CN118910256A

CN118910256A - Fgf19扩增用于评价和/或预测食管癌患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的用途

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Publication number: CN118910256A
Application number: CN202410984974.1A
Authority: CN
Inventors: 王玮; 林水苗; 曾钦; 褚帅
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2024-07-22
Filing date: 2024-07-22
Publication date: 2024-11-08

Abstract

本发明涉及FGF19扩增作为生物标志物用于评价和/或预测食管癌细胞或食管癌患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的用途。具体而言，本发明涉及检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的试剂盒中的用途。本发明还涉及一种用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的试剂盒。

Description

FGF19扩增用于评价和/或预测食管癌患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的用途

技术领域

本发明涉及基于生物标志物来评价和/或预测食管癌细胞或食管癌患者对化疗的敏感性。更具体而言，本发明涉及基于基因标志物或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段来评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性。

背景技术

目前针对食管癌的临床干预措施主要包括手术、放疗、化疗和药物治疗。化疗贯穿着食管癌治疗的整个过程，包括新辅助化疗、辅助化疗、同期化疗、姑息化疗等等。临床中发现，很多晚期食管癌患者对化疗不敏感。目前食管癌使用的化疗药物种类也有限，使用较广泛的包括氟尿嘧啶及氟尿嘧啶类药物、紫杉类及铂类等。并且，大多数晚期食管癌患者都经过了多线方案的治疗，层层治疗筛选后的残留肿瘤细胞多是对常规化疗药物耐受的肿瘤细胞。

因此，解决食管癌细胞对常规化疗药物耐药的问题是食管癌研究领域的重要课题。但是当前缺乏有效的体外和体内模型来研究靶向药物敏感性预测的生物标志物，导致很多药物无法准确筛选到敏感人群，极大的影响到药物临床试验的推进。

发明内容

为解决现有技术的不足，本申请发明人基于临床食管癌患者基因测序结果筛选食管癌治疗新靶点；通过食管癌基因测序数据筛选出合适的变异基因FGF19。然后，本申请发明人通过数据库分析食管癌中FGF19基因特征及对预后的影响，分析FGF19可能具有作为靶点的潜力。最后，本申请发明人通过体内外实验发现FGF19扩增导致食管癌细胞对氟尿嘧啶耐药。基于此，本申请发明人发现，FGF19能够作为临床评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性降低的关键生物标志物，具有较大的临床医学转化价值。

本发明总体上关于FGF19扩增作为生物标志物用于评价和/或预测食管癌细胞或食管癌患者对氟尿嘧啶化疗剂的敏感性的用途。

在一方面，本发明涉及用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗或氟尿嘧啶化疗剂或氟尿嘧啶的敏感性的试剂盒中的用途，其中与对照相比，FGF19基因的表达水平升高和/或拷贝数扩增指示食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗或氟尿嘧啶化疗剂或氟尿嘧啶的敏感性降低。

本文所称的氟尿嘧啶化疗是指使用氟尿嘧啶化疗剂进行的化疗，本文所称的氟尿嘧啶化疗剂是指氟尿嘧啶，其又称为5-氟尿嘧啶，具有结构式：

如下文定义部分所详细说明，本领域技术人员能够理解对照的含义以及了解如何设置对照。例如对照可以是FGF19基因无扩增的健康的食管细胞，或者与FGF19基因扩增无关的患病细胞，例如保持了对氟尿嘧啶化疗的敏感性不下降的患病前期的食管癌细胞或患有食管癌的患者。

本文所称的FGF19扩增与FGF19基因扩增具有相同的含义，涵盖FGF19基因拷贝数扩增和表达水平升高等。本领域技术人员也了解如何判断“升高”和/或“扩增”，如下文定义部分所详细说明，所述升高和/或扩增是统计学显著的，例如至少约1.1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍的升高和/或扩增，例如拷贝数扩增。

根据FGF19基因序列(NM_005117)或者相应的mRNA和蛋白质序列，设计或选择用于检测FGF19基因扩增的寡核苷酸探针、引物或抗体以及用于实施该检测的其他试剂和方法，在本领域技术人员的技术范围内。

在一些实施方案中，所述用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂包括与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂，或与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质。

在一些实施方案中，所述与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为抗FGF19的抗体。

在一些实施方案中，所述与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质包括寡核苷酸探针或引物，或由其组成。

基于本发明的教导，本领域技术人员还可以选择其他任何能够实现检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的技术手段和试剂。

在另一方面，本发明涉及一种用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂。

在一些实施方案中，所述与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为抗FGF19的抗体。本领域技术人员可以根据检测目的和实际情况，合理确定任何能够实现检测目的抗FGF19的抗体，例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体等或其抗体片段；所述抗体可以是鼠源性抗体、人源性抗体等。

在一些实施方案中，所述与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质包括探针或寡核苷酸引物，或由其组成。

在一些实施方案中，所述食管癌为食管鳞癌或食管腺癌。

在一些实施方案中，所述食管癌为食管鳞癌。

在一些实施方案中，所述食管癌选自复发性食管癌、转移性食管癌、复发转移性食管癌和晚期转移性食管。

在又一方面，本发明涉及一种用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗或氟尿嘧啶化疗剂或氟尿嘧啶的敏感性的方法，其包括以下步骤：

