CN119082141B

CN119082141B - LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白在提高植物抗干旱胁迫中的用途

Info

Publication number: CN119082141B
Application number: CN202411587216.2A
Authority: CN
Inventors: 王文生; 霍明月; 尹明; 雷雨鑫; 张帆; 赵秀琴; 傅彬英; 徐建龙
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-11-08
Filing date: 2024-11-08
Publication date: 2025-01-28
Anticipated expiration: 2044-11-08
Also published as: CN119082141A

Abstract

本发明公开了LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白在提高植物抗干旱胁迫中的用途。本发明人水稻种质资源的抗旱性进行调研并全基因组关联分析结合干旱处理表达水平分析结果筛选出SEQ ID No.1所示基因可能具有增强水稻对干旱胁迫耐受性的能力。通过模拟干旱胁迫条件和旱地直播观察过表达和CRISPR敲除水稻植株的表型变化，结果发现在水稻中过表达LOC_ Os12g07640基因植株对干旱胁迫耐受性增强，敲除突变该基因的水稻植株对干旱胁迫更敏感，降低水稻抵抗干旱胁迫的能力。本发明在改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，提高植物抗干旱胁迫抗性或培育抗干旱胁迫抗性的植物品种等具有应用前景。

Description

LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白在提高植物抗干旱胁迫中的用途

技术领域

本发明涉及LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白的新用途，尤其涉及水稻LOC_ Os12g07640基因及其编码蛋白在提高植物抗干旱胁迫中的新用途，属于LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白的新用途领域。

背景技术

随着全球气候变暖，土壤干旱且沙漠化程度日益加剧。水稻种植灌溉用水占农业总用水量的60%以上，水稻对干旱胁迫非常敏感，严重干旱会导致水稻大面积减产甚至绝收(Luo L. (2010). Breeding for water-saving and drought-resistance rice (WDR)in China. J Exp Bot.61, 3509-3517.)。因此，挖掘抗旱基因资源，克隆水稻抗旱基因，解析分子调控网络和机制，培育节水抗旱水稻对确保国家粮食生产安全和可持续发展具有非常重要的科学意义和应用价值。

抗旱生理反应均受到复杂且精密的基因网络的调控，水稻抗旱基因挖掘和功能解析仍是当前逆境研究的重要课题，近期水稻抗旱功能基因组研究取得了一系列进展。截止到 2024年3月已成功克隆了379个与水稻抗旱性相关的功能基因 (国家水稻数据中心数据https://www.ricedata.cn)。

近年来，国内外在水稻农艺性状基因发掘和功能基因组研究方面取得令人瞩目的成绩，利用连锁分析、全基因组关联分析(Genome-wide association studies, GWAS)、单倍型分析及表达谱分析等多种技术手段，克隆了多个具有重要育种价值的抗旱基因qRT9、 OsLG3、OsDROT1、OsAL、OsRINGzf1和OsRRS1等基因。其中，OsDROT1的自然变异位点位于启动子区，主要存在于旱稻中，这一成果为稻作抗旱分子育种提供优异基因资源。该基因被农业农村部认定为具有重大育种价值基因 (Sun, X., Xiong, H., Jiang, C., Zhang, D.,Yang, Z., Huang, Y., Zhu, W., Ma,S., Duan, J., Wang, X., et al. (2022).Natural variation ofDROT1confers drought adaptation in upland rice. NatCommun.13, 4265.)。过表达OsRINGzf1水稻产量比对照高10%以上，降低了干旱带来的产量损失，该基因具有育种应用潜力 (Chen, S., Xu, K., Kong, D., Wu, L., Chen, Q.,Ma, X., Ma, S., Li, T., Xie, Q., Liu, H., et al. (2022). UbiquitinligaseOsRINGzf1 regulates drought resistance by controlling the turnover of OsPIP2;1. Plant Biotechnol J.20, 1743–1755.)。因此，通过GWAS和单倍型分析等手段能够有效的挖掘与抗旱表型相关的优异等位基因，以便利于研究和应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种从水稻中分离得到的LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白；

本发明的目的之二提供含有所述LOC_Os12g07640基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明的目的之三将所述从水稻中分离得到的LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白、含有所述LOC_Os12g07640基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞等应用于调控植物抗干旱胁迫抗性。

