CN119183348A - 赋予细胞质雄性不育 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于赋予植物品系细胞质雄性不育(CMS)的方法。这些方法包括获得包含CMS细胞质的第一植物，该CMS细胞质也是单倍体诱导系(CHIP)，并且将该第一植物与包含希望的核基因组(DIP)的第二植物杂交。该CHIP还包含cenh3突变，并且可含有花色素苷标记和恢复系因子。该方法进一步包括由所述杂交生成子代。由该方法的杂交产生的子代是单倍体，并且包含该CHIP的CMS细胞质以及该DIP的希望的核基因组。该子代进一步缺乏任何花色素苷标记或恢复系因子。
Description
技术领域
本申请披露的主题总体上涉及植物育种领域。更特别地，本主题涉及赋予植物品系CMS(细胞质雄性不育)的方法。此外，本申请披露的主题涉及在转化方法中使用的CMS诱导系(例如，CENH3编辑)的特定特征。另外，本主题总体上涉及单倍体诱导。
序列表
本申请附有一个序列表，该序列表命名为82657-WO-REG-ORG-P-1.xml，创建于2023年5月5日，其大小为大约187千字节。该序列表通过引用以其全文并入本文。该序列表随同此申请经由EFS-Web提交，并且符合37C.F.R.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。
背景技术
在玉米杂交种的生产中，可以利用雄性不育玉米近交种来消除对去雄的需要，从而显著节省成本。被称为细胞质雄性不育(CMS)的母系遗传性状是有效产生杂种种子的有用工具。已经鉴定出了三种主要类型的CMS(CMS-T、CMS-S和CMS-C)。被称为育性恢复系(Rf)的核基因可以推翻细胞质的雄性不育效应。具有Rf基因的品系产生功能性花粉，即使它们仍然携带CMS细胞质。已知恢复系基因座Rf1和Rf2抑制CMS-T品系的CMS表型，而Rf3基因恢复CMS-S品系的育性。参见Laughnan等人Annu.Rev.Genet.[遗传学年鉴]1983.17:27-48。CMS-C的恢复系基因座Rf4映射至Sisco等人在Crop Science[作物科学]第31卷第5期,第1263-1266页,1991中报告的染色体8。Kohls等人在2010年玉米遗传学会议(MaizeGenetics Conference)上报告了对Rf4的精细作图。此外，作为WO 2012047595公布的专利申请(通过引用并入本文)报告了对与Rf4相关的基因和标记的鉴定。育种者使用CMS系统，通过开发携带CMS细胞质但缺乏恢复系基因的雌性品系以及开发携带适当恢复系基因的雄性品系来产生杂交种子。由雌性品系产生的F1杂种种子携带CMS细胞质，但由于父本贡献的核恢复系基因的作用而产生可育的植物。对于玉米，细胞型C被鉴定为所希望的CMS系统，因为它总体上在各种环境和遗传背景中都具有稳定性。
为了形成杂交种子，育种者将近交亲本品系杂交，一个充当父本，一个充当母本。开发基本上纯合的近交亲本品系的过程通常需要杂交种进行多个世代的选择和自花授粉(自交)以变得接近纯合。这个过程耗时且昂贵。为了缩短在玉米、稻、小麦、大麦和其他作物中开发纯合近交种的时间，育种者可以选择使用单倍体诱导系来诱导杂交亲本的单倍体种子产生。然后将单倍体植物的染色体加倍，例如通过染色体加倍剂如秋水仙碱，以形成双单倍体纯合品系。在许多植物物种(如高粱、大麦、小麦和其他草)中观察到了单倍体诱导。
在玉米中，单倍体诱导(HI)与基因MATRILINEAL、ig1、CENH3和DMP有关。总体上参见WO 2017/087682(通过引用并入本文)；T.Kelliher等人,MATRILINEAL,a sperm-specific phospholipase,triggers maize haploid induction[作为精子特异性磷脂酶的MATRILINEAL触发玉米单倍体诱导],Nature[自然]542,105-109(2017)；美国专利号7,439,416(通过引用并入本文)；M Pollacsek,Management of the ig gene for haploidinduction in maize[对用于玉米中单倍体诱导的ig基因的管理],Agronomie[农业学],12:247-251(1991)；美国专利号8,618,354(通过引用并入本文)；还参见A.B.Britt和S.Kuppu,Cenh3:An Emerging Player in Haploid Induction Technology[Cenh3：单倍体诱导技术中的新兴选手],Front.Plant Sci.[植物科学前沿]7:357(2016)doi:10.3389/fpls.2016.00357；以及CN 111763687B(通过引用并入本文)。单倍体诱导系可以以各种方式建立，例如通过基因组编辑。如本文所披露的，例如，可以通过CENH3突变生成单倍体诱导系。CENH3是HISTONE3(H3)的着丝粒(centromere)特异性变体，并且是有丝分裂和减数分裂中动粒(kinetochore)成核和纺锤体附着所必需的。
在本申请披露的主题中，具有cenh3突变的CMS-C型品系在CMS转化方法中充当单倍体诱导系。
发明内容
用以将具有正常细胞型的玉米品系转化为细胞质雄性不育(CMS)植物的方法有利于节省杂交种子生产的成本和时间。当前工业标准使用性状渐渗来对雌性杂种优势池中的优良系进行杂交，以成为CMS细胞质。本文披露了在不进行渐渗的情况下并且替代地通过单倍体诱导过程实现向CMS细胞质的这种转化的方法。这个过程导致在单交中核基因组100％转化为CMS细胞质。在此方法中，第一植物(本文称为“CHIP”)是CMS，该第一植物在其核基因组中关于CENH3中的敲除突变为杂合的(即，CENH3的一个等位基因是野生型；“CENH3+/-”)，并且是父本单倍体诱导系(即，它可以产生父本单倍体)。任选地，CHIP还可以在其核基因组中包含恢复系因子(例如，Rf3、Rf4、Rf10、Rf11等)，并且如果是这样，尽管它具有CMS细胞型，但还是自交可育的。可替代地，CHIP还可以包含非恢复系等位基因(例如，rf3、rf4、rf10、rf11、rf12)。如果是这样，则CHIP是雄性不育的并且需要保持系来继续繁殖。保持系不是CMS(即，具有正常细胞质)。另外，在CHIP中任选的花色素苷标记是纯合的。
第二植物(本文称为“DIP”)不是单倍体诱导系(即，关于CENH3为纯合野生型(“CENH3+/+”))，具有正常细胞型(即，非细胞质雄性不育)，并且包含希望的有待转化为CMS细胞质的核基因组。DIP是花粉供体。
将CHIP与DIP花粉杂交，后代包括二倍体子代(“F1”)、单倍体子代(仅包含DIP的核基因组)和非整倍体子代。仅单倍体子代是希望的，并且将包含(i)DIP的具有一个野生型CENH3等位基因的单倍体核基因组(即，所希望的基因组)(“CENH3+/空”)，以及(ii)CMS-C细胞型，(iii)进一步缺乏恢复系因子，以及任选地(iv)视觉标记。
当使用时，可以采用视觉标记，如花色素苷标记(例如，R1-nj或R1-scm2)将不希望的二倍体F1子代与所希望的单倍体子代区分开。如果使用，标记以纯合状态存在于单倍体诱导系基因组(即，CHIP)中。通过使用诱导系亲本的遗传标记将非整倍体与真单倍体子代区分开，即显示雌性(诱导系)亲本标记(指示CHIP核DNA)的任何推定单倍体都将作为非整倍体被丢弃。可替代地，可以通过测序、选择性标记、株型、或倍性水平测量将单倍体子代与二倍体和非整倍体区分开。
对序列表中的序列的简述
SEQ ID NO:1为实例1的SYN-INBC34近交未成熟胚和实例2的SYN-INBC34 x SYN-INBC34RS近交未成熟胚的生物弹道轰击中由LbCas12a RNP携带的gRNA140的核苷酸序列，该gRNA140靶向基因ID GRMZM2G158526的第二外显子。
SEQ ID NO:2是TaqMan测定3895中使用的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是TaqMan测定3895中使用的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是TaqMan测定3895中使用的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是表示cenh3中的19碱基对缺失的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是表示cenh3中的10碱基对缺失的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是野生型cenh3(GRMZM2G158526)的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是cenh3 10碱基对缺失突变体(509A115A)的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是cenh3 19碱基对缺失突变体(509A151A)的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是cenh3等位基因(GRMZM2G158526)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是KD(佐治亚大学(University of Georgia)的Kelly Dawe)cenh3等位基因的推导氨基酸序列的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是具有10碱基对缺失的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是具有19碱基对缺失剪接变体a的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是具有19碱基对缺失剪接变体c的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是具有19碱基对缺失剪接变体b的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是具有19碱基对缺失剪接变体d的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是具有19碱基对缺失剪接变体e的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是具有10碱基对缺失剪接变体a的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是具有10碱基对缺失剪接变体b的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是具有10碱基对缺失剪接变体c的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是具有10碱基对缺失剪接变体d的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是具有10碱基对缺失剪接变体e的cenh3等位基因的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是用于测定SM0253EQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是用于测定SM0253EQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是用于测定SM0253EQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是用于测定SM0253EQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是用于测定SM0253EQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是用于测定SM0093B的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是用于测定SM0093B的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是用于测定SM0093B的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是用于测定SM0093B的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是用于测定