CN118879707A - 一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5及其应用 - Google Patents
一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种白菜花发育相关基因模块N‑miR172‑BraNPY5及其应用，白菜N‑miR172的前体序列如SEQ ID No.1所示，其靶基因BraNPY5序列如SEQ ID No.2所示。通过农杆菌浸花转化法将miRNA过表达载体与STTM抑制表达载体转化至Col‑型拟南芥中，得到异源表达拟南芥株系，结果发现N‑miR172的抑制表达会导致拟南芥幼叶发育迟缓、开花延迟、花粉活力下降，而3倍过表达N‑miR172会导致拟南芥发育不良、植株矮小、种子萌发活力下降。这表明白菜N‑miR172在花器官发育和营养生长向生殖生长转变方面发挥重要作用，可将该基因模块应用于白菜类及其他园艺植物育种。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5与其编码蛋白在植物育种过程中的应用技术领域，尤其涉及一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5及其应用。
背景技术
白菜（Brassica rapaL. syn.B. campestrisL.）属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）植物，是起源于我国并在全球各国广泛栽培的世界性蔬菜，食用部位多样，包括叶球、莲座叶、幼叶、花茎、薹叶等，可炒食、煮汤及脱水加工，风味独特，营养价值高，备受人们喜爱。白菜杂种优势明显，通常采用细胞质雄性不育系（CMS）制种，但实际生产中细胞质雄性不育株经常会出现开花习性差、花蕾畸形、花器官发育不全等问题，显著影响制种产量、质量和效率。
miRNA是生物中的一类内源性非编码小RNA，长度为20~24 nt，本身不能翻译为蛋白质行使功能，但能够与一类mRNA结合，通过切割以及抑制翻译在转录后水平负调控基因的表达。许多研究表明，miRNA广泛参与细胞的增殖、分化以及凋亡过程，在植物的生长发育、新陈代谢、生物与非生物胁迫的响应等多种生物学过程中发挥着重要作用。近年来，大量研究表明，许多miRNA通过不同途径调控花发育相关基因通路，参与花发育过程。miR156在植物从营养生长转向生殖生长过程中发挥重要作用，过表达miR156会导致拟南芥、烟草和杨树营养生长时间延长，开花延迟。miR319家族同样在植物花发育过程中扮演着重要角色，主要调控植物花器官发育。研究表明，miR319a能控制花器官的大小和形状，当miR319a发生突变时，会导致花瓣和雄蕊变短。因此，进一步阐明miRNA对白菜花发育的分子调控机制具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中育种资源不足的问题，提供一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供了一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5，所述N-miR172及其靶基因BraNPY5具有：
（1）SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
（2）SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸；或
（3）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5的生物材料，所述生物材料为表达载体，表达盒，宿主细胞或工程菌。
本发明提供了上述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5在植物体内的靶向关系验证。
本发明提供了上述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或其相应的生物材料在调控植物花发育功能中的应用。
本发明提供了上述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或其相应的生物材料在调控植物营养生长向生殖生长转变过程中的应用。
