CN119162140A - 一种糖基转移酶突变体及其在红景天苷合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的糖基转移酶突变体，对酪醇的区域选择性显著提高，由野生型51%提高到99%以上，在催化合成红景天苷应用时，能够生成单一的糖基化产物红景天苷；此外，本发明微生物糖基转移酶突变体对酪醇的催化活力显著提高，比酶活由野生型的14 mU/mg提高到97 mU/mg，底物转化率高于99％；本发明成功的解决了红景天苷制备过程中的糖基转移酶表达难、区域选择性低、活力低的关键问题，表现出非常大的工业应用前景。

Description

一种糖基转移酶突变体及其在红景天苷合成中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及糖基转移酶突变体及其在催化酪醇制备红景天苷中的应用。

背景技术

红景天苷是红景天中的主要药用成分。临床研究结果表明，红景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等主要功能，而且还具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。红景天苷无毒无害，可直接作为天然保健食品或药品，也可添加到焙烤制品、肉制品、面制品、乳制品、果冻、饮料等几乎大部分食品中。红景天苷在化妆品、饲料添加剂方面也有很好的市场前景。

红景天苷目前的生产方式主要有植物提取和化学合成两种。红景天生长于高寒无污染地区，野生资源珍稀，红景天苷含量很低，采用植物提取方法会破坏红景天野生的植物资源，且价格昂贵。而采用化学合成方法需要选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂等，成本较高，容易造成环境污染。

糖基转移酶(glycosyltransferases,GT；EC 2.4.x.y)是一类能够催化糖基部分从活化的糖基供体分子转移到特定糖基受体分子并形成糖苷键的酶。催化的糖基化反应是合成结构复杂多样同时具有生理活性功能的糖苷类化合物的关键步骤。相比化学法，糖基转移酶所介导的糖基化反应无需繁琐的保护与脱保护，无需使用红磷、溴素等对人体和环境具有危害作用的催化剂，是一种对环境友好的生物修饰方法。因此，通过糖基转移酶糖基化酪醇合成红景天苷，在有机合成领域受到越来越广泛的关注。由于多数具有重要药理药效的天然产物发现于植物中，植物源糖基转移酶成为人们的主要研究对象，然而，植物来源糖基转移酶存在表达难、包涵体严重的问题，严重限制了糖基转移酶在红景天苷合成中的应用。相比植物来源糖基转移酶，微生物源糖基转移酶容易采用酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等模式菌株异源表达，更易于实现工业化生产。然而，面对非天然底物分子酪醇，已报道的微生物源糖基转移酶所催化的糖基化反应除了生成红景天苷外，还会生成大量副产物淫羊藿次甙D2，副产物的产生不仅会降低红景天苷的收率还会极大的增加后续分离纯化成本。因此，通过分子改造提高微生物糖基转移酶对酪醇的区域选择性是实现红景天苷生物合成的关键。

发明内容

本发明针对微生物糖基转移酶区域选择性低的问题，通过对底物结合口袋处的氨基酸进行定点饱和突变，获得了一类对酪醇的醇羟基具有高度选择性的糖基转移酶突变体，显著提高了红景天苷的得率。

为解决上述技术问题，本发明的第一个目的，提供一种糖基转移酶突变体，具体如下：

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸和第325位异亮氨酸分别突变为亮氨酸和酪氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸和第70位亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸和精氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸和第136位的谷氨酰胺分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸和谷氨酸，氨基酸序列如SEQID NO.5所示；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺和第67位的异亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺、第67位的异亮氨酸和第77位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酸和精氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的提二个目的，提供一种编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。

本发明的第三个目的，提供一种携带权利要求2所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的，提供一种表达上述糖基转移酶突变体、或携带上述基因或上述表达载体的微生物。