SM0093B的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是用于测定SM0435A的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是用于测定SM0435A的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是用于测定SM0435A的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是用于测定SM0435A的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37是用于测定SM0435A的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是用于测定SM1071CQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是用于测定SM1071CQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是用于测定SM1071CQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是用于测定SM1071CQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是用于测定SM1071CQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是用于测定SM1280CQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是用于测定SM1280CQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:45是用于测定SM1280CQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是用于测定SM1280CQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47是用于测定SM1280CQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是用于测定SM1447AQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:49是用于测定SM1447AQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是用于测定SM1447AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:51是用于测定SM1447AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是用于测定SM1447AQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:53是用于测定SM1847AQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54是用于测定SM1847AQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:55是用于测定SM1847AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:56是用于测定SM1847AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:57是用于测定SM1847AQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58是用于测定SM1286AQ的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:59是用于测定SM1286AQ的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60是用于测定SM1847AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:61是用于测定SM1847AQ的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:62是用于测定SM1286AQ的靶标的核苷酸序列。
SEQ ID NO:63是用于测定SM2513的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是用于测定SM2513的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:65是用于测定SM2513的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:66是用于测定SM2513的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:67是用于测定SM2513的靶标的核苷酸序列。SEQ ID NO:68是用于测定SM2962的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:69是用于测定SM2962的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:70是用于测定SM2962的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:71是用于测定SM2962的探针的核苷酸序列。SEQID NO:72是用于测定SM2962的靶标的核苷酸序列。SEQ ID NO:73是用于测定SM2988的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:74是用于测定SM2988的反向引物的核苷酸序列。SEQ IDNO:75是用于测定SM2988的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:76是用于测定SM2988的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:77是用于测定SM2988的靶标的核苷酸序列。SEQ ID NO:78是用于测定SM3400的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:79是用于测定SM3400的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:80是用于测定SM3400的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:81是用于测定SM3400的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:82是用于测定SM3400的靶标的核苷酸序列。SEQID NO:83是用于测定SM3747的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:84是用于测定SM3747的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:85是用于测定SM3747的探针的核苷酸序列。SEQ IDNO:86是用于测定SM3747的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:87是用于测定SM3747的靶标的核苷酸序列。SEQ ID NO:88是用于测定SM4788的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:89是用于测定SM4788的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:90是用于测定SM4788的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:91是用于测定SM4788的探针的核苷酸序列。SEQ ID NO:92是用于测定SM4788的靶标的核苷酸序列。SEQ ID NO:93是用于测定SM5515的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:94是用于测定SM5515的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:95是用于测定SM5515的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:96是用于测定SM5515的探针的核苷酸序列。
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SEQ ID NO:98-100是用于测定PM1901(野生型ZmCENH3)的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:101-103是用于测定PM1909(ZmCENH3中包含10bp缺失的突变)的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:101、102和104是用于测定PM1913(ZmCENH3中包含19bp缺失的突变)的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:105-108是用于测定SM0576CQ的引物和探针的核苷酸序列。
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SEQ ID NO:133-136是用于测定SM8040的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:137-140是用于测定SM8091的引物和探针的核苷酸序列。
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SEQ ID NO:145-148是用于测定SM4813的引物和探针的核苷酸序列。
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SEQ ID NO:157-160是用于测定SM0954BQ的引物和探针的核苷酸序列。
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SEQ ID NO:173-176是用于测定SM5665的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:177是来自表1(509A150A)的cenh3 19碱基对缺失突变体的部分核苷酸序列。
定义
除非下文中另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与如本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。对本文采用的技术的提及旨在是指本领域中通常所理解的技术，包括对本领域普通技术人员而言很清楚的那些技术的变型和/或等效技术的替代方案。虽然认为以下术语可以被本领域普通技术人员很好地理解，还是对以下定义进行了陈述，以便于解释本申请披露的主题。
根据长期存在的专利法公约，在本申请(包括权利要求)中使用的术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”是指“一个/种或多个/种”。例如，短语“一个/种细胞”是指一种或多种/一个或多个细胞，并且在一些实施例中可以是指组织和/或器官。类似地，短语“至少一个/种”当在本文中用于指代实体时，是指例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100个或更多个该实体，包括但不限于1与100之间的所有整数值以及大于100的整数。
除非另外指示，本说明书和权利要求中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指示，在本说明书和所附权利要求中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