本发明提供了上述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或其相应的生物材料在制备转基因植物中的应用。
本发明提供了上述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或其相应的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
进一步地，所述应用具体为：
通过上调表达白菜的N-miR172使植株发育迟缓，植株矮小，抑制表达白菜的N-miR172使植物开花延迟且花粉活力下降。
本发明提供的白菜N-miR172前体序列如SEQ ID No.1所示，其靶基因BraNPY5序列如SEQ ID No.2所示，通过烟草瞬时表达实验验证N-miR172和BraNPY5在植物体内靶向结合。分别构建N-miR172的过表达载体和STTM抑制表达载体，通过农杆菌介导法转入拟南芥中，获得白菜N-miR172过表达和抑制表达的转基因拟南芥株系，结果发现，3倍表达N-miR172的转基因拟南芥生长迟缓、发育受阻，抑制表达N-miR172的植株出现幼叶发育异常、开花延迟与花粉活力显著降低，这表明了白菜N-miR172可能参与调控白菜的花器官发育过程，对植株的生殖生长有重要影响，具有良好的应用前景。
本发明的有益效果为，本发明提供了白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5功能和表达分析，有利于白菜花的育种，白菜N-miR172在花器官发育和营养生长向生殖生长转变方面发挥重要作用，可将该基因模块应用于白菜类蔬菜及其他园艺植物育种，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为N-miR172前体片段和BraNPY5 CDS片段扩增的电泳图；其中，图1中的（A）为N-miR172前体片段的电泳图，图1中的（B）为BraNPY5 CDS片段的电泳图；
图2为烟草瞬时表达验证N-miR172 靶定BraNPY5（标尺为100 μm）的结合位点、荧光蛋白以及相对荧光含量分析图；其中，图2中的（A）为3个载体SK-N-miR172、SK和pFGC-BraNPY5-target的示意图以及miRNA与靶基因的结合位点图，图2中的（B）为SK-N-miR172和空载分别与pFGC-BraNPY5-target菌液共转染烟草后的荧光蛋白图，图2中的（C）为N-miR172 靶定BraNPY5的相对荧光含量分析图；
图3为白菜各器官中N-miR172与靶基因BraNPY5 相对表达量分析示意图；
图4为转基因植株PCR检测结果图；其中，图4中的（A）为抑制表达株系PCR检测结果图，图4中的（B）为过表达株系PCR检测结果图；
图5为转基因拟南芥的qRT-PCR分析结果图；其中，图5中的（A）为6个过表达阳性苗的N-miR172与AtNPY5相对表达量结果图，图5中的（B）为5个抑制表达阳性苗的N-miR172与AtNPY5相对表达量结果图；
图6为转基因拟南芥10天幼苗表型示意图（标尺为2 mm）；
图7为生长24 天转基因拟南芥抽薹情况示意图（标尺为2 mm）；
图8为过表达与抑制表达N-miR172拟南芥花粉活力示意图；
图9为过表达与抑制表达N-miR172拟南芥植株；其中，图9中的（A）为拟南芥植株表型（标尺为2 cm），图9中的（B）为OE-N-miR172-6株系N-miR172相对表达量；
图10为播种7 天的拟南芥幼苗（标尺为1 cm）；其中，图10中的（A）为Col-0拟南芥图，图10中的（B）为OE-N-miR172-5株系图，图10中的（C）为STTM-N-172-1株系图，图10中的（D）为OE-N-miR172-6株系图；
图11为BraNPY5亚细胞定位结果图（标尺为100 μm）；
图12为BraNPY5启动子与GUS融合表达载体转化拟南芥阳性植株的组织化学染色结果图；其中，图12中的（A）为萼片的化学染色结果图，图12中的（B）为花瓣的化学染色结果图，图12中的（C）为雄蕊的化学染色结果图，图12中的（D）为雌蕊的化学染色结果图，图12中的（E）为开放的花的化学染色结果图，图12中的（F）为根的化学染色结果图，图12中的（G）为茎的化学染色结果图，图12中的（H）为叶的化学染色结果图，图12中的（I）为角果的化学染色结果图；
