CN118879643A - 表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒hvt-h9-ibd及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT‑H9‑IBD，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间和HVT065位点和HVT066位点之间分别插入目标基因1和目标基因2；或，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间和HVT087位点和HVT088位点之间分别插入目标基因1和目标基因2；所述目标基因1为带有CMV启动子和bgH终止子的HA基因，所述目标基因2为带有mCMV启动子和SV40终止子的VP2基因；分别得到重组病毒1和重组病毒2。两株表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT‑H9‑IBD在体外能够生长复制并稳定遗传，对H9N2亚型禽流感和nVarIBDV提供良好的免疫保护效果。同时，本发明还提供该重组火鸡疱疹病毒的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD及其应用。
背景技术
H9N2亚型AIV在世界范围内流行，可感染鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、野鸭、海鸟等多种禽类(Xu et al.J Virol,2007)。因此，加强对H9N2 AIV的防控，减少病毒的传播与流行，对家禽养殖业及人类公共卫生安全均具有重要的现实意义。
目前主要采用灭活疫苗免疫来防控H9亚型AIV，然而灭活疫苗只能产生体液免疫，不能有效地控制病毒的感染与排毒。饲养周期较长的蛋鸡或者种鸡群需要多次注射免疫以提高抗体水平。然而这种免疫方式给养殖人员带来巨大的工作量，而且每次免疫都会造成鸡群应激，降低生产效益。同时灭活疫苗中的佐剂成分易引发过敏或使注射部位肌肉坏死，降低生产质量。另外，过度的免疫，会使机体产生免疫疲劳现象，降低各种疫苗免疫效果。
传染性法氏囊病(IBD)是家禽中最重要的免疫抑制性家禽传染病之一，给全世界养禽业造成了巨大的经济损失。nVarIBDV导致的非典型IBD，不会引起明显的外观症状和死亡，但中枢免疫器官法氏囊被严重破坏，导致受感染鸡的免疫严重抑制，生产性能下降。在鸡群中引起了严重的免疫抑制，给养禽业带来了新的威胁。
疫苗免疫是预防和控制IBDV感染的有效手段。流行病学调查结果显示，H9N2 AIV和nVarIBDV常常并发或继发，给养殖业造成巨大经济损失，然而HVT-H9和HVT-IBD同时免疫鸡后，两者存在，免疫竞争，导致两者均不能诱导良好的免疫保护，因此亟需研发HVT-H9-IBD。该病毒是以HVT病毒为载体，插入H9N2 AIV病毒的HA基因和nVarIBDV病毒VP2基因真核表达盒，能够同时表达HA蛋白和VP2蛋白，进而产生针对H9N2 AIV和nVarIBDV的保护力。所构建的重组病毒能够作为三联疫苗的候选毒株，用于同时对H9N2 AIV、nVarIBDV和MDV的预防和控制。HVT-H9-IBD活载体疫苗能够有效避免母源抗体的干扰；免疫鸡群后，同时诱导产生细胞免疫和体液免疫；一次免疫能够产生持久免疫力，减少多次免疫对鸡群产生的应激，减少养殖人员的工作量，具有广泛的应用前景。
CN117551699A公开了一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其于火鸡疱疹病毒基因组中插入H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒、鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的表达盒和间隔序列；
具体插入位点为：火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT053和HVT054之间、火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT088基因内。
当本项目意图于其他位置或非编码区插入基因时，发现存在插入困难、基因表达效价低等问题。这说明HVT载体平台不同的插入位点对于目标基因是具有非常强的选择性的。
发明内容
本发明的目的在于提供一株表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD；该重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD在体外能够生长复制并稳定遗传，对H9N2亚型禽流感和nVarIBDV提供良好的免疫保护效果。