(1)获取受试者的生物样品；和

(2)检测所述样品的FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的表达水平和/或拷贝数；

其中与对照相比，FGF19基因的表达水平升高和/或拷贝数扩增指示食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性降低。

在一个实施方案中，所述生物样品为ctDNA、肿瘤组织、肿瘤循环细胞或人体其它来源的组织。

本领域技术人员能够根据检测目的和实际情况，合理选择和确定适合的检测技术。适用于不同的检测目标，检测技术可以包括但不限于基因测序、PCR、FISH、免疫组化、ELISA、Western或流式细胞技术。

由下文实施例部分所表明，安罗替尼能够逆转(与对照相比)FGF19基因的表达水平升高和/或拷贝数扩增导致的食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性降低。由此，在根据本发明的再一个方面中，本发明涉及一种安罗替尼制备用于提高(与对照相比)FGF19基因扩增(包括FGF19基因表达水平升高和/或拷贝数扩增)的食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的药物的用途。

附图说明

图1：对50例食管癌患者进行基因测序的结果，其显示排在前16位的基因变异及变异频数。其中显示FGF19基因在食管癌中的变异类型为基因扩增，排在第3位。

图2：数据库分析FGF19相关特征。A.cBioPortal网站分析食管癌数据集FGF19基因扩增占比；B.GeneMANIA数据库分析与FGF19相关的20个基因；C.STRING数据库分析与FGF19相关的10个蛋白；D.针对FGF19+20相关基因进行KEGG通路富集分析；E.针对FGF19+10相关蛋白进行KEGG通路富集分析。

图3：FGF19在食管癌组织和正常组织中差异表达。A.TCGA泛癌种分析显示FGF19在多种癌症组织中高表达；B.FGF19在食管癌组织中显著高表达；C.使用TCGA数据库绘制的FGF19表达预测食管癌肿瘤组织ROC曲线图(AUC＝0.788)；D.使用TCGA+GTEx数据库绘制的FGF19表达预测食管癌肿瘤组织ROC曲线图(AUC＝0.914)。

图4：成功构建包含FGF19基因扩增的食管癌细胞株。A.qPCR实验及蛋白免疫印迹实验证实FGF19扩增食管癌细胞构建成功(分别为KYSE-410FGF19^AM和KYSE-510FGF19^AM)；B.FGF19基因扩增促进食管癌细胞增殖。其中对照组为对应的空载食管癌细胞株(KYSE-410CON和KYSE-510CON)。

图5：Transwell实验测定FGF19扩增显著增强了食管癌细胞的侵袭能力。

图6：FGF19扩增显著增强了食管癌的迁移能力。对照组的设置同图4和图5。

图7：FGF19扩增对食管癌细胞周期的影响，以及氟尿嘧啶(5μg/ml)、安罗替尼(5μM)处理后对细胞周期的影响。A.KYSE-410CON食管癌细胞各处理组的细胞周期分布；B.KYSE-410FGF19^AM食管癌细胞各处理组的细胞周期分布；C.KYSE-510CON食管癌细胞各处理组的细胞周期分布；D.KYSE-510FGF19^AM食管癌细胞各处理组的细胞周期分布。

图8：FGF19扩增降低食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性，安罗替尼能增强FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。柱形图中各图例从上到下分别表示：对照组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增/5-氟尿嘧啶+安罗替尼(左侧柱形图中为3μM，右侧柱形图中为1μM)。

图9：FGF19扩增降低食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性，FGFR4特异抑制剂FGF401增强了FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。柱形图中各图例从上到下分别表示：对照组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增/5-氟尿嘧啶+FGF401(10μM)。

图10：FGF19-FGFR4下游信号通路的探索。A.蛋白免疫印迹实验检测不同处理组的蛋白表达变化；B-C.CCK8实验检测FGF19扩增对Wnt通路抑制的影响(LGK974是一种Wnt通路抑制剂)。C图中各图例从上到下分别表示：对照组、5-氟尿嘧啶(3μg/m l)、5-氟尿嘧啶(3μg/m l)+LGK974(10μM)、5-氟尿嘧啶(3μg/m l)+安罗替尼(左侧柱形图中为3μM，右侧柱形图中为1μM)。图11：裸鼠皮下移植瘤模型验证FGF19扩增对食管癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响。左侧折线图中各图例从上到下分别表示：对照组/空白对照、对照组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增组/空白对照、FGF19扩增组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增组/安罗替尼、FGF19扩增组/5-氟尿嘧啶+安罗替尼。

图12：裸鼠皮下瘤组织免疫组化染色(Ki 67、CD31、TUNEL)。B图中从上到下各组分别为：对照组/空白对照、对照组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增组/空白对照、FGF19扩增组/5-氟尿嘧啶、FGF19扩增组/安罗替尼、FGF19扩增组/5-氟尿嘧啶+安罗替尼。