图13为功能互补实验载体构建示意图；其中，图13中的（A）为pFGC1008过表达载体，图13中的（B）为STTM抑制表达载体，图13中的（C）为启动子-GUS融合表达载体，图13中的（D）为BraNPY5-eGFP融合表达载体，图13中的（E）为SK-miR172表达载体。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，实施例中未作详细描述的技术手段属于本领域专业技术人员熟知的常规技术。实施例只用于说明本发明，但不限制本发明的范围，任何本领域的技术人员在不付出创造性劳动的情况下，以本发明的实施例为基础所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种白菜花发育相关miRNA及其靶基因，该miRNA与靶基因从白菜“219-06”克隆得到，即本发明所述的白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5，其中N-miR172及其靶基因BraNPY5具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。
本发明实施例还提供了上述N-miR172及其靶基因BraNPY5在调控叶片、开花时间以及花粉活力方面的应用，下面对其进行具体描述。
实施例1：N-miR172与靶基因BraNPY5互作验证
1、植物总RNA提取与cDNA的合成：
采用Trizol法提取白菜组织总RNA，通过反转录得到基因的cDNA，具体步骤参照TOYOBO反转录试剂盒说明书。miRNA本身长度较短，通常为18~23 nt，因此需要为miRNA添加上一段茎环（stem-loop），在反转录酶的作用下，茎环反转录引物首先与miRNA的3'端结合，从而获得人为加长的miRNA第一链cDNA，具体步骤参照Vazyme miRNA专用茎环法反转录试剂盒。
2、目的基因及线性化载体的获得：
分别以白菜DNA、cDNA为模板扩增miRNA前体片段和靶基因CDS片段，根据载体酶切位点序列设计带有同源臂的扩增引物，如表1所示，扩增体系为：KOD One Master Mix 25 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA/cDNA 500 ng，ddH2O（双蒸水）补足至50 μL；扩增程序为：98℃3 min，98℃ 10 s，53℃ 5 s，68℃ 5 s，68℃ 2 min，变性到延伸共35个循环，扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像仪JS-680D（上海培清，中国）拍照，得到对应的电泳图，如图1所示，进而确定目的片段，如图1中的（A）所示，泳道2为N-miR172前体片段，如图1中的（B）所示，泳道1为BraNPY5 CDS片段。用胶回收试剂盒回收目的片段，测定浓度后置于-20℃备用。
烟草瞬时表达实验验证miRNA与靶基因互作共需要两个载体，pGreen II-002960-SK (SK) MCS用Bam H I和Xba I酶切后连接miRNA前体片段，pFGC5941-eGFP用Bam H I和Hind III酶切后连接靶基因的CDS片段。酶切体系为：质粒1000 ng，两种内切酶各1 μL，10×mix 5 μL，ddH2O补足至50 μL，37℃孵育30 min后用PCR产物回收试剂盒回收，得到线性化载体。
表1：烟草瞬时表达实验载体构建所用引物
3、同源重组法构建载体：
载体双酶切后，先用同源臂引物扩增插入片段，在片段两端加上同源臂；再利用同源重组酶连接，反应体系为：5×CEΙΙ Buffer 4 μL，ExnaseΙΙ 2 μL，片段和载体依据实际浓度添加，具体为：根据线性化载体和插入片段的碱基对数确定加入反应体系的量，其中线性化载体添加量（ng）为碱基对数×0.02，插入片段添加量（ng）为碱基对数×0.04，载体的适宜添加量为50~200 ng，插入片段的适宜添加量为10~200 ng，实际添加时超出或不足则以最高或最低添加量添加即可；最后用ddH2O补足至20 μL，置于37℃孵育30 min，孵育完成后迅速转移至冰上5 min，即可获得重组载体。