同时，本发明还提供该重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD的用途和疫苗。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
表达两种外源基因的表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间(95322-95323)和HVT065位点和HVT066位点之间(112072-112073)分别插入目标基因1和目标基因2；
或，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间和HVT087位点和HVT088位点之间(140055-140056)分别插入目标基因1和目标基因2；
所述目标基因1为带有CMV启动子和bgH终止子的HA基因，所述目标基因2为带有mCMV启动子和SV40终止子的VP2基因，分别得到重组病毒1和重组病毒2。
在上述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD中，HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在上述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD中，插入的HA基因所述启动子为CMV启动子，所述终止子为bgH终止子；插入的VP2基因所述启动子为mCMV启动子，所述终止子为SV40终止子。
带启动子和终止子的目标基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；带启动子和终止子的目标基因2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
同时，本发明还公开了采用如上所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD制备用于预防H9N2亚型禽流感和传染性法氏囊病新型变异株感染的疫苗的用途。
最后，本发明还公开了一种疫苗，含有如上任一所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的VP2基因的高变区产生了12个氨基酸突变，其抗原性产生了突变，通过将VP2基因表达盒插入火鸡疱疹病毒，验证了重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD具有极强的保护力；
相比于同期分离的其他IBDV的VP2基因，本发明所选择的VP2基因更容易插入到UL区的HVT087位点和HVT065位点；同时，本发明所选择的VP2基因的表达后免疫保护效果更好。
同时，本发明还针对HVT087和HVT065位点的插入效果进行了评估，得到的结论是HVT087位点的免疫保护效果更佳；
同时HVT065位点插入后会影响插入的HA基因的表达免疫保护效果，这说明本发明所选择的HVT087位点和特定的VP2基因是具有非常强的协同性的。
2.近年来H9N2亚型禽流感病毒抗原性持续变异，HA蛋白抗原表位主要位于三聚体HA蛋白头部，HA蛋白头部关键氨基酸位点的突变改变了病毒的抗原性，造成了先前疫苗免疫的病毒逃逸，先前研究将1994年至2008年的代表性H9N2毒株分为5个抗原群，A群至E群，抗原基团的分布与分离年份呈现明显的相关性，表明H9N2 AIV正在经历持续的抗原变化。但疫苗毒株更新缓慢，滞后于抗原基团的变化。最近的研究结果表明，中国的H9N2已进化出两个抗原群，HI交叉滴度差异在8至32倍之间，抗原性差异很大，可称为抗原群F群和G群。其中，G抗原群进一步变异，分化成G1、G2、G3抗原群，根据本实验室的先前研究，当前G3抗原群为中国最流行的H9N2亚型禽流感病毒亚群，插入序列应提供对当前流行毒株的良好保护。
本发明的HA基因为典型的G3抗原群的H9N2亚型禽流感病毒，属于当前市面上流行的抗原亚群，通过将HA基因转入火鸡疱疹病毒，验证了其具有极强的保护力；
3.本发明利用在先专利中已经构建的感染性克隆HVT-BAC，构建了表达出针对H9N2亚型禽流感病毒的HA蛋白和nVarIBDV的VP2蛋白，其复制能力与亲本病毒一致，且能够为H9N2亚型禽流感病毒和IBDV新型变异株提供良好免疫保护，符合疫苗候选株要求；
4.通过基于已经构建的感染性克隆HVT-BAC，确认了HA基因插入位点为HVT053位点，通过比较HVT065、HVT087位点的插入VP2基因，可以确认本发明的HA、VP2对于感染性克隆HVT-BAC的插入位点的选择具有特异性。
附图说明
图1为本发明的实施例的H9N2亚型禽流感病毒HA基因进化树；
图1A为图1的局部A的放大图；
图1B为图1的局部B的放大图；
图1C为图1的局部C的放大图；
图1D为图1的局部D的放大图；
图1E为图1的局部E的放大图；
图1F为图1的局部F的放大图；
图1G为图1的局部G的放大图；
