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CN118922207A - TNFα免疫缀合物制剂 - Google Patents

TNFα免疫缀合物制剂 Download PDF

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CN118922207A
CN118922207A CN202380028689.6A CN202380028689A CN118922207A CN 118922207 A CN118922207 A CN 118922207A CN 202380028689 A CN202380028689 A CN 202380028689A CN 118922207 A CN118922207 A CN 118922207A
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C·巴奇
A·雷迪
E·萨尼
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R·斯图基
R·德卢卡
C·迪尼托
M·马塔西
D·内里
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Abstract

本申请涉及包含非糖基化TNFα免疫缀合物和糖基化TNFα免疫缀合物的制剂，特别是药物制剂，其中所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比低，优选为10％或更低。所述制剂可用于治疗人患者的癌症，如脑肿瘤。

Description

TNFα免疫缀合物制剂
本申请要求于2022年3月21日提交的欧洲专利申请号22163383.7的优先权，将其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含非糖基化TNFα免疫缀合物和糖基化TNFα免疫缀合物的制剂，特别是药物制剂，其中所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比低，优选为10％或更低。所述制剂可用于治疗人患者的癌症，如脑肿瘤。
背景技术
本申请人在WO 2001/062298(通过引用以其整体特此并入)中描述了包含与抗体L19融合的人TNFα(“L19-TNFα”)的免疫缀合物。L19(美国专利号8,097,254)特异性结合纤连蛋白异形体B-FN的ED-B结构域，其为血管生成的最著名标记之一。ED-B是在B-FN异形体中发现的91个氨基酸的额外结构域。ED-B在侵袭性肿瘤和经历血管生成的其他组织(如处于增生期的子宫内膜和处于病理状态下的一些眼部结构)中在新生血管结构周围累积，但是在正常的成年组织中原本是检测不到的。本申请人先前已经在WO 2013/045125、WO2018/011404、WO 2019/185792、WO 2021/234178(通过引用以其整体并入本文)中描述了L19-TNFα的许多用途(包括治疗人癌症)和配制品。
免疫缀合物(如L19-TNFα)的大规模生产可以通过重组表达来实现。然而，原核(细菌)表达不适于表达复杂蛋白，如在溶液中形成大的150kDa的非共价同三聚体的L19-TNFα。
Borsi等人Blood(2003)102,4384详细描述了使用SP2/0鼠骨髓瘤细胞表达重组L19-鼠(m)TNFα的方法，报告了最终产量为3mg/L的纯化蛋白，这不适合于缀合物的工业生产。
鉴于上述情况，本领域需要用于大规模生产适合于治疗人患者的L19-人TNFα的另外的方法。
发明内容
诸位发明人设计了用于制备L19-TNFα的生产方法，所述方法具有高产率，并且令人惊讶地导致制剂中糖基化L19-TNFα的百分比低。特别地，据报道在所述制剂中所述糖基化L19-TNFα的百分比在3％与5.36％之间(图5A)，平均4.19％的所述L19-TNFα被糖基化(图5B)。
此外，预期与包含高百分比糖基化L19-TNFα的制剂相比，包含低百分比糖基化L19-TNFα的制剂具有优异的生物活性。特别地，预期相对于糖基化L19-TNFα缀合物，非糖基化L19-TNFα缀合物对肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和/或肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)具有增加的亲和力。
还预期与包含高百分比糖基化L19-TNFα的制剂相比，包含低百分比糖基化L19-TNFα的制剂具有优异的热稳定性和/或储存稳定性。特别地，预期相对于糖基化L19-TNFα缀合物，非糖基化L19-TNFα缀合物具有增加的热稳定性。
仍进一步，预期与包含高百分比糖基化L19-TNFα的制剂相比，包含低百分比糖基化L19-TNFα的制剂对蛋白酶介导的降解更不敏感。特别地，预期相对于糖基化L19-TNFα缀合物，非糖基化L19-TNFα缀合物对蛋白酶介导的降解更不敏感。
还预期与包含高百分比糖基化L19-TNFα的制剂相比，包含低百分比糖基化L19-TNFα的制剂更适合于冻干。
不希望受理论束缚，据信用于制备本文所述的L19-TNFα缀合物的发酵条件导致观察到低水平的糖基化物质。
高水平的糖基化在以下方面造成挑战：用于良好操作规范(GMP)生产的批次间再现性、增加的免疫原性和制备用于工业开发的产品时未达最佳标准的药代动力学。Durocher和Butler,Current Opinion Biotechnol(2009),20,770解释，聚糖结构可能具有免疫原性，并且免疫原性可能因免疫系统的快速清除而降低生物制剂的功效。Planinc等人Analytica Chimica Acta(2016)13,27类似地证实了聚糖的低丰度的重要性，这是由于聚糖的潜在免疫原性。Leepenies和Seeberger Nature Biotechnol.(2016),32,443进一步评论，异质性糖基化可能在功效或药代动力学方面导致批次间差异。
鉴于以上详细描述的与免疫缀合物(如L19-TNFα)的糖基化相关的缺点，预期与包含更高百分比糖基化L19-TNFα的L19-TNFα制剂相比，由诸位发明人设计的生产方法产生的制剂中糖基化L19-TNFα的低百分比在用于人患者的治疗时具有有利的特性。
鉴于先前已经示出当在相同细胞系(中国仓鼠卵巢)中制备时人TNFα的生产导致高水平的糖基化的事实，所述制剂中糖基化L19-TNFα的低水平是出人意料的。特别地，在WO98/55662中，重组非缀合人TNFα在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达得到如下TNFα制剂，其中据报道总TNFα的35％为O-糖基化的。作者认为这是有利的，因为与非糖基化TNFα相比，糖基化TNFα可以在体液中具有增加的半衰期，可以改善与受体的结合，并且可以针对蛋白酶的影响受到更好的保护。在Takakura等人,Eur J Bioch(1996),235,431中，使用人B细胞类淋巴母细胞细胞系BALL-1来表达重组人TNFα。与WO 98/55662中报道的高水平的糖基化相一致，据报道在所得制剂中O-糖基化TNFα的百分比为20％。进一步报道了O-糖基化与人TNFα的氨基酸序列位置4处的丝氨酸连接。
因此，在第一方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
(i)非糖基化TNFα免疫缀合物；和
(ii)糖基化TNFα免疫缀合物；
