.51mmol)在DMSO(4mL)中的溶液中添加二异丙基碳二亚胺(80μL，0.51mmol)。在搅拌1.5h之后，添加Boc-Peg11-二胺(220mg，0.34mmol)在DMSO(1mL)中的溶液，并将反应物搅拌过夜。在添加水(35mL)之后，沉淀出固体。通过过滤收集沉淀物，并通过反相HPLC纯化，以产生F2(364mg，67％产率)。C48H77N9O18的MALDI-TOF质量计算值：1067.54，实测值：1069.89[M+H]。
叶酸-peg11-HyNic丙酮腙(F3)的制备。用TFA(9mL)和丙酮(1mL)将单Boc F2(210mg，0.2mmol)处理1.5h，在真空中浓缩，并在高真空下干燥。C43H69N9O16的MALDI-TOF质量计算值：967.48，实测值：969.86[M+H]。将粗产物淡黄色固体溶解在DMSO(200μL)中，并用HyNic-NHS酯(10.0mg，0.03mmol)和DIEA(40μL，0.23mmol)的溶液处理1.5h。通过RP-HPLC纯化粗产物，以产生F3(1.2mg，3.5％产率)。C52H78N12O17的MALDI-TOF质量计算值：1142.56，实测值：1144.03[M+H]。
一价叶酸叠氮化物的合成
叠氮基-Peg4-酰胺基-Peg11叶酸(F6)的制备。将在DMSO(1.0mL)中的氨基-Peg11叶酸F4(115mg，0.12mmol)添加至用TBTU(42mg，0.13mmol)、HOBt(20mg，0.13mmol)和DIEA(63μL，0.36mmol)活化的叠氮基-Peg4酸(38mg，0.13mmol)在DMSO(1.0mL)中的溶液中。在2h之后，在真空中除去碱，并通过RP-HPLC纯化粗产物，以产生F6(75mg，50％)。C54H88N12O21的AP-ESI+质量计算值：1240.61，实测值：1241.7[M+H]+，621.5[M+2H]2+。
PSMA配体的合成
Cbz-Lys脲基Glu三叔丁酯(PSMA4)的制备。向谷氨酸二叔丁酯(1.06g，3.58mmol)、DMAP(27mg)和TEA(1.25mL，8.95mmol)在CH2Cl2(10.0mL)中的冰冷的溶液中一次性添加CDI(638mg，3.94mmol)。在30min之后，将反应物从冰浴中移走，并搅拌过夜。将反应物用CH2Cl2稀释并用饱和NaHCO3(aq.)、水和盐水洗涤。在经Na2SO4干燥之后，将有机层在真空中浓缩并在高真空下干燥，以得到PSMA2。将PSMA2在DCE(10mL)中的溶液冷却至0℃，并依次用MeOTf(0.59g，3.58mmol)和TEA(1.00mL，7.16mmol)处理。在45min之后，添加在DCE(2mL)中的Cbz-Lys叔丁酯PSMA3(1.34g，3.58mmol)，并将混合物在40℃下加热。在2h之后，将反应物用CH2Cl2稀释，并用饱和NaHCO3(aq.)、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，以产生浓稠的浆状物。将粗材料通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生白色泡沫状PSMA4(1.73g，78％)。C32H51N3O9的AP-ESI+质量计算值：621.36，实测值：622.4[M+H]+，644.4[M+Na]+。
Lys脲基Glu三叔丁酯(PSMA5)的制备。通过施加真空和用氩气回填将PSMA4(1.73g，2.79mmol)在EtOAc(100mL)中的溶液脱气。一次性添加钯(在活性炭上为10重量％，0.15g)，并通过施加真空和用H2(g)回填将混合物脱气，并搅拌6h。通过过滤移除催化剂，并在真空中浓缩母液，以定量地得到PSMA5。C24H45N3O7的AP-ESI+质量计算值：487.32，实测值：488.4[M+H]+。
一价PSMA叠氮化物(PSMA7)的合成
叠氮基Peg4 Lys脲基Glu三叔丁酯(PSMA6)的制备。在DMF(3.0mL)中将叠氮基Peg4酸(133mg，0.45mmol)用TBTU(146mg，0.45mmol)、HOBt(69mg，0.45mmol)和DIEA(216μL，1.24mmol)活化。在15min之后，递送PSMA5(202mg，0.41mmol)的溶液，并将反应物在室温下搅拌1.5h。RP-HPLCMS显示所需产物形成。将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA6(257mg，83％)。C35H64N6O12的AP-ESI+质量计算值：760.46，实测值：761.5[M+H]+，783.5[M+Na]+。
叠氮基Peg4 Lys脲基Glu(PSMA7)的制备。将三叔丁酯PSMA6(257mg，0.34mmol)用TFA∶TIPS(10mL，97.5∶2.5，v/v)的溶液处理30min。RP-HPLCMS显示所需产物的完全转化。将反应物在真空中浓缩，并通过RP-HPLC纯化，以产生PSMA7(112mg，56％)。C23H40N6O12的AP-ESI+质量计算值：592.27，实测值：593.3[M+H]+。
一价PSMA HyNic(PSMA10)的合成
N-Boc 4-肼基-烟酰胺基Peg4酸(PSMA8)的制备。在DMF中将N-Boc 4-肼基烟酸NAG9(137mg，0.54mmol)用TBTU(124mg，0.49mmol)、HOBt(83mg，0.54mol)和DIEA(128μL，0.74mmol)处理20min。向经活化的酯中添加氨基-Peg4-酸(130mg，0.49mmol)的溶液，并将混合物搅拌2h。将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA8(107mg，44％)。C22H36N4O9的AP-ESI+质量计算值：500.25，实测值：501.3[M+H]+。
N-Boc 4-肼基-烟酰胺基Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu三叔丁酯(PSMA9)的制备。在DMF中、在二胺PSMA5(104mg，0.21mmol)存在下用HATU(81mg，0.21mmol)和DIEA(93μL，0.53mmol)将PSMA8(107mg，0.21mmol)处理1h，在此之后，将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA9(85mg，42％)。C46H79N7O15的AP-ESI+质量计算值：969.46，实测值：760.6[M+H]+。
二甲基4-亚肼基烟酰胺基Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu(PSMA10)的制备。将三叔丁酯PSMA9(85mg，0.09mmol)用TFA∶丙酮的溶液(10mL，97.5∶2.5，v/v)处理30min。RP-HPLCMS显示完全转化成所需产物。将反应物在真空中浓缩，并通过RP-HPLC纯化，以产生PSMA10(55mg，84％)。C32H51N7O13的AP-ESI+质量计算值：741.35，实测值：742.4[M+H]+。
二价PSMA叠氮化物(PSMA18)的合成
N-Fmoc双-亚氨基-(乙酰胺基-Peg4叔丁酯)(PSMA13)的制备。在DMF中将N-Fmoc亚氨基二乙酸，PSMA11(107mg，0.30mmol)用PSMA12(212mg，0.66mmol)、TBTU(193mg，0.60mmol)、HOBt(92mg，0.60mmol)和DIEA(209μL，1.20mmol)处理2h。将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA13(250mg，91％)。C49H75N3O16的AP-ESI+质量计算值：961.51，实测值：962.6[M+H]+，984.6[M+Na]+。
N-Fmoc双-亚氨基-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu三叔丁酯)(PSMA15)的制备。将在DCM(1mL)中的二叔丁酯PMSA13(250mg，0.26mmol)用TFA(10mL)和TIPS(111μL，0.54mmol)处理。在30min之后，将反应物在真空中浓缩以产生浆状物，将其用己烷洗涤以产生浓稠浆状二酸PSMA14。在DMF中将PSMA14用HATU(198mg，0.54mmol)、PSMA5(292mg，0.57mmol)和DIEA(362μL，2.08mmol)处理1h。将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA15(408mg，88％)。PSMA14：C41H59N3O16的AP-ESI+质量计算值：849.39，实测值：850.5[M+H]+，872.5[M+Na]+。PSMA15：C89H145N9O28的AP-ESI+质量计算值：1788.02，实测值：895.3[M+2H]2+，917.2[M+2Na]2+。
双-亚氨基-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu三叔丁酯)(PSMA16)的制备。将在乙腈(10mL)中的N-Fmoc PMSA15(408mg，0.22mmol)用哌啶处理30min。将反应物在真空中浓缩、与PhMe(3x10mL)共沸、用己烷(3x20mL)洗涤并在高真空下干燥，以产生PSMA16。C74H135N9O26的AP-ESI+质量计算值：1565.95，实测值：895.3[M+2H]2+，917.2[M+2Na]2+。
叠氮基-Peg4-亚氨基-双-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu三叔丁酯)(PSMA17)的制备。将胺PMSA16(172mg，0.11mmol)添加至在DMF(2mL)中用HATU(52mg，0.14mmol)和DIEA(116μL，0.66mmol)活化的N3-Peg4-COOH(40mg，0.14mmol)中。在1h之后，将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA17(194mg，91％)。C85H154N12O31的AP-ESI+质量计算值：1839.08，实测值：895.3[M+2H]2+，917.2[M+2Na]2+。
叠氮基-Peg4-亚氨基-双-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu)(PSMA18)的制备。将六-叔丁酯PSMA17(194mg，0.10mmol)用TFA∶丙酮的溶液(10mL，97.5∶2.5，v/v)处理30min。RP-HPLCMS显示完全转化成所需产物。将反应物在真空中浓缩，并通过RP-HPLC纯化，以产生PSMA18(69.4mg，44％)。C61H106N12O31的AP-ESI+质量计算值：1502.70，实测值：752.5[M+2H]2+。
二价PSMA HyNic(PSMA20)的合成
N-Boc4-肼基-烟酰胺基Peg4-亚氨基-双-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu三叔丁酯)(PSMA19)的制备。将胺PMSA16(172mg，0.11mmol)添加至在DMF(2mL)中用HATU(46mg，0.12mmol)和DIEA(116μL，0.66mmol)活化的PSMA8(61mg，0.12mmol)中。在1h之后，将反应物在真空中浓缩，并通过SiO2凝胶色谱纯化，以产生PSMA19(201mg，89％)。C96H169N13O34的AP-ESI+质量计算值：2048.19，实测值：1025.3[M+2H]2+，684.0[M+3H]3+。
二甲基4-亚肼基-烟酰胺基-Peg4-亚氨基-双-(乙酰胺基-Peg4-ε-酰胺基lys-α-脲基-glu)(PSMA20)的制备。将六-叔丁酯PSMA19(201mg，0.10mmol)用TFA∶丙酮的溶液(10mL，9∶1，v/v)处理60min。RP-HPLCMS显示完全转化成所需产物。将反应物在真空中浓缩，并通过RP-HPLC纯化，以产生PSMA20(69.4mg，44％)。C70H117N13O32的AP-ESI+质量计算值：1651.79，实测值：827.1[M+2H]2+。
甘露糖配体的合成：
Lys6-Peg24-HyNic(M5)的制备。使用标准Fmoc化学在Rink酰胺树脂(0.61mmol/g)上、伴随HCTU偶联和20％哌啶脱保护来合成肽支架。简言之，在自动化合成器上以25μmol的规模制备肽M1。在Lys(Mtt)的脱保护之后，偶联Peg24氨基(Mtt)酸，以提供M3。Mtt基团的去除和随后BocHyNic的偶联提供M4。使用三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水∶丙酮∶二硫苏糖醇(90∶2∶2∶3∶3)使肽从树脂中释放以及通过RP-HPLC进行纯化产生M5(7.0mg)。C96H185N17O32的AP-ESI+质量计算值：2088.33，实测值：1046m/2z、698m/3z、524m/4z。