图1H为图1的局部H的放大图；
图1I为图1的局部I的放大图；
图1J为图1的局部J的放大图；
图2A为本发明的实施例的A/chicken/chongqing/120101/2022(CQ/22)株与先前H9N2亚型禽流感病毒毒株HA蛋白氨基酸位点序列比较结果；
图2B为本发明的实施例的A/chicken/chongqing/120101/2022(CQ/22)株与先前H9N2亚型禽流感病毒毒株HA蛋白关键氨基酸位点序列比较结果；
图3为本发明的实施例的IBDV VP2基因进化树；
图4A为本发明的实施例的3株nVarIBDV与经典毒株BC6/85基因序列同源性的比较结果；
图4B为本发明的实施例的3株nVarIBDV与经典毒株BC6/85、VP2氨基酸序列的比较结果；
图5A为本发明的实施例的IBDV感染SPF鸡攻毒模型法氏囊剖检图片；
图5B为本发明的实施例的IBDV感染SPF鸡法氏囊指数(BBIX)对比的结果图；
图6A为本发明的实施例的galk筛选技术构建HVT-BAC-H9-065IBD示意图；
图6B为本发明的实施例的galk筛选技术构建HVT-BAC-H9-087IBD示意图；
图7A为本发明的实施例的CRISPR/Cas9删除HVT-BAC-H9-065IBD中BAC序列示意图；
图7B为本发明的实施例的CRISPR/Cas9删除HVT-BAC-H9-087IBD中BAC序列示意图；
图8为本发明的实施例的表达H9N2亚型禽流感HA基因和传染性法氏囊病新型变异株VP2基因的重组火鸡疱疹病毒蚀斑形态观察；
图9为本发明的实施例的重组HVT-H9-IBD病毒体外生长曲线；
图10为本发明的实施例的HVT-H9-IBD病毒HA基因和VP2基因蛋白表达IFA结果；
图11A为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD接种细胞72h后HA蛋白电泳鉴定结果图；
图11B为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD接种细胞72h后VP2蛋白电泳鉴定结果图；
图11C为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD接种细胞72h后HA蛋白电泳鉴定结果图；
图11D为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD接种细胞72h后VP2蛋白电泳鉴定结果图；
图12A为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD病毒细胞传代中HA基因遗传稳定性PCR检测结果图，其中，各代号含义为M是maker；PC是HVT-H9-065IBD病毒DNA；P5、P10、P15、P20分别是HVT-H9-065IBD在CEF细胞上传代5代、10代、15代、20代的子代病毒DNA；NC是HVT病毒DNA；
图12B为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD病毒细胞传代中VP2基因遗传稳定性PCR检测结果图，其中，各代号含义为M是maker；PC是HVT-H9-065IBD病毒DNA；P5、P10、P15、P20分别是HVT-H9-065IBD在CEF细胞上传代5代、10代、15代、20代的子代病毒DNA；NC是HVT病毒DNA；
图12C为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD病毒细胞传代中HA基因遗传稳定性PCR检测结果图，其中，各代号含义为M是maker；PC是HVT-H9-087IBD病毒DNA；P5、P10、P15、P20分别是HVT-H9-087IBD在CEF细胞上传代5代、10代、15代、20代的子代病毒DNA；NC是HVT病毒DNA；
图12D为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD病毒细胞传代中VP2基因遗传稳定性PCR检测结果图，其中，各代号含义为M是maker；PC是HVT-H9-087IBD病毒DNA；P5、P10、P15、P20分别是HVT-H9-087IBD在CEF细胞上传代5代、10代、15代、20代的子代病毒DNA；NC是HVT病毒DNA；
图13A为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD病毒细胞传代病毒HA蛋白检测结果图，HVT泳道为阴性对照；CQ/22泳道为阳性对照；P5、P10、P15、P20分别代表病毒传代第5、10、15、20代感染CEF后的细胞裂解液；
图13B为本发明的实施例的HVT-H9-065IBD病毒细胞传代病毒VP2蛋白检测结果图，HVT泳道为阴性对照；WD/22泳道为阳性对照；P5、P10、P15、P20分别代表病毒传代第5、10、15、20代感染CEF后的细胞裂解液；