作为一个具体实施例，所述微生物包括但不限于基因工程菌。

本发明的第五个目的，提供一种上述的糖基转移酶突变体、或上述的基因、或上述的表达载体、或者上述的微生物在红景天苷合成中的应用。

作为一个具体实施例，红景天苷的合成过程如下：

在UDP-葡萄糖循环系统提供的UDP-葡萄糖存在下，底物酪醇在糖基转移酶突变体催化下发生糖基化反应生成红景天苷。具体地，首先制备糖基转移酶突变体的酶液，将酶液或能表达糖基转移酶突变体的基因工程菌加入底物酪醇中，与UDP-葡萄糖循环系统混合，在混合体系中进行糖基化反应，制备获得红景天苷。

其中，反应温度为15～50℃，反应体系的pH值为6～10，UDP-葡萄糖浓度为0～2mM。

酶液可以为表达所述糖基转移酶突变体的基因工程菌的破胞粗酶液或纯化后的酶液。

UDP-葡萄糖循环系统具体循环过程如下：在UDP存在的条件下，蔗糖由蔗糖合成酶催化生成葡萄糖、果糖和UDP-葡萄糖，生成的UDP-葡萄糖再次参与红景天苷的合成。蔗糖浓度为0～600mM。

本发明所达到的有益技术效果：本发明所采用的糖基转移酶为微生物来源，相比于植物来源糖基转移酶，本发明的糖基转移酶更容易在大肠杆菌等模式菌株高效可溶性表达；本发明获得的糖基转移酶突变体对酪醇的区域选择性显著提高，由野生型51％提高到99％以上，能够生成单一的糖基化产物红景天苷；此外，本发明微生物糖基转移酶突变体对酪醇的催化活力显著提高，比酶活由野生型的14mU/mg提高到97mU/mg，底物转化率高于99％；本发明成功的解决了红景天苷制备过程中的糖基转移酶表达难、区域选择性低、活力低的关键问题，表现出非常大的工业应用前景。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析糖基转移酶在大肠杆菌中过表达效果；其中M为marker；1为诱导前；2为诱导后；3为诱导后破碎上清；

图2为糖基转移酶BlYjiC和底物酪醇的分子对接及底物口袋附近关键氨基酸残基，其中青色部分代表酪醇分子；

图3为糖基转移酶BlYjiC关于区域选择性的突变景观图；其中垂直轴表示所突变的氨基酸残基位置，水平轴表示20个替代氨基酸残基；每个位置的野生型氨基酸残基用粗实心方块表示，含有×的方框代表显示没有酶活性的突变体；

图4为糖基转移酶BlYjiC及其突变体的区域选择性演示；其中，A为糖基转移酶BlYjiC在区域选择性方面的进化过程，regio为区域选择性，conv为转化率；B为糖基转移酶BlYjiC及其突变体催化酪醇的HPLC色谱图，Tyrosol为酪醇；Salidroside为红景天苷；Icariside为淫羊藿次甙D2；

图5为野生型糖基转移酶BlYjiC及突变体比酶活；

图6为糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶偶联制备红景天苷示意图；

图7为糖基转移酶突变体(M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R)催化酪醇生成红景天苷的时间曲线，Tyrosol：酪醇；Salidroside：红景天苷；Icariside：淫羊藿次甙D2；

图8为红景天苷¹H核磁共振谱图；

图9为红景天苷¹³C核磁共振图谱。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施实例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明所述实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明实施例中所使用的DNA聚合酶(2×Phanta Max Master Mix)、Dpn I酶、重组克隆试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Takara生物科技股份有限公司；基因、引物的合成与基因测序工作由通用生物(安徽)股份有限公司完成，以上试剂使用方法参考商品说明书。

本发明所涉及的表达载体为pET-28a(+)，所用宿主为大肠杆菌BL21(DE3)，均由发明人所在皖西学院生物与制药工程学院实验室保藏。

本发明所用的所有酪醇、红景天苷标样、UDP-葡萄糖均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；其他常用试剂购自安耐吉化学试剂有限公司。