如本文所用，术语“等位基因”是指遗传基因座处的变体或替代序列形式。在二倍体中，在每一个基因座处的单个等位基因由子代个体分别从每一个亲本处遗传。虽然本领域普通技术人员理解在任何特定个体中的等位基因不必代表存在于该物种中的所有等位基因，但是存在于二倍体生物体中的给定基因座的两个等位基因占据一对同源染色体上相对应的位置。
如本文所使用的，术语“扩增”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西索加的坎基尼公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications[诊断分子微生物学：原理与应用],PERSING等人编,American Society forMicrobiology[美国微生物学会],华盛顿(Washington,D.C.),(1993)。扩增的产物被称为“扩增子”。
如本文所用，术语“和/或”当在列举实体的上下文中使用时，是指实体单独存在或以组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括单独地A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合(例如，AB、AC、AD、BC、BD、CD、ABC、ABD和BCD)。在一些实施例中，“和/或”所指的一个或多个要素也可以单独存在于一个或多个组合和/或一个或多个子组合中的单次或多次出现中。
术语“非整倍体”是指在单倍体组中具有异常染色体数的植物。
如本文所用，术语“回交(backcrossing或backcrossed)”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。
术语“轰击(bombarding/bombardment)”和“生物弹道轰击”是指使粒子加速冲向靶标生物样品(例如，细胞、组织等)，以损伤靶标生物样品中细胞的细胞膜和/或使粒子进入靶标生物样品中的过程。用于生物弹道轰击的方法是本领域已知的(例如，US 5,584,807)，并且是可商购的(例如，来自伯乐公司(BioRad)的氦气驱动的加速器(PDS-1000/HeTM))。生物弹道PDS-1000基因枪(伯乐公司，加州赫拉克勒斯)使用氦气压力使涂有DNA的金或钨微粒加速冲向靶细胞。
如本文所用，术语“扩大(bulk)”是指增加种子数目的过程。
如本文所用，术语“cDNA”是指与mRNA互补并衍生自mRNA的单链或双链DNA。
如本文所用，术语“CHIP”是指本发明的方法中初次杂交的亲本之一。此亲本在其核基因组中具有杂合cenh3突变(C)，是父本单倍体诱导系(HI)，并且如上所述，是亲本(P)之一。CHIP是雌性可育的和CMS雄性不育的。CHIP可以任选地在其核基因组中含有纯合恢复系因子。CHIP还可以任选地在其核基因组中含有纯合花色素苷标记。
在本文所用的术语“染色体”是如本领域公认的，意指细胞核中含有细胞DNA并具有线性基因阵列的自我复制的基因结构。
术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”和“特征在于(characterized by)”是同义的，是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素和/或方法步骤。“包含”是意指所指定的要素和/或步骤存在，但是其他要素和/或步骤可以添加进来并且仍然落入相关主题的范围内的术语。
如本文所用，短语“由……组成”排除未具体列举的任何要素、步骤或成分。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中，而不是直接地接在前序部分后面时，它只限制该子句中所阐述的要素；其他要素并不整体排除在该权利要求之外。
如本文所用，短语“基本上由……组成”限制相关的披露或权利要求的范围至规定的材料和/或步骤，加上并不实质上影响所披露的和/或所要求保护的主题的一个或多个基本和新型特征的那些。
如本文所用，术语“细胞交换”是指细胞质从一个品系交换到另一个品系中(例如，玉米品系中的“正常A”细胞质交换到最初为“正常B”细胞质的另一个玉米品系中)。
如本文所用，术语“DIP”是指本发明的方法中初次杂交的亲本之一。此亲本含有希望的单倍体核基因组(“希望的亲本”或“DIP”)。DIP是自交可育的(关于野生型CENH3为纯合的)并且具有正常的细胞型。
如本文所用，被称为“单倍体”的植物具有两个完整染色体组(2n；每个亲本一组)。
如本文所用，术语“优良品系”或“近交品系”是指从针对更优的农艺表现的育种和选择而产生的任何品系。优良品系具有稳定的遗传学，即它在其基因组中是合理地或几乎等基因的。换言之，优良品系关于其基因组中的所有等位基因为合理地或几乎纯合的。
如本文所用，当与参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)一起使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白的方法。基因表达可以在该方法的许多阶段进行调节。例如，分别在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，表达可仅指反义RNA的转录或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。
如本文所用，术语“基因”是指包括DNA序列的遗传单位，该遗传单位占据染色体上的特定位置并且含有生物体中的具体特征或性状的遗传指令。“基因组”
如本文所用，术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组遗传标记的基因型”包括个体中存在的一个或多个遗传标记基因座的特定等位基因。如本领域中已知的是，基因型可以涉及单个基因座或多个基因座，无论这些基因座是相关还是不相关的，和/或是连锁还是非连锁的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为这些基因中的一个或多个参与目的表型(例如，如本文定义的数量性状)的表达。因此，在一些实施例中，基因型包括个体内在数量性状的一个或多个遗传基因座处存在的一个或多个等位基因的总和。在一些实施例中，基因型以单倍型(下文进行定义)表示。
如本文所用，术语“种质”是指群体或另外的个体组(例如，物种)的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，一组植物，其充当各种等位基因的储存库。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。
如本文所用，被称为“单倍体”的植物具有单个染色体组(基因组)，并且单倍体植物中减少的染色体数目(1n)等于配子中的染色体数目。如本文所用，通过使单倍体染色体组加倍(从1n到2n)而开发被称为“双单倍体”的植物。从自交到任何世代数的双单倍体植物获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，即使该植物的整个营养部分不是由具有加倍的染色体组的细胞组成的，该植物也被认为是双单倍体；也就是说，如果植物含有存活的配子，即使它是嵌合的，也将被认为是双单倍体。
如本文所用，“单倍体BC1(HaploidBC1)”是指单倍体植物的子代，其已经用其轮回亲本授粉，以便在子代中实行回交。单倍体BC1子代包含二倍体基因组。
如本文所用，单倍体诱导率(“HIR”)意指在用单倍体诱导系花粉对穗进行授粉后存活的单倍体籽粒的数目除以籽粒的总数。
如本文所用，当提及基因或核酸使用时，术语“异源”是指编码某因子的基因不是在其天然环境中(即，已经通过人工改变)。例如，异源基因可以包括从一个物种引入另一个物种中的基因。异源基因还可以包括对生物体来说是天然的基因，该基因已经以某种方式加以改变(例如，突变、以多个拷贝添加、连接至非天然启动子或增强子多核苷酸等)。异源基因可以进一步包含植物基因多核苷酸，该植物基因多核苷酸包含植物基因的cDNA形式；cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)被表达。在本发明的一个方面，异源基因与内源植物基因的区别在于，该异源基因多核苷酸典型地与包含调节元件如启动子的多核苷酸接合，未发现这些多核苷酸与该异源基因编码的蛋白质的基因或与染色体中的植物基因多核苷酸天然地相关，或者这些多核苷酸与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在通常不表达该基因的基因座中表达的基因)相关。此外，在实施例中，“异源的”多核苷酸是不与引入它的宿主细胞天然地相关的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多个拷贝。
如本文所用，术语“杂合的”是指当不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处时存在的遗传条件。
如本文所用，术语“纯合的”是指当相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处时存在的遗传条件。
如本文所用，术语“人诱导的突变”是指由于直接或间接的人作用而发生的任何突变。此术语包括但不限于通过任何靶向诱变方法获得的突变。
如本文所用，术语“杂交种”是指通过杂交两株遗传上不同的亲本植物而产生的后代。此杂交的所得子代是“双亲本”群体。在植物育种的上下文中，术语“杂种”、“杂种植物”和“杂种子代”是指植物，该植物是通过杂交不同品系或品种或物种的植物(包括但不限于两个近交品系(例如，基因杂合的或大部分杂合的个体)之间的杂交)而产生的基因上不同的亲本的后代。短语“单交F1杂种”是指由两个近交品系之间的杂交产生的F1杂种。
在两个核酸或氨基酸序列的情况下，术语“同一性”或“相同的”是指在全面比对两个序列时，如与测试(“受试”)序列相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或氨基酸序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。除非另有陈述，否则如本文所用的序列同一性是指如下获得的值：使用在EMBOSS Needle比对工具中实现的Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443--453)，使用默认矩阵文件EBLOSUM62(用于蛋白质)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)或DNAfull(用于核酸)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)；或其任何等效程序。EMBOSS Needle可例如从EMBL-EBI获得，例如在以下网站：ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/并且如在以下出版物中所述：“The EMBL-EBI search and sequence analysistools APIs in 2019.[2019年EMBL-EBI搜索和序列分析工具API]”Madeira等人NucleicAcids Research[核酸研究],2019年6月,47(W1):W636-W641。如本文所用，术语“等效程序”是指任何序列比较程序，对于任两个所讨论序列，在与通过EMBOSS Needle生成的相应比对相比时，该程序生成具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。在一些实施例中，基本上相同的核酸或氨基酸序列可以发挥基本上相同的功能。
短语“近交品系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交品系可以通过若干循环的兄弟/姐妹育种或自体受精来获得。在一些实施例中，近交品系针对一个或多个目的表型性状进行纯育。“近交”、“近交个体”或“近交子代”是来自一个近交品系的单独的样品。术语“近交”是指基本上纯合的个体或品系。
如本文所用，“引入”是指递送、表达、施用、运输、转移、渗透或其他相似的术语以指示所希望的物体的核酸或蛋白质或其组合向一个物体的递送。例如，编码定点核酸酶的核酸和任选地至少一种指导RNA可通过单倍体诱导引入单倍体胚中。同样地，现存编辑机器(包含定点核酸酶蛋白质和任选地至少一种指导RNA)可通过施用适宜的细胞穿透肽引入到单倍体胚中。
如本文所用，术语“渐渗(introgression)”，“渐渗的(introgressed)”和“进行渐渗(introgressing)”是指自然过程和人工过程，其中通过将一个物种、品种或栽培品种与另一个物种、品种或栽培品种杂交来将该一个物种、品种或栽培品种的基因组区域移至该另一个物种、品种或栽培品种的基因组。该过程可以任选地通过与轮回亲本回交来完成。