为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明的一方面提供了从水稻中分离得到的LOC_Os12g07640基因，其多核苷酸序列为（a）、（b）、（c）、（d）或（e）所示：

（a）、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；或

（b）、编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

（c）、与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有调控植物抗干旱胁迫的功能或活性；或

（d）、与SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸序列；或

（e）、在SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控植物抗干旱胁迫的功能或活性。

本发明的另一方面提供了从水稻分离得到的LOC_Os12g07640基因的编码蛋白，其氨基酸序列为（a）或（b）所示：

（a）、SEQ ID No.2所示的氨基酸；或

（b）、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控植物抗干旱胁迫的功能或活性的蛋白变体。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

将本发明的SEQ ID No .1所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。

本发明还提供了含有所述LOC_Os12g07640基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述LOC_Os12g07640基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率；例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

本发明中所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明的再一方面是提供了所述从水稻中分离得到的LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白、含有所述LOC_Os12g07640基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞在调控植物抗干旱胁迫中的应用。

作为一种优选的实施方案，本发明中所述的调控植物抗干旱胁迫抗性是提高植物对于干旱胁迫抗性，包括：将所述LOC_Os12g07640基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于干旱胁迫的抗性增强；譬如：将水稻LOC_Os12g07640基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体。

作为本发明一种优选的具体实施方案，本发明提供了一种培育抗干旱胁迫抗性的植物品种的方法，包括： (1)构建含有水稻LOC_Os12g07640基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到受体植物组织或植物细胞中；(3)培育筛选得到对干旱胁迫抗性提高的转基因植物。

本发明的再一方面是提供了一种降低植物对于干旱胁迫抗性的方法，包括：将植物中的LOC_Os12g07640基因进行敲除或突变，使LOC_Os12g07640基因所编码的蛋白的正常功能产生缺陷或丧失，所得到的转基因植物对于干旱胁迫抗性降低或敏感。

本领域人员可以采用常规的基因敲除或基因编辑技术等常规的方法将植物中的LOC_Os12g07640基因进行功能缺失突变，譬如采用基因编辑技术构建LOC_Os12g07640基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体等，将植物中的LOC_Os12g07640基因进行功能缺失突变，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。

本领域技术人员知悉，CRISPR/Cas 基因编辑系统或基因编辑方法的主要原理是通过一个叫向导RNA（guide-RNA，gRNA）的核酸片段在宿主基因组找到要进行基因编辑的位置，也就是靶向DNA 序列，然后通过Cas 蛋白对DNA 进行切割。在本申请中，所述Cas 蛋白包括但不限于Cas9、Cas12、Cas12a、Cas12j、Cas12e、Cas13 和/或Cas14等蛋白。

本发明中所述转化方案以及将所述基因(或多核苷酸)引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述基因多(或核苷酸)引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将所述基因(或多核苷酸)提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株。

本发明可用于转化任何植物种类，所述的植物包括但不限于单子叶植物或双子叶植物；更优选的，所述的植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是水稻、棉花、玉米、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等，优选为水稻。

本发明人前期通过408份水稻种质资源的抗旱性进行调研并全基因组关联分析，结合干旱处理表达水平分析结果，筛选出LOC_Os12g07640可能具有增强水稻对干旱胁迫耐受性的能力。本发明进一步通过PEG模拟干旱胁迫条件和旱地直播，观察过表达和CRISPR敲除水稻植株的表型变化，进行该基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻干旱胁迫应答的关系，结果表明在水稻中过表达LOC_Os12g07640基因植株对干旱胁迫耐受性增强，敲除突变LOC_Os12g07640基因的水稻植株对干旱胁迫更敏感，降低水稻抵抗干旱胁迫的能力；本发明在改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，提高植物抗干旱胁迫抗性或培育抗干旱胁迫抗性的植物品种等方面具有应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

本发明中所述术语“转化”指将水稻LOC_Os12g07640蛋白的编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

附图说明

图1 为LOC_Os12g07640基因在20% PEG模拟干旱胁迫处理后表达水平检测结果。

图2为过表达材料转基因植株PCR阳性鉴定；其中，1-2号泳道为阳性过表达OE1材料鉴定引物扩增片段，3-4号泳道为阳性过表达OE2材料鉴定引物扩增片段，5号泳道为转化载体阳性对照，6号泳道为为DNA Marker Ⅰ 标记，7号泳道野生型材料鉴定引物扩增阴性对照，8号泳道为添加双蒸水的阴性对照。