Man6-Lys6-Peg24-HyNic(M6)的制备。将在DMSO(1mL)中的肽支架M5(7.0mg)用甘露糖异硫氰酸酯(8.0mg)和N-甲基吗啉(NMM；200μL)处理。将反应物在37℃下搅拌4h并通过RP-HPLC纯化以产生M6(1.2mg)。C174H275N23O68S6的MALDI-TOF质量计算值：3966.70，实测值：3987.39[M+Na]。
六价甘露糖叠氮化物(M9)的合成
Lys6-Peg24-叠氮化物(M8)的制备。使用标准Fmoc化学在Rink酰胺树脂(0.61mmol/g)上、伴随HCTU偶联和20％哌啶脱保护来合成肽支架。简言之，在自动化合成器上以100μmol的规模制备肽M1。在Lys(Mtt)的脱保护之后，偶联叠氮基Peg24酸，以提供M7。使用混合物TFA∶TIPS∶H2O(92.5∶2.5∶5)使肽从树脂中释放产生M8(167.0mg)。C87H174N16O31的MALDI-TOF质量计算值：1940.4，实测值：1941.1。
Man6-Lys6-Peg24-Azide(M9)的制备。用甘露糖异硫氰酸酯和NMM(500μL)处理在DMSO(2mL)中的肽支架M4(167.0mg)。在37℃下搅拌反应物，并通过MALDI-TOF监测之，直至实现至所需产物的完全转化(总共添加58mg的甘露糖异硫氰酸酯)。通过RP-HPLC纯化最终产物，以产生M9(22mg)。C165H264N22O6756的MALDI-TOF质量计算值：3820.37，实测值：3843.79[M+Na]。
三价甘露糖叠氮化物(M15)的合成
叠氮基三-甘露糖(M15)的制备：在吡啶中通过Ac2O将D-甘露糖全乙酰化过夜。通过旋转蒸发进行浓缩、接着与PhMe共沸，以定量产率提供五乙酸酯(M8)。在市售可得的叠氮基Peg2醇的存在下，用Sc(OTf)3活化M8，产生叠氮基-Peg2甘露糖苷(M9)，其经定量氢化成胺(M10)。同时，将三连接子的甲酯(NAG13)选择性水解，以产生酸(M11)。通过TBTU活化进行市售可得的叠氮基Peg3胺与M11的偶联提供叠氮基三连接子(M12)。用TFA处理三叔丁酯M12得到三酸M13。通过HATU介导M10与M13的偶联，并将粗混合物整体脱乙酰化，以产生叠氮基三甘露糖(M15)。
一价甘露糖亚磷酰胺(M21)的合成
甘露糖二硫化2-氟尿苷亚磷酰胺(M21)的制备：通过标准保护/脱保护化学，将M9的乙酸酯通过脱乙酰化的中间体M16转化成叔丁基甲硅烷基(TBS)M17。通过氢化将叠氮化物M17还原成胺M18促进用位阻硫代内酯进行N-酰化以产生硫醇M19。通过添加芳基巯基-硫代吡啶干净地形成二硫化物M20，其用MeOTf预活化。通过用双(二异丙基氨基)氯膦处理2-氟尿苷，接着添加糖二硫化物M20，以标准两步一锅法方式形成亚磷酰胺M21。
六价甘露糖叠氮化物(M30)的合成
N-苄氧羰基三-(叔丁氧基羰基乙氧基甲基)-甲基酰胺(M22)的制备：向在冰浴中冷却的NAG12(3.55g，7.02mmol)在CH2Cl2(12mL)中的溶液中添加Cbz-Cl(在PhMe中为35％，7.3mL)和TEA(3.9mL)。将反应物升温至室温并搅拌过夜。将混合物用CH2Cl2稀释、用饱和NaHCO3(aq)洗涤、经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。将粗产物油通过SiO2色谱纯化，以产生M22(0.98g，22％产率)。C33H53NO11的AP-ESI+质量计算值：639.4，实测值：662.4[M+Na]+。
N-苄氧羰基三-((2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-α-D-吡喃甘露糖基)-Peg3-酰胺基乙氧基甲基)-甲基酰胺(M24)的制备：将在CH2Cl2(5mL)中的三叔丁酯M22(0.97g，1.51mmol)和TIPS(0.93mL，4.55mmol)用TFA(20mL)处理5h。将混合物在真空中浓缩，将油状残余物用己烷洗涤并在高真空下干燥以提供M23。C21H29NO11的AP-ESI+质量计算值：471.2，实测值：493.9[M+Na]+。
将在DMF(5mL)中的粗M23在冰浴上冷却并用HATU(0.62g，1.63)和DIEA(0.65mL，3.71mmol)处理。在搅拌20min之后，添加M10(0.89g，1.86mmol)在DMF(5mL)中的溶液，并将混合物升温至室温并搅拌3h。将溶剂在真空中除去，并将粗产物溶解于EtOAc中、用饱和NaHCO3(aq)洗涤、经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。通过SiO2色谱纯化产生M24(0.49g，62％产率)。C81H122N4O44的MALDI-TOF质量计算值：1854.74，实测值：1850.14。
三-((2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-α-D-吡喃甘露糖基)-Peg3-酰胺基乙氧基甲基)-甲基胺(M25)的制备：将M24(0.49g，0.26mmol)的溶液用HOAc(0.2mL)溶解于EtOAc(50mL)中，通过施加真空并用Ar(g)回填使其脱气。添加在活性炭上的Pd(0.16g)，并将混合物抽空并用H2(g)回填三次。将反应物搅拌2天，通过过滤移除催化剂，并将母液在真空中浓缩，以产生M25。C73H116N4O42的AP-ESI+质量计算值：1720.7，实测值：1723.42。
叠氮基-Peg4-亚氨基-双-(乙酰胺基-Peg4-叔丁酯)(M27)的制备：将在CH2Cl2中的N-Fmoc PSMA13(0.72g，0.75mmol)用哌啶(0.75mL)处理1小时。HPLCMS显示完全转化成M26，C34H65N3O14的AP-ESI+质量计算值：739.4，实测值：740.5[M+H]+。
将混合物在真空中浓缩并与PhMe共沸。使粗M26与叠氮基Peg4酸(0.44g，1.51mmol)、HATU(0.57g，1.51mmol)以及DIEA(0.52mL)在DMF(5mL)中的溶液反应1h。在真空中除去溶剂之后，将粗产物溶解于EtOAc中、用饱和NaHCO3(aq.)洗涤、经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。通过SiO2色谱纯化产生M27(0.71g，93％产率，两步)。C45H84N6O19的AP-ESI+质量计算值：1012.6，实测值：1013.6[M+H]+。
叠氮基-Peg4-亚氨基-双-(三聚体甘露糖)(M30)的制备：将亚氨基连接子M27(0.69g，0.68mmol)用TIPS(0.28mL，1.36mmol)和TFA(10mL)处理以产生三酸M28；C37H68N6O19的AP-ESI+质量计算值：900.5，实测值900.9[M+H]+、922.9[M+Na]+。在真空中除去挥发物，并在高真空下干燥M28。在0℃下在DMF(2mL)中将二酸M28(82.0mg，0.09mmol)用HATU(75mg，0.2mmol)和DIEA(0.28mL)活化。在30min之后，添加M25(0.26mmol)在DMF(2mL)中的溶液，并将混合物升温至室温并搅拌2h。RP-HPLCMS显示完全转化成M29；C183H296N14O101的质量计算值：4305.84，MALDI-TOF实测值：4303.36，AP-ESI+实测值：1436.1[M+3H]3+，1077.3[M+4H]4+。将反应物用CH2Cl2稀释、用饱和NaHCO3(aq.)洗涤、经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。将粗M29油(538mg)溶解于MeOH(20mL)中，并用NaOMe(在MeOH中为25wt％，0.5mL)处理1h。RP-HPLCMS显示完全转化成M30。通过用Dowex H+树脂中和来淬灭反应。通过HPLC纯化粗材料以产生M30(38.1mg，经过3个步骤后，13％产率)。C135H248N14O77的质量计算值：3297.59，MALDI-TOF实测值：3318.61，[M+Na]+ AP-ESI+实测值：1100.0[M+3H]3+，825.3[M+4H]4+。
实施例2.多核苷酸构建体和杂交的多核苷酸构建体的合成
实验细节：
将所合成的所有多核苷酸构建体在2’-核糖位置处用2’-F和2’-OMe修饰进行修饰，以改善血清稳定性并降低脱靶效应。用以下试剂/溶剂进行自动化多核苷酸合成(1μmol规模)：
氧化剂-0.02M I2于THF/吡啶/H2O中(每个循环60s氧化)
去封闭-3％三氯乙酸(每个循环2x 40s去封闭)
封端混合物A-THF/吡啶/Pac2O(每个循环60s封端)
封端混合物B-THF中的16％甲基咪唑(每个循环60s封端)
硫化-0.05M硫化试剂，3-((N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)，于60％吡啶/40％乙腈中(每个循环360s硫化)
与标准寡核苷酸合成条件的不同如下：
-使用用于更温和脱保护的具有Q-连接子(氢醌-O，O’-二乙酸连接臂)的CPG支持体
-在合成之前将所有二硫化亚磷酰胺在无水乙腈中再悬浮至100mM的浓度
-用2.5倍摩尔过量的5-苄硫基-1-H-四唑(BTT)进行亚磷酰胺活化。每次插入，将活化的亚磷酰胺偶联2×3分钟偶联步骤。
多核苷酸脱保护和纯化方案：
-在自动多核苷酸合成之后，在室温下在1ml的在甲醇中的10％二异丙胺(10％DIA/MeOH)中将磷酸三酯多核苷酸裂解并脱保护4小时。在4小时脱保护之后，将多核苷酸样品通过离心蒸发进行干燥。
-当磷酸三酯多核苷酸含有标准核碱基保护基团(例如A-Bz、C-Ac和G-iBu等)时，使用以下裂解和脱保护条件：将磷酸三酯多核苷酸在室温下在1.0mL的AMA(甲醇中的1∶1比例的36％氨水和40％甲胺)中裂解并脱保护2小时，接着进行离心蒸发。
-将粗多核苷酸丸粒再悬浮于100μL的50％乙腈中，短暂加热至65℃，并彻底地涡旋。将总计100μL粗多核苷酸样品注射到反相HPLC上，使用以下缓冲液/梯度：
●缓冲液A＝50mM三乙基乙酸铵(TEAA)水溶液
●缓冲液B＝90％乙腈
●流速＝1mL/min
●梯度：
■0-2min(100％缓冲液A/0％缓冲液B)
■2-42min(0％至60％缓冲液B)
■42-55min(60％至100％缓冲液B)
-跨主要反相HPLC峰，收集0.5mL级分并通过MALDI-TOF质谱进行分析，以确认具有期望质量峰的化合物的存在。将含有具有正确质量峰的化合物的纯化级分冷冻并冻干。一旦干燥，将级分再悬浮、与相应级分合并、冷冻并冻干，以得到最终产物。
将需要额外脱保护的三酯插入物首先如上文所描述进行分离，接着进行必要的二次脱保护步骤(参见下文)：
具有缩醛基团的磷酸三酯多核苷酸的二次脱保护：
将反相HPLC纯化的多核苷酸产物再悬浮于100μL的80％甲酸中。对于每种醛修饰，使反应物在室温下进行～1h。通过MALDI-TOF质谱监测反应以确认完全脱保护。一旦脱保护完成，将样品冷冻并冻干直到干燥。然后将冻干的样品再悬浮于1mL的20％乙腈水溶液中并进行凝胶过滤来分离最终的多核苷酸构建体。
具有TBDMS保护的磷酸三酯多核苷酸的二次脱保护：
将反相HPLC纯化的多核苷酸产物再悬浮于219μL的无水DMSO中，短暂加热至65℃，并且彻底地涡旋。向该DMSO溶液中添加31μL的6.1M三乙胺三氢氟酸盐(TEA.3HF)以得到0.75M的最终浓度。对于每种TBDMS-保护的羟基修饰，使反应物在室温下进行～1h。通过MALDI-TOF质谱监测反应以确认完全脱保护。一旦脱保护完成，依次添加35μL的3M乙酸钠和1mL丁醇。将样品彻底地涡旋并置于-80℃下持续2h。在2h之后，将样品离心以使多核苷酸成丸。移除丁醇层，并将多核苷酸丸粒再悬浮于1mL的20％乙腈水溶液中。将样品进行凝胶过滤来分离最终的多核苷酸构建体。
杂交的多核苷酸构建体的制备
使用标准条件来使等比例的过客链和引导链退火，以提供具有约90％的良好纯度的杂交的多核苷酸构建体，如通过凝胶电泳所确认的。
立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯
包括立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯的多核苷酸构建体可如本文中所描述并利用本领域中已知的用于制备立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯的方法(例如，根据Oka等人，Chem.Soc.Rev.，40：5829-5843，2011；Oka等人，Org.Lett.，11：967-970，2009；以及美国专利授予前公布号2013/0184450和2015/0197540中描述的原理)来制备。具有一个或更多个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯的杂交的多核苷酸构建体的非限制性实例提供于表3中。
表3