如本文所用，当在本发明的核酸分子或多核苷酸的上下文中使用时，术语“分离的”是指在相应源生物体内的染色体多核苷酸上下文中识别并分离/分开的多核苷酸。如果分离的核酸或多核苷酸确实具有天然存在的对应物，则其分离的核酸或多核苷酸不是其在其天然环境中存在的核酸。相比之下，非分离的核酸是核酸(如DNA和RNA)，它们是在自然界存在的状态下发现的。例如，在相邻基因附近的宿主细胞染色体上发现给定的多核苷酸(例如，基因)。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。可替代地，其可以包含正义链和反义链(即，核酸分子可以是双链的)。在优选的实施例中，本发明的核酸分子理解为分离的。
如本文所用，术语“敲除突变”是指其中所述基因的表达被停止或‘敲除’的基因突变。此突变可以包括但不限于通过任何靶向诱变方法获得的突变。
如本文所用，术语“基因座”是指在给定的物种中在染色体上的位置(例如，基因、遗传标记等的位置)。
如本文所用，“母本单倍体诱导系”是指产生花粉并且当作为雄性杂交时导致单倍体种子的雌核发育的品系。“父本单倍体诱导系”是指当在杂交中用作雌性时导致单倍体种子的雄核发育的品系。单倍体诱导系植物可以使用这些母本或父本机制中的任一种来衍生单倍体。
如本文所用，术语“保持系”是指如下的植物品系，其是雄性可育的，包含正常细胞质，与CMS植物品系基本上遗传相似(例如，等基因)，并且用于保持CMS诱导系的储备。保持系优选地关于非恢复系等位基因(例如，rf4)以及R1颜色标记(例如，R1-nj或R1-SCM2)为纯合的。另外，保持系可包含CenH3突变。在本文中，保持系用作与CMS品系杂交的雄性，该CMS品系可以包含或可以不包含CenH3突变。如本文所用，术语“正常细胞质”是指可育的细胞型(与细胞质雄性不育相反)。可以将保持系自交以增加其种子储备。
如本文所用，当鉴定HI相关的基因座的存在/不存在时，术语“分子标记”可以用于指如上文所定义的遗传标记，或其用作参比点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标记可以源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，源自RNA、cDNA等)。该术语也指与标记序列互补或与位于其侧翼的核苷酸序列，如用作能够扩增标记序列的探针和/或引物的核苷酸序列。当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，这些核苷酸序列是“互补的”(例如，根据沃森-克里克碱基配对原则)。此术语也指通过与标记序列互补或与位于其侧翼的核苷酸序列(如用作能够扩增标记序列的探针和/或引物的核苷酸序列)的不存在指示性状的遗传标记。
如本文所用，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸片段”是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的、和/或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是从其构建DNA或RNA聚合物并且由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基团组成的单体单元。核苷酸(通常以其5'-单磷酸酯形式发现)以其单字母名称表示如下：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
术语“后代”是指作为一种或多种亲本植物或其后裔的营养或有性繁殖的子代的任何植物。例如，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是由亲本(其中至少一方是首次用作性状的供体)生成的第一世代后代，而第二世代(F2)或随后世代(F3、F4等)的后代是由F1、F2等的自交生成的样本。因此，F1可以是由两个纯种亲本(纯种是关于性状为纯合的)之间的杂交产生的杂种，而F2可以是由该F1杂种的自花授粉产生的后代。
术语“PCR(聚合酶链反应)”在本发明的范围内被理解为是指产生DNA的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。
如本文所用，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，除非另有说明，否则术语“植物”可以指以下中的任一项：全株植物、植物组分或器官(例如，叶片、茎、根等)、植物组织、种子和/或植物细胞。
“植物细胞”是植物的结构和生理单元，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或经培养的细胞的形式，或作为高等组织化单元(如例如，植物组织、植物器官或全株植物)的一部分。
如本文所用，“保存的花粉”是指手动收集的并且以一些方式储存以供将来使用的花粉(参见通过引用并入本文的美国申请号63/289299)。
如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下以及在合适的温度和pH下)时，其能够退火至核酸靶标(在一些实施例中，特异性地退火至核酸靶标)，以允许DNA聚合酶和/或逆转录酶与其附接，从而用作DNA合成的起始点。在一些实施例中，采用一个或多个引物来扩增植物核酸(例如，使用聚合酶链式反应；PCR)。
如本文所用，术语“探针”是指可以与靶核酸序列中的互补序列形成氢键合的双链体的核酸(例如，单链核酸或双链或更高级核酸的链、或其子序列)。典型地，探针具有足够的长度以便与其互补序列形成稳定且序列特异性的双链体分子，并且这样可以在一些实施例中用于检测在多个核酸中存在的目的序列。
术语“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文所使用的，“植物组织”是指被组织化成结构和功能单元的植物细胞群组。包括植物中或培养中的任何植物组织。此术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。此术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
术语“植物部分”指示植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶片、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。
如本文所用，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指植物或植物细胞的一种或多种性状。表型是可通过裸眼或通过本领域已知的任何其他评估方式(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)观察的。在一些情况下，表型直接由单一基因或遗传基因座控制(即，对应于“单基因性状”)。在单倍体诱导的情况下，使用颜色标记(例如R Navajo)和其他标记(包括通过种子内颜色的存在或不存在来可视化的转基因)证明种子是否是诱导的单倍体种子。使用RNavajo作为颜色标记和使用转基因作为检测雌株上单倍体种子诱导的手段在本领域是熟知的。在其他情况下，表型是若干个基因之间相互作用的结果，在一些实施例中，其也由植物和/或植物细胞与其环境相互作用引起。
如本文所用，术语“群体”意指共享共同的遗传衍生(genetic derivation)的植物的遗传上异质的集合。
如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，当置于诱导引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下以及在合适的温度和pH下)时，其能够退火至核酸靶标(在一些实施例中，特异性地退火至核酸靶标)，以允许DNA聚合酶和/或逆转录酶与其附接，从而用作DNA合成的起始点。在一些实施例中，采用一个或多个引物来扩增植物核酸(例如，使用聚合酶链式反应；PCR)。
如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，当置于诱导引物延伸产物的合成的条件下(例如在核苷酸和用于聚合的试剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够退火至扩增靶标，以允许DNA聚合酶附接，从而用作DNA合成的起始点。(扩增)引物优选地是单链的，以获得最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括引物的温度和组成(A/T和G/C含量)。一对双向引物由DNA扩增领域中(诸如在PCR扩增中)常用的一个正向引物和一个反向引物组成。应当理解的是，如本文所用，“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些模糊性的情况下。因此，“引物”包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。寡核苷酸引物可以通过任何合适的方法制备。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如在例如US 4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相载体法。如果需要，可以通过并入可通过例如光谱方法、荧光方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法或化学方法检测的手段来对引物进行标记。一种或多种寡聚核苷酸引物的模板依赖性延伸由聚合试剂在适量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP；即dNTP)或类似物的存在下、在反应介质(包含适当的盐、金属阳离子和pH缓冲体系)中催化。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶或其Klenow片段、T4DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域已知的。合成的产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子，其包括靶序列。这些产物反过来作为另一轮复制的模板。在第二轮复制中，第一轮循环的引物延伸链用其互补引物退火；合成产生“短”产物，该产物通过引物序列或其互补物在5'-末端和3'-末端两者上结合。变性、引物退火和延伸的重复循环导致由引物限定的靶区域的指数累积。进行足够的循环以实现所希望量的含有核酸靶区域的多核苷酸。所希望的量可以变化，并且由产物多核苷酸起到的功能决定。PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR进行扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，该探针多核苷酸在低、中度或甚至高度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列的多核苷酸形成稳定的杂交体。如果预期探针将与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用高度严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。然而，典型地选择排除非特异性/偶然结合的条件。影响杂交并针对非特异性结合而选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell,2001中。通常，较低的盐浓度和较高温度增加了杂交条件的严格性。“PCR引物”在本发明的范围内优选地被理解为是指DNA的特定区域的PCR扩增中所用的单链DNA的相对短的片段。
如本文所用，术语“探针”是指可以与靶核酸序列中的互补序列形成氢键合的双链体的核酸(例如，单链核酸或双链或更高级核酸的链、或其子序列)。典型地，探针具有足够的长度以便与其互补序列形成稳定且序列特异性的双链体分子，并且这样可以在一些实施例中用于检测在多个核酸中存在的目的序列。
术语“探针”是指将与靶核酸分析物或其cDNA衍生物中的基本上互补的寡核苷酸形成氢键合双链体的单链寡核苷酸。
如本文所用，术语“标记探针”和“探针”是指可以用于检测较大序列内序列的存在或不存在的核苷酸序列或核酸分子，例如，通过核酸杂交与标记或标记基因座的全部或部分互补的核酸探针。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个连续核苷酸的标记探针可以用于核酸杂交。