图3为敲除材料转基因植株PCR阳性鉴定；其中，1-2号泳道为敲除材料KO1敲除突变鉴定引物扩增片段，3号泳道为添加的双蒸水的阴性对照，4-5号泳道为敲除材料KO2敲除突变鉴定引物扩增片段，6号泳道为野生型材料鉴定引物扩增基因片段，7号泳道为DNAMarker Ⅰ 标记。

图4为水稻LOC_Os12g07640基因的敲除材料检测结果。

图5为LOC_Os12g07640转基因植株与野生型植株在PEG模拟干旱胁迫处理后的表型。

图6为LOC_Os12g07640基因敲除转基因植株与野生型植株在土壤干旱胁迫处理后的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

试验例1 LOC_Os12g07640基因在20% PEG模拟干旱胁迫处理后表达水平检测

1、处理方法和样本取材

选择丰满且均匀的中花11野生型材料种子，并将其置于50°C烘箱中三天以打破休眠，然后将它们在0.5%次氯酸钠溶液中表面灭菌30分钟。再次用自来水冲洗3次，随后放置于30℃条件下人工气候室的自来水(pH 5.5～5.8)中催芽3天左右，待水培待种子出芽2-3cm时，转入剪底的PCR版漂浮于自来水(pH 5.5～5.8)上生长，一周后转移在Yoshida培养液上培养，并且调节pH 5.5～5.8，培养液每周一换。对生长至21日龄幼苗的培养液中施加20%PEG，模拟干旱胁迫处理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，36 h和48 h后对地上部分和根部进行取材，每次取5株，材料液氮速冻后放于-80℃冰箱保存备用。

2、水稻总RNA的提取及RT-PCR检测

(1)植物组织总RNA的提取

1) 将用液氮速冻的植物组织样品充分研磨成粉末，按照每管约150 mg分装于RNase-free管中，实验样品每管加入1 mL TRIzol，充分振荡混匀5 min，冰浴静置5min; 2)每管加200 μL氯仿进行抽提，充分振荡混匀1 min，冰浴静置2 min; 3) 12, 000 g，4°C离心15 min，吸取500 μL上清于新RNase-free管中; 4) 每管加500 μL异丙醇，混匀后冰浴静置10 min; 5) 12, 000 g，4°C离心15 min，弃上清后，加1 mL预冷的70% 乙醇悬浮沉淀;6) 12, 000 g，4°C离心3 min，弃上清后，管置冰上于超净台中吹干5 min; 7) 每管用50 μL DEPC水溶解沉淀; 8) 37°C DNase I消化DNA 30 min，每100 μL体系包含50 μL总RNA，10μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase I，0.5 μL RNaseinhibitor和29.5 μL DEPC水; 9)每管加300 μL DEPC水，200 μL氯仿和200 μL水饱和酚，充分混匀; 10) 12,000 g，4°C离心15 min，取350 μL上清于新RNase-free离心管中; 11) 加预冷700 μL无水乙醇和0.1倍体积的3 M NaAc，充分混匀，-80°C沉淀RNA过夜或2 h以上; 12) 12, 000 g，4°C离心15 min，弃上清后，加入1 mL预冷的70% 乙醇，悬浮沉淀; 13) 12, 000 g，4°C离心2 min，弃上清后，管置冰上于超净台中吹干5 min; 14)每管用50 μLDEPC水溶解沉淀，可用于RNA反转录或 -80°C冰箱保存备用。

(2)反转录为cDNA

1) Nanodrop测定RNA浓度，依据浓度向反转录体系中加入5 μg RNA; 2) 每反转录体系中加入5 μg RNA，2 μL 50 μM Oligo (dT)，DEPC水补至37.5 μL，70°C变性5 min后冰浴静置2 min;3) 每50 μL反转录体系中再加入10 μL 5×M-MLV buffer，1 μL M-MLVReverse Transcriptase (Promega，USA)，1 μL dNTP Mix (each10 mM)，0.5 μL RNaseinhibitor，42°C金属浴反应1 h，70°C 15 min; 4)Nanodrop测定cDNA浓度，-20°C保存备用。