在表3中，过客链的编号和引导链的编号在5’-末端开始；P(n)-P(n+1)表示介于过客链中的核苷编号(n)和核苷编号(n+1)之间的确定的立体化学富集的硫代磷酸酯的位置；G(n)-G(n+1)表示介于引导链中的核苷编号(n)和核苷编号(n+1)之间的确定的立体化学富集的硫代磷酸酯的位置；R和S标示所确定的磷立体中心的优势立体化学。
二硫代磷酸酯
可使用本领域中已知的以及本文中公开的标准多核苷酸合成方案来合成含有多核苷酸的二硫代磷酸酯(参见，例如Yang等人，ACS Chem.Biol.，7：1214-1220，2012；Wu等人，Nat.Commun.，5：3459，2013)。可使用例如市售可得的硫代亚磷酰胺(例如，可获自GlenResearch)来实施合成。硫代亚磷酰胺的非限制性实例包括：
B1＝核碱基；
Y＝卤素(例如F)、任选取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基或甲氧基乙氧基)或受保护的羟基。
本发明的多核苷酸构建体的代表性实施例：
在以下方案中，为清楚起见，忽略用于合成的特定的核苷亚磷酰胺。
连接子X1和X2
连接子X3和X4
连接子X5和X6
R＝核苷(例如，A、U、C或G)亚磷酰胺；
n是1至6的整数
L2＝-(CH2)m-或-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-
各m独立地为1至20的整数
各m1独立地为1至10的整数
连接子X7和X8
R-L2-NHFmoc＝核苷(例如，A、U、C或G)亚磷酰胺，其中磷原子被-O-L2-NHFmoc取代，
其中L2＝-(CH2)m-或-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-
n是1至6的整数
各m独立地为1至20的整数
各m1独立地为1至10的整数
连接子X9和X10
R-L2-NHFmoc＝核苷(例如，A、U、C或G)亚磷酰胺，其中磷原子被-O-L2-NHFmoc取代，
其中L2＝-(CH2)m-或-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-
各m独立地为1至20的整数
各m1独立地为1至10的整数
连接子X11和X12
连接子X13和X14
连接子X15和X16
连接子X17和X18
可使用本领域中已知的反应条件来制备连接子X11、X12、X13和X14。例如，化合物X1a可经历选择性TBS保护、苄基去除、接着烷基化和TBS基团去除，以得到醇X1d，其可随后在本领域中已知的用于制备亚磷酰胺的反应条件下转化为化合物X11和X12。可使用相同的实验条件将化合物X2a转化成化合物X13和X14。使用X3a和X4a的略微改变的方法可得到化合物X15、X16、X17和X18。
可使用本领域中已知的方法和技术来制备其它连接子和含有其的多核苷酸构建体。例如，可制备以下结构：
X＝O、CH2或NH
各n独立地为1-6。
杂交的多核苷酸构建体
所制备的杂交的多核苷酸构建体的清单提供于表4。
表4
在表4中，下划线代表共轭位点；大写字母代表2’-氟-2’-脱氧核糖；小写字母代表2’-甲氧基-2’-脱氧核糖；p代表高炔丙基磷酸三酯；斜体字代表2-(叔丁基-二硫代)苯基-乙基磷酸三酯；s代表硫代磷酸酯；n代表3’C3-OH基团；b代表正丁基磷酸三酯；e代表2-氨乙基-二乙二醇磷酸三酯；k代表2-氨乙基磷酸三酯；k1代表2-氨丙基磷酸三酯；U代表具有与2-(叔丁基-二硫代)苯基-乙基磷酸三酯键合的3’-碳的尿苷；P代表苯乙基磷酸三酯；R＊是RP手性核苷间硫代磷酸酯；S＊是SP手性核苷间硫代磷酸酯；I是2’-OMe肌苷核苷；P1、p2、P3和p4的结构示于图8B中；在配体共轭前的X1、X2、X3、X4、X5和X2-NH2的结构示于图8B中。
共轭方法
点击反应
铜-THPTA复合物制备
将五水合硫酸铜(CuSO4-5H2O)的5mM水溶液和三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)的10mM水溶液以1∶1(v/v)(1∶2摩尔比)混合并使其在室温下静置1小时。该复合物可用于催化胡伊斯根(Huisgen)环加成，例如，如下文通用共轭方案中所示。
通用程序(100nM规模)：
向710μL的水和100μL叔丁醇(最终体积的10％)在1.7mL Eppendorf管中的溶液中添加60μL的铜-THPTA复合物，接着添加50μL的2mM低聚物溶液、60μL的20mM抗坏血酸钠水溶液以及20μL的10mM GalNAc-叠氮化物溶液。在充分混合之后，使该溶液在室温下静置1小时。通过凝胶分析确认反应的完成。
将反应混合物添加至含有5-10倍摩尔过量的TAAcONa(树脂结合的EDTA钠盐)的螺旋盖小瓶中。将混合物搅拌1小时。然后将该混合物通过illustraTM NapTM-10柱SephadexTM进行洗脱。然后将所得的溶液冷冻并冻干过夜。
酰胺化
可在本领域中已知的酰胺化反应条件下实施通过酰胺化进行的共轭。参见，例如Aaronson等人，Bioconjugate Chem.22：1723-1728，2011。
通用程序(100nmol规模)：
将100μL的X2-NH2 ssRNA在50％乙腈中的1mM储备溶液与9μL的GalNAc-PFP的100mM储备溶液混合。用水将溶液稀释至195μL的总体积，并添加5μL二异丙基乙胺。使反应在室温下进行30分钟，接着进行尿素变性凝胶分析和MALDI-TOF质谱，以确认完全共轭。一旦确认共轭反应完成，用水将200μL反应溶液稀释至1mL，并经illustraTM NAP-10柱纯化。随后将NAP-10洗脱液冷冻并冻干，接着进行定量和siRNA双链体化(duplexing)。
通用共轭方案
通过点击反应的共轭1
其中
各n和q独立地为0或1；
m是0至5的整数；
R是H或-(CH2)3-OH；
各R’独立地为H或炔丙基；
各R”独立地为H或-(CH2)-(1，2，3-三唑-1，4-二基)-(Linker)-(AM)p；
各RA是H或炔丙基，条件是至少一个RA是炔丙基；
各RB是H或-(CH2)-(1，2，3-三唑-1，4-二基)-(Linker)-(AM)p；
各AM独立地为辅助部分(例如，GalNAc或甘露糖)；
各p独立地为1至6的整数；且
各Linker独立地为多价连接子(例如，-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，其中
若p为1，则Q2是直链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-)，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中p1为0或1，p2为0、1、2或3)；
各Q3和Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的C2-12亚杂烷基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链)。
通过点击反应的共轭2
其中
n是1至6的整数；
各p独立地为1至6的整数；
各AM独立地为辅助部分(例如，靶向部分(例如，GalNAc或甘露糖))；
R是H或-(CH2)3-OH；且
各Linker独立地为多价连接子(例如，-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，其中
若p为1，则Q2是直链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-)，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中p1是0或1，p2是0、1、2或3)；各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
各Q3和Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的C2-12亚杂烷基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个)。
通过酰胺化的共轭1
其中
n和q各自独立地为0或1；
m是0至5的整数；
R是H、-(CH2)3-OH或-(CH2)3-O-Sol，其中Sol为固体支持体；
各R’独立地为H或-(Linker1)-NHRPG；
各R”独立地为H或-(Linker1)-NH-C(O)-(Linker)-(AM)q；
各RA是H或-(Linker1)-NHRPG，条件是至少一个RA是-(Linker1)-NHRPG；
各RB是H或-(Linker1)-NH-C(O)-(Linker)-(AM)q；
各RPG独立地为H或N-保护基团；
各AM独立地为辅助部分(例如，GalNAc或甘露糖)；
各p独立地为1至6的整数；
各Linker独立地为多价连接子(例如，-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，其中
若p为1，则Q2是直链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-)，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中p1是0或1，p2是0、1、2或3)；各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个)；
且
各Linker1是[-Q3-Q4-Q5]s-，条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
通过酰胺化的共轭1
其中
n是1至6的整数；
各p独立地为1至6的整数；
RPG是H或N-保护基团(例如，Fmoc)，其中所有的RPG基团被-C(O)-(Linker)-(AM)p替代；
R是H、-(CH2)3-OH或-(CH2)3-O-Sol，其中Sol为固体支持体；
各AM独立地为辅助部分(例如，GalNAc或甘露糖)；且
各Linker独立地为多价连接子(例如，-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，其中
若p为1，则Q2是直链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-)，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团(例如，[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2，其中p1是0或1，p2是0、1、2或3)；各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链)。
在溶液相中和在固体支持体上均可实施通过酰胺化的共轭。当RPG是N-保护基团(例如，Fmoc)时，可使用本领域中已知的用于N-保护基团(为RPG)脱保护的N-保护基团去除剂来处理受保护的胺，以得到中间体，其中RPG是H。
所述辅助部分可以是GalNAc。GalNAc和Linker之间的键合可通过GalNAc的异头碳原子进行。特别地，GalNAc的异头碳原子与环氧原子一起可为半缩醛胺的一部分(例如，当GalNAc的异头碳原子与存在于Linker中的酰胺官能团的氮原子键合时)。
GalNAc-Linker-COOH可具有以下结构：
其中x是0至20的整数(例如，x是0至10或2至10的整数(例如，x是2、4、6或8))。
在另一示例性的通过酰胺化的共轭中，可将PFP酯(例如，NAG40)共轭至本发明的多核苷酸构建体中的共轭部分。
实施例3.评价杂交的多核苷酸构建体的体外和体内活性的实验
体外实验
使用标准的两步胶原酶灌注技术分离原代小鼠肝细胞(Li等人，MethodsMol.Biol.，633：185-196；2010)。简言之，将6-10周龄雌性C57/B16小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(80-100mg/kg)/甲苯噻嗪(5-10mg/kg)的混合物来进行麻醉。随后使腹腔暴露，并使用22G针对内脏腔静脉插管。将肝静脉切断，并使用含有0.5mM ETDA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的溶液将肝立即灌注5-10min。将该溶液立即转移至胶原酶(100IU/ml)在杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM，Gibco)中的溶液中，保持另外5-10min。在灌注结束时，将肝移除，并将肝细胞收集在4℃的含有10％胎牛血清的DMEM中。随后将细胞通过70μm无菌过滤器过滤，在同一溶液中洗涤三次，并使用台盼蓝染色评价细胞活力。随后将细胞接种在涂覆有0.1％大鼠尾胶原或2％基质胶的96孔板中，并在37℃下在5％CO2培养器中培养3-4小时。随后将测试化合物添加至细胞并在37℃下在5％CO2培养器中培养。在培养期结束时，将细胞溶解，分离mRNA，并通过qPCR测量靶基因的表达且使用标准方案将其归一化至管家基因。该实验的数据在表5中。
转染实验