图13：质粒pcDNA3.1-FGF19的图谱。

具体实施方式

本发明涉及新发现的生物标志物(即FGF19)的表达和/或拷贝数与食管癌、尤其是食管鳞癌对氟尿嘧啶化疗的敏感性之间的关系。本文所述生物标志物提供用于评价和/或预测氟尿嘧啶对治疗食管癌的效果的方法和用途。因此，本发明的一个实施方案代表生物标志物的改进，所述生物标志物适用于评价和/或预测氟尿嘧啶对治疗食管癌的效果。在又一个实施方案中，本发明新发现的生物标志物(即FGF19)可与本领域已知的一种或多种其它癌症标志物(例如CEA、CA 19-9、CA 125、CA 72-4、SCC、CF21-1、TSGF、P53-Ab、VEGFR2、VEGFA、CD24)联用，例如用于评价和/或预测氟尿嘧啶对治疗食管癌的效果或用于制备用于此目的的试剂盒。

本发明发现并证实了FGF19扩增(例如基因拷贝数增加)是预测食管鳞中氟尿嘧啶化疗敏感性的关键生物标志物，这提示FGF19有潜力成为临床评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性降低的关键生物标志物，具有巨大的发掘潜力和应用前景。

基于基因变异在癌症发展中的重要作用，靶标治疗是用于遏制癌症发展的有效手段。另一方面，由于生物体和疾病的复杂性，并不总能准确鉴定能够用于有效治疗癌症的靶标基因。目前，放疗和化疗仍然是用于癌症的广泛手段。然而，临床上许多晚期食管癌患者对较广泛使用的化疗剂氟尿嘧啶不敏感。并且，大多数晚期食管癌患者都经过了多线方案的治疗，层层治疗筛选后的残留肿瘤细胞多是对常规化疗药物耐受的肿瘤细胞。本发明为解决食管癌细胞对常规化疗药物耐药的问题提供了一种新颖的技术方案，为特别是晚期的、并不清楚或完全清楚致病机理、缺乏靶标治疗的食管癌患者提供更多宝贵的生存机会。

发明人期望在此澄清一些概念。例如，在癌症细胞中检测到的变异基因，甚至是作为检测用生物标志物的变异基因，不一定与癌症或肿瘤的耐药性有关。这二者之间没有必然的联系。如本申请实施例1中所描述，我们基于对50例食管癌患者的基因测序结果进行的频数统计分析，发现了排在前16位的变异基因，其中FGF19变异基因仅排在第3位，分别排在第1位和第2位的是TP53和CCND1变异基因。本发明中发现的FGF19基因扩增降低食管癌细胞对氟尿嘧啶化疗剂敏感性这一现象，是出乎意料的。

定义

术语“样品”意指已知或疑似表达或含有生物标志物(即FGF19)或其结合剂的材料，结合剂为例如对生物标志物(即FGF19)有特异性的抗体。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物在内的细胞培养物和生物或生理流体，例如全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆、稀释黏液等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是人生理流体，例如人血清。在本发明的某些方面，样品是活组织检查样品例如经组织检查获得的肿瘤组织或细胞。在本发明的某些方面，样品是恶性或正常组织样品例如癌旁正常组织样品。

本文使用的术语“标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是基因、蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的基因、蛋白或多肽预期包括所述基因或蛋白的天然存在的变体以及所述基因或蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害(例如在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。标志物多肽的变体可由相同的基因编码，但可能在其等电点(＝PI)或分子量(＝MW)或以上二者上有差异，例如作为可选的mRNA或mRNA前体加工的结果。变体的氨基酸序列与对应的标志物序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。

标志物的表达也可通过检测标志物的翻译(即，样品中标志物蛋白的检测)来鉴定。适合于检测标志物蛋白的方法包括用于检测和/或测量得自细胞或细胞提取物的蛋白的任何合适方法。这样的方法包括，但不限于免疫印迹(如蛋白质印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫组织化学和免疫荧光。用于检测蛋白的特别优选的方法包括任何基于细胞的测定，包括免疫组织化学和免疫荧光测定。这样的方法是本领域熟知的。

术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文可互换使用，是指温血动物，例如哺乳动物。该术语包括但不限于家畜、啮齿动物(例如大鼠和小鼠)、灵长类动物和人。优选该术语是指人。

成纤维细胞生长因子19(Fibroblast growth factor,FGF19)在人脑中首次被发现，其编码基因位于染色体11q13，由216个氨基酸组成，在回肠和胆囊上皮细胞中高表达，但在正常肝脏中检测不到。成年小鼠的回肠、空肠和十二指肠中高度表达FGF15，是FGF19的小鼠同源物，由218个氨基酸组成，与人FGF19具有51％的相似性。本文中所讨论的FGF19基因指的是序列示于NCBI号NM_005117的人FGF19基因。

术语“对照”应根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示用于比较基因拷贝数、蛋白质或mRNA水平的任何有用的参考。对照可以是用于比较目的的任何样品、标准品、标准曲线或水平。对照可以是正常参考样品或参考标准或水平。对照可以是患者自身的血液对照样本；食管癌如食管鳞癌肿瘤细胞本身的内参基因(如FGF19)的表达；预先确定的对氟尿嘧啶相对不敏感的细胞(例如对氟尿嘧啶相对不敏感的食管鳞癌原代细胞)，如“正常对照”或取自同一受试者的先前样品；来自正常健康受试者的样品，如正常细胞或正常组织；来自未患疾病的受试者的样品(例如，细胞或组织)；或已知正常浓度下的纯化蛋白或RNA的样品。“参考标准或水平”是指源自参考样品的值或数字。“正常对照值”是指示非疾病状态的预先确定的值，例如，在健康对照受试者中预期的值。通常，正常对照值被表示为范围(“介于X与Y之间”)、高阈值(“不高于X”)或低阈值(“不低于X”)。对于特定生物标志物，具有在正常对照值内的测量值的受试者通常被称为对于所述生物标志物“在正常限值内”。正常参考标准或水平可以是从未患疾病或病症(例如，癌症)的正常受试者。本文实施例中所构建的空载食管癌细胞株(KYSE-410CON和KYSE-510CON)，是所构建的FGF19扩增稳转食管癌细胞株(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)的对照组。