其中所述TNFα免疫缀合物包含与含有SEQ ID NO:1至6中所示的L19互补决定区(CDR)的抗体分子缀合的人TNFα，并且
其中在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比≤10％。
在优选的实施方案中，在所述TNFα免疫缀合物中的抗体分子包含SEQ ID NO:7中所示的L19 VH结构域和SEQ ID NO:9中所示的L19 VL结构域。更优选地，所述抗体分子具有SEQ ID NO:10中所示的呈scFv形式的L19抗体的序列。最优选地，所述TNFα免疫缀合物由SEQ ID NO:13中所示的L19-TNFα的序列组成或包含SEQ ID NO:13中所示的L19-TNFα的序列。
所述TNFα优选是人TNFα。最优选地，所述TNFα具有SEQ ID NO:11中所示的序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
(i)非糖基化L19-TNFα；和
(ii)糖基化L19-TNFα；
其中所述L19-TNFα包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成；并且
其中在所述制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比≤10％。
在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比优选≤10％、≤9％、≤8％、≤7％或≤6％，出于以上解释的原因，较低的糖基化％是优选的。
在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比可以为≥2％或≥3％。
例如，在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比可以为≥3％并且≤6％。
所述糖基化TNFα免疫缀合物优选包含在TNFα的位置4丝氨酸处的O-连接的糖基化，其中所述TNFα具有SEQ ID NO:11中所示的序列。在所述TNFα免疫缀合物是L19-TNFα并且包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成的情况下，所述糖基化L19-TNFα优选包含在SEQ ID NO:13的位置257处的丝氨酸上的O-连接的糖基化。所述O-连接的糖基化优选包含一个己糖-乙酰基-己糖1的核心和一个N-乙酰神经氨酸残基。最优选地，所述O-连接的糖基化是HexNAc1Hex1NeuAc1。在优选的实施方案中，所述TNFα免疫缀合物在所述TNFα序列中的任何其他位置处均未被糖基化。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
(i)非糖基化L19-TNFα；和
(ii)糖基化L19-TNFα；
其中所述L19-TNFα包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成，其中在所述制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比≤6％，并且
其中与制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂具有更高的生物活性。
在优选的实施方案中，相对于制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高的制剂，所述制剂对肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和/或肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)具有增加的亲和力。
在优选的实施方案中，与制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂具有优异的热稳定性和/或储存稳定性。
在优选的实施方案中，与制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂对蛋白酶介导的降解更不敏感。
在优选的实施方案中，与制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂更适合于冻干。
用于确定TNFα免疫缀合物的制剂中糖基化TNFα免疫缀合物的类型和百分比的方法是本领域技术人员已知的，并且包括质谱法，特别是完整质量分析，如本文所述。
除了活性成分(糖基化和非糖基化TNFα免疫缀合物)外，本发明的药物制剂可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的并且适合于施用至人患者的其他材料。此类材料应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。对于在肿瘤部位注射，所述药物制剂可以呈肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液无热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。
本发明的药物制剂可以用于在治疗患者的癌症的方法中使用。还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的药物制剂。类似地，提供了本发明的药物制剂在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。所述患者优选是人患者。
可以使用本发明的药物制剂治疗的癌症包括皮肤癌(如恶性黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌)、肉瘤(如软组织肉瘤)和脑肿瘤(如神经胶质瘤或胶质母细胞瘤)。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这样的组合。
附图说明
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方案和实验，在附图中：
图1示出了用于获得本发明的包含低百分比糖基化L19-TNFα的药物制剂的L19-TNFα生产过程的通用概述。
图2示出了用于获得本发明的包含低百分比糖基化L19-TNFα的药物制剂的L19-TNFα生产过程的通用发酵程序。
图3A和图3B：对包含低百分比糖基化L19-TNFα的药物制剂的二维SDS-PAGE分析证实了生产后样品的纯度以及L19-TNFα的分子量(约45KDa)和等电点(约7.7)。可见两个斑点：非糖基化L19-TNFα(斑点1)和糖基化L19-TNFα(斑点2)。非糖基化L19-TNFα是最明显的斑点，而对应于糖基化L19-TNFα的斑点几乎不可见，这表明糖基化种类的丰度非常低。图3C：从七个生产批次回收的每升发酵培养物中纯化的L19-TNFα的毫克数。
图4示出了根据本文所述方法制备的包含低百分比糖基化L19-TNFα的L19-TNFα制剂的质谱分析的去卷积谱。在43957Da处的主峰(1)对应于非糖基化L19-TNFα缀合物，而在44613Da处的峰(2)对应于在位置257处具有O-连接的糖基化的L19-TNFα变体。其他次峰是不相关的：在43913Da处的小峰是典型的MS假象，对应于不含一个CO2基团的L19-TNFα。在44056Da处的另一个小峰对应于与缓冲液的磷酸基团聚集的L19-TNFα。