为了评价siRNA双链体的体外活性，在37℃下、在5％CO2下，在推荐的培养基条件(即，补充有10％胎牛血清(FBS)、100μg/ml链霉素以及100U/ml青霉素的DMEM或类似培养基)中生长指示的细胞类型。在转染之前，将细胞以1×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔微量滴定板中，并使其粘连过夜。将用siRNA处理的细胞包装并通过LipofectamineRNAiMax(Life Technologies)根据制造商的推荐以100nM的浓度以全log递减剂量响应递送。在培养期结束时，将细胞溶解，分离mRNA，并通过qPCR测量靶基因的表达且使用标准方案将其归一化至管家基因。该实验的数据在表8中。
自由摄取实验
将来自BioreclamationIVT的原代非人肝细胞解冻并以70,000个细胞/孔的密度接种在涂覆有胶原的96孔板中，并使其在37℃下在5％CO2培育器中粘连4小时。在4小时之后，在不存在转染试剂(自由摄取)的情况下用共轭siRNA处理肝细胞。用以1μM起始的化合物浓度以全log递减稀释处理细胞。在培育期结束时，将细胞溶解，分离mRNA，并通过qPCR测量靶基因的表达且使用标准方案将其归一化至管家基因。该实验的数据在表6和表8中。
体内实验
将测试化合物经由皮下或静脉内(侧尾静脉)注射(200μL；3只小鼠/处理)给予雌性C57B16小鼠。在注射后的适当时间点，将小鼠处死并通过心脏穿刺收集血液样品。收集大约50-100mg肝样品片并立即将其冷冻在液氮中。使用标准方案从肝匀浆分离全部mRNA，并且通过qPCR将靶基因的表达定量化并使用标准方案将其归一化至管家基因。
在另一形式中，使用柠檬酸钠作为抗凝剂在给药后不同时间点从小鼠收集血液。使用市售可得的显色测定来测量血浆AT3蛋白，该显色测定使用抗因子Xa方法评价AT3的肝素辅因子活性。
体外和体内实验结果提供在图1-7和9-20以及表5-8中。
表5
表6
表8
表9
来自表9的数据显示于图10中。
表10
来自表10的数据显示于图11中。
表11
来自表11的数据显示于图12中。
表12
来自表12的数据显示于图13中。
表13
来自表13的数据显示于图14中。
表14
来自表14的数据显示于图17中。
其它实施方案
由以下列举的各项进一步描述本发明。
1.一种多核苷酸构建体，其包含与至少一个式(I)的基团键合的链：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子，至少一个所述多价连接子包含与T键合的-C(O)-N(H)-；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
2.一种多核苷酸构建体，其包含与至少一个式(I)的基团键合的链：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述多核苷酸构建体包含不超过一种Sol：
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0；且
其中所述链包含至少一个在2位被任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C2-12烷氧基烷基、卤素或氰基取代的核苷。
3.第1或2项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个-LinkA(-T)p具有式(II)：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子；
若p为1，则Q2是直链基团，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基(例如，各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基)；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
4.第3项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中各-LinkA(-T)p独立地具有式(II)。
5.第3或4项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1是-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-12亚烷基，且QC为(i)任选取代的C2-12亚杂烷基，其包含-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-；(ii)任选取代的C1-12亚杂环基；(iii)任选取代的C1-12亚硫代杂环基；(iv)环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基；或(v)吡啶-2-基腙。
6.第3或4项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1包含：
7.第3至6项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为1，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-的直链基团。
8.第3至6项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为2至6的整数，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2的支链基团，其中Q7为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
9.第1至8项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是靶向部分。
10.第1至9项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体、甘露糖、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗体或抗原结合片段。
11.第10项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是所述去唾液酸糖蛋白受体配体。
12.第11项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是N-乙酰半乳糖胺。
13.第12项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中N-乙酰半乳糖胺包含与LinkA键合的异头碳，其中所述异头碳是半缩醛胺基团的一部分。
14.第13项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述N-乙酰半乳糖胺的异头碳与酰胺氮原子键合。
15.第1至14项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是细胞穿透肽。
16.第1至15项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是内体逃逸部分。
17.第1至16项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个式(I)的基团与为五个5’-末端核苷或五个3’-末端核苷之一的核苷连接。
18.第1至17项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链与1个、2个、3个或4个式(I)的基团键合，其中所述式(I)的基团相同或不同。
19.第1至18项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
20.第19项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L是C2-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
21.第20项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为包含1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为包含1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
22.第19至21项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含1至5个所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
23.第19至22项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二核苷和第三核苷。
24.第19至23项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第五核苷和第六核苷。
25.第19至24项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十七核苷和第十八核苷。
26.第19至25项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十九核苷和第二十核苷。
27.第19至26项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二十核苷和第二十一核苷。
28.第19至22项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
29.第19至28项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含一个或更多个核苷间膦酸酯。
30.第29项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述一个或更多个核苷间膦酸酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
31.第1至30项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含19个或更多个核苷。
32.第1至31项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于100个核苷。
33.第32项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于50个核苷。
34.第33项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于32个核苷。
35.第1至34项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个2’位修饰的核苷。
36.第35项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中所有的核苷独立地为2’位修饰的核苷。
37.第1至36项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。
38.权利要求37所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个核苷间脱碱基间隔子具有式(III)：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
39.一种多核苷酸构建体，其包含被至少一个式(III)的核苷间脱碱基间隔子中断的链：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
40.第39项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中t为1。
41.第39或40项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中R9是H。
42.第39至41项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X4是O。
43.第39至41项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X4是S。
44.第39至43项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X5是O。
45.第39至44项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(x)是2、3、4或5。
46.第39至45项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(x)是13、14、15或16。