(3)实时荧光定量PCR (RT-qPCR)

所用引物序列为:

LOC_Os12g07640-RT-F：5’-CTACCACCACCACTACTCGG-3’(SEQ ID No.3)；

LOC_Os12g07640-RT-R：5’-CACTGTTGACGACGATGCAT-3’ (SEQ ID No.4)；

OsUBQ-RT-F:5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’ (SEQ ID No.5)；

OsUBQ-RT-R:5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’ (SEQ ID No.6)。

1) RT-qPCR反应体系如下：

表1 RT-qPCR反应体系

2) RT-qPCR 运行程序如下：

表2 RT-qPCR 运行程序

3) 利用实时荧光PCR仪按照如下反应体系和程序进行RT-PCR反应;利用ΔΔCt法(Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of Relative GeneExpression Data UsingReal-Time Quantitative PCR and the 2^−ΔΔCTMethod.Methods.25, 402–408.) 计算基因相对于OsUBQ的表达水平。通过检测干旱胁迫下LOC_ Os12g07640基因随着处理时间的延长表达量的变化。

检测结果如图1；图1显示在地上部分和根部中LOC_Os12g07640基因受干旱诱导上调表达，LOC_Os12g07640基因在处理2 h初期后的地上部分中表达显著升高，结果表明LOC_ Os12g07640参与水稻对干旱胁迫的早期应答。

试验例2 LOC_Os12g07640基因在水稻中的遗传转化试验

1、LOC_Os12g07640基因过表达载体构建

设计克隆LOC_Os12g07640基因CDS 序列的引物, 引物 5′ 端引入XbaⅠ 酶切位点序列（5’-TCTAGAATGGGGAGGTCGCCGTGCTGCGA-3’） (SEQ ID No.7), 引物 3′ 端引物引入KpnI 酶切位点序列（5’GGTACCCACTGTTGACGACGATGCATTG-3’） (SEQ ID No.8)。以水稻ZH11cDNA为模板, 进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件如下：95℃, 预变性 5 min；95℃,变性 10 s；60℃, 退火 30 s；72℃, 延伸 30 s；扩增 32 个循环；72℃, 后延伸 10 min；4℃保存。将PCR 产物在1%琼脂糖凝胶中电泳, 用庄盟小量琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的条带。取适量回收产物, 与pTOPO-Blunt载体连接转化大肠杆菌感受态。经菌落 PCR鉴定后提取阳性菌落质粒 pTOPO- LOC_Os12g07640, 送公司进行测序。

超表达载体中目的基因LOC_Os12g07640的表达由Super启动子和胭脂碱合成基因Nos的 3′ 终止区域组成,选择标记基因为Hpt基因, 编码 HYG 蛋白。用XbaⅠ和KpnI 酶切质粒 pTOPO-LOC_Os12g07640 和 pSuper1300-Myc 载体骨架, 分别获得带有酶切位点的LOC_Os12g07640目的片段和带相同粘性末端的线性化 pSuper1300-Myc, 用T₄DNA连接酶将目的片段连接到线性化 pSuper1300载体骨架形成重组质粒 pSuper1300-LOC_Os12g07640-Myc。

2、LOC_Os12g07640基因CRISPR敲除载体构建

根据LOC_Os12g07640基因cDNA序列设计敲除的靶位点，所用网站为：http: //skl.scau .edu .cn/dsdecode/；

靶位点序列：5 ′-ATCGCCCACATCAACCAGCACGG-3’ (SEQ ID No.9)，

实验方法及载体来自刘耀光院士实验室(Ma, X., Zhang, Q., Zhu, Q., Liu,W., Chen, Y., Qiu, R., Wang, B., Yang, Z., Li, H., Lin, Y.,et al. (2015). ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants. Molecular Plant,8, 1274–1284. ) ，将重组载体命名为pYLCRISPR/Cas9Pubi-LOC_Os12g07 640。