图5A示出了在使用本文所述的方法制备的药物制剂的不同生产批次中，非糖基化L19-TNFα和糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比。在使用本文所述的方法的七个生产批次中，在制剂中糖基化L19-TNFα从未超过总L19-TNFα的6％，并且在制剂中糖基化L19-TNFα的平均百分比为4.19％(图5B)。
图6示出了在包含低百分比糖基化L19-TNFα的L19-TNFα制剂的代表性生产批次中，糖基化TNFα肽SSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNR的MS1谱。在958.21m/z处检测到的4+带电离子与附接至TNFα肽的位置2处的丝氨酸(对应于L19-TNFα缀合物中位置257处的丝氨酸)的HexNAcHex1核心上一个另外的NeuAc基团的存在是一致的。
图7示出了在包含低百分比糖基化L19-TNFα的L19-TNFα制剂的代表性生产批次中，糖基化TNFα肽SSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNR的MS2谱。在958.21m/z处的先驱离子已被分离，并且HCD已被片段化以产生该MS2谱。与预期的y-离子列表一起，在274.09m/z(NeuAc-H2O)和292.10m/z(NeuAc)处的两个峰的存在证实了所述肽上NeuAc基团的存在。该数据进一步证实了对所述肽的位置2处的丝氨酸(对应于L19-TNFα缀合物的位置257处的丝氨酸)上的HexNAc1Hex1NeuAc1基团的正确鉴定。
具体实施方式
现将参考附图讨论本发明的各方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是清楚的。将本文本中提及的所有文献都通过引用并入本文。
本发明的药物组合物包含TNFα免疫缀合物，其中TNFα免疫缀合物包含含有SEQ IDNO:1至6中所示的L19互补决定区(CDR)的抗体分子和TNFα。
抗体分子优选是单克隆的。抗体分子可以是人的或人源化的，但优选是人抗体分子。
TNFα免疫缀合物可以是分离的，在没有污染物的意义上，所述污染物如能够结合其他多肽的抗体和/或血清组分。
抗体分子可以是天然的或部分或完全合成产生的。例如，抗体分子可以是重组抗体分子。
抗体分子可以是免疫球蛋白或其抗原结合片段。例如，抗体分子可以是IgG、IgA、IgE或IgM分子，优选IgG分子，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，但更优选是其抗原结合片段。在更优选的实施方案中，抗体分子包含单链Fv(scFv)、小免疫蛋白、双抗体或由其组成，但最优选是scFv。
抗体分子优选包含SEQ ID NO:7中所示的L19 VH结构域和/或SEQ ID NO:9中所示的L19 VL结构域。更优选地，抗体分子具有SEQ ID NO:10中所示的呈scFv形式的L19抗体的序列。
在抗体分子是scFv的情况下，抗体的VH和VL结构域优选通过12至20个氨基酸的接头连接。例如，VH和VL结构域可以通过长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的氨基酸接头连接。合适的接头序列是本领域已知的，并且包括SEQ ID NO:8中所示的接头序列。
TNFα优选是人TNFα。最优选地，TNFα包含SEQ ID NO:11中所示的序列或由其组成。
抗体分子(例如呈scFv形式)和TNFα可以彼此直接连接，例如通过任何合适的化学键连接，但优选经由肽接头连接。化学键可以是例如共价键或离子键。共价键的例子包括肽键(酰胺键)和二硫键。
在TNFα经由肽接头与抗体分子连接的情况下，肽接头可以是氨基酸的短(2-30个，优选10-20个)残基延伸段。肽接头序列的合适的例子是本领域已知的。可以使用一个或多个不同的接头。示例性接头序列示出于SEQ ID NO:12中。在一个实施方案中，接头可以是可切割接头。
在抗体分子和TNFα经由肽键或肽接头连接的情况下，缀合物可以作为单链多肽(如融合蛋白)产生(分泌)。
在优选的实施方案中，TNFα与呈scFv形式的抗体分子的C末端缀合。最优选地，所述TNFα免疫缀合物由SEQ ID NO:13中所示的L19-TNFα的序列组成或包含SEQ ID NO:13中所示的L19-TNFα的序列。
包含在本发明的药物制剂中的糖基化TNFα免疫缀合物中的TNFα优选包含在SEQID NO:11中所示的TNFα序列的位置4处的丝氨酸上的O-连接的糖基化。在所述TNFα免疫缀合物是L19-TNFα并且包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成的情况下，所述糖基化L19-TNFα优选包含在SEQ ID NO:13的位置257处的丝氨酸上的O-连接的糖基化。
所述O-连接的糖基化包含一个己糖-乙酰基-己糖1的核心和一个N-乙酰神经氨酸残基。优选地，所述O-连接的糖基化是HexNAc1Hex1NeuAc1。在优选的实施方案中，所述TNFα免疫缀合物在所述TNFα序列中的任何其他位置处均未被糖基化。
包含在本发明的药物制剂中的糖基化L19-TNFα免疫缀合物中的L19是非糖基化的。也就是说，仅包含在本发明的药物制剂中的糖基化L19-TNFα免疫缀合物中的TNFα是糖基化的。
在药物制剂中糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比优选≤10％、≤9.5％、≤9％、≤8.5％、≤8％、≤7.5％、≤7％、≤6.5％、≤6％或≤5.5％，出于以上解释的原因，较低的糖基化％是优选的。在优选的实施方案中，糖基化的％≤6％，更优选≤5.5％。
在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比可以为≥2％、≥2.5％或≥3％。这不包括在细菌细胞中制备的TNFα免疫缀合物，所述TNFα免疫缀合物是非糖基化的。
例如，在所述制剂中所述糖基化TNFα免疫缀合物占总TNFα免疫缀合物的百分比可以为≥2％并且≤10％、≥2％并且≤6％、≥3％并且≤6％、≥2％并且≤5.5％、≥3％并且≤5.5％。
用于测量药物组合物中存在的糖基化TNFα免疫缀合物的百分比以及确定存在的糖基化的类型的方法是本领域已知的，并且包括质谱法，特别是完整质量分析。示例性方法在实施例3中详细描述。所述分析的结果示出于图4至图7中。
如权利要求中所述，除了糖基化和非糖基化TNFα免疫缀合物外，本发明的药物制剂可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的并且适合于施用于人患者的其他材料。药物组合物可以包含如WO 2018/011404中所披露的缓冲液组合物。特别地，药物组合物可以包含如权利要求所述溶解在磷酸钠缓冲液中的糖基化和非糖基化TNFα免疫缀合物和稳定剂，所述磷酸钠缓冲液包含浓度为至少约1.5mM的盐、浓度为至少约0.005％(v/v)的聚山梨醇酯，其中磷酸钠缓冲液的pH高于7.5并且低于9。优选地，聚山梨醇酯浓度为约0.1％(v/v)或更低。磷酸钠缓冲液优选包含约0.5％-1.5％w/v的甘油。磷酸钠缓冲液可以进一步包含浓度为约5-25mM的NaH2PO4。磷酸钠缓冲液可以进一步包含浓度为约5-20mM的Na2HPO4。磷酸钠缓冲液还可以包含浓度为约1-2mM的KCl。此外，磷酸钠缓冲液可包含浓度为约1-20mM的EDTA。稳定剂可以是糖，优选甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖或木糖醇，最优选甘露糖醇。糖可以以20-250mM的浓度存在。盐可以是NaCl，并且可以以约10-30mM的浓度存在于磷酸钠缓冲液中。磷酸钠缓冲液优选包含浓度为约0.005％至约0.03％的聚山梨醇酯。聚山梨醇酯可以是聚山梨醇酯20。在优选的实施方案中，药物制剂中总TNFα免疫缀合物(糖基化的和非糖基化的)的浓度可以是至少约0.2mg/mL，更优选至少约0.4mg/mL。在最优选的实施方案中，除了糖基化和非糖基化TNFα免疫缀合物外，本发明的药物制剂还包含浓度为15mM的NaH2PO4(2H2O)、浓度为10mM的Na2HPO4(2H2O)、浓度为1.5mM的KCl、浓度为75mM的甘露糖醇、浓度为30mM的NaCl、1％w/v甘油、浓度为5mM的EDTA、0.01％v/v Tween20，并且具有8.00的pH。