47.第39至46项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述构建体包含仅1个核苷间脱碱基间隔子或仅2个核苷间脱碱基间隔子。
48.第39至47项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个2’位修饰的核苷。
49.第48项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中全部核苷均独立地为2’位修饰的核苷。
50.第48项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中至少80％的核苷为2’位修饰的核苷。
51.第50项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中各2’位修饰的核苷独立地为2’-烷氧基核苷。
52.第48项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷中的至少一个为2’-氟代核苷。
53.第52项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。
54.一种多核苷酸构建体，其包含链，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。
55.第52至54项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中剩余的核苷为2’-烷氧基核苷。
56.第52至55项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中剩余的核苷为2’-甲氧基核苷。
57.第39至56项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含种子区，所述种子区包含含次黄嘌呤核碱基的核苷(例如，肌苷)。
58.一种多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其包含含有种子区的链，所述种子区包含含次黄嘌呤核碱基的核苷(例如，肌苷)。
59.第57或58项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第二核苷。
60.第57或58项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第三核苷。
61.第57或58项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第四核苷。
62.第57或58项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第五核苷。
63.第57或58项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第六核苷。
64.第39至63项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个立体化学富集的硫代磷酸酯。
65.一种多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其包含含有至少一个立体化学富集的硫代磷酸酯的链。
66.第64或65项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含仅1个、2个、3个或4个立体化学富集的硫代磷酸酯。
67.第64至66项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷中的两个。
68.第64至67项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个(例如，一个或两个)立体化学富集的硫代磷酸酯位于两个连续核苷之间，所述两个连续核苷为所述链的六个3’-末端核苷中的两个。
69.第64至68项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(i)一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第一核苷和第二核苷之间。
70.第64至68项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(i)一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二核苷和第三核苷之间。
71.第64至70项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十一核苷和第二十二核苷之间。
72.第64至71项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中一个立体化学富集的硫代磷酸酯共价键合在所述链内的第二十二核苷和第二十三核苷之间。
73.第64至72项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有RP立体化学构型。
74.第64至73项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述立体化学富集的硫代磷酸酯具有SP立体化学构型。
75.第39至74项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含19个或更多个核苷。
76.第39至75项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于100个核苷。
77.第76项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于50个核苷。
78.第77项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于32个核苷。
79.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链，其中所述引导链是第39至78项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体。
80.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链，其中所述过客链是第1至38项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体。
81.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链；其中至少一个所述链包含至少一个二硫代磷酸酯或至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯；且其中至少一个所述链与至少一个式(I)的基团键合：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述杂交的多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
82.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链；其中至少一个所述链包含至少一个2’位修饰的核苷；且其中至少一个所述链与至少一个式(I)的基团键合：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述杂交的多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
83.第81或82项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个-LinkA(-T)p具有式(II)：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子；
若p为1，则Q2是直链基团，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基(例如，各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基)；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
84.第83项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1是-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-12亚烷基，且QC为(i)任选取代的C2-12亚杂烷基，其包含-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-；(ii)任选取代的C1-12亚杂环基；(iii)任选取代的C1-12亚硫代杂环基；(iv)环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基；或(v)吡啶-2-基腙。
85.第83项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1包含：
86.第83至85项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为1，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-的直链基团。
87.第83至86项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为2至6的整数，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2的支链基团，其中Q7为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
88.第81至87项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中各-LinkA(-T)p独立地具有式(II)。
89.第81至88项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是靶向部分。
90.第81至89项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体、甘露糖、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗体或抗原结合片段。
91.第90项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体。
92.第91项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是N-乙酰半乳糖胺。
93.第92项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中N-乙酰半乳糖胺包含与LinkA键合的异头碳，其中所述异头碳是半缩醛胺基团的一部分。
94.第93项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述N-乙酰半乳糖胺的异头碳与酰胺氮原子键合。
95.第81至94项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是细胞穿透肽。
96.第81至94项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是内体逃逸部分。
97.第81至96项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述杂交的多核苷酸构建体包含1至6个式(I)的基团，其中所述式(I)的基团相同或不同。
98.第81至97项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
99.第81至98项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
100.第98或99项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L1是C1-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
101.第98或99项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性磷酸三酯各自是被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为包含1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为包含1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