4、冻融法转化大肠杆菌：
取50 μL大肠杆菌感受态细胞于冰上化冻，加入5 μL连接产物，轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激90 s，立刻转移到冰上3~5 min；在超净工作台添加700 μL平衡至室温的无抗性LB液体培养基，37℃，200 rpm复苏1 h；5000 rpm 1 min离心收菌，在超净工作台弃去大部分上清，留100 μL左右用于重悬菌体；将菌液转移至含有相应抗生素（Kan.或Cmr.）的LB固体培养基（Kan.抗生素浓度为50 mg·L-1、Cmr.抗生素浓度为34 mg·L-1）上，用涂布器涂抹均匀，待干燥后置于37℃培养箱倒置培养12 h。
挑单克隆扩繁，将菌液37℃ 200 rpm摇2 h即可用于聚合酶链式反应（PCR）检测，检测引物如表2所示。过表达载体miRNA载体和eGFP载体的上游检验引物分别为35S-F和pFGC5941-F，下游引物为插入片段本身的下游扩增引物，检测体系为：2×Rapid TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR检测程序为98℃ 3min，98℃ 10 s，56℃ 10 s，72℃ 15 s，72℃ 2 min，变性到延伸共35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，比对目的片段长度，条带正确的菌液送测验证。测序验证后提取质粒，-20℃保存。
表2：烟草瞬时表达实验载体PCR检测所用引物
5、烟草瞬时表达实验验证N-miR172与靶基因BraNPY5互作验证：
将本氏烟草的种子用水浸泡过夜，次日播种在育苗基质中（蛭石占比较高），盖上保鲜膜并在表面扎孔以便透气，放在25℃环境下催芽。烟草出芽后，生长2~3天（d），待子叶张开后即可移苗，每天的光照设置为4000 lux，环境温度为24℃/16 h，22℃/8 h。移苗后约4周，烟草可用于瞬时表达实验。
在15~20 mL含Rif. 抗生素（50 mg·L-1）和Kan. 抗生素（50 mg·L-1）的LB液体培养基中加入50 μL经过两次活化的目的菌液，28℃ 200 rpm 培养16~20 h，用大型台式低温离心机5810R（Eppendorf，德国）5000 rpm 15 min离心收菌，用重悬液将菌体重悬，其中重悬液为10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1MES、100 μmol·L-1 乙酰丁香酮的混合液；再用紫外分光光度计UV-6100（上海凌析，中国）测定重悬液OD值，调整OD600=0.8~1.0，避光静置2~3h后注射烟草。
将适合注射的叶片做好标记，左右两侧分别注射阴性对照与实验组菌液，注射时提前将含有miRNA前体的菌液与含有靶基因结合位点载体菌液按照4:1的比例混合均匀，每组实验注射6个叶片，每个叶片注射2~3次。暗培养48 h后，用小型打孔器在注射处打均等的小圆孔，背面朝上，用axio Zoom.V16荧光显微镜（卡尔蔡司，德国）观察对照组和实验组的荧光信号强弱，其荧光蛋白图如图2中的（B）所示，从中可以观察到注射了SK-N-miR172的烟草叶片荧光信号减弱，使用ImageJ软件分析相对荧光值，如图2中的（C）所示，结果显示，与miR172过表达载体共转的烟草荧光值显著降低，表明N-miR172在植物体内能与BraNPY5靶向结合，并调控其表达，其中3个载体SK-N-miR172、SK和pFGC-BraNPY5-target以及miRNA与靶基因的结合位点如图2中的（A）所示，其中的SK-miR172表达载体如图13中的（E）所示。
6、白菜各器官中N-miR172与靶基因BraNPY5 相对表达量分析：
分别取测序样品的根、茎、叶、正常花、嵌套花和果实，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 N-miR172及其靶基因的相对表达量，其检测所用引物如表3所示。定量PCR的结果如图3所示，显示了白菜各器官中N-miR172与靶基因BraNPY5 相对表达量，由图3可知，N-miR172和在叶片中表达最高，其次是花，且嵌套花中高于正常花，而在茎、果实和根中表达较少。相对应的，靶基因与miRNA呈现了较为明显的相反的表达模式，BraNPY5达到花中20倍以上，而在叶片、茎中表达量较低，这一分析结果进一步支持了N-miR172与BraNPY5的靶向关系。