预期与制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比为15％或更高、20％或更高、25％或更高、或30％或更高的制剂相比，本发明的制剂具有更高的生物活性。
在一个实施方案中，如通过BiaCore或其他合适的技术所测量的，预期制剂对TNFR1和/或TNFR2具有更高的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的药物制剂可以单独施用或与其他治疗组合施用，它们是同时或依次施用，取决于待治疗的病症。
涉及本发明的药物制剂的治疗可以包括施用第二抗癌疗法。许多合适的抗癌疗法是本领域已知的。例如，当与多柔比星、达卡巴嗪、放射疗法和替莫唑胺或洛莫司汀组合施用时，L19-TNFα已成功用于抗癌疗法(WO 2021/234178)。这些组合的临床试验正在进行中。还报道了L19-TNFα和L19-IL2的组合施用的有希望的抗癌效果(WO 2018/011404)。这是对L19-TNFα单一疗法显示的抗癌效果的补充。
因此，本发明的药物制剂可以用于在治疗患者的癌症的方法中使用，其中所述方法进一步包括向患者施用选自以下的第二抗癌治疗剂：多柔比星、达卡巴嗪、放射疗法和替莫唑胺、洛莫司汀或L19-IL2。向患者施用本发明的药物制剂和第二抗癌疗法可以是同时的或依序的，其中同时施用是指在同一治疗周期中但不一定在同一天施用。
本发明的药物制剂和第二抗癌疗法可以作为组合制剂提供，但优选作为分开的制剂提供，以允许同时或依序施用。在治疗进一步涉及放射疗法的情况下，该放射疗法将必须与本发明的药物制剂分开施用，但是施用仍然可以是同时的。
可以与本发明的药物制剂组合使用的其他治疗包括施用合适剂量的疼痛缓解药物(如非甾体抗炎药(例如，阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬))或阿片类药物(如吗啡或止吐药)。
在施用本发明的药物制剂用于癌症治疗的情况下，其可以肠胃外注射。在一个实施方案中，在肿瘤部位注射本发明的药物制剂，优选通过瘤内注射进行。瘤周注射(例如，局部皮内注射)是用于将本发明的药物制剂局部施用至肿瘤部位的另一种合适的方法。在一些实施方案中，本发明的药物制剂可以通过输注(例如，静脉内输注)施用。
根据本发明的癌症治疗可以包括肿瘤的完全根除。治疗终止后任何重要肿瘤的证据的消失表示肿瘤的完全治疗。当肿瘤没有可辨别的体积或不再可见时，可以确定肿瘤的消失。治疗可以包括根除肿瘤并且预防肿瘤再生长的治疗。
在施用本发明的药物制剂后，优选在至少一个月、优选至少六个月或至少一年的随访期期间监测患者。在随访期中可以观察到肿瘤的消失以及肿瘤再生长的缺乏。可以观察到不存在肿瘤再生长。
通过将本发明的药物制剂施用至患者而施用的L19-TNFα的量尤其将取决于肿瘤的大小和性质。合适的剂量的确定在熟练从业者的能力范围内。合适的剂量披露于WO2021/234178、WO 2018/011404和WO 2013/045125中。特别地，L19-TNFα可以以如下剂量来给予：在5与20μg/Kg之间，优选在6与18μg/Kg之间、在7与17μg/Kg之间或在8与15μg/Kg之间，更优选在10与13μg/Kg之间。优选地，L19-TNFα的剂量在200μg至400μg的范围内。最优选地，L19-TNFα的剂量为400μg。这些仅是例子，并且可以使用不同的剂量。
本发明的药物制剂可以用于在治疗癌症的方法中使用。癌症可以是实体瘤。在优选的实施方案中，癌症选自皮肤癌(如恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌(如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(cSCC)))、神经胶质瘤(如胶质母细胞瘤)或肉瘤(如软组织肉瘤)。癌症可以是转移性的或非转移性的。癌症可以是复发性的或非复发性的，如复发性胶质母细胞瘤。
在要用本发明的药物制剂治疗的癌症是神经胶质瘤(如胶质母细胞瘤)的情况下，药物制剂优选与洛莫司汀和任选的另外的化学疗法一起施用。这种疗法的细节在WO 2021/234178中披露，其通过引用以其整体特此并入。因此，本发明的药物制剂可以用于在治疗患者的神经胶质瘤(如胶质母细胞瘤)的方法中使用，其中所述方法进一步包括向患者施用洛莫司汀和任选的第二化学疗法(如替莫唑胺)。
在要用本发明的药物制剂治疗的癌症是皮肤癌的情况下，药物制剂优选与L19-IL2一起施用。L19-IL2优选包含SEQ ID NO:14中所示的序列或由其组成。这种疗法的细节在WO 2013/045125中披露，其通过引用以其整体特此并入。因此，本发明的药物制剂可以用于在治疗患者的皮肤癌(如恶性黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌，但优选恶性黑色素瘤)的方法中使用，其中所述方法进一步包括向患者施用L19-IL2。可以通过在肿瘤部位注射(特别是通过瘤内注射)施用。最优选地，L19-IL2的剂量为2.17mg。L19-IL2的剂量可以可替代地以国际单位(IU)表示。2.17mg L19-IL2等同于1300万IU L19-IL2。在瘤内注射的情况下，可以用1300万IU的L19-IL2(对应于2.17mg的L19-IL2)以及用每周一次400μg的L19-TNFα持续一至四周(例如，持续连续的一、二、三或四周)治疗患者。剂量可以作为单次瘤内注射施用，或者可以将剂量分成多次瘤内注射(施用至同一肿瘤)。可替代地，在某些情况下，可以将剂量减半为1.08mg的L19-IL2和200μg的L19-TNFα。
在前述说明书、或所附权利要求、或附图中公开的特征以其特定形式或在执行所公开的功能的手段、或用于获得所公开的结果的方法或过程方面进行表达，可以酌情单独地或以这样的特征的任何组合加以利用，以其多样的形式来实现本发明。
虽然已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开文本时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员来说是清楚的。因此，上述本发明的示例性实施方案被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种改变。
为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了改善读者的理解。诸位发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。
本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