术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后裔可以是例如F1、F2或任何后续世代。
如本文所用，术语“子代”和“子代植物”是指从一个或多个亲本植物通过营养繁殖或有性繁殖生成的植物。在单雌生殖-介导的单倍体诱导中，母本上的单倍体胚包含雌性染色体排除雄性染色体—因此它不是雄性单倍体-诱导品系的子代。单倍体玉米种子典型地仍然具有含有雄性染色体组的正常的三倍体胚乳。经编辑的单倍体子代和随后的经编辑的双单倍体植物和随后的种子不是唯一的所希望子代。还有常常携带Cas9转基因的来自单倍体诱导系本身的种子、和后续植物以及单倍体诱导植物的种子子代。单倍体种子和单倍体诱导系(自花授粉诱导的)种子可以是子代。子代植物可以通过克隆单一亲本植物或使单一亲本植物自交、或者通过使两个或更多个亲本植物杂交来获得。例如，子代植物可以通过一个亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是生成自两个亲本的第一世代子代(两个亲本中至少一个是第一次用作性状的供体)，而第二代(F2)或后续代(F3、F4等)的子代是生成于F1、F2等的自交、互交、回交和/或其他杂交的样本。因此，F1可以是(并且在一些实施例中是)从两个纯种亲本(即，纯种的亲本各自关于目的性状或其等位基因都为纯合的)之间的杂交产生的杂交种，而F2可以是(并且在一些实施例中是)从F1杂交种自花授粉产生的子代。
术语“R1-nj”和“R1-SCM2”是指R1-Navajo和R1-SCM2花色素苷标记。这些视觉标记可用于区分单倍体与二倍体(或非整倍体)。如本文所述，单倍体植物的颜色被鉴定为奶油色，而二倍体的颜色是紫色。
如本文所用，术语“再生”及其语法变体是指从组织培养物中生成植物。
如本文所用，“恢复系因子”或“育性恢复系”或“Rf”或“恢复系等位基因”是指植物中恢复雄性不育植物的育性的一个或多个基因。恢复系因子基因的实例包括但不限于Rf3、Rf4、Rf10、Rf11和Rf12。植物关于一种或多种恢复系因子基因可以为杂合的或纯合的。例如，植物可以含有Rf4以及Rf11，但也可以是rf10。杂交中的另一种植物可以是rf4，但也可以是Rf11和Rf10。因此，每一植物都可以含有和缺乏恢复系等位基因和非恢复系等位基因。因此，包含至少一个恢复系等位基因的CMS植物仍将是雄性可育的。
非恢复系等位基因(也称为“rf”)意指植物中不会恢复雄性不育植物的育性的一种或多种基因。非恢复系等位基因的实例包括但不限于rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。如果植物具有CMS，则关于非恢复系等位基因为纯合的植物将是雄性不育的。
如本文所用，“自发染色体加倍”(“SCD”)或“自发单倍体基因组加倍”或“单倍体雄性育性”或“自发基因组加倍”可互换使用，以描述在没有任何干预的情况下单倍体基因组的加倍。SCD允许正确的染色体减数分裂减少和随后形成成熟花粉。在本披露中，SCD通过将可育性单倍体植物的数目/除以植物的总数来计算。
如本文所用，“自发双单倍体植物”是指其小花已经历自发加倍的植物。自发双单倍体植物的其他组织可以保留其单倍体状态(例如，根、叶、茎)。
如本文所用，术语“靶向诱变”或“诱变策略”是指导致所选择的基因的有意诱变的任何诱变方法。靶向诱变包括CRISPR、TILLING、TALEN方法和其他尚未发现但可以用于实现相同结果的其他方法。如本文所用，术语“靶向诱变”或“诱变策略”是指导致所选择的基因的有意诱变的任何诱变方法。靶向诱变包括CRISPR、TILLING、TALEN方法和其他尚未发现但可以用于实现相同结果的其他方法。
如本文所用，术语“性状”是指目的表型、促成目的表型的基因、以及与促成目的表型的基因相关联的核酸序列。例如，“HI性状”是指单倍体诱导表型、以及促成单倍体诱导的基因(例如，玉蜀黍中的matl或水稻中的Os03g27610)和与单倍体诱导表型的存在或不存在相关的核酸序列(例如，HI相关的基因产物)。
如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入细胞中。
如本文所用，术语“转基因”是指通过某些形式的人工转移技术引入生物体或一个或多个其祖先中的核酸分子。因此，人工转移技术建立“转基因生物体”或“转基因细胞”。应当理解的是，人工转移技术可以在祖先生物体(或其中的细胞和/或可以发育成祖先生物体的细胞)中发生，并且即使一种或多种自然和/或辅助育种导致了人工转移的核酸分子存在于子代个体中，具有人工转移的核酸分子或其片段的任何子代个体仍然被认为是转基因的。
具体实施方式
本文描述了用于赋予植物品系细胞质雄性不育(CMS)的方法。该方法包括获得包含作为单倍体诱导系(CHIP)的CMS细胞质的第一植物，获得包含希望的核基因组(DIP)的第二植物，并且将CHIP与DIP杂交且由所述杂交生成子代。所得子代包含分别来自CHIP和DIP的CMS细胞质和希望的核基因组。在实施例中，CMS细胞质选自由以下组成的组：CMS-C、CMS-S和CMS-T。在一个实施例中，CMS细胞质是CMS-C。在一个实施例中，CHIP是雌性可育的和CMS雄性不育的。在另一个实施例中，CHIP是雌性可育的和CMS雄性可育的。CHIP是父本单倍体诱导系，并且包含cenh3突变。在一个实施例中，cenh3突变是敲除突变。在一个实施例中，cenh3敲除突变是通过基因编辑获得的。在另一个实施例中，cenh3敲除突变包括SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6。在另一个实施例中，cenh3敲除突变是杂合的。在又另一个实施例中，使用CRISPR-Cas12a编辑cenh3突变。在一个实施例中，CRISPR-Cas12a选自由以下组成的组：AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a、MbCas12a和Mb2Cas12a。在一个实施例中，CRISPR-Cas12a是LbCas12a。
在又另一个实施例中，CHIP进一步包含花色素苷标记。花色素苷标记选自由R1-navajo和R1-SCM2组成的组。在一个实施例中，花色素苷标记是R1-navajo；并且在另一个实施例中，花色素苷标记是R1-SCM2。花色素苷标记是纯合的。在又另一个实施例中，CHIP进一步包含恢复系等位基因，其中恢复系等位基因选自由以下组成的组：Rf3、Rf4、Rf11、Rf10和Rf12。在实施例中，恢复系等位基因是Rf4。在另一个实施例中，恢复系等位基因是纯合的。在另一个实施例中，CHIP包含非恢复系等位基因，其中非恢复系等位基因选自由以下组成的组：rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。非恢复系等位基因是rf4且是纯合的。
在实施例中，CHIP包含cenh3突变、R1-navajo标记、以及恢复系因子4基因的恢复系等位基因。在另一个实施例中，CHIP包含cenh3突变、R1-SCM2标记、以及恢复系因子4基因的恢复系等位基因。在一个实施例中，CHIP包含cenh3突变、R1-navajo标记、以及恢复系因子4基因的非恢复系等位基因；而在另一个实施例中，CHIP包含cenh3突变、R1-SCM2标记、以及恢复系因子4基因的非恢复系等位基因。在又另一个实施例中，CHIP选自由以下组成的组：玉米、小麦、水稻、向日葵、番茄、大麦、芸苔属植物(brassicas)、黄瓜和西瓜。在另一个实施例中，CHIP是玉米。
在实施例中，在CHIP与DIP的杂交中，DIP是花粉供体。DIP关于非恢复系等位基因可以为纯合的或杂合的。在另一个实施例中，DIP关于非恢复系等位基因为纯合的，其中非恢复系等位基因选自由以下组成的组：rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。在一个实施例中，非恢复系等位基因是rf4。在实施例中，DIP选自由以下组成的组：玉米、小麦、水稻、和向日葵、番茄、大麦、芸苔属植物、黄瓜以及西瓜。在一个实施例中，DIP是玉米。
在又另一个实施例中，本文披露了通过上述方法产生的植物，其中该植物是CMS单倍体植物。在实施例中，CMS单倍体植物包含CHIP的CMS细胞质和DIP的核基因组，同时缺乏花色素苷标记、恢复系等位基因和cenh3敲除突变。在另一个实施例中，用加倍剂处理CMS单倍体植物。在一个实施例中，加倍剂选自由以下组成的组：秋水仙碱、拿草特、氟硫草定(dithipyr)、氟乐灵、一氧化二氮、或另一种已知的抗微管剂。在另一个实施例中，加倍剂是秋水仙碱。在又另一个实施例中，用来自DIP的花粉对CMS单倍体植物授粉。在另一个实施例中，用保存的花粉对CMS单倍体植物授粉。在又另一个实施例中，通过基因分型或其他分子分析来确认CMS单倍体植物。
实例实例1：建立具有R1-nj颜色标记的CMS单倍体诱导系(CHIP)。
1.为了选择用于基因编辑的有效gRNA，我们用与各种候选gRNA的LbCas12a-crRNARNP复合物转染黄化的玉米原生质体。用于LbCas12a的crRNA支架是基于CRISPR-LbCpf1系统。如所述(Sheen,1991)从生长在黑暗条件下的黄化玉米叶中分离原生质体。原生质体转染如所述(Sant’Ana等人,2020)进行，但有一些修改。转染反应的每个反应由5x 105个原生质体组成，并将其与PEG溶液(40％ PEG-4000、0.6M甘露醇、100mM CaCl2)一起孵育15min。在利用W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES(pH 5.7))终止后，将转染的原生质体重悬于300μl W1溶液(0.6M甘露醇、4mM MES(pH 5.7)、4mM KCl)中，转移至96孔透明底微孔板中，并在不摇动的情况下在28℃于黑暗中孵育2天。2天后从转染的原生质体中分离DNA，并通过PCR扩增随后进行扩增子的限制性T7内切核酸酶I(NEB)酶切来分析基因编辑效率。
2.使用携带如上所述选择的具有序列CAGGTGGTGCGAGTACCTCGGCG(SEQ ID NO:1)的gRNA140(靶向基因ID GRMZM2G158526的第二外显子)的LbCas12a RNP和携带PMI选择性标记的DNA载体26258(参见表16)进行SYN-INBC34近交未成熟胚的生物弹道轰击。为了生成LbCas12a-crRNA RNP复合物，将0.3nmol的Cas12蛋白和0.3nmol的crRNA以11μl的总体积混合，并在室温下孵育10分钟。对于单独的RNP递送，如下将RNP涂到0.6μm金粒子(伯乐公司(Bio-Rad)，美国)上:将100μl金粒子(10mg/ml的水悬浮液)和20μl糖原(20mg/ml)添加到预混合的RNP中，轻轻混合，并且然后在冰上孵育10分钟。对于RNP与DNA的共递送，如下将RNP和DNA载体质粒26258涂到金粒子上：将100μl金粒子(10mg/ml的水悬浮液)和20μl糖原(20mg/ml)添加到预混合的RNP和DNA载体中，轻轻混合，并且在冰上孵育10分钟。将涂有RNP/DNA的金粒子以8,000g离心40秒，除去上清液。将沉淀用30μl的无菌水通过简短的超声处理重悬，并且然后散布于大载体盘上(各10μl)，随后在层流净化罩中风干(2-4h)。
3.在授粉后约9-11天从收获的穗分离未成熟胚，并在渗透培养基上预培养1-3天。然后使用伯乐公司PDS-1000HeTM生物弹道粒子递送系统，用LbCas12a-RNP复合物和上述DNA轰击预培养的胚。在愈伤组织诱导培养基中孵育轰击的胚。然后将诱导的愈伤组织移至甘露糖选择培养基上。将甘露糖抗性愈伤组织转移到再生培养基中以诱导芽形成。然后将芽继代培养到生根培养基上。使用先前描述的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)TaqMan R方法，从生根的植物收获叶样品进行TaqMan R测定，以检测靶位点中的突变。
4.我们用引物TCCTTGTTCCGTCTTTTGCAG(SEQ ID NO:2)和AAGGCAAAAGGAGGGAACTGAT(SEQ ID NO:3)以及探针TACCTCGGCGACGCC(SEQ ID NO:4)使用TaqMan测定3895并且针对移码等位基因通过PCR测序明确地鉴定出CenH3-het编辑的植物。SYN-INBC34是rf4/rf4，不具有R-nj标记，并且不是CMS。进行以下步骤以将编辑的CenH3等位基因带入包括纯合R1-nj、CMS和纯合Rf4的遗传背景中。
5.使T0事件生长至成熟，并自花授粉和/或作为雄性异交到CMS-C材料SYN-INB77M-CMS(rf4/rf4且雄性不育)上。还通过TaqMan测定和PCR测序将来自T0自交的T1世代植物鉴定为关于CenH3编码序列中的移码突变(从此处起称为CenH3[+/-]植物)为杂合的，并且使其生长至成熟以与CMS杂交，从而生成更多CMS-Cenh3编辑的种子。