102.第99至101项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含1至5个所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
103.第99至102项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述引导链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
104.第99至103项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二核苷和第三核苷。
105.第99至104项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第五核苷和第六核苷。
106.第99至105项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十七核苷和第十八核苷。
107.第99至106项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十九核苷和第二十核苷。
108.第98至106项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二十核苷和第二十一核苷。
109.第97至108项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含1至5个所述非生物可逆性磷酸三酯。
110.第97至109项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述过客链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
111.第81至110项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链或所述引导链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。
112.第111项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。
113.第111或112项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。
114.第79至113项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链或所述过客链包含一个或更多个膦酸酯。
115.第79至114项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含19个或更多个核苷。
116.第79至115项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于100个核苷。
117.第116项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于50个核苷。
118.第117项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于32个核苷。
119.第79至118项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含19个或更多个核苷。
120.第79至119项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于100个核苷。
121.第120项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于50个核苷。
122.第121项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于32个核苷。
123.第79至122项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链的3’端与所述引导链的5’端杂交，以形成平末端。
124.第1至38项中任一项所述的多核苷酸构建体或第80至122项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中R1和R2与MOIETY中的同一原子相连。
125.第124项所述的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中MOIETY、R1和R2组合形成：
其中
R7是连接靠近R4的氧原子的键，
R8是连接靠近所述链的氧原子的键，且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，
条件是式(Ia)中的季碳与0或1个不同于碳和氢的原子键合，且条件是m1、m2、m3和m4的总和小于10。
126.一种将多核苷酸构建体递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与第1-78、124和125项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与第79至123项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述多核苷酸构建体驻留在所述细胞内。
127.一种降低细胞中的蛋白表达的方法，其包括使所述细胞与第1-78、124和125项中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与第79至123项中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述蛋白在所述细胞中的表达降低。
128.一种式(IV)的化合物：
其中
各R1和R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基或共轭部分；
各R16独立地为二烷基氨基、2-氰乙基或共轭部分，条件是至少一个R16是二烷基氨基；
R17是羟基保护基团；且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，条件是m1和m2的总和不为0；
其中，当R1和R2二者均为包含任选取代的C2-16炔基的共轭部分时，R16是二烷基氨基或共轭部分。
129.第128项所述的化合物，其中m1是0或1。
130.第128或129项所述的化合物，其中m2是0或1。
131.第128至130项中任一项所述的化合物，其中R1是H或所述共轭部分，其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
132.第131项所述的化合物，其中R1中的Q3是-O-。
133.第131或132项所述的化合物，其中R1中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R1中的Q5不存在。
134.第128至133项中任一项所述的化合物，其中R2是H或所述共轭部分，其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
135.第134项所述的化合物，其中R2中的Q3是-O-。
136.第134或135项所述的化合物，其中R2中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R2中的Q5不存在。
所描述的发明的各种改变和变型将对于本领域技术人员而言显而易见而不偏离本发明范围和精神。尽管已结合特定的实施方案描述了本发明，但是应当理解，如所要求保护的发明不应不当地限于此类特定的实施方案。实际上，对于本领域技术人员而言显而易见的所描述的用于实施本发明的方式的各种改变意欲在本发明的范围之内。
其它实施方案在权利要求书中。

Claims (111)

1.一种多核苷酸构建体，其包含与至少一个式(I)的基团键合的链：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子，至少一个所述多价连接子包含与T键合的-C(O)-N(H)-；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
2.一种多核苷酸构建体，其包含与至少一个式(I)的基团键合的链：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述多核苷酸构建体包含不超过一种So1；
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0；且
其中所述链包含至少一个在2位被任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C2-12烷氧基烷基、卤素或氰基取代的核苷。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个-LinkA(-T)p具有式(II)：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子；
若p为1，则Q2是直链基团，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
4.权利要求3所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中各-LinkA(-T)p独立地具有式(II)。
5.权利要求3或4所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1是-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C1-12亚烷基或-(任选取代的C1-6亚烷基)-(任选取代的C6-10亚芳基)-，且QC为(i)任选取代的C2-12亚杂烷基，其包含-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-；(ii)任选取代的C1-12亚杂环基；(iii)任选取代的C1-12亚硫代杂环基；(iv)环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基；或(v)吡啶-2-基腙。
6.权利要求3或4所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1包含：
7.权利要求3至6中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为1，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-的直链基团。
8.权利要求3至6中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为2至6的整数，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2的支链基团，其中Q7为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
9.权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是靶向部分。
10.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体、甘露糖、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗体或抗原结合片段。
11.权利要求10所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是所述去唾液酸糖蛋白受体配体。
12.权利要求11所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是N-乙酰半乳糖胺。
13.权利要求12所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中N-乙酰半乳糖胺包含与LinkA键合的异头碳，其中所述异头碳是半缩醛胺基团的一部分。
14.权利要求13所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述N-乙酰半乳糖胺的异头碳与酰胺氮原子键合。
15.权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是细胞穿透肽。
16.权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是内体逃逸部分。
17.权利要求1至16中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个式(I)的基团与为五个5’-末端核苷或五个3’-末端核苷之一的核苷连接。