在整个说明书中，包括随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和“包括(include)”，以及变化形式如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”和“包括(including)”将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。
必须指出，如在说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。范围可以在本文中被表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。与数值相关的术语“约”是任选的，并且意指例如+/-10％。
实施例
实施例1-用于产生包含低百分比糖基化L19-TNFα的L19-TNFα制剂的方法
1.1制造过程和过程控制的总体描述
L19-TNFα是在中国仓鼠卵巢宿主细胞(CHO-K1)中稳定表达的重组融合蛋白，所述细胞使用半连续发酵方法在生物反应器中培养。通过几个色谱纯化步骤从收获的培养基中回收L19-TNFα。L19-TNFα原料药的制造过程可以分为两个上游阶段和两个下游阶段。
–上游1(阶段A)：接种物制备
–上游2(阶段B)：发酵
–下游1(阶段C)：通过亲和色谱进行捕获纯化
–下游2(阶段D)：通过以下进行精制和配制：凝胶过滤、阳离子交换色谱、缓冲液交换、阴离子交换色谱、纳滤和最终浓缩。
两个上游阶段专用于细胞培养，而下游阶段用于通过色谱纯化从收获的培养基中回收L19-TNFα。图1示出了总结的L19-TNFα生产的过程流程图。上游和下游过程报告如下。
1.1.1上游过程
用于生产L19-TNFα的上游过程可以分为两个阶段：上游1(阶段A；接种物制备)和上游2(阶段B；发酵)。两个阶段可以分为几个步骤：
上游1(阶段A)
具有6mM L-谷氨酰胺的EX-CELL CD CHO培养基(由Sigma Aldrich的部门SAFC提供；目录号14361C-1000ML)允许重组CHO细胞以小规模(烧瓶)培育或适应。该培养基在上游1阶段中使用，当在滚瓶中使用时补充20mM HEPES缓冲液。
上游2(阶段B)
在上游2阶段中，还使用具有6mM L-谷氨酰胺的EX-CELL CD CHO培养基用于更大规模生物反应器发酵。此外，在上游2阶段中，将补料补充物BalanCD CHO补料3添加至L19-TNFα的细胞培养物中。此外，当葡萄糖浓度降至低于2g/L时，将葡萄糖30％w/v溶液添加至细胞培养物以达到4g/L的葡萄糖浓度。
上游1(阶段A)：用于发酵的接种物制备
L19-TNFα细胞培养开始于适合于L19-TNFα生产的主细胞库小瓶的解冻。首先在标准条件(37℃，5％ CO2)下将细胞培养物在含有15/30ml细胞培养物的T75/T150方形烧瓶中扩增，然后在含有250ml细胞培养物的2L滚瓶(37℃，1.2rpm)中扩增。使用补充有6mM谷氨酰胺(6-XF)的EX-CELL CD CHO培养基进行方形烧瓶细胞培养。对于在滚瓶中的细胞培养，使用补充有20mM HEPES缓冲液(6-XRG)的相同培养基。每3-4天分割方形烧瓶和滚瓶中的细胞培养物，如下文所详述。在不同的稀释度下进行扩增，以在用新鲜培养基稀释后达到在100.000-150.000个细胞/ml范围内的活细胞浓度。为了获得用于生物反应器发酵的细胞接种物，将滚瓶培养物扩增至9L的总体积(36个滚瓶)并且细胞浓度≥500.000个细胞/ml，活力≥60％。
在扩增结束时，使用蠕动泵将细胞悬浮液转移至无菌袋中。然后使用原位蒸汽(steam-in-place)不锈钢连接器将密封袋与生物反应器连接。
上游2(阶段B)：发酵
发酵在Biostat C 30生物反应器(B.Braun)中进行。生物反应器配备有具有4个出口的气体混合器和环形喷洒器曝气系统。通过CO2流来控制pH并且通过添加碳酸钠溶液进行校准。搅拌器是单个船用叶轮。通过连接至蒸汽热交换器的水套控制温度。工作体积为30L，容器的总体积为42L。当将在上游1阶段结束时获得的细胞培养物的一部分被添加至生物反应器中的新鲜培养基(接种物)中时，半连续发酵过程开始。根据细胞培养物的活力和生产要求，单个批次的发酵可能需要27-48天。使用两个成对生物反应器Biostat C 30以半连续方法进行发酵，其中每6-7天分割每个生物反应器以收获细胞培养物。收获的体积取决于收获前确定的活细胞浓度。为了以100.000-200.000个细胞/ml的活细胞浓度开始每个新的发酵循环，通过添加新鲜培养基在生物反应器中保留足够的细胞培养物以达到27L的最终工作体积。在两个成对Biostat C 30反应器中进行所述过程时，两个生物反应器并行接种在上游1结束时获得的细胞培养物的部分，同时运行半连续发酵。通用发酵方案概述于图2中。上游2(阶段B)过程的操作步骤总结如下。
1根据细胞培养物的活力和生产要求进行步骤U2-410至U2-655。因此，生物反应器中的发酵可以在第3次、第4次、第5次或第6次收获后终止。
生物反应器的接种
在发酵开始时生物反应器接种物达到在100.000-200.000个活细胞/ml范围内的活细胞浓度。计算培养基和细胞培养物的必要稀释度以达到27L的总工作体积。在接种之前，向生物反应器无菌填充所需量的培养基(EX-CELL CHO培养基+6mM谷氨酰胺)。通过原位蒸汽灭菌的添加端口装置将培养基转移至生物反应器容器中，在蠕动泵的帮助下通过0.22μm过滤器。然后将所需量的细胞培养物(大约对应于总发酵体积的1/4)接种到生物反应器容器中以开始发酵过程。接种物的无菌添加通过生物反应器的原位蒸汽灭菌的添加端口装置借助重力来进行。
发酵温度
在整个发酵过程期间，温度保持在37℃±0.01℃。
培养物pH
在发酵过程中，通过用于酸性校正的CO2流(分压：1.25个大气压)以及通过用于碱性校正的20％w/v Na2CO3溶液的校准添加将培养物pH保持稳定在7.20±0.02的pH。酸或碱添加通过生物反应器管理软件通过气体混合器装置(CO2添加)和系统蠕动泵(碳酸钠添加)自动调节。
溶解氧(pO2)
用空气、氮和氧流将溶解氧的浓度维持恒定在25％±2％空气饱和值。这三种不同气体的相对比率通过发酵管理软件通过生物反应器的气体混合器装置加以控制。每个的分压：0,95个大气压的氧气、氮气和空气。
曝气和搅拌
将细胞培养物通过环形喷洒器扩散系统进行曝气。气体混合物经1mm孔从位于发酵容器基部上的喷洒装置中出来。通过搅拌系统(单个船用叶轮)将气泡向下推动，以增加气体混合物与细胞培养物的接触时间，从而改善气体溶解度。在发酵的前24小时期间，叶轮以88rpm±5旋转，然后速率增加至100rpm±5，直到收获细胞培养物。在每个发酵周期的前24小时期间，气流(气体混合物流速)设定点为1,0≤流速≤1,3slpm±0,05，然后将所述值增加至1,3≤流速≤1,5slpm±0,05，直到收获细胞培养物。
半连续发酵和收获体积
在用来自上游1(阶段A)的滚瓶汇集物以27L的初始工作体积接种后，发酵过程开始。在每个发酵循环期间，在第1、3和5天用补料(总初始体积的5％)对细胞培养进行补料，如上游2(阶段B)部分中所描述。调节葡萄糖浓度以在生物反应器中达到4g/L的葡萄糖浓度。在6-7天后周期性地中断发酵以进行细胞培养物的中间收获，收获约30L的细胞培养物，更换新鲜培养基以在每个新的发酵循环开始时获得在100.000-200.000个活细胞/ml范围内的细胞浓度。根据细胞培养物的活力和生产要求，进行至少3次且最多7次分割循环。在发酵期间，每日对细胞培养物进行无菌取样。在第3次、第4次、第5次、第6次或第7次循环结束时，终止发酵过程并且收获生物反应器中的全部细胞培养物。因此，完整的发酵过程总共持续27至48天，包括设备洗涤和灭菌。可以从每个生物反应器获得总共七次收获，总粗收获体积为约215L/生物反应器。从一次发酵运行获得平均8g粗产物。