与对照或标准(例如来自健康食管细胞的正常水平、不同病期的水平或患者其它样品的水平、保持了对氟尿嘧啶的敏感性不下降的之前病期的食管癌细胞或患有食管癌的患者的水平)相比，患者样品中标志物表达水平“升高”或“降低”或者拷贝数“扩增”或“缺失”可表示高于或低于检测试验的标准误差的水平，优选水平或拷贝数分别为对照或标准的至少约1.1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍或者为对照或标准的至多约1/1.1、1/1.25、1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10或更少。拷贝数扩增或缺失可通过本领域周知的技术检测，例如实施例所述的高通量测序，或者本领域已知的全基因组测序、全转录组测序、其他二代测序检测方法、芯片检测、液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)等。本文所称的FGF19基因扩增是指与不包含扩增的上述对照或标准相比，FGF19基因的拷贝数增加或者表达水平提高，优选增加或提高至少约1.1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍。

术语“多肽”和“蛋白”或“蛋白质”在本文可互换使用，表示通过共价和/或非共价键连接的氨基酸的至少一个分子链。该术语包括肽、寡肽和蛋白质及多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。蛋白质片段、类似物、突变蛋白质或变体蛋白质、融合蛋白等也包括在该术语的含义中。

在本发明中，蛋白片段是指与全长天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或中间缺失的多肽。所述片段还可含有与天然蛋白相比经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长度为约5-215个氨基酸。例如，片段长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150或200个氨基酸。在一个实施方案中，所述片段是免疫学上可检测的片段，其优选地包含标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。蛋白表达水平的变化是指与对照或标准的表达水平相比，至少为对照或标准的表达水平的至少约1.1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍或者为对照或标准的表达水平的至多约1/1.1、1/1.25、1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10或更少。在本文中，归因于FGF19基因的扩增，其相应的RNA(例如mRNA)和蛋白质的表达或水平也可以相比对照组增加，例如增加至少约1.1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍。

在某些实施方案中，如本文所用的测定“蛋白表达水平”、“基因表达”或“基因表达水平”包括但不限于测定相应的RNA、蛋白或者肽水平(或其组合)。本发明不限于测定蛋白、肽或RNA水平的具体方法和试剂，所有这些方法和试剂是本领域熟知的。

用于测定样品中蛋白质的量或浓度的方法为技术人员所知。所述方法包括放射性免疫测定、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析和ELI SA测定。对于使用抗体的方法，单克隆和多克隆抗体都适用。所述抗体对于蛋白质、蛋白表位或蛋白片段可为免疫学上特异的。

术语“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚体形式，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链DNA和RNA，例如多核苷酸的甲基化或帽化等修饰形式和未修饰形式。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用。寡核苷酸可包括但非必需包括其它编码或非编码序列，或者它可以但不一定与其它分子和/或载体或支持材料连接。用于本发明方法或试剂盒的寡核苷酸可具有适于具体方法的任何长度。在某些应用中，该术语是指反义核酸分子(例如处于与编码本发明癌症标志物(例如FGF19)的有义多核苷酸相反方向的mRNA或DNA链)。

用于本发明的寡核苷酸包括互补核酸序列和与这些序列基本相同的核酸，并且还包括因遗传密码简并而不同于核酸序列的序列。可用于本发明的寡核苷酸还包括在严格条件下、优选高严格性条件下与寡核苷酸癌症标志物核酸序列杂交的核酸。

核苷酸杂交测定是本领域熟知的。杂交测定程序和条件将根据应用而变化并依据已知的通用结合方法选择，参见例如J.萨姆布鲁克等，分子克隆：实验指南(第三版.科学出版社，2002)；以及Young和Davis，P.N.A.S，80:1194(1983)。进行重复和受控杂交反应的方法和设备已经描述于美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996、6,386,749和6,391,623中，其各自通过引用结合到本文中。

在某些情况下，可能需要扩增样品。基因组样品可通过各种机制扩增，其中一些机制可采用PCR。样品可在阵列上扩增。参见，例如美国专利号6,300,070和美国专利申请系列号09/513,300。

其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(如Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)、Landegren等Science 241、1077(1988)和Barringer等Gene 89:117(1990))、转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)、自维持序列复制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995)、目标多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引发的聚合酶链反应(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)、任意引发的聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909、5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)(参见美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603，其各自通过引用结合到本文中)。

可用于检测FGF19表达水平和/或拷贝数的试剂是本领域众所周知的。适用于本发明的这种试剂可市购获得或通过本领域技术人员熟知的方法常规地制得。

术语“结合剂”是指例如与本发明生物标志物(FGF19)特异性结合的多肽、抗体、核糖体或适体等物质。如果物质以可检测的水平与本发明生物标志物起反应，而不与含有无关序列或不同多肽的序列的肽可检测地起反应，则它与本发明生物标志物“特异性结合”。可采用本领域技术人员可容易进行的方法例如ELISA来评价结合性质。