3、农杆菌转化

冻融法将过表达pSuper1300-LOC_Os12g07640-Myc和敲除载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-LOC_Os12g07640转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yang, R., Tang, Q., Wang, H.,Zhang, X., Pan, G., Wang, H., and Tu, J. (2011). Analyses of tworice (Oryzasativa) cyclin-dependent kinase inhibitors and effects of transgenicexpression of OsiICK6 on plant growth and development. Annals ofBotany,107,1087–1101.)，方法参照分子克隆实验指南。

4、遗传转化

用农杆菌介导的遗传转化法，以中花11为受体材料，进行遗传转化，培养基配方见表3。

表3 遗传转化所用培养基及其配方

具体方法如下：

1)愈伤诱导

取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg/L的2，4-D的诱导培养基中，28℃暗培养30～40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。

2)农杆菌侵染

a)将携带有表达质粒载体的农杆菌划线于含有抗生素(50 mg/L卡那霉素或壮观霉素、25 mg/L利福平)的LB固体培养基表面，28 ℃，200 rpm 培养过夜。

b)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28 ℃震荡培养到OD₆₀₀＝0.5。

c)取活化好的新鲜菌液按1:100的比例接种到25mL相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD₆₀₀＝0.5。

d)菌液在5000 g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25 mL 10 mM的MgSO₄悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000 g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。

e)用25mL含有200 μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。

f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3～0.4 mm大小) ，在超净工作台上风干10～20min。

g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50 mL离心管中20 min，期间每隔5 min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10～20 min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200 μM乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25 ℃黑暗条件下共培养3天。

h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600 mg/L头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。

i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500 mg/L头孢霉素和50 mg/L潮霉素的N6培养基)上继续筛选2～3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。

3)转化体植株再生

取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2 mm的小块，接于预分化培养基中，28 ℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12 h光照/12 h黑暗)继续培养 8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250 mL组培瓶) 上，继续光照培养。等到不定芽长成4～6 cm高的小苗后再转移到生根培养基中，在28 ℃光照培养间(12 h光照/12 h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T₀代)，一月后取叶片进行PCR阳性鉴定(F：5’- TGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGC-3’ (SEQ ID No.10)，R：5’-GTTCGACAGCGTCTCCGACCTGAT-3’ (SEQ ID No.11))，将鉴定为阳性的转基因植物收获其阳性植株种子 (T₁代)。

试验例3水稻基因组DNA的提取及PCR检测阳性转基因材料试验

1、CTAB法提取水稻基因组DNA

(1) 取植物叶片于2 mL离心管中，每管加入直径5 mm的钢珠，液氮速冻，用组织研磨仪1500 rpm研磨样品约90 s；(2)每管加600 μL CTAB提取缓冲液，充分混匀，65°C水浴30 min，中间颠倒混匀两次；(3)等待冷却至室温，加500 μL氯仿:异戊醇 (24:1)，充分混匀，置于摇床抽提 20 min；(3)室温12, 000 g离心15 min，吸取约550 μL上清于新的1.5mL离心管中；(5)加0.8倍体积的异丙醇轻柔混匀后，放置常温静置10 min；(6)室温 12,000 g 离心 10min，弃除上清，加入1 mL 70%乙醇悬浮沉淀；弃除上清，加入1 mL 70%乙醇悬浮沉淀；(7) 室温12,000 rpm离心 2 min，弃尽上清，用1 mL 70%乙醇悬浮沉淀；8)室温12,000 rpm离心 2 min，弃尽上清，超净台中吹干，加50 μL ddH₂O溶解DNA，4°C存放备用。

2、LOC_Os12g07640基因过表达水稻阳性材料检测

提取T₂代LOC_Os12g07640基因过表达水稻基因组DNA，利用PCR阳性鉴定引物(F：5’-TGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGC-3’ (SEQ ID No.12)，R：5’-GTTCGACAGCGTCTCCGACCTGAT-3’ (SEQ ID No.13))扩增。

1) 反应体系如下:

表4 PCR 反应体系

2) 扩增程序如下:

表5 PCR扩增程序

3) 取 10 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测, 扩增包含385 bp的过表达载体上的片段, 结果如图2所示, 两个OE株系检测出了外源片段的插入, 而野生型植株未检测出，两个LOC_Os12g07640-OE株系可被用于后续表型观察实验。