微滤
使用一次性筒式过滤器将收获的材料澄清并且灭菌。澄清的第一步用0.65μm，0.6m2筒式过滤器进行，而进一步的澄清和灭菌通过组合的0.22μm，0.45m2的筒式过滤器获得。用蠕动泵以1-2L/min的流速将收获的材料加载到过滤器中。过程产率典型地>90％。过滤后，向澄清的收获物中添加0.5M EDTA溶液(pH8.0)以获得5mM的最终EDTA浓度。将原料的pH调节至7.5以获得澄清的成批物质。可以将澄清的成批物质在2-8℃下储存长达两个月，直到下一个纯化步骤。
1.1.2下游方法
用于纯化L19-TNFα的下游过程包括一系列色谱和(渗滤)过滤步骤。根据以下方案，将所述过程分为下游1(阶段C)和下游2(阶段D)：
a)蛋白A亲和色谱(下游1)
b)凝胶过滤(用于缓冲液交换)(下游2)
c)阳离子交换色谱(CIEX)(下游2)
d)凝胶过滤(用于缓冲液交换/配制)(下游2)
e)阴离子交换色谱(AIEX)(下游2)
f)纳滤(用于去除病毒)(下游2)
g)渗滤(用于浓缩)(下游2)
h)添加Tween20(用于配制完成)(下游2)。
下游1(阶段C)
下游1过程(阶段C)由亲和色谱步骤组成，所述亲和色谱步骤使用rmp蛋白A琼脂糖速流型(重组多点配体蛋白A树脂)。进行多次色谱运行以处理在上游过程结束时获得的全部量的澄清的成批物质。然后在该步骤结束时，在下游2过程中纯化半加工的材料，或在添加1.5％w/v甘油后以其他方式在-80℃下储存长达60天。下游1的纯化方案在以下示出。
缓冲液制备
在机械搅拌下在不锈钢罐中制备每种缓冲液，并且用5M NaOH或5M HCl调节pH。然后通过过滤将缓冲液灭菌，并且在蠕动泵的帮助下转移至无菌袋或瓶中。将缓冲液储存在2-8℃下并且在一个月内使用。
蛋白A上的亲和色谱(步骤从D1-10至D1-50)
使用填充在Vantage A2-180柱中的rmp琼脂糖速流型树脂进行蛋白A亲和色谱。所述树脂是低泄漏、非哺乳动物基亲和树脂，设计用于单克隆和多克隆抗体的高纯度分离。基础基质(琼脂糖4速流型)是高度交联的4％琼脂糖衍生物，含有五个抗原结合结构域。L19-TNFα融合蛋白的scFv(L19)部分与固定在树脂上的蛋白A结合。填充在Vantage A2-180柱中的树脂的体积根据下表而不同。
柱 最小体积 最大体积
Vantage A2-180 800ml 2000ml
树脂的体积取决于待纯化的样品的量；通常使用1ml的树脂纯化多达4.3mg的L19-TNFα。
柱消毒和平衡
在样品加载之前，将色谱系统的柱、树脂和流动管线用0.1M乙酸/20％乙醇的溶液原位消毒。接触时间为至少60分钟。消毒后，将系统用2CV PBS pH 7.50(50mM NaH2PO4·2H2O；NaCl 150mM，5mM EDTA，50mM NaOH)以在85与255ml/min(对应于20与60cm/h)之间的流速进行平衡。
样品加载
消毒后，每次运行以大约80L的级分加载澄清的成批物质，所述澄清的成批物质含有大约3800-4300mg的L19-TNFα。在室温下以100与200ml/min(对应于24与48cm/h)之间的流速加载，这允许至少8分钟的接触时间。样品加载持续大约14小时。
样品纯化
一旦加载澄清的成批物质，将柱依序用以下缓冲液洗涤：
-10CV PBS/NaCl(50mM NaH2PO4·2H2O；650mM NaCl，5mM EDTA，53mM NaOH，pH7.50)；
-5CV PBS pH 7.50(50mM NaH2PO4·2H2O；150mM NaCl，5mM EDTA，50mM NaOH)。
然后用10mM TEApH 11.50(10mM TEA，5mM EDTA，pH 11.50)从柱上洗脱L19-TNFα融合蛋白。样品以单一级分洗脱，范围在4与5CV之间。该色谱步骤的典型产率高于90％。通过监测A280nm、电导率和pH进行色谱运行。然后将洗脱的样品(半加工材料)溶解在10mM TEApH 11.50(10mM TEA，5mM EDTA，pH 11.50)中，并且在室温下孵育1小时用于病毒灭活。在此阶段的O.D.(A280nm)范围在0.470与1.460之间。
将半加工材料在下游2过程中的下一个纯化步骤中进行处理，或在添加1.5％w/v甘油后在-80℃下储存最长60天的时间。
下游2(阶段D)
下游2过程(阶段D)由一系列色谱和(渗滤)过滤步骤组成，以纯化并且精制L19-TNFα。在该过程结束时获得的纯化的成批物质代表原料药。下游2的纯化方案在以下示出。
步骤号 步骤描述
D2-10 Sephadex G25系统准备
D2-20 通过Sephadex G25对半加工材料进行缓冲液交换(第1次运行)
D2-30 通过Sephadex G25对半加工材料进行缓冲液交换(第2次运行)
D2-40 通过SephadexG25对半加工材料进行缓冲液交换(第3次运行)
D2-50 CHT II型40μm系统准备
D2-60 通过CHT II型40μm对脱盐的半加工材料进行阳离子交换
D2-70 通过Sephadex G25对纯化中间体1进行配制
D2-80 通过Sartobind Q对纯化中间体2进行阴离子交换
D2-90 通过Viresolve ProModus对纯化中间体3进行纳滤
D2-100 通过Sartocon slice盒系统对纯化中间体4进行浓缩
D2-110 添加0.01％v/v Tween20
通过Sephadex G25进行凝胶过滤(缓冲液交换)(步骤D2-10至D2-40)
系统准备
半加工材料(获自下游1)通过凝胶过滤经历缓冲液交换，所述凝胶过滤使用填充在Vantage A2-130柱中的交联葡聚糖Sephadex G25细树脂进行。填充在Vantage A2-130柱中的树脂的体积根据下表变化。
柱 最小体积 最大体积
Vantage A2-130 3000ml 4500ml
所使用的树脂的体积取决于待处理的蛋白的量；通常使用1 ml的树脂纯化多达0.55mg的L19-TNFα。
柱消毒和平衡
在样品加载之前，将色谱系统的柱、树脂和流动管线用0.2M NaOH的溶液原位消毒。消毒后，将系统用2CV“5mM磷酸盐缓冲液”溶液(5mM NaH2PO4·2H2O，pH 6.50)以在100与300ml/min(对应于45与135cm/h)之间的流速进行平衡。
样品加载
消毒后，以100与300ml/min(对应于45与135cm/h)之间的流速加载半加工材料。半加工材料以几个级分(通常3-4个级分)加载，使得加载不超过柱的容量(柱体积的20％)。
样品洗脱
将L19-TNFα用0.6CV“5mM磷酸盐缓冲液”溶液(5mM NaH2PO4·2H2O，pH 6.50)以在100与300ml/min(对应于45与135cm/h)之间的流速洗脱(作为脱盐的半加工材料)。通过凝胶过滤进行的缓冲液交换包括大约2-3倍的稀释。该色谱步骤的典型产率为65％-80％。通过监测A280nm、电导率和pH进行色谱运行。脱盐的半加工材料可以在2-8℃下储存最长72小时的时间段。
阳离子交换色谱(CIEX)(步骤从D2-50至D2-60)
系统准备
使用填充在Vantage A2-60柱中的CHT II型陶瓷羟基磷灰石(40μm)树脂进行阳离子交换色谱(CIEX)。多组五个钙双峰(C位点)和多对含羟基磷酸三重峰(P位点)以重复的几何模式排列。填充在柱中的树脂的体积根据下表变化。
柱 最小体积 最大体积
Vantage A2-60 500ml 1000ml
所使用的树脂的体积取决于待纯化的样品的量；通常使用1 ml的树脂纯化多达2.7mg的L19-TNFα。
柱消毒和平衡