表3：嵌套花样品qRT-PCR检测所用引物
实施例2：N-miR172过表达与抑制表达载体构建
1、过表达载体的构建：
N-miR172的前体片段扩增与载体构建操作见实施例1，过表达载体为pFGC1008，如图13中的（A）所示，酶切位点为SalΙ和KpnΙ，添加同源臂引物后扩增得到目的片段，重组获得载体后进行PCR检测，上游引物为载体引物，下游引物为Pre-N-miR172-R，如表4所示。
表4：N-miR172过表达载体所用引物
2、抑制表达载体的构建：
在测序结果中检索N-miR172的成熟序列及其在茎环上的互补序列，基于此设计一段STTM序列，中间一段是48 nt固定序列，两侧有与N-miR172不完全互补的碱基序列，可以结合miRNA又不会被RISC切割。设计完成后由武汉伯远生物科技有限公司合成，将STTM片段连接在pBWA(V)HS载体上，如图13中的（B）所示，构建miR172的抑制表达载体，命名为STTM-N-172，构建引物与检测引物如表5所示。
表5：STTM-N-172抑制表达载体所用引物
实施例3：浸花法转化拟南芥及阳性植株的筛选
1、浸花法转化拟南芥：
提前一天将野生型拟南芥的果荚和已经开放的花去除，浇透水。在100 mL含Rif.（50 mg·L-1）和Cmr.（34 mg·L-1）的LB液体培养基中加入200 μL经过两次活化的目的菌液， 28℃ 200 rpm 培养16~20 h，5000 rpm 15 min离心收菌，用5%蔗糖溶液将菌株重悬至OD600=0.8，加入20 μL Silwet L-77表面活性剂，混匀后将拟南芥花蕾倒置放进菌液中1min，取出后擦干，平放在托盘内，暗培养24 h后恢复正常培养至收种。为提高转化效率，一周后再次重复转化一次。
2、阳性植株的筛选：
pFGC1008过表达载体具有潮霉素抗性标记基因，转入植株中会使植株具有潮霉素抗性。收获的T0代种子需要经过多次消毒后播在培养基上筛选，消毒和播种均在超净工作台完成，具体筛选步骤如下：
2.1、将T0代种子分装于2 ml离心管中，用ddH2O浸泡1 min。离心后用移液枪吸出上层的水和一些质量较差的种子。
2.2、用75%乙醇消毒1次，用ddH2O洗种子3次，每次1 min，此步骤重复3次，使种子充分消毒并洗去种子表面残留的酒精。
2.3、消毒后将种子均匀播撒在含有90 mg·L-1潮霉素的1/2 MS播种培养基上，25℃培养。
2.4、培养一周后观察筛选情况，具有潮霉素抗性的拟南芥能在培养基中正常直立生长，不含抗性的拟南芥会在出芽后3~4 d死亡。
2.5、将培养基内生长良好的阳性苗移栽至基质中，覆膜两天，直至幼苗适应环境再揭膜。
2.6、移苗10 d后，取正常生长的叶片提取DNA，并进行PCR检测，其结果如图4所示，有目的条带的鉴定为阳性苗。图4中的（A）为抑制表达株系PCR检测结果，其中，泳道1-5为STTM-N-172-1~5，泳道6为阳性对照，泳道7为野生型，泳道8为H2O。图4中的（B）为过表达株系PCR检测结果，其中，泳道1-6分别为OE-N-miR172-1~6，泳道7为阳性对照，泳道8为野生型，泳道9为H2O。
3、转基因拟南芥的qRT-PCR分析：
本研究已经对N-miR172与靶基因BraNPY5进行了验证，在拟南芥中存在BraNPY5的同源基因AtNPY5，经TargetFinder、psRobot和psRNATarget多个软件预测发现，AtNPY5也是N-miR172的靶基因，因此，对鉴定为阳性的转基因植株同时进行N-miR172和AtNPY5相对表达量分析，其结果如图5所示。如图5中的（A）所示，在6个过表达株系中，OE-N-miR172-4、5、6植株的N-miR172表达量相较于野生型有显著的上调，其余三个植株无显著差异。同时观察还发现，在三个上调的过表达株系中，其预测的靶基因AtNPY5表达量下调，除OE-N-miR172-4外，其余两个株系的AtNPY5表达量的下调幅度为显著或极显著。如图5中的（B）所示，在抑制表达株系中，STTM-N-172-1、2、5植株的N-miR172相对表达量显著下调了，同样的，也检测到这三个阳性植株中靶基因AtNPY5的显著上调。