3、LOC_Os12g07640基因敲除水稻sgRNA靶点编辑分析

提取T₂代LOC_Os12g07640基因敲除水稻基因组DNA，并以靶点为中心设计引物LOC_Os12g07640-F/R (F: 5’-AGTGGGACCCACTCCCTTTCTTT-3’ (SEQ ID No.14), R: 5’-ACCCTATTACCATGTCAGTCAAA-3’ (SEQ ID No.15))，扩增LOC_Os12g07640基因组DNA序列。图3为敲除材料转基因植株PCR阳性鉴定结果；PCR扩增产物送往公司测序，通过测序结果序列比对分析，获得了两个不同基因敲除材料。野生型靶点处的核苷酸序列(sgRNA:ATCGCCCACATCAACCAGCACGG) (SEQ ID No.16)，LOC_Os12g07640-KO1株系在靶点处缺失2个碱基，核苷酸序列(ATCGCCCACATCAAC--GCACGG)如图4所示;LOC_Os12g07640-KO2株系在靶点处缺失1个碱基，核苷酸序列(ATCGCCCACATCAACC-GCACGG)如图4所示。以上两个株系碱基的缺失或插入均会引起移码突变，产生不含保守结构域的蛋白序列，LOC_Os12g07640蛋白功能缺失，两个LOC_Os12g07640-KO株系可被用于后续表型观察实验。

试验例4、LOC_Os12g07640基因敲除材料干旱处理后表型鉴定试验

1、20% PEG模拟干旱胁迫处理表型鉴定

为了明确LOC_Os12g07640基因正调控水稻抗旱性，选择丰满且均匀的野生型与基因过表达和敲除材料种子，并将其置于50°C烘箱中三天以打破休眠，然后将它们在0.5%次氯酸钠溶液中表面灭菌30分钟。再次用自来水冲洗3次，随后放置于30℃条件下人工气候室的自来水(pH 5.5～5.8)中催芽3天左右，待水培待种子出芽2-3 cm时，转入剪底的PCR版漂浮于自来水(pH 5.5～5.8)上生长，一周后转移在Yoshida培养液上培养，并且调节pH 5.5～5.8，培养液每周一换。对生长至21日龄幼苗的培养液中施加20%PEG，处理设置三个重复，每个重复野生型和敲除材料各30个种子。干旱胁迫处理9天后观察表型。

根据图5的试验结果可见，在水稻中敲除突变体植株对干旱胁迫更敏感，表明敲除水稻LOC_Os12g07640基因能够显著影响水稻耐干旱胁迫的能力。干旱胁迫处理14天后，过表达OE植株萎蔫程度低于野生型, 生长状态优于野生型。

2、旱地直播表型鉴定

为了证实LOC_Os12g07640基因敲除材料对干旱胁迫的耐受性降低，选择丰满且均匀的野生型与敲除突变材料种子，播种于海南三亚中国农业科学院作物科学研究所实验站旱地，播种完喷灌浇水(土壤含水量50%)，20天后第二次浇水(土壤含水量30%)，之后断水开始干旱处理，旱地生长约2个月后调研表型。

根据图6结果可见，敲除突变体植株萎蔫和枯萎程度大于野生型，在水稻中敲除突变水稻LOC_Os12g07640基因后植株对干旱胁迫更敏感。表明LOC_Os12g07640基因正调控水稻抗旱性，因此水稻LOC_Os12g07640基因及其编码蛋白能够应用于增强作物的抵抗干旱胁迫能力。

Claims

1.LOC_Os12g07640基因、LOC_Os12g07640基因的编码蛋白、含有LOC_Os12g07640基因的嵌合基因或表达盒、含有LOC_Os12g07640基因的重组植物表达载体或重组宿主细胞在提高水稻抗干旱胁迫抗性中的应用，包括：将LOC_Os12g07640基因在水稻中进行过表达得到转基因水稻，所得到的转基因水稻对于干旱胁迫的抗性增强；所述的LOC_Os12g07640基因的核苷酸序列为编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述的LOC_Os12g07640基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.一种抗干旱胁迫的水稻品种的培育方法，其特征在于，包括： (1)构建含有LOC_ Os12g07640基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到水稻组织或细胞中；(3)培育筛选得到对干旱胁迫抗性提高的转基因水稻；所述的LOC_Os12g07640基因的核苷酸序列为编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。