在样品加载之前，将色谱系统的柱、树脂和流动管线用1M NaOH的溶液消毒。接触时间为至少60分钟。消毒后，将系统用10 CV“磷酸盐缓冲液A”溶液(10mM NaH2PO4·2H2O，pH6.50)以在95与235ml/min(对应于200与500cm/h)之间的流速进行平衡。在CHT柱之前串联安装Sartobind Q柱筒(0.250m2过滤面积)。将Sartobind Q柱筒单独用1 M NaCl激活，用1M Na0H消毒(至少60分钟)，并且用“5mM磷酸盐缓冲液”溶液(5mM NaH2PO4·2H2O，pH 6.50)平衡。
样品加载
柱消毒后，将脱盐的半加工材料加载到系统Sartobind Q-CHT柱上。加载以95与235ml/min(对应于200与500cm/h)之间的流速进行，这允许与CHT树脂的接触时间为至少2.5分钟。
样品洗脱
加载后，将CHT柱用2CV“磷酸盐缓冲液A”溶液(10mM NaH2PO4·2H2O，pH 6.50)洗涤。然后通过线性梯度从柱中洗脱L19-TNFα融合蛋白，所述梯度通过以200ml/min的流速从0到100％逐渐引入40CV“磷酸盐缓冲液B”溶液(10mM NaH2PO4·2H2O，1M NaCl，pH 6.50)获得。该色谱步骤的典型产率为约70％。通过监测A280nm、电导率和pH进行色谱运行。在阳离子交换色谱结束时获得的纯化中间体1的纯度对于总L19-TNFα高于98％，且对于L19-TNFα同三聚体高于95％。可以将纯化中间体1在2-8℃下储存最长48小时的时间段。
通过Sephadex G25进行凝胶过滤(缓冲液交换/配制)(步骤D2-70)
系统准备
下游2的第三操作步骤是纯化中间体1的配制，通过凝胶过滤色谱进行缓冲液交换来进行。处理纯化中间体1以将融合蛋白L19-TNFα转移至其配制缓冲液中。使用填充在Vantage A2-130柱中的交联葡聚糖Sephadex G25细树脂进行凝胶过滤。填充在VantageA2-130柱中的树脂的体积根据下表变化。
柱 最小体积 最大体积
Vantage A2-130 3000ml 4500ml
所使用的树脂的体积取决于待处理的蛋白的量；通常使用1 ml的树脂纯化多达大约0.30mg的L19-TNFα。
柱消毒和平衡
在样品加载之前，将色谱系统的柱、树脂和流动管线用0.2M NaOH的溶液原位消毒。接触时间为至少60分钟。消毒后，将系统用2CV“不含Tween20的配制缓冲液L19-TNFα”(15mM NaH2PO4·2H2O，10mM Na2HPO4·2H2O，1.5mM KCl，75mM甘露糖醇，30mM NaCl，1％w/v甘油，5mM EDTA，pH 8.00)以在100与300ml/min(对应于45与135cm/h)之间的流速进行平衡。
样品加载
消毒后，以100与300ml/min(对应于45与135cm/h)之间的流速加载纯化中间体1。纯化中间体1以几个级分(通常5个级分)加载，因为加载应不超过柱的容量(柱体积的30％)。加载每个级分后进行洗脱。
样品洗脱
将L19-TNFα作为纯化中间体2用0.6 CV“不含Tween20的配制缓冲液L19-TNFα”(15mM NaH2PO4·2H2O，10mM Na2HPO4·2H2O，1.5mM KCl，75mM甘露糖醇，30mM NaCl，1％w/v甘油，5mM EDTA，pH 8.00)以在150与250ml/min(对应于70与113cm/h)之间的流速进行洗脱。通过凝胶过滤进行的缓冲液交换包括约1.5倍的稀释。该色谱步骤的典型产率为约95％。整个过程通常持续大约2小时。通过监测A280nm、电导率和pH进行色谱运行。然后在阴离子交换色谱的下一个纯化步骤中直接处理纯化中间体2。
通过Sartobind Q进行阴离子交换色谱(AIEX)(步骤D2-80)
通过阴离子交换色谱(AIEX)使用0.250m2过滤面积的一次性Sartobind Q胶囊处理纯化中间体2。样品加载前，通过200ml NaCl 1M冲洗激活胶囊；然后通过NaOH 1M冲洗至少60分钟使胶囊消毒，并且通过以在150与300ml/min之间的流速用“不含Tween20的配制缓冲液L19-TNFα”(15mM NaH2PO4·2H2O，10mM Na2HPO4·2H2O，1.5mM KCl，75mM甘露糖醇，30mMNaCl，1％w/v甘油，5mM EDTA，pH 8.00)冲洗进行平衡。以150与250ml/min之间的流速加载纯化中间体2。L19-TNFα蛋白带正电荷(pH 8.0)，因此以流穿模式使用Sartobind Q胶囊，将L19-TNFα作为纯化中间体3直接收集到容器中。通过与Sartobind O基质结合去除可能的带负电荷的污染物(如残留的DNA)。该色谱步骤的典型产率高于95％。在纳滤的下一个纯化步骤之前，可以将纯化中间体3在2-8℃下储存最长48小时的时间段。
纳滤(去除病毒)(步骤D2-90)
使用Viresolve ProModus 1.1或Viresolve ProModus 1.2过滤器，通过纳滤处理纯化中间体3以清除病毒。可以使用ProModus 1.1或1.2，其过滤面积分别为0.017和0.070m2。膜标称截留为大约20nm。在使用之前，通过以1.8巴的恒压冲洗注射用水10分钟来润湿柱筒，然后通过以相同压力冲洗0.5M NaOH至少60分钟来对其进行消毒。消毒后，将柱筒通过用“不含Tween20的配制缓冲液L19-TNFα”(15mM NaH2PO4·2H2O，10mM Na2HPO4·2H2O，1.5mM KCl，75mM甘露糖醇，30mM NaCl，1％w/v甘油，5mM EDTA，pH 8.00)以3巴恒压冲洗5分钟来平衡。平衡后，以大约300ml/min的流速(对于Viresolve ProModus 1.2过滤器)加载纯化中间体3。纳滤后的L19-TNFα回收率通常高于99％。在纳滤结束时，获得纯化中间体4。如果光密度低于0.530，则在下一个下游2步骤中浓缩纯化中间体4。否则，向其直接添加0.01％v/v Tween20以完成原料药配制，获得纯化的成批物质。
渗滤(用于浓缩)(步骤D2-100)
如果光密度低于0.530，则通过渗滤浓缩纯化中间体4，以将其光密度调节至包含于0.530与0.580之间的合适的范围。使用Sartocon Slice盒系统进行渗滤。将系统通过1MNaOH流通至少60分钟进行消毒，然后用注射用水冲洗并且用“不含Tween20的配制缓冲液L19-TNFα”(15mM NaH2PO4·2H2O，10mM Na2HPO4·2H2O，1.5mM KCl，75mM甘露糖醇，30mMNaCl，1％w/v甘油，5mM EDTA，pH 8.00)以大约50ml/min的流速进行平衡。当平衡完成时，将纯化中间体4加载到系统中。将纯化中间体4连续冲洗通过Sartocon盒。L19-TNFα被保留并且返回到起始瓶“渗余物”中，而通过膜的配制缓冲液被丢弃在瓶“渗透物”中。由于没有更换缓冲液，L19-TNFα浓度逐渐增加。在浓缩过程中，根据起始光密度，纯化中间体4的体积减少大约2-4倍。通过监测光密度值来控制过程。当其达到建立的范围0.530-0.580时，停止浓缩过程。该操作步骤的产率通常高于99％。然后可以向获得的纯化中间体5直接添加0.01％v/vTween20以完成原料药配制。
添加0.01％v/v Tween20(步骤D2-110)
通过添加0.01％v/v Tween20获得原料药配制品。以合适的量添加10％v/vTween20的储备溶液，以达到0.01％v/v Tween20的最终含量。如果光密度已经在0.530-0.580范围内，则在纳滤结束时将Tween20添加至纯化中间体4中，否则在浓缩过程完成后将其添加至纯化中间体5中。0.01％v/v Tween20的添加完成了下游2过程。可以将纯化的成批物质(原料药)在2-8℃下储存最长7天的时间段，或在-80℃下储存长达1个月。