18.权利要求1至17中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链与1个、2个、3个或4个式(I)的基团键合，其中所述式(I)的基团相同或不同。
19.权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
20.权利要求19所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L是C2-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
21.权利要求20所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：
C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为包含1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为包含1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
22.权利要求19至21中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含1至5个所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
23.权利要求19至22中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二核苷和第三核苷。
24.权利要求19至23中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第五核苷和第六核苷。
25.权利要求19至24中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十七核苷和第十八核苷。
26.权利要求19至25中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第十九核苷和第二十核苷。
27.权利要求19至26中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述链的第二十核苷和第二十一核苷。
28.权利要求19至22中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
29.权利要求19至28中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含一个或更多个核苷间膦酸酯。
30.权利要求29所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述一个或更多个核苷间膦酸酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
31.权利要求1至30中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含19个或更多个核苷。
32.权利要求1至31中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于100个核苷。
33.权利要求32所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于50个核苷。
34.权利要求33所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含少于32个核苷。
35.权利要求1至34中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。
36.权利要求1至35中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个2’位修饰的核苷。
37.权利要求36所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中所有的核苷独立地为2’位修饰的核苷。
38.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链，其中所述过客链是权利要求1至37中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体；其中所述至少一个式(I)的基团与所述过客链的5’-末端、3’-末端、核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合。
39.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链；其中至少一个所述链包含至少一个二硫代磷酸酯或至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯；且其中至少一个所述链与至少一个式(I)的基团键合：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述杂交的多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
40.一种杂交的多核苷酸构建体，其包含过客链和可加载到RISC复合体中的引导链；其中至少一个所述链包含至少一个2’位修饰的核苷；且其中至少一个所述链与至少一个式(I)的基团键合：
或其盐或其立体异构体，
其中
各X1独立地为O或S；
各X2独立地为O、S、NH或键；
MOIETY为任选取代的C2-10烷烃-四基或基团-M1-M2-M3-，其中各M1和各M3独立地不存在或为任选取代的C1-6亚烷基，且M2为任选取代的C3-9杂环-四基、任选取代的C6-10芳烃-四基或任选取代的C3-8环烷烃-四基；
各R1和各R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p，条件是至少一个R1或至少一个R2是共轭部分或-LinkA(-T)p；
各R3独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基、任选取代的C2-16烯基、任选取代的C2-16炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、共轭部分或-LinkA(-T)p；
R4为H、任选取代的C1-6烷基、-LinkA(-T)p或-Sol；
各LinkA独立地为多价连接子；
各T独立地为辅助部分；
Sol为固体支持体；
m是1至6的整数；
各n独立地为0或1；
各p独立地为1至6的整数；且
q为0至3的整数；
其中所述杂交的多核苷酸构建体包含不超过一种Sol；且
其中，当所述至少一个式(I)的基团与核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯键合时，q为0。
41.权利要求39或40所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个-LinkA(-T)p具有式(II)：
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p，
(II)
其中
各s独立地为0至20的整数，其中重复单元相同或不同；
Q1是共轭连接子；
若p为1，则Q2是直链基团，或若p为2至6的整数，则Q2是支链基团；
各Q3和各Q6独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基、任选取代的C6-10亚芳基、任选取代的C1-9亚杂芳基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各Ra独立地为H或氨基酸侧链；
条件是存在Q3、Q4和Q5中的至少一个。
42.权利要求41所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1是-O-QL-QC-，其中QL为任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-12亚烷基，且QC为(i)任选取代的C2-12亚杂烷基，其包含-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-；(ii)任选取代的C1-12亚杂环基；(iii)任选取代的C1-12亚硫代杂环基；(iv)环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基；或(v)吡啶-2-基腙。
43.权利要求41所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中Q1包含：
44.权利要求41至43中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为1，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-的直链基团。
45.权利要求41至44中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中p为2至6的整数，且Q2是式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2的支链基团，其中Q7为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
p1为0或1；
p2为0、1、2或3；
其中，
当p1为0时，LinkA是三价或四价连接子，且
当p1为1时，LinkA是四价、五价或六价连接子。
46.权利要求39至45中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中各-LinkA(-T)p独立地具有式(II)。
47.权利要求39至46中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是靶向部分。
48.权利要求39至47中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体、甘露糖、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗体或抗原结合片段。
49.权利要求48所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是去唾液酸糖蛋白受体配体。
50.权利要求49所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是N-乙酰半乳糖胺。
51.权利要求50所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中N-乙酰半乳糖胺包含与LinkA键合的异头碳，其中所述异头碳是半缩醛胺基团的一部分。
52.权利要求51所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述N-乙酰半乳糖胺的异头碳与酰胺氮原子键合。
53.权利要求39至52中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是细胞穿透肽。
54.权利要求39至53中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中至少一个T是内体逃逸部分。
55.权利要求39至54中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述杂交的多核苷酸构建体包含1至6个式(I)的基团，其中所述式(I)的基团相同或不同。
56.权利要求39至55中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
57.权利要求39至56中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
58.权利要求56或57所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯是被独立地选自以下的取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和具有以下结构的基团：
其中
L1是C1-6亚烷基；
Rb为任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1至4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚乙二醇；且
Rc是H或C1-6烷基。
59.权利要求56或57所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性磷酸三酯各自是被以下取代基取代的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯：