实施例4：N-miR172转基因阳性植株表型观察
1、幼叶生长情况观察：
将T1代阳性拟南芥单株收种，根据T1代转基因拟南芥的N-miR172的表达量分析，选择差异较大的株系继续用含潮霉素的1/2 MS培养基筛选阳性苗，繁殖T2代观察表型。观察发现，与野生型WT相比，抑制表达载体STTM-N-172对应的抑制表达株系真叶生长缓慢，但过表达载体OE-N-miR172对应的过表达株系与野生型无显著差异，如图6所示。播种10 d后，此时野生型拟南芥已经长出2片真叶，整体形成“十”字，但抑制表达株系真叶较小，未生长完全，植株整体呈现“一”字，过表达株系拟南芥与野生型无差异。
2、开花时间统计：
持续培养并观察T2代转基因拟南芥，当生长至21 d时，野生型最先开始抽薹，在23d时，半数野生型拟南芥都开始抽薹，然而，STTM-N-172转基因株系直到24 d才出现第一株抽薹的植株，如图7所示，半数以上植株抽薹的时间相比于野生型推迟了3~4 d。分别统计野生型、过表达与抑制表达N-miR172株系的抽薹时间，结果显示，STTM-N-172转基因株系出现显著的开花延迟，如表6所示，其中的数值以平均值±标准差表示，每个样本统计了24株，每一列采用多重比较检验（p<0.05）。
表6：野生型与转基因拟南芥开花时间统计
3、花粉活力检测：
吸取30 μL亚历山大染液至载玻片上，用镊子夹取拟南芥生长旺盛的花，将花药在染液上重复蘸几下，为保证观察到足够多的花粉粒，可以摘下花药直接放入染液中，并用镊子搅拌。为保证统计结果的可靠性，每个株系至少观察3株，且统计的的花粉粒总数不低于1000粒。有活力的花粉粒在染色液中呈现紫色饱满的圆形，而活力较差的花粉粒干瘪皱缩，被染色液染成蓝色。
染色结果如图8所示，野生型与过表达N-miR172的拟南芥花粉活力较好，显微镜视野内观察到大量紫色饱满的花粉粒，但抑制表达N-miR172的拟南芥植株花粉活力显著降低，在花药内有大量蓝色没有活力的花粉粒。拍照并统计有活力的花粉粒比例，结果表明，野生型的正常花粉比例为98.72%，过表达N-miR172拟南芥的花粉活力为97.81%，而抑制表达N-miR172的拟南芥正常花粉比例仅有46.06%，如表7所示。
表7：过表达与抑制表达N-miR172拟南芥正常花粉比例（%）
4、高表达N-miR172株系表型观察：
观察T2代过表达转基因苗时发现，OE-N-miR172-6株系的6株阳性苗均出现生长不良，叶片小且多，植株矮小等表型，如图9中的（A）所示，将T2代OE-N-miR172-6株系的6株阳性苗混合取样，提取RNA并测定N-miR172的相对表达量，qRT-PCR结果显示，与野生型相比，T2代OE-N-miR172-6株系中N-miR172含量显著提高，达到了野生型的3倍，如图9中的（B）所示。将T2代转基因植株培养至收种，OE-N-miR172-6株系种子数量较少，且萌发率显著降低，如图10所示，其中，图10中的（A）为Col-0拟南芥图，图10中的（B）为OE-N-miR172-5株系图，图10中的（C）为STTM-N-172-1株系图，图10中的（D）为OE-N-miR172-6株系图。由图10所示的结果可知，高过表达N-miR172至野生型的3倍会导致拟南芥植株发育不良，植株矮化且种子活力下降。
实施例5：靶基因BraNPY5时空表达模式分析
1、亚细胞定位分析：
亚细胞定位所用载体为pFGC5941-eGFP，在实施例1中已构建完成BraNPY5蛋白的亚细胞定位载体，烟草与菌液准备与实施例1相同。选择长势良好且较为平整的烟草叶片，在叶背面远离叶脉处用针头扎孔，提前将marker与空载和对应基因菌液1:1分别混合均匀，用1 mL注射器吸取适量混合后的菌液，从伤口处注射进烟草中，黑暗环境培养48 h。用剪刀剪下针孔附近约1 cm2大小的叶片，背面朝上，用axio Zoom.V16荧光显微镜观察荧光信号分布，结果显示，BraNPY5定位在膜上，如图11所示。
2、启动子-GUS融合表达载体构建：