结合剂可以是含或不含肽组分的核糖体、RNA或DNA分子或多肽。结合剂可以是包含多肽生物标志物序列、其肽变体或这类序列的非肽模拟物的多肽。

适体包括与核酸和蛋白质结合的DNA或RNA分子。与本发明标志物结合的适体可在无需过多实验的情况下利用常规技术产生。[例如参见下列描述适体体外选择的出版物：Klug等,Mol.Biol.Reports20:97-107(1994)；Wallis等,Chem.Biol.2:543-552(1995)；Ellington,Curr.Biol.4:427-429(1994)；Lato等,Chem.Biol.2:291-303(1995)；Conrad等,Mol.Div.1:69-78(1995)；以及Uphoff等,Curr.Opin.Struct.Biol.6:281-287(1996)]。

用于本发明的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2)、dAb(结构域抗体；参见Ward等，1989，Nature，341:544-546)、抗体重链、胞内抗体、人源化抗体、人抗体、抗体轻链、单链Fv(scFv)(例如包括单特异性、双特异性等)、抗独特型(ant-Id)抗体、包含抗体部分的蛋白质、嵌合抗体(例如含有鼠抗体的结合特异性但其中其余部分是人来源的抗体)、衍生物例如酶缀合物或标记的衍生物、双链抗体、线性抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、上述任一种的表位结合片段和包含所需特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的抗体，抗体不必是任何特定的类型、类别或亚类。在本发明的某些实施方案中，抗体是IgG抗体或其类别或亚类。抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物(例如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。

例如，用于本发明的抗体可市购自例如BioVision(例如货号5542R-100)、Abcam(例如货号ab172545)等。或者，所述抗体可通过本领域周知的重组方法制备。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。对于单克隆抗体的制备参见例如Kohler等(1975)Nature256:495-497；Kozbor等(1985)J.Immunol Methods 81:31-42；Cote等(1983)ProcNatl Acad Sci 80:2026-2030和Cole等(1984)Mol Cell Biol 62:109-120。

根据本公开的试剂盒可以通过本领域常规方法制备。试剂盒可包含实施本发明方法或用途所需要的材料或试剂(包括用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)的容器。例如，试剂盒可以包括一个或多个容纳相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开施用至待检测的样品。作为一个实例，试剂盒可含有用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂、缓冲液以及使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。以上实例仅用于更清楚地说明本发明，而在任何方便都不构成对适用于本发明的试剂盒及其内容物的限制。

实施例

为了更清楚的解释本发明的内容，以下将结合附图和实施例详细说明。

实施例1基于临床食管癌患者基因测序结果筛选食管癌治疗新靶点

在临床工作中，我们收集进行基因测序的食管癌患者的临床资料。对收集到的本南方医院动物实验中心50例食管癌患者的全基因组测序结果进行统计分析，从中筛选出治疗新靶点。

对50例食管癌患者的基因测序结果进行频数统计分析，发现排在前16位的变异基因依次为：TP53、CCND1、FGF19、NOTCH1、LRP1B、FAT1、MYC、CDKN2A、NSD1、EP300、CHEK2、ZNF217、PTCH1、DICER1、CBLB、GNAS，基因变异类型包括：基因突变、基因扩增、单拷贝数缺失、基因融合，其中排前三位的基因变异及占比分别为：TP53基因突变占比88％，CCND1基因变异占比48％(其中，扩增占比46％，突变占比2％)，FGF19基因扩增占比46％，如图1所示。

我们筛选出FGF19作为研究的新靶点。

实施例2数据库分析食管癌中FGF19基因特征及对预后的影响

虽然基于实施例1的研究结果发现FGF19扩增有作为食管癌精准治疗新靶点的潜质，但需要进一步明确新靶点是否在肿瘤组织中显著高表达，是否对食管癌患者预后产生影响。因此，本实施例通过在线数据库大样本量测序结果进一步分析FGF19在食管癌患者中的特征以及对食管癌患者预后的影响。

利用cBioPortal网站食管癌数据集(TCGA,FirehoseLegacy)分析FGF19扩增在食管癌中的占比。通过GeneMANIA和STRING网站进行FGF19相关基因-基因和蛋白-蛋白互作网络分析，KEGG分别进行FGF19基因相关基因和蛋白的通路富集分析。利用TCGA数据库食管癌数据集进行FGF19在食管癌肿瘤组织和正常组织中的差异表达分析。通过LinkedOmics数据库筛选食管癌中与FGF19表达正相关、负相关基因及进行FGF19的生物学功能富集分析。使用R语言对TCGA数据库食管癌数据集进行临床特征、预后分析及可视化。

采用R软件进行分析。采用独立样本t检验，分析TCGA数据库中食管癌组织与正常组织之间FGF19 mRNA的差异表达水平。采用皮尔逊卡方检验分析FGF19表达与临床病理特征的相关性。采用Kaplan-Meier图进行疾病特异生存期(DSS)分析，并采用log-rank检验比较差异。采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多变量分析。双尾P＜0.05时被认为有统计学意义。