a.在将T0或T1 CenH3突变体花粉杂交到SYN-INB77M-CMS上后，在F1世代中，我们通过TaqMan测定和桑格测序(Sanger sequencing)鉴定出了携带杂合的CENH3中10碱基缺失的植物。此植物是雄性不育的，并且通过来自关于R-nj和Rf4为纯合的RWKS植物品系的花粉进行授粉。
b.还将T1世代(非CMS)CenH3(+/-)突变体植物与RWKS互交以生成具有CenH3和R-nj标记的F1。
c.来自步骤5b的CMS CenH3(+/-)x RWKS杂交的所有种子都是红色或紫色的，指示R1-nj标记以至少杂合的情况存在。种植这些种子，并且通过TaqMan测定将所得植物针对CenH3(+/-)和Rf4(+/-)接合性进行基因分型，并且然后自花授粉(归因于Rf4标记，它们是可育的)。还将一些植物用来自步骤5b中CenH3(+/-)x RWKS杂交的F1子代的携带CenH3(+/-)和R-nj的种子进行回交。
d.种植由步骤5c的杂交得到的紫色种子，并通过TaqMan和测序针对CenH3(+/-)杂合、R-nj纯合和CMS细胞质进行选择。这些诱导系材料容易通过自交而增加。如果Rf4标记不存在(即，诱导系植物是rf4/rf4)，则还可以使用与携带R-nj标记和任选地CenH3(+/+或+/-)的突变体等位基因的同胞植物或保持系植物的杂交来增加种子。
e.然后将此诱导系用作用于一步转化的CMS供体品系。将该材料用作雌性并且与来自希望直接转化为CMS细胞质的任何品系的花粉杂交。杂交后，将单倍体颜色分选为具有奶油色胚的成熟干种子(二倍体杂种具有紫色胚)。然后，在种植于土壤中之前可以对或可以不对单倍体种子进行化学处理来诱导基因组加倍，并且使其生长至成熟，然后在那里将它们与轮回亲本花粉杂交。
表1.CENH3缺失突变体等位基因与野生型(SEQ ID NO:7)相比的核苷酸比对(509A115A由SEQ ID NO:8表示；509A151A由SEQ ID NO:9表示，并且509A150A由SEQ ID NO:177表示)
GRMZM2G158526CTCTCCGACCCTGGTGCTAAGCACGTTCCTTGTTCCGTCTTTTGCAGGTGGTGCG509A115A CTCTCCGACCCTGGTGCTAAGCACGTTCCTTGTTCCGTCTTTTGCAGGTGGTGCG 509A150A CTCTCCGACCCTGGTGCTAANCACGTTCCTTGTTCCGTCTTTTGCAGGTGGTGCG 509A151A CTCTCCGACCCTGGTGCTAAGCACGTTCCTTGTTCCGTCTTTTGCAGGTGGTGCG GRMZM2G158526AGTACCTCGGCGACGCCGGTGAGCGCGTGCGTGCGGGGATCAGTTCCCTCCTTTT 509A115A AG----------ACGCCGGTGAGCGCGTGCGTGCGGGGATCAGTTCCCTCCTTTT 509A150A AG-------------------AGCGCGTGCGTGCGGGGATCAGTTCCCTCCTTTT 509A151A -------------------TGAGCGCGTGCGTGCGGGGATCAGTTCCCTCCTTTT GRMZM2G158526GCCTTTTTTTGTTGGGCTGCTCTTACTTGCTTGCAAGCTGTTTGATGGAATGCAG509A115A GCCTTTTTT-GT-GGGCTGCTCTTACTTGCTTGCAAGCTGTTTGATGGAATGCAG 509A150AGCCTTTTTT-GT-GGGCTGCTCTTACTTGCTTGCAAGCTGTTTGATGGAATGCAG 509A151A GCCTTTTTT-GT-GGGCTGCTCTTACTTGCTTGCAAGCTGTTTGATGGAATGCAG GRMZM2G158526GAAAGGGCTGCTGGGACCGGGGGAAG
509A115A GAAAGGGCTGCTGGGACCGGGGGAAG
509A150A GAAAGGGCTGCTGGGACCGGGGGAAG
509A151A GAAAGGGCTGCTGGGACCGGGGGAAG
表2.CENH3缺失突变体等位基因的推导氨基酸序列的部分比对(GRMZM2G158526WT由SEQ ID NO:10表示)。509A115A(10bp缺失SEQ ID NO:12)完全存在于外显子2中，因此推导的剪接维持处于野生型。对于509A151A和509A150A(19bp缺失)，取决于用于内含子剪接的GT供体位点，我们生成了所有可能的剪接变体(SEQ ID NO:13-22)。还显示了KD等位基因(Kelly Dawe,佐治亚大学)的推导氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。
GRMZM2G158526 MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATP--------ERAAG---
CENH3_KD MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATP--------ERAAG---
509A115A_转录物_ MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGARRR-------------------
509A151A_转录物_a MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSA-------------
509A151A_转录物_b MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSAC----ERAAG---
509A151A_转录物_c MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSERAAG---
509A151A_转录物_d MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSVPSFCLFL
509A151A_转录物_e MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSVPSFCLFL
509A150A_转录物_a MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSA-------------
509A150A_转录物_b MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSAC----ERAAG---
509A150A_转录物_c MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSERAAG---
509A150A_转录物_d MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSVPSFCLFL
509A150A_转录物_e MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPVSACVRGSVPSFCLFL
GRMZM2G158526 TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGTVALREIRKYQKSTEPL
CENH3_KD TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGL*RCGRSGSTRSPLNRS
509A115A_转录物_ KG---LL----GPGEERRLEVTQLRRRNHATAGGQGL*RCGRSGSTRSPL
509A151A_转录物_a KG---LL----GPGEERRLEVTQLRRRNHATAGGQGL*RCGRSGSTRSPL
509A151A_转录物_b TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGTVALREIRKYQKSTEPL
509A151A_转录物_c TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGTVALREIRKYQKSTEPL
509A151A_转录物_d KG---LL----GPGEERRLEVTQLRRRNHATAGGQGL*RCGRSGSTRSPL
509A151A_转录物_e LGCSYLLAS*KGCWDRGKSGVWR*LS*EDETTPPLAARDCSAAGDQEVPE
509A150A_转录物_a KG---LL----GPGEERRLEVTQLRRRNHATAGGQGL*RCGRSGSTRSPL
509A150A_转录物_b TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGTVALREIRKYQKSTEPL
509A150A_转录物_c TG---------GRAASGGDSVKKTKPRHRWRPGTVALREIRKYQKSTEPL
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509A150A_转录物_e LGCSYLLAS*KGCWDRGKSGVWR*LS*EDETTPPLAARDCSAAGDQEVPE
GRMZM2G158526 IPFAPF-VRVVR---ELTNFVTN--GKVERYTAEALLALQE
CENH3_KD *GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRC—K—S---PLRLSSVW--
509A115A_转录物_ NRSSPLRLSSVW---*GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRCK-
509A151A_转录物_a NRSSPLRLSSVW---*GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRCK-
509A151A_转录物_b IPFAPF-VRVVR---ELTNFVTN--GKVERYTAEALLALQE
509A151A_转录物_c IPFAPF-VRVVR---ELTNFVTN--GKVERYTAEALLALQE
509A151A_转录物_d NRSSPLRLSSVW---*GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRCK-
509A151A_转录物_e VH*TAHPLCAFRPCGEGVNQFRNKRESRALYRRSPPCAAR-
509A150A_转录物_a NRSSPLRLSSVW---*GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRCK-
509A150A_转录物_b IPFAPF-VRVVR---ELTNFVTN--GKVERYTAEALLALQE
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509A150A_转录物_d NRSSPLRLSSVW---*GS*PIS*QTGK*SAIPQKPSLRCK-
509A150A_转录物_e VH*TAHPLCAFRPCGEGVNQFRNKRESRALYRRSPPCAAR-
实例2：建立具有R1-SCM2颜色标记的CMS单倍体诱导系(“CHIP”)。
1.为了选择用于基因编辑的有效gRNA，我们用与各种候选gRNA的LbCas12a-crRNARNP复合物转染黄化的玉米原生质体。用于LbCas12a的crRNA支架是基于CRISPR-LbCpf1系统。如所述(Sheen,1991)从生长在黑暗条件下的黄化玉米叶中分离原生质体。原生质体转染如所述(Sant’Ana等人,2020)进行，但有一些修改。转染反应的每个反应由5x 105个原生质体组成，并将其与PEG溶液(40％ PEG-4000、0.6M甘露醇、100mM CaCl2)一起孵育15分钟。在利用W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES(pH 5.7))终止后，将转染的原生质体重悬于300μl W1溶液(0.6M甘露醇、4mM MES(pH 5.7)、4mM KCl)中，转移至96孔透明底微孔板中，并在不摇动的情况下在28℃于黑暗中孵育2天。2天后从转染的原生质体中分离DNA，并通过PCR扩增随后进行扩增子的限制性T7内切核酸酶I(NEB)酶切来分析基因编辑效率。