启动子与GUS融合表达载体用的是实验室保存的pCAMBIA1300-GUS载体，上下游使用的限制性内切酶分别是Hind ΙΙΙ和XbaI，如图13中的（C）所示，酶切1 h后用PCR产物回收试剂盒得到纯化的线性化载体。启动子的扩增以白菜DNA为模板，从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查询基因序列，选择BraNPY5基因上游约 2000 bp的序列作为目的基因的启动子，通过PlantCare数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）检测所选择启动子序列的活性。根据启动子和载体酶切位点序列设计扩增引物，同源同组后采用载体上游引物和片段下游引物作为PCR检测引物如表8所示，经测序验证后得到pBraNPY5-GUS质粒，如图13中的（D）所示。
表8：启动子-GUS融合表达载体所用引物
3、组织化学染色及观察：
将pBraNPY5-GUS质粒转化拟南芥，筛选得到阳性苗后用镊子摘取拟南芥阳性植株根、茎、叶、花、果各部位放入2 mL离心管中，加入新鲜配制的GUS染色液至完全浸没材料，37℃避光染色12 h，用75%乙醇脱色1~3 h，每小时更换一次75%乙醇，脱色完全后，分别用DVM6超景深荧光显微镜（Leica，德国）显微镜和BX53显微镜（OLYMPUS，日本）观察各部位的染色情况，其染色结果如图12所示，其中，萼片的染色结果如图12中的（A）所示，花瓣的染色结果如图12中的（B）所示，雄蕊的染色结果如图12中的（C）所示，雌蕊的染色结果如图12中的（D）所示，开放的花的染色结果如图12中的（E）所示，根的染色结果如图12中的（F）所示，茎的染色结果如图12中的（G）所示，叶的染色结果如图12中的（H）所示，角果的染色结果如图12中的（I）所示。由图12所示的颜色结果可知，BraNPY5基因的启动子在拟南芥的根、茎、叶、花、角果均能启动下游GUS基因表达，其中根的启动活性最强，根各部连同根毛均有较强的GUS表达。此外，在叶、花瓣、萼片、雄蕊的表达活性较高，茎的表达活性很低，仅基部有少量GUS信号。在雌蕊的柱头、中部和基部均有较强的启动活性，但当其发育为角果时，仅顶部与基部有启动活性。
以上所述为本发明较佳的具体实施方式，这些实施例子是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。但这些实施方式并未详细叙述所有细节，在其基础上可以进行一些改进或修改，这对任何熟悉本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在本发明基础上所作的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5，其特征在于，所述N-miR172及其靶基因BraNPY5具有：
（1）SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
（2）SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸；或
（3）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述的白菜花发育相关基因模块N-miR172-BraNPY5的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体，表达盒，宿主细胞或工程菌。
3.一种权利要求1所述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或权利要求2所述的生物材料在调控植物花发育功能中的应用。
4.一种权利要求1所述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或权利要求2所述的生物材料在调控植物营养生长向生殖生长转变过程中的应用。
5.一种权利要求1所述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。
6.一种权利要求1所述白菜N-miR172及其靶基因BraNPY5或权利要求2所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
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