首先，我们通过数据库对FGF19基因在食管癌中的变异情况进行分析，了解其在食管癌中的特征。通过cBioPortal网站对TCGA数据库食管癌数据集(TCGA,Firehose Legacy)进行分析，发现FGF19在食管癌中扩增占比35％(图2A)。通过GeneMANIA网站和STRING网站进行基因-基因和蛋白-蛋白的互作网络分析，发现与FGF19基因相互作用的20个潜在靶基(FGFR4/KLB/KL/SDC2/FGFR1/FGF20/FGF5/FGF17/FGF22/FGF16/FGF23/FGF8/FGF18/FGF6/FGF9/FGF3/FGF7/FGF4/FGF10/FGF1)(图2B)以及10个潜在靶蛋白(KLB/FGFR1/FGFR3/FGFR2/FGF23/FGF10/FGF7/FGF2/PLCG1/FGFR4)(图2C)。将FGF19与20个相关基因(图2D)及与10个相关蛋白编码基因(图2E)分别进行KEGG通路富集分析，发现从基因和蛋白水平与FGF19相关的主要富集信号通路为PI3K-Akt信号通路以及MAPK信号通路等。

我们在TCGA数据库分析FGF19在泛癌中的表达，发现FGF19在多种肿瘤组织与正常组织中存在差异表达(图3A)，在食管癌组织中FGF19表达显著高于正常组织(图3B)。并且在肿瘤发生发展过程中，FGF19高表达能对肿瘤组织进行预测(AUC＝0.788)(图3C)，TCGA+GTEx数据库显示FGF19高表达对肿瘤组织的预测具有较高的准确性(AUC＝0.914)(图3D)。以上结果提示FGF19在食管癌肿瘤组织中显著高表达，有可能作为食管癌治疗的新靶点。

实施例3FGF19扩增降低对食管癌细胞的化疗敏感性

使用购自上海美轩生物科技有限公司的人源食管癌细胞株KYSE-410细胞和KYSE-510细胞，我们成功构建了包含FGF19扩增的稳定转染的食管癌细胞株(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)，以及空载食管癌细胞株(KYSE-410CON/KYSE-510CON)。使用的质粒名称为pcDNA3.1-FGF19(图13)，包含插入在CMV启动子下游的FGF19基因，并带有嘌呤霉素抗性基因作为选择标记。FGF19基因的序列为NCBI号：NM_005117所示的基因序列，基因片段由吉凯生物技术有限公司合成。空载质粒为pcDNA3.1-empty，其含有CMV启动子和嘌呤霉素抗性基因，但没有FGF19基因的插入。当细胞培养至30-50％汇合度时，使用50μL病毒液和8μg/mlpolybrene进行转染，培养24-48小时后更换新鲜培养基，转染48-96小时后将KYSE-410细胞和KYSE-510细胞分别置于含250μg/ml及450μg/ml G418的完全培养基中培养5-7天，获得带G418抗性的细胞，再筛选培养单克隆稳转细胞株。

通过实时定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(Westernblot)实验分别进行mRNA水平和蛋白质水平的验证。如图4A所示，包含FGF19扩增的稳定转染的食管癌细胞株相比对照组，具有显著更高的FGF19表达量。

还通过克隆形成实验发现FGF19扩增促进了食管癌细胞的增殖。将稳定转染的细胞以低密度(500个细胞/孔)接种到6孔板培养皿中，培养两周，期间每3天更换一次培养基。随后用4％多聚甲醛固定细胞，并用0.1％的结晶紫染色。每个培养皿中形成的克隆数目进行计数和比较。结果如图4B所示。实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.0001。

3.1FGF19扩增增强食管癌细胞的侵袭能力

成功构建FGF19扩增的食管癌细胞株后，进一步验证了FGF19扩增对食管癌细胞恶性生物学特征的影响。首先，通过Transwell侵袭实验观察FGF19扩增对食管癌细胞侵袭能力的影响。使用的Transwell装置购自Corning公司，孔径为8μm。细胞接种数量为5×10⁴个细胞/孔，接种于装有含有Matrigel(BD Biosciences)的上室中，下室加入含有10％ FBS的培养基作为趋化因子。培养48小时后，移除上室中未迁移的细胞，用4％多聚甲醛固定迁移的细胞，并用0.1％的结晶紫染色。计数每孔迁移细胞数目，并与对照组(即空载食管癌细胞株)进行比较。

结果发现FGF19扩增的食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)侵袭能力显著强于对照组(KYSE-410CON/KYSE-510CON)。结果如图5所示，实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.0001。

3.2FGF19扩增增强食管癌细胞的迁移能力

将细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至80-90％汇合度时，用200μl移液器吸头在细胞单层上划出一条直线，随后用PBS轻轻洗去浮动的细胞。加入无血清培养基，分别在0小时、24小时、48小时和72小时拍照记录划痕的愈合情况。通过ImageJ软件测量划痕区域，并计算划痕愈合的百分比。结果显示，FGF19扩增组食管癌细胞(KYSE-410FGF19AM/KYSE-510FGF19AM)的迁移能力显著强于对照组(KYSE-410CON/KYSE-510CON)。结果如图6所示，实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05，**代表P<0.01。