2.使用与靶向基因ID GRMZM2G158526的第二外显子的gRNA140(序列CAGGTGGTGCGAGTACCTCGGCG，SEQ ID NO:1)复合的LbCas12a和DNA载体26258(表16)(两者均携带PMI选择性标记)进行SYN-INBC34 x SYN-INBC34RS分离未成熟胚(关于R1-SCM2标记为杂合的)的生物弹道轰击。为了生成Cas12a-crRNA RNP复合物，将0.3nmol的Cas12蛋白和0.3nmol的crRNA以11μl的总体积混合，并在室温下孵育10分钟。对于单独的RNP递送，如下将RNP涂到0.6μm金粒子(伯乐公司(Bio-Rad)，美国)上:将100μl金粒子(10mg/ml的水悬浮液)和20μl糖原(20mg/ml)添加到预混合的RNP中，轻轻混合，并且在冰上孵育10分钟。对于RNP与DNA的共递送，如下将RNP和DNA载体质粒26258涂到金粒子上:将100μl金粒子(10mg/ml的水悬浮液)和20μl糖原(20mg/ml)添加到预混合的RNP和DNA载体中，轻轻混合，并且在冰上孵育10分钟。将涂有RNP/DNA的金粒子以8,000g离心40s，除去上清液。将沉淀用30μl的无菌水通过简短的超声处理重悬，并且散布于大载体盘上(各10μl)，随后在层流净化罩中风干(2-4h)。
3.在授粉后约9-11天从收获的穗分离未成熟胚，并在渗透培养基上预培养1-3天。使用伯乐公司PDS-1000HeTM生物弹道粒子递送系统，用LbCas12a-RNP复合物和上述DNA轰击预培养的胚。然后在愈伤组织诱导培养基中孵育轰击的胚。将诱导的愈伤组织移至甘露糖选择培养基上。将甘露糖抗性愈伤组织转移到再生培养基中以诱导芽形成。然后将芽继代培养到生根培养基上。使用先前描述的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)TaqMan R方法，从生根的植物收获叶样品进行TaqMan R测定，以检测靶位点中的突变。
4.我们用引物TCCTTGTTCCGTCTTTTGCAG(SEQ ID NO:2)和AAGGCAAAAGGAGGGAACTGAT(SEQ ID NO:3)以及探针TACCTCGGCGACGCC(SEQ ID NO:4)使用TaqMan测定3895并且针对移码等位基因通过PCR测序明确地鉴定出CenH3-het编辑的植物。进行以下步骤以将编辑的CenH3等位基因带入包含纯合R1-SCM2、CMS和纯合Rf4的遗传背景中。
5.使T0事件生长至成熟并进行自交。种植紫色种子的T1子代，并且通过TaqMan和PCR测序鉴定出CenH3(+/-)植物，使其生长至成熟，以便自交和杂交到携带保持系等位基因rf4和rf11的SYN-INB77M-CMS品系穗上。
6.在用携带R1-SCM2标记和序列TACCTCGGCGACGCCGGTG(SEQ ID NO:5)的19碱基对缺失的植物授粉后获得两个SYN-INB77M-CMS穗。再次针对紫色种子颜色选择有待种植的子代种子。针对纯合的R1-SCM2用R1标记且针对关于19bp缺失为杂合用对此cenh3突变体等位基因具有特异性的TaqMan测定对幼苗进行基因分型和进一步选择。如果这些植物是雄性可育的，则将它们自交。如果这些植物是雄性不育的，则将它们作为雌性与存在R1-SCM2和CenH3(+/-)的非CMS T2植物杂交。
表3.用于鉴定R1颜色标记和R1-颜色抑制基因的所希望基因型的标记的列表。
表4.用以鉴定细胞质或线粒体基因组类型的标记的列表。
表5.用于鉴定恢复系基因等位基因类型的标记的列表。
表6.用于CENH3测定的RT-PCR序列。
7.对下一世代进行针对R1-SCM2的纯合性、CMS的存在和杂合的敲除CenH3(+/-)构型的基因分型。这种特定组合是可以用于CMS细胞交换的理想诱导系基因型之一。这些诱导系材料容易通过自交而增加。然而，如果该品系是雄性不育的(即，Rf4标记不存在并且诱导系植物是rf4/rf4)，则还可以将这些诱导系作为雌性与保持系花粉杂交以增加种子，它们关于R1-SCM2或R-nj标记以及任选地CenH3(+/+或+/-)的突变体等位基因为纯合的。
8.然后将此诱导系用作用于一步转化的CMS供体品系。将该材料用作雌性并且与来自希望直接转化为CMS细胞质的任何品系的花粉杂交。杂交后，在体外授粉后10天和25天之间对单倍体进行颜色分选(在培养箱中颜色诱导24小时后，我们选择奶油色胚)。可以对或可以不对单倍体种子进行化学处理来诱导基因组加倍，并且简单地移植到土壤中，使其生长，以与轮回亲本进一步杂交。同样地，可以通过自交来维持可育诱导系植物，而不育诱导系可以与携带R1-SCM2(或R-nj)颜色标记的非CMS(即，正常细胞质)保持系杂交。任选地，保持系可具有rf4和rf11的非恢复系等位基因以及CenH3 WT或CenH3敲除(突变体)等位基因。
实例3.玉米中的细胞交换概念验证(正常A细胞交换)
通过从佐治亚大学植物生物学系的Kelly Dawe实验室获得基因组编辑的材料并将其与一小组玉米品系杂交以生成单倍体，来证明在玉米中使用CenH3(+/-)诱导系进行的细胞交换。然后将单倍体加倍并自交，以建立DH1种子。从Dawe博士获得的材料的细胞质是“标准A”，已知为可转化玉米遗传背景常见的细胞质并且特征在于SM2914标记的特征性基因型。相比之下，已知选择用于细胞交换到此正常A的品系是正常B，其不为可转化背景并且特征在于SM2914标记的不同特征性基因型。
我们对来自Dawe博士的植物进行了针对CenH3编辑的等位基因的基因分型，选择CenH3杂合(+/-)的CenH3杂合(+/-)植物，并且将它们作为雌性与七个正常B先正达(Syngenta)雄性杂交。我们在授粉16天后收获这些穗，并将胚分离到皮氏培养皿中含有秋水仙碱的萌发培养基上保持24小时，以诱导基因组倍增。然后我们将胚移至植物培养托盘(phytatray)中的恢复培养基，并使植物生长至两叶期。然后，我们从植物中取样叶并提取DNA以用一小组TaqMan终点标记进行评估，这些TaqMan终点标记在正常A单倍体诱导系与正常B雄性亲本之间为多态性的。这些标记覆盖所有10条染色体，并用于选择仅携带来自花粉供体的染色体的植物。
表7.用于鉴定单倍体植物的标记小组
我们通过关于父本标记为“纯合”而鉴定出“父本单倍体”，并从那些被基因分型为杂交种的植物中分选出对小组中所有的核DNA标记都为杂合的植物。下表8显示了基于此数据的单倍体诱导率的汇总。还通过倍性分析测试了若干植物，以确定它们是否确实是单倍体。参见图3a(二倍体对照)和3b(单倍体)。
表8.父本单倍体后代的单倍体诱导率汇总。
表9.不同玉米种质中的细胞交换概念验证和效率测试。
双单倍体中细胞质交换的确认
数据显示我们从诱导系杂交中回收了3％至10％的单倍体。使单倍体生长至成熟并自花授粉(回顾一下，它们已经经由秋水仙碱处理而基因组加倍，因此更合理地说，它们是双单倍体)。下表10中所示的种子数是在自花授粉的穗上获得的。
表10.由经过细胞质转化的双单倍体的自交产生的种子
重要的是，对双单倍体和DH1世代后代两者进行基因分型，并且显示出具有与正常A(而非正常B)相关的细胞质标记。这清楚地指示，使用CenH3+/-诱导系，细胞交换概念有效地起作用。这个概念容易应用于交换雄性不育细胞质(在以下实例中示出)。
实例4：使用杂合CENH3品系的CMS细胞交换轮回亲本和R1-SCM2标记。
步骤1.我们选择十三个DIP玉米品系(9个大田玉米品系和4个甜玉米品系)用于转化为CMS。这些品系具有非育性恢复基因型rf4和rf11。DIP玉米品系也可以被称为轮回亲本。
步骤2.我们种植了两种转化系材料的种子，一种针对CENH3(SEQ ID NO:9)中19bp缺失分离，另一种针对CENH3(SEQ ID NO:8)中10bp缺失分离。两种类型的材料分离为野生型与杂合1:1，并且携带R1-SCM2等位基因(在胚的盾片中表达的花色素苷标记)。
步骤3.我们使用对野生型和两种缺失等位基因具有特异性的TaqMan测定从这些植株中鉴定出cenh3突变体杂合植物(总共3个测定)，并使它们生长至成熟。这些所得品系是转化系植物，即CHIP植物。
表11.用以鉴定cenh3杂合植物、细胞质类型(线粒体基因组)的测定以及R1、C1、Rf4和Rf11处的所希望等位基因。
步骤4.我们用来自轮回亲本(DIP)植物的花粉对来自CHIP植物的转化系穗进行授粉，并在授粉后16-19天收获穗用于胚提取。将提取的胚(即，F1世代)置于含有以下的皮氏培养皿上：40ml含0.5mg/ml秋水仙碱的Murashige和Skoog培养基(MS)培养基或不含秋水仙碱的相同MS培养基(通常参见Maluszynski等人编辑,Doubled Haploid Production inCrop Plants:A Manual[作物植物中的双单倍体生成：手册](2003)；还参见通过引用并入本文的WO 2002/085104)。在28℃，将板在Percival生长室中在连续光和123μmol/m.sec下放置16-24小时，以允许胚表达来自显性R1-SCM2等位基因的颜色。
步骤5.在16至24小时之后，将白色胚(即，缺乏R1-SCM2表达的那些)转移到含有100ml萌发培养基的植物培养托盘中，并且置于28℃下16小时光照(118μmol/m.sec)和24℃下8小时黑暗的生长室中。萌发培养基配方含有MS盐、维生素和肌醇(总体参见Murashige和Skoog,A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco TissueCultures[用于烟草组织培养物的快速生长和生物测定的改良培养基],PhysiologiaPlantarum[植物生理学]15:473-497(1962))，加入了0.5ml/升的植物防腐混合物(PPM,Plant Cell Technology[植物细胞技术])。
步骤6.约10天后，我们将存活的幼苗移植到包含土壤的2.5英寸盆中，并将它们放置在处于以下环境条件下的硬化室中：白天温度-80°F，夜晚温度-72°F，湿度-55％，光周期-12小时，光强度-约1200μmol，CO2-400ppm。
步骤7.移植后约5天对幼苗取样，并用覆盖所有10个玉米染色体的标记进行基因分型。选择被发现关于所有标记为纯合的144株植物的子集进行加倍(表13)。我们还通过CMS细胞质的两种标记(SM2915和SM2916)对它们进行测试来确认细胞质类型。
表12.提取的F1胚、进行基因分型的幼苗和单倍体幼苗的数目。
表13.每个品系每个处理选择加倍的单倍体的数目(秋水仙碱相比无秋水仙碱)。
| 品系 | 秋水仙碱 | 无秋水仙碱 | 总计 |
| 品系1 | 3 | 16 | 19 |
| 品系2 | 7 | 11 | 18 |
| 品系3 | 4 | 6 | 10 |
| 品系4 | 2 | 10 | 12 |
| 品系5 | 0 | 7 | 7 |
| 品系6 | 0 | 6 | 6 |
| 品系7 | 1 | 16 | 17 |
| 品系8 | 5 | 2 | 7 |
| 品系9 | 0 | 10 | 10 |
| 品系10 | 7 | 9 | 16 |
| 品系11 | 0 | 13 | 13 |
| 品系12 | 0 | 3 | 3 |
| 品系13 | 0 | 6 | 6 |
步骤8.我们将单倍体回收率(HRR)计算为确认的单倍体幼苗数目与提取的胚数目的比率。具有处于杂合状态的CENH3突变(10bp缺失或19bp缺失)的植物具有非常相似的HRR(表14)。
表14.针对所测试的两个CENH3突变得到的所有F1家族的单倍体回收率的平均值。
| CENH3突变 | 平均HRR | N |
| 509A115A(10bp缺失) | 6.7 | 48 |
| 509A151A(19bp缺失) | 5.3 | 13 |
将所有单倍体用轮回亲本植物的花粉授粉以生成单倍体BC1世代。
表15.按品系和处理产生的双单倍体种子(秋水仙碱相比无秋水仙碱)
| 品系 | 秋水仙碱 | 无秋水仙碱 | 总计 |
| 品系1 | 449 | 134 | 583 |
| 品系2 | 33 | 2 | 35 |
| 品系3 | 411 | 46 | 457 |
| 品系4 | 10 | 79 | 89 |
| 品系5 | NA | 6 | 6 |
| 品系6 | NA | 17 | 17 |
| 品系7 | 2 | 45 | 47 |
| 品系8 | 192 | 12 | 204 |
| 品系9 | NA | 15 | 15 |
| 品系10 | 33 | 3 | 36 |
| 品系11 | NA | 0 | 0 |
| 品系12 | NA | 5 | 5 |
| 品系13 | NA | 1 | 1 |