本发明中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。

实施例1糖基转移酶的克隆

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580基因组为模板，F和R为引物，如表1所示，扩增糖基转移酶基因，其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示，命名为WT-BlYjiC，通过一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将扩增的BlYjiC基因连接至pET-28a(+)质粒(C端加His-tag纯化标签)，构建重组质粒pET28a-BlYjiC。将该重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并检测，获得包含BlYjiC基因的重组工程菌。

表1克隆糖基转移酶所用引物

引物名称	引物序列
		F	aagaaggagatatactgcagATGGGACATAAACATATCGCGA
R	cggagctcgaattcggatccTTATTTTACTCCTGCGGGTGC

SEQ ID NO.1 WT-BlYJiC

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实施例2重组糖基转移酶BlYjiC的表达及纯化

重组工程菌菌株接种到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，并在37℃的轨道培养摇床上以200rpm的速度培养12小时。将1mL培养物加入含有50mLLB培养基的250毫升埃伦迈耶烧瓶中，在37℃和200rpm的条件下进行好氧培养。当OD₆₀₀达到约0.6-0.8时，用0.1mM IPTG诱导细胞。在18℃诱导24小时后收获细胞。将细胞经离心处理，重悬于50毫米pH 8.0的磷酸钾缓冲液中，并通过超声波破碎细胞。将细胞提取物以12000rpm的速度离心20分钟，上清即为粗酶溶液，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，检测BlYjiC表达情况。结果如图1所示，可以看出上清中的目的蛋白含量和总的目的蛋白含量相当，证明BlYjiC在大肠杆菌中能够高效可溶性表达，这比绝大多数植物来源糖基转移酶表达效果要好。

采用镍柱亲和层析法对重组糖基转移酶BlYjiC进行纯化：

1)样品预处理：用上样缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，25mM咪唑，500mMNaCl)将菌体重悬，冰浴中超声破碎，4℃，12000rpm离心去除细胞碎片，上清再用0.22μm滤膜过滤；

2)上样：用10倍柱体积上样缓冲液冲洗镍柱，将(1)中预处理样品缓慢上柱，使蛋白与镍柱充分结合；

3)洗杂：用10倍柱体积洗杂缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，50mM咪唑，500mMNaCl)冲洗镍柱；

4)目标蛋白洗脱：用洗脱缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，250mM咪唑，500mMNaCl)对目标蛋白进行洗脱；

5)超滤与保存：将收集的洗脱液移至超滤管中，通过4℃离心超滤对蛋白样品进行脱盐与浓缩；超滤后的蛋白样品加入终浓度为20％的甘油，液氮速冻后放入-80℃保存。

实施例3重组糖基转移酶BlYjiC的活力和区域选择性测定

将50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、2mM酪醇、5mM UDP-葡萄糖以及适量的酶混合，在30℃和1000rpm的条件下摇动。通过添加4倍甲醇体积来终止反应，并通过高效液相色谱法(HPLC)进行分析。酶活性的单位定义为在标准测定条件下，每分钟催化产生1μM产物所需的酶量为1个活力单位。区域选择性计算方法为：产物红景天苷的摩尔浓度/总产物摩尔浓度*100％。HPLC检测采用C18柱(ZORBAX SB-C18，Agilent，美国)，在30℃下以1mL/min的流速分析糖基化产物，检测波长275nm。

实施例4重组糖基转移酶BlYjiC定点饱和突变

如图2所示，本发明通过同源建模和分子对接发现底物酪醇在活性口袋中具有两种空间取向，因此本发明将两种空间取向附近的氨基酸筛选出来作为后续的定点饱和突变热点，这些氨基酸包括I62,D63,I67,L70,M77,F111,M112,Q136,F140,M174,F175,M320,P321和I325。