3.3FGF19扩增对食管癌细胞周期的影响

接下来检测了FGF19扩增对食管癌细胞的细胞周期的影响，以及安罗替尼(5μM)、氟尿嘧啶(5μg/ml)药物处理对食管癌细胞周期的影响。结果发现FGF19扩增组(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)和对照组(KYSE-410CON/KYSE-510CON)的细胞周期无显著差异，但不同药物处理导致食管癌细胞阻滞于不同的细胞分裂期，氟尿嘧啶处理细胞后，细胞周期主要阻滞在S期，而安罗替尼处理细胞后，食管癌细胞周期主要阻滞在G2/M期。结果如图7所示。这些实验结果表明，虽然FGF19扩增并不显著影响细胞周期分布，但氟尿嘧啶和安罗替尼对细胞周期的影响是显著的。

3.4体外验证FGF19扩增降低食管癌细胞的氟尿嘧啶化疗敏感性

通过前面的关于FGF19扩增对食管癌细胞侵袭、迁移、细胞周期、细胞凋亡等生物学特性的影响的实验结果，我们发现：对照组食管癌细胞对氟尿嘧啶敏感，使用氟尿嘧啶能显著抑制对照组食管癌细胞的侵袭功能；FGF19扩增促进了食管癌细胞的侵袭迁移，然而使用氟尿嘧啶无显著抑制作用，而安罗替尼或安罗替尼联合氟尿嘧啶能显著抑制FGF19扩增食管癌细胞的侵袭和迁移。这提示我们：FGF19扩增导致食管癌细胞恶性生物学行为增强，这一增强同时使食管癌细胞对化疗剂氟尿嘧啶的敏感度降低，而安罗替尼或安罗替尼联合氟尿嘧啶能阻止这一过程。

结合我们在临床中的研究的研究，即临床病例中4例FGF19扩增患者使用安罗替尼联合氟尿嘧啶类药物方案治疗均获得部分缓解(PR)，我们推测：FGF19扩增导致食管癌细胞氟尿嘧啶耐药，而联用安罗替尼能逆转这一过程。

为此，通过CCK8实验测定FGF19扩增对食管癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响。将对照细胞(KYSE-410CON/KYSE-510CON)和FGF19扩增食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)分别以1000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后，分别加入不同浓度的氟尿嘧啶(0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/ml)和安罗替尼(KYSE-410FGF19^AM 3μM，KYSE-510FGF19^AM 1μM)，单独或联合处理120小时。然后，每孔加入10μl CCK8试剂(Dojindo)，在37℃孵育2小时后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度。

实验结果与我们的推测相符合：相比于对照组(KYSE-410CON/KYSE-510CON)，FGF19扩增食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)对氟尿嘧啶的化疗敏感性下降，而联用安罗替尼能增强FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的化疗敏感性，二者具有协同效应。结果如图8所示，实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.0001。

3.5FGF19扩增通过FGF19-FGFR4-AKT信号通路降低食管癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性

CCK8实验结果表明，对照组食管癌细胞(KYSE-410CON/KYSE-510CON)对氟尿嘧啶化疗敏感，而FGF19扩增组食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM/KYSE-510FGF19^AM)对使用氟尿嘧啶的化疗不敏感。

接下来，我们进一步探索，FGF19扩增食管癌细胞氟尿嘧啶敏感性下降的分子机制。众所周知FGF401是FGFR4的特异性抑制剂，我们使用FGF401阻断FGF19-FGFR4信号向下游的传导，结果发现当使用氟尿嘧啶联合FGF401后，FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的化疗敏感性恢复了。以上结果可以说明FGF19扩增是通过增强FGFR4信号导致了氟尿嘧啶敏感性的下降，所以使用FGF401特异阻滞FGFR4后，食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性恢复了。结果如图9所示。实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.0001；ns代表无统计学意义。

同时，我们还通过蛋白免疫印迹(Westernblot)实验及CCK8实验对FGF19-FGFR4信号的下游通路进行了探索。结合实施例2中与FGF19相关的蛋白主要富集信号通路，我们通过蛋白免疫印迹，对AKT和MAPK、STAT3、Wnt信号通路进行了验证。蛋白免疫印迹所使用抗体包括p-AKT(Cell Signaling Technology,#4060,1:1000稀释)、AKT(Cell SignalingTechnology,#9272,1:1000稀释)、p-ERK1/2(Cell Signaling Technology,#4370,1:1000稀释)、ERK1/2(Cell Signaling Technology,#9102,1:1000稀释)、p-STAT3(CellSignaling Technology,#9145,1:1000稀释)、STAT3(Cell Signaling Technology,#9139,1:1000稀释)，以及β-actin(Cell Signaling Technology,#4970,1:5000稀释)作为内参抗体。

结果显示：单独使用氟尿嘧啶或联合应用安罗替尼处理后，p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3表达量并没有显著改变，如图10A所示；但是使用Wnt通路抑制剂LGK974处理食管癌细胞后，FGF19扩增食管癌细胞的抑制效率显著强于对照组，如图10B所示，并且，LGK974能增强FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性，氟尿嘧啶联合LGK974或安罗替尼处理FGF19扩增食管癌细胞，对细胞增殖的抑制无显著差异。结果如图10C所示。图10B和10C的实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；ns代表无统计学意义。