授粉后，使穗干燥。将完成由轮回亲本进行的另一轮胚拯救和授粉，以使DH种子量扩大。
实例5.用以将非CMS轮回亲本品系转化为CMS品系的通用方法。
步骤1.选择待转化为CMS的DIP。选择的品系需要是关于rf4(当与CMS细胞质组合时赋予雄性不育的隐性等位基因)为纯合的(理想情况)或杂合的品系。这些品系是rf4轮回亲本。
步骤2.使CHIP生长，并且如果需要，对各植物进行针对CenH3以及针对CMS、Rf4和R1基因座的标记的基因分型。使用关于CenH3敲除等位基因为杂合的植物进行CMS细胞交换。在任何诱导系群体中，都将存在许多关于CenH3基因为纯合WT的植物。这些植物不是诱导系并且必须被分选出来。选择的CHIP植物任选地是R1-SCM2或R1-nj纯合的。在理想的一步细胞交换方法中，这两个等位基因之一已经固定在该品系中。诱导系可以通过自花授粉(如果它们是雄性可育的)或通过与保持系的花粉杂交(如果它们是雄性不育的)来增加。保持系将具有R1-SCM2或R1-nj颜色标记，以使其固定在诱导系中。保持系可具有rf4和rf11的非恢复系等位基因以及CenH3 WT或CenH3敲除(突变体)等位基因。
步骤3.将DIP作为雄性(花粉供体)杂交到CHIP上。
步骤4.如果使用R1-nj标记，则使所得种子生长至成熟，干燥并收获，并针对单倍体(奶油色胚)进行分选，然后种植。相比之下，如果使用R1-SCM2标记，则在授粉后十天和二十五天之间收获所得穗。将来自籽粒的胚分离出来，并在适合于维持胚生存力的适当培养基(称为胚拯救培养基)中孵育。在一个实施例中，用于单倍体诱导率(HIR)测定的拯救培养基包含4.43克含维生素的Murashige和Skoog基础培养基、30克蔗糖和70mg水杨酸。将拯救培养基中的胚置于允许颜色指示基因(例如，R1-SCM2)表达的条件下。在示例性实施例中，将胚置于22℃-31℃ 100-400微摩尔光下16-24小时，直到一些胚由于R1-SCM2基因的表达而变成紫色(参见例如在WO 2015/104358中描述的方案)。紫色(二倍体)和奶油色(单倍体)胚可从每个穗计数。单倍体的频率(称为HIR或单倍体诱导率)可以根据总计胚中单倍体的数目来确定。任选地，施用秋水仙碱处理以在此过程期间的某个时间点诱导基因组加倍。通常参见Maluszynski等人编辑,Doubled Haploid Production in Crop Plants:A Manual[作物植物中的双单倍体产生：手册](2003)。还参见WO 2002/085104，将其通过引用并入本文。在一个实施例中，将秋水仙碱共同施用在上述拯救培养基中。
步骤5.种植DIP种子，使得它将能成功配种(在子代的经过CMS转化的单倍体植物上，在穗处于可交配状态、吐丝的同时，它的花粉脱落发生)，并且当它们开花时用作单倍体植物的花粉供体。然而，任选地，还可以简单地使用此处储存或保存的花粉作为开花单倍体植物的供体。
步骤6.对单倍体小植株进行取样并进行基因分型。携带CMS细胞质的标记和用于其他测定的父本基因型的植物被确认为父本单倍体。最低限度下，对单倍体进行针对CenH3基因的基因分型，并且单倍体含有野生型(未编辑的)等位基因。如果进行测试，单倍体将具有rf4等位基因和来自DIP(父本)基因组的任何其他等位基因。无论它们是否用加倍剂处理过，由于CMS细胞质和rf4等位基因，这些单倍体都被预期是雄性不育的。换言之，通过基因分型，如果基因分型结果是它们不携带编辑的CenH3等位基因，并且它们具有CMS细胞质基因型标记并且所有其他核标记均表现为DIP亲本(而不是CHIP)命名，则可以任选地通过基因分型来将推定单倍体植物(通过胚颜色分选)确认为经过细胞交换的单倍体。
步骤7.将单倍体植物用DIP亲本花粉授粉。如果单倍体未用化学加倍剂处理，则任何种子集(隐含雌性育性)都将是雌性花序(穗)自发加倍的自然生物过程(已知这在玉米种质中是常见的)的结果。用化学加倍剂处理胚可以通过生成双单倍体扇区来改善穗的种子集。总体而言，不希望受理论束缚，预期CMS细胞交换途径可以在几乎任何玉米种质的情况下伴随或不伴随加倍步骤进行，这是由于单倍体穗将具有自发加倍的一些胚珠或胚囊，并且那些胚珠或胚囊可以被轮回亲本花粉(例如回交)受精，以建立纯的单倍体BC1种子。单倍体BC1是轮回亲本与单倍体基因组之间的杂交，并且如果在亲本品系中存在任何变异(即，如果轮回亲本不是固定的近交品系)，则来自该过程的不同细胞交换品系中的变异可能是明显的。
步骤8.成熟并干燥后，收获单倍体植物经过授粉的一个或多个穗，并且将所得种子种植在DIP亲本(其将再次充当花粉供体)旁边。再次进行杂交以扩大CMS品系的种子数量。在这一世代中，可以再次对CMS品系进行基因分型，以确认转化的状态和纯度，并验证CHIP核DNA(包括Rf4和CenH3突变体标记)的不存在。
步骤9.当希望制备杂交种子时，CMS细胞交换品系可以作为雌性种植在雄性品系旁边。雌性CMS品系应当是雄性不育的，因此在杂交生产领域，它可以很容易与花粉供体杂交，不需要很多人为干预。表16.构建体注释。
构建体26258：
Claims (48)
1.一种用于赋予植物品系细胞质雄性不育(CMS)的方法，所述方法包括
a.获得包含CMS细胞质的第一植物，其中所述第一植物是单倍体诱导系(CHIP)；
b.获得包含希望的核基因组(DIP)的第二植物；以及
c.使所述第一植物与所述第二植物杂交；以及
d.由所得杂交植物生成子代；
i.其中所述子代包含所述CMS细胞质和所述希望的核基因组。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CMS细胞质选自由以下组成的组：CMS-C、CMS-S和CMS-T。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述CMS细胞质是CMS-C。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP是雌性可育的和CMS雄性可育的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP是雌性可育的和CMS雄性不育的。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述CHIP是父本单倍体诱导系。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述CHIP包含cenh3突变。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述cenh3突变是敲除突变。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述cenh3敲除突变是通过基因编辑获得的。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述cenh3敲除突变包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述cenh3敲除突变是杂合的。
12.如权利要求11所述的方法，其中使用CRISPR-Cas12a编辑所述cenh3敲除突变。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述CRISPR-Cas12a选自由以下组成的组：AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a、MbCas12a、Mb2Cas12a等。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述CRISPR-Cas12a是LbCas12a。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述CHIP进一步包含花色素苷标记。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述花色素苷标记选自由R1-navajo和R1-SCM2组成的组。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述花色素苷标记是R1-navajo。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述花色素苷标记是R1-SCM2。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述花色素苷标记是纯合的。
20.如权利要求7所述的方法，其中所述CHIP进一步包含恢复系等位基因。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述恢复系等位基因选自由以下组成的组：Rf3、Rf4、Rf10、Rf11和Rf12。
22.如权利要求5所述的方法，其中所述CHIP包含非恢复系等位基因，其中所述非恢复系等位基因选自由以下组成的组：rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述恢复系等位基因是Rf4。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述非恢复系等位基因是rf4。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述恢复系等位基因是纯合的。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述非恢复系等位基因是纯合的。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP包含cenh3突变、R1-navajo标记、以及恢复系因子4基因的恢复系等位基因。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP包含cenh3突变、R1-SCM2标记、以及恢复系因子4基因的恢复系等位基因。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP包含cenh3突变、R1-navajo标记、以及恢复系因子4基因的非恢复系等位基因。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP包含cenh3突变、R1-SCM2标记、以及恢复系因子4基因的非恢复系等位基因。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述CHIP选自由以下组成的组：玉米、小麦、水稻、向日葵、番茄、大麦、芸苔属植物、黄瓜和西瓜。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述CHIP是玉米。
33.如权利要求1所述的方法，其中在步骤c的杂交中，所述DIP是花粉供体。
34.如权利要求1所述的DIP，其中所述DIP关于非恢复系等位基因为纯合的或杂合的。
35.如权利要求34所述的DIP，其中所述DIP关于非恢复系等位基因为纯合的。
36.如权利要求35所述的恢复系因子，其中所述非恢复系等位基因选自由以下组成的组：rf3、rf4、rf10、rf11和rf12。
37.如权利要求36所述的恢复系因子，其中所述非恢复系等位基因是rf4。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述DIP选自由以下组成的组：玉米、小麦、水稻、和向日葵、番茄、大麦、芸苔属植物、黄瓜以及西瓜。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述DIP是玉米。
40.一种通过如权利要求1所述的方法产生的植物，其中所述植物是CMS单倍体植物。
41.如权利要求40所述的CMS单倍体植物，其中所述CMS单倍体植物包含所述CHIP的CMS细胞质和所述DIP的核基因组。
42.如权利要求41所述的CMS单倍体植物，其中所述CMS单倍体植物缺乏花色素苷标记、恢复系等位基因和cenh3敲除突变。
43.如权利要求42所述的CMS单倍体植物，其中用加倍剂处理所述CMS单倍体植物。
44.如权利要求43所述的加倍剂，其中所述加倍剂选自由以下组成的组：秋水仙碱、拿草特、氟硫草定、氟乐灵、一氧化二氮、或另一种已知的抗微管剂。
45.如权利要求44所述的加倍剂，其中所述加倍剂是秋水仙碱。
46.如权利要求42所述的CMS单倍体植物，其中用来自所述DIP的花粉对所述CMS单倍体植物授粉。
47.如权利要求42所述的CMS单倍体植物，其中用保存的花粉对所述CMS单倍体植物授粉。
48.如权利要求40所述的CMS单倍体植物，其中通过基因分型或其他分子分析来确认所述CMS单倍体植物。
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