C2-16烷基、 或由与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中
t是1至6的整数；
Rd为任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为包含1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为包含1或2个氮原子的六元环；
Re是H或C1-6烷基；
X3是卤素、-COOR5或-CONR6 2，其中各R5和R6独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；且
所述含叠氮基的底物是
60.权利要求57至59中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含1至5个所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯。
61.权利要求57至60中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述引导链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
62.权利要求57至61中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二核苷和第三核苷。
63.权利要求57至62中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第五核苷和第六核苷。
64.权利要求57至63中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十七核苷和第十八核苷。
65.权利要求57至64中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第十九核苷和第二十核苷。
66.权利要求57至65中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述非生物可逆性核苷间磷酸三酯之一连接所述引导链的第二十核苷和第二十一核苷。
67.权利要求57至66中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含1至5个所述非生物可逆性磷酸三酯。
68.权利要求57至67中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述至少一个非生物可逆性核苷间磷酸三酯连接两个连续核苷，所述两个连续核苷为所述过客链的六个5’-末端核苷或六个3’-末端核苷中的两个。
69.权利要求39至68中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链或所述引导链被至少一个核苷间脱碱基间隔子中断。
70.权利要求69所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。
71.权利要求69或70所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链被一个核苷间脱碱基间隔子中断。
72.权利要求38至71中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链或所述过客链包含一个或更多个膦酸酯。
73.权利要求38至72中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含19个或更多个核苷。
74.权利要求38至73中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于100个核苷。
75.权利要求74所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于50个核苷。
76.权利要求75所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述引导链包含少于32个核苷。
77.权利要求38至76中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含19个或更多个核苷。
78.权利要求38至77中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于100个核苷。
79.权利要求78所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于50个核苷。
80.权利要求79所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链包含少于32个核苷。
81.权利要求38至79中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述过客链的3’端与所述引导链的5’端杂交，以形成平末端。
82.权利要求1至37中任一项所述的多核苷酸构建体或权利要求38至81中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中R1和R2与MOIETY中的同一原子相连。
83.权利要求82所述的多核苷酸构建体或杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中MOIETY、R1和R2组合形成：
其中
R7是连接靠近R4的氧原子的键，
R8是连接靠近所述链的氧原子的键，且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，
条件是式(Ia)中的季碳与0或1个不同于碳和氢的原子键合，且条件是m1、m2、m3和m4的总和小于10。
84.一种将多核苷酸构建体递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-37、82和83中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与权利要求38至83中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述多核苷酸构建体驻留在所述细胞内。
85.一种降低细胞中的蛋白表达的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-37、82和83中任一项所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体或与权利要求38至83中任一项所述的杂交的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体接触，其中在所述接触后，所述蛋白在所述细胞中的表达降低。
86.一种式(IV)的化合物：
其中
各R1和R2独立地为H、任选取代的C1-16烷基、任选取代的C2-16杂烷基或共轭部分；
各R16独立地为二烷基氨基、2-氰乙基或共轭部分，条件是至少一个R16是二烷基氨基；
R17是羟基保护基团；且
m1、m2、m3和m4各自独立地为0至6的整数，条件是m1和m2的总和不为0；
其中，当R1和R2二者均为包含任选取代的C2-16炔基的共轭部分时，R16是二烷基氨基或共轭部分。
87.权利要求86所述的化合物，其中m1是0或1。
88.权利要求86或87所述的化合物，其中m2是0或1。
89.权利要求86至88中任一项所述的化合物，其中R1是H或所述共轭部分，其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
90.权利要求89所述的化合物，其中R1中的Q3是-O-。
91.权利要求89或90所述的化合物，其中R1中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R1中的Q5不存在。
92.权利要求86至91中任一项所述的化合物，其中R2是H或所述共轭部分，其中所述共轭部分是[-Q3-Q4-Q5]s-QC1，其中
QC1为包含-COOR21或-CHO的任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-受保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-受保护的巯基、或其N-受保护的形式、其中各R21独立地为H或任选取代的C1-6烷基，且R22是卤素；
各Q3独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-或-OCH2-；
各Q4独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12亚杂烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
各Q5独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-或-C(O)-CH(Ra)-NH-；且
各s独立地为0至20的整数。
93.权利要求92所述的化合物，其中R2中的Q3是-O-。
94.权利要求92或93所述的化合物，其中R2中的Q4不存在或为任选取代的C2-12亚杂烷基，且R2中的Q5不存在。
95.一种多核苷酸构建体，其包含被至少一个式(III)的核苷间脱碱基间隔子中断的链：
其中
L是糖类似物；
各X4独立地为O或S；
各X5独立地为O、S、NH或键；
各R9独立地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基、-LinkA(-T)p或共轭部分；
各LinkA独立地为多价连接子(例如，包括-C(O)-N(H)-)；
各T独立地为辅助部分；
R10是连接所述链中的核苷(x)的3’位碳原子的键；
R11是连接所述链中的核苷(x+t+1)的5’位氧原子的键；
p是1至6的整数；且
t是1至6的整数。
96.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中t为1。
97.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中R9是H。
98.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X4是O。
99.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X4是S。
100.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中X5是O。
101.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(x)是2、3、4或5。
102.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中(x)是13、14、15或16。
103.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述构建体包含仅1个核苷间脱碱基间隔子或仅2个核苷间脱碱基间隔子。
104.权利要求95所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链包含至少一个2’位修饰的核苷。
105.权利要求104所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷中的至少一个为2’-氟代核苷。
106.权利要求105所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。
107.一种多核苷酸构建体，其包含链，其中所述链中的第二、第十二、第十四和第十六核苷全部独立地为2’-氟代核苷。
108.权利要求107所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中剩余的核苷为2’-烷氧基核苷。
109.一种多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其包含含有种子区的链，所述种子区包含含次黄嘌呤核碱基的核苷。
110.权利要求109所述的多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其中所述含次黄嘌呤核碱基的核苷是所述链中的第二、第三、第四、第五或第六核苷。
111.一种多核苷酸构建体或其盐或其立体异构体，其包含含有至少一个立体化学富集的硫代磷酸酯的链，所述立体化学富集的硫代磷酸酯位于为所述链的六个5’-末端核苷中的两个的两个连续核苷之间，或位于为所述链的六个3’-末端核苷中的两个的两个连续核苷之间。
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