3.6体内验证FGF19扩增对食管癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

接下来，我们通过裸鼠皮下移植瘤模型体内验证FGF19扩增对食管癌氟尿嘧啶化疗敏感性的影响。选择3-4周龄的雌性BALB/c裸鼠(购自广东省广州市南方医科大学动物实验中心，并饲养于南方医院动物实验中心SPF级环境中)，共60只，将KYSE-410CON和KYSE-410FGF19^AM细胞分别接种于裸鼠背部皮下，每只裸鼠接种5×10⁵个细胞。接种后等待肿瘤体积达到约150-250mm³时开始药物处理。裸鼠随机分为四组(每组10只)：对照组、氟尿嘧啶处理组(50mg/kg，腹腔注射，每周两次，共2周)、安罗替尼处理组(0.3mg/kg，灌胃，每日一次，共14天)及氟尿嘧啶联合安罗替尼处理组(剂量同前)。处理结束后，处死裸鼠，取出皮下瘤进行尺寸测量。

结果发现FGF19扩增食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM)皮下瘤对氟尿嘧啶(50mg/kg/w×2w)的敏感性不如对照组食管癌细胞(KYSE-410CON)皮下移植瘤，但是联合安罗替尼(0.3mg/kg/d×14d)处理后，FGF19扩增食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性显著增强，具有药物协同作用，与我们的体外实验结果一致，如图11所示。实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；**代表P<0.01；ns代表无统计学意义。

药物处理完成后，处死裸鼠，取出皮下瘤进一步进行免疫组化染色，免疫组化所使用抗体包括Ki67抗体(Cell Signaling Technology,#9027,1:200稀释)、CD31抗体(Abcam,ab28364,1:100稀释)及TUNEL试剂盒(Roche,#11684795910)。

免疫组化结果显示：对照组食管癌细胞(KYSE-410CON)移植瘤经氟尿嘧啶处理后，Ki67阳性率显著下降；而FGF19扩增组食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM)移植瘤使用氟尿嘧啶或安罗替尼处理后，Ki67阳性率无显著降低，但安罗替尼联合氟尿嘧啶处理后FGF19扩增组食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM)移植瘤Ki67阳性率显著降低了。CD31染色提示移植瘤肿瘤组织中肿瘤血管阳性，对照组和扩增组使用氟尿嘧啶处理后，CD31染色无显著变化；FGF19扩增组食管癌细胞使用安罗替尼联合氟尿嘧啶处理后，FGF19扩增组食管癌细胞(KYSE-410FGF19^AM)移植瘤CD31染色显著减少。TUNEL染色显示各组差异不大，但FGF19扩增组食管癌细胞使用氟尿嘧啶联合安罗替尼处理后，TUNEL染色阳性率显著升高。

以上结果表明：氟尿嘧啶能显著抑制对照组食管癌细胞的增殖，而氟尿嘧啶对FGF19扩增组食管癌细胞的增殖抑制不显著，但是氟尿嘧啶联合应用安罗替尼后不仅能显著抑制FGF19扩增组食管癌细胞的增殖，还能抑制血管形成及促进凋亡。这些结果证明：FGF19扩增显著抑制食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性，安罗替尼能显著增强氟尿嘧啶对FGF19扩增食管癌细胞的敏感性，二者联用具有协同效应。结果如图12所示。实验比较结果基于t检验进行显著性统计，所有P均为双侧检验，P<0.05被视为具有统计学意义。*代表P<0.05；ns代表无统计学意义。

3.7结论

我们通过功能实验了解FGF19扩增对食管癌细胞恶性生物学特征的影响。结果证明了FGF19基因扩增促进了食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，降低了食管癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。

本部分研究表明了FGF19扩增降低食管癌细胞对氟尿嘧啶的化疗敏感性。进一步，这种对氟尿嘧啶的化疗敏感性的降低能够通过安罗替尼逆转。

根据本公开内容，可以在不进行过多实验的情况下制备和实施本文公开和要求保护的所有用途、产品和方法。本领域技术人员可以根据实践需求，对本发明所公开的技术方案和内容进行修改和变化，但这些修改和变化不背离本公开内容的概念、精神和范围。所有这样的修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的，在本申请权利要求所限定的保护范围内。

Claims

1.用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的试剂盒中的用途，其中与对照相比，FGF19基因的表达水平升高和/或拷贝数扩增指示所述食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性降低。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂包括与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂，或与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为抗FGF19的抗体。

4.根据权利要求2所述的用途，其中所述与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质为探针或寡核苷酸引物。

5.一种用于评价和/或预测食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述用于检测FGF19基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂包括与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂，或与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述与FGF19基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为抗FGF19的抗体。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述与FGF19基因或其mRNA杂交或扩增FGF19基因或其mRNA的物质为寡核苷酸引物或探针。

9.安罗替尼在制备用于提高FGF19基因扩增的食管癌细胞或患有食管癌的患者对氟尿嘧啶化疗的敏感性的药物中的用途。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的用途或根据权利要求5-8中任一项所述的试剂盒或根据权利要求9所述的用途，其中所述食管癌为食管鳞癌或食管腺癌。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的用途或根据权利要求5-8中任一项所述的试剂盒或根据权利要求9所述的用途，其中所述食管癌选自复发性食管癌、转移性食管癌、复发转移性食管癌和晚期转移性食管。