本发明通过设计特异性引物(见表2)，利用Quickchange技术(An efficientonestepsite-directed and site-saturation mutagenesis protocol[J].NucleicAcidsResearch,2004,32(14):e115)在野生型糖基转移酶BlYjiC基因序列引入突变，构建了62,63,67,70,77,111,112,136,140,174,175,320,321和325位点的饱和突变库。

具体的，PCR反应体系为：ddH₂O 2μL，DNA聚合酶5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL。PCR扩增条件：1)预变性94℃2min；2)变性98℃10s，退火60℃15s，延伸72℃40s(此步骤循环30次)；后延伸72℃5min。PCR产物在37℃下经Dpn I限制性酶消化20分钟。然后经消化的产物被转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与LB/Kan固体平板上37℃培养过夜。

表2糖基转移酶BlYjiC理性设计所用引物

注：加粗部分为突变后的兼并密码子

实施例5突变体文库筛选

每个位点的突变平板挑选96个克隆子并转移到含有50μg/mL卡那霉素和500μL LB液体培养基的96深孔板中培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，用0.1mMIPTG诱导细胞。离心去上清，反复冻融3次后作为粗酶用于催化反应。反应体系含有2mM酪醇、5mM UDP-葡萄糖、1％DMSO和50μL粗酶液的50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中进行。反应在30℃，200rpm下孵育6小时，并以4倍甲醇体积终止。采用实施例3所述的检测方法对突变子的活力和选择性进行检测，结果如图3所示。结果显示I67,L70,M77,M112,Q136和I325位点的突变更有利于生成红景天苷，其中M112L表现出最高的区域选择性82.3％，BlYJiC-M112L氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

SEQ ID NO.2:BlYJiC-M112L

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实施例6迭代饱和突变

以M112L突变体基因序列为模板，以实施例4所述的定点饱和突变方法，对67,70,77,136和I325位点分别进行定点饱和突变，以实施例5所述方法对突变文库进行筛选，获得了一个区域选择性有效提高的双点变体M112L/I325Y，其区域选择性显著提高至87.3％，如图4所示，该糖基转移酶突变体BlYJiC-M112L/I325Y氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；以M112L/I325Y突变体基因序列为模板在I67、L70、M77、Q136位点上进行了定点饱和突变，获得了一个三点突变体M112L/I325Y/L70R，其区域选择性达到了93.1％，如图4所示，所述糖基转移酶突变体BlYJiC-M112L/I325Y/L70R氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。随后，以M112L/I325Y/L70R为模板，对I67、M77、Q136进行定点饱和突变库，获得了一个四点突变体M112L/I325Y/L70R/Q136E(M4)，区域选择性达到了97.6％，如图4所示，所述糖基转移酶突变体BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。然后，将M112L/I325Y/L70R/Q136E作为模板进行下一轮突变，得到了一个五点突变体M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E，其区域选择性为98.4％，所述糖基转移酶突变体BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。此外，在M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E的基础上，在I67和M77位点进行了定点饱和突变实验，获得了一个六点突变体M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R，采用实施例3所述方法对其区域选择和酶活进行检测，结果如图4所示，所述糖基转移酶突变体BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。结果显示该突变子催化酪醇的区域选择性达到了99.3％，比酶活从野生型的14.1mU/mg增加到了97.2mU/mg，如图4和图5所示。这些结果表明本发明通过定点突变改造，成功实现了BlYjiC催化时严格的区域选择性，并且同时提高了其催化活力，极大的强化了该酶在红景天苷合成中的应用。SEQ ID NO.3：BlYJiC-M112L/I325Y

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SEQ ID NO.4：BlYJiC-M112L/I325Y/L70R

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SEQ ID NO.5：BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E