实施例2-GMP批次的质量控制
使用几种质量控制分析(包括ELISA、SDS-PAGE、尺寸排阻色谱法、A280测量、生产率、生物活性和免疫反应性测定、重量摩尔渗透压浓度、病毒测试、视觉外观等)来表征根据实施例1制备的良好操作规范(GMP)批次的纯度。用于2D-SDS-PAGE分析的方案报告如下。
2.1 2D-SDS-PAGE
使用预制系统(IPGRunnerTM)在二维电泳测定中分析每个样品。通过采用用于等电聚焦的两个pH范围来进行所述测定：
1)pH 3.0-10.0
2)pH 6.0-10.0。
在(1)中，pH范围足够宽以突出最终的污染物，而在(2)中，pH范围分离较小，但仍包括样品的等电点(pH＝7.7)。用蓝色考马斯R-250进行染色。结果报告于图3中。
实施例3-GMP批次的质谱分析
3.1用于完整质量分析的直接输注HR-MS
在分析前用C18-纯化(微型离心柱，Harvard Apparatus)使100μg的L19-TNFα样品脱盐。在与Ion Max ESI源耦合的Orbitrap Q-Exactive上进行直接输注。使用以下参数：注射筒流速4μL/min，毛细管电压3.0kV，源内诱导解离40eV，鞘气4单位，毛细管温度300℃，S-lens RF水平90，分辨率17500(200m/z的FWHM)，AGC靶5x 104，微扫描10，质量范围500-3000m/z，以及最大注射时间200ms。然后分析原始光谱以量化制剂中糖基化和非糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的相对量。通过将分别对应于糖基化或非糖基化L19-TNFα的峰的强度求和来实现量化，并且使用以下方程式计算百分比。
其中x是分别对应于非糖基化或糖基化L19-TNFα的强度的总和。此分析的结果示出于图4和图5中。
3.2用于糖肽分析的MS/MS分析
将7.5μg的L19-TNFα重悬于1M尿素(溶解于NH4HCO3溶液中)中，最终pH＝8。在室温下用TCEP还原蛋白质15min，随后在65℃下还原45min，并且在黑暗中用碘乙酰胺(IAA)烷基化1小时。然后在37℃下将L19-TNFα用胰蛋白酶(酶-蛋白质比率1:60)消化过夜。消化后，将样品用10％甲酸酸化，然后经历C18纯化和脱盐(小型离心柱，Harvard Apparatus)。然后使500ng的所得肽经历HPLC-MS/MS分析。在Orbitrap Q-Exactive质谱仪上分析所有样品，所述质谱仪经由Nano Flex离子源与EASY nanoLC 1000系统耦合。色谱分离在AcclaimPepMap RSLC柱(50μm x 15cm，粒度2μm，孔径)上进行，使用5％-35％溶剂B(在乙腈中的0.1％甲酸)的40min线性梯度，流速为300nL/min。电离以正离子模式进行，喷雾电压为2kV，毛细管温度为250℃，S-lens RF水平为60。质谱仪在数据依赖模式下工作。MS1扫描范围设置为从350至1650m/z，使10个最丰富的肽经历HCD片段化，NCE为25。动态排除设置为10秒。用Proteome Discoverer 1.4处理原始文件。使用Sequest作为搜索引擎，使用含有目的蛋白、小家鼠(mus musculus)参考蛋白质组和另外的污染物(人角蛋白异形体、牛血清白蛋白和来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)的蛋白A)的FASTA文件进行数据库搜索。半胱氨酸的脲基甲基化被设置为固定修饰，而甲硫氨酸的氧化和O-糖基化(HexNAc1Hex1NeuAc1)被设置为可变修饰。将胰蛋白酶设置为切割特异性，允许最多2次错过的切割。使用渗滤器(percolator)进行数据过滤，导致1％的错误发现率(FDR)。此分析的结果报告于图6和图7中。
序列表
L19 CDR的氨基酸序列
L19 CDR1 VH-SFSMS (SEQ ID NO:1)
L19 CDR2 VH-SISGSSGTTYYADSVKG (SEQ ID NO:2)
L19 CDR3 VH-PFPYFDY (SEQ ID NO:3)
L19 CDR1 VL-RASQSVSSSFLA (SEQ ID NO:4)
L19 CDR2 VL-YASSRAT (SEQ ID NO:5)
L19 CDR3 VL-QQTGRIPPT (SEQ ID NO:6)
L19VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS
VH与VL之间的接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
GDGSSGGSGGAS
L19VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
L19 scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
人TNFα(huTNFα)的细胞外结构域的可溶形式的氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)。
scFv与TNFα之间的接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
EFSSSSGSSSSGSSSSG
L19-huTNFα缀合物的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
丝氨酸257以粗体、斜体和下划线示出
L19-IL2缀合物的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
苏氨酸256以粗体、斜体和下划线示出

Claims (8)

1.一种药物制剂，所述药物制剂包含：
(i)非糖基化L19-TNFα；和
(ii)糖基化L19-TNFα；
其中所述L19-TNFα包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成，并且其中在所述制剂中糖基化L19-TNFα占总L19-TNFα的百分比≤6％。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述糖基化L19-TNFα包含在SEQ ID NO:13的位置257处的丝氨酸上的O-连接的糖基化。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述O-连接的糖基化由HexNAc1Hex1NeuAc1组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述糖基化L19-TNFα的百分比通过质谱法分析来确定，优选通过完整质谱法分析来确定。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂用于在治疗患者的癌症的方法中使用。
7.根据权利要求6所述的用于所述用途的药物制剂，其中所述癌症是黑色素瘤、神经胶质瘤或皮肤癌，如恶性黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌。
8.根据权利要求6或7所述的用于所述用途的药物制剂，其中所述方法包括向所述患者施用第二抗癌治疗剂。
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