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SEQ ID NO.6：BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67EMGHKHIAIFNIPAHGHINPTLALTASLVKRGYRVTYPVTDEFVKAVEETGAEPLNYRSTLNIDPQQERERMKNKKDMSQAPLMFIKEMEEVLPQLEALYENDKPDLILFDFLAMAGKLLAEKFGIEAVRLCSTYAENEHFTFRSISEEFKIELTPEQEDALKNSNLPSFNFEDMFEPAKLNIVFMPRAFQPYGETFDERFSFVGPSLAKRKFQEKETPIISDSGRPVMLISLGTAFNAWPEFYHMCIEAFRDTKWQVIMAVGTTIDPESFDDIPENFSIHQRVPQLEILKKAELFITHGGMNSTMEGLNAGVPLVAVPQMPEQEYTARRVEELGLGKHLQPEDTTAASLREAVSQTDGDPHVLKRIQDMQKHIKQAGGAEKAADEIEAFLAPAGVK

SEQ ID NO.7：BlYJiC-M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R

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实施例7糖基转移酶突变体(M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R)制备红景天苷

红景天苷的制备采用双酶偶联系统进行酪醇的糖基化和UDP-葡萄糖的原位再生，制备过程如图6所示，蔗糖合成酶在UDP的存在下催化蔗糖生成葡萄糖、果糖和UDP-葡萄糖，从而使反应产生的UDP-葡萄糖能够再次参与红景天苷合成，确保反应的持续进行。其中蔗糖合成酶来源于大豆(NCBI accession:NP_001237525.1)，经密码子优化后，由通用生物(安徽)股份有限公司合成至pET28a载体，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，蔗糖合成酶的制备和纯化同实施实例2所述方法。具体的，反应混合物(200mL)包含50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、2mM酪醇、0.5mMUDP、500mM蔗糖、25mg糖基转移酶突变体(M112L/I325Y/L70R/Q136E/I67E/M77R)以及蔗糖合酶50mg。反应在30℃下进行，搅拌速度800rpm。2mM酪醇根据底物的消耗周期性地加入到反应混合物中。在反应过程中，每隔一段时间吸取50μL的反应物，加入150μL甲醇终止反应，采用实施例3所述方法对反应进程进行分析。

级联反应中使用了初始浓度为2mM的酪醇，并在底物耗尽时向反应混合物中加入2mM的酪醇，结果如图7所示。最终，产生了11.9毫摩尔(3.6g/L)和红景天苷，摩尔转化率>99％，区域选择性>99％，空间产率达到了10.8g/L/d，是迄今为止报道的最高水平。这些结果表明，经过工程改造后的BlYjiC在红景天苷合成方面有着巨大的实际应用价值。

实施例8产物鉴定

将实施例7制得的产物，通过半制备性高效液相色谱和C18半制备柱对红景天苷进行了纯化，流动相采用20％甲醇。将获得的红景天苷进行旋转蒸发浓缩并冷冻干燥，使用DMSO-d6作为溶剂溶解所得粉末并进行¹H和¹³C核磁共振光谱分析，结果如图8-图9，结果表明产物为红景天苷。

以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于：

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸突变为亮氨酸；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸和第325位异亮氨酸分别突变为亮氨酸和酪氨酸；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸和第70位亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸和精氨酸；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸和第136位的谷氨酰胺分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸和谷氨酸；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺和第67位的异亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酸；或

将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺、第67位的异亮氨酸和第77位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酸和精氨酸。

2.编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述糖基转移酶突变体、或携带权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体的微生物。

5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述微生物为基因工程菌。

6.权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的表达载体、或者权利要求4-5任一项所述的微生物在红景天苷合成中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在UDP-葡萄糖循环系统提供的UDP-葡萄糖存在下，底物酪醇在糖基转移酶突变体催化下发生糖基化反应生成红景天苷。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，UDP-葡萄糖循环系统具体循环过程如下：在UDP存在的条件下，蔗糖由蔗糖合成酶催化生成葡萄糖、果糖和UDP-葡萄糖，生成的UDP-葡萄糖再次参与红景天苷的合成。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：反应温度为15～50℃，反应体系的pH值为6～10，UDP-葡萄糖浓度为0～2 mM。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：蔗糖浓度为0～600 mM。