图13C为本发明的实施例的HVT-H9-087BD病毒细胞传代病毒HA蛋白检测结果图，HVT泳道为阴性对照；CQ/22泳道为阳性对照；P5、P10、P15、P20分别代表病毒传代第5、10、15、20代感染CEF后的细胞裂解液；
图13D为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD病毒细胞传代病毒VP2蛋白检测结果图，HVT泳道为阴性对照；WD/22泳道为阳性对照；P5、P10、P15、P20分别代表病毒传代第5、10、15、20代感染CEF后的细胞裂解液；
图14为本发明的实施例的HVT-H9、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD、HVT免疫后14日、21日、28日、35日血清免疫诱导的HI抗体水平；
图15为本发明的实施例的HVT-H9、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD、HVT免疫后攻毒H9N2亚型禽流感后保护率比较的结果图；
图16A为本发明的实施例的HVT-065IBD、HVT-087IBD、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD、HVT免疫后攻毒传染性法氏囊病同源病毒WD/22的法氏囊指数图；
图16B为本发明的实施例的HVT-065IBD、HVT-087IBD、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD、HVT免疫后攻毒传染性法氏囊病同源病毒WD/22的保护率比较结果图；
图17A为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD、HVT-H9-087IBD/HB、HVT-H9-087IBD/XT、HVT免疫后攻毒传染性法氏囊病检验用强毒BC6/85株的法氏囊指数图；
图17B为本发明的实施例的HVT-H9-087IBD、HVT-H9-087IBD/HB、HVT-H9-087IBD/XT、HVT免疫后攻毒传染性法氏囊病检验用强毒BC6/85株的保护率比较结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂与耗材
商业购买：见表1；
自配试剂：
0.2mg/mL生物素：将10mg的生物素溶于50mL ddH2O中，待完全溶解后，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
10mg/mL L-亮氨酸：称取500mg L-亮氨酸溶于50mL ddH2O，完全溶解后用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
1M/L MgSO4：称取12.3g MgSO4·7H2O溶于50mL ddH2O，完全溶解后用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
20％半乳糖：称取20g半乳糖溶于100mL ddH2O中，完全溶解后高压灭菌，置于4℃保存备用。
20％2-脱氧-半乳糖(DOG)：称取20g DOG溶于100mL ddH2O中，完全溶解后高压灭菌，置于4℃保存备用。
M9盐水：称取15.13g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、1g NH4Cl和0.5g NaCl溶于800mLddH2O中，充分搅拌溶解后加ddH2O将溶液定容至1L，高压灭菌后置于4℃保存备用。
5×M63培养液：称取10g(NH4)2SO4、68g KH2PO4和2.5mg FeSO4·7H2O，溶于800mLddH2O中，充分搅拌溶解后，用KOH调节至pH＝7.0，定容至1L，高压灭菌。
半乳糖筛选培养板：称取15g琼脂溶于800mL ddH2O，完全溶解后，121℃高压灭菌20min。取出后，加入200mL高压灭菌的5×M63培养液和1mL MgSO4·7H2O，并用无菌ddH2O调整体积到1L。温度降到50℃左右时，加入5mL 0.2mg/mL生物素、4.5mL 10mg/mL的L-亮氨酸、10mL 20％半乳糖和500μL 50mg/mL氯霉素。充分混匀后，倒平板。
DOG培养板：称取15g琼脂溶于800mL ddH2O，完全溶解后，121℃高压灭菌20min。取出后，加入200mL高压灭菌的5×M63培养液和1mL MgSO4·7H2O，用无菌ddH2O调整体积到1L。温度降到50℃左右时，加入5mL 0.2mg/mL生物素、4.5mL 10mg/mL L-亮氨酸、4.5mL 10mg/mL L-异亮氨酸、4.5mL 10mg/mL L-缬氨酸、10mL 20％ DOG、10mL20％甘油和500μL 50mg/mL氯霉素。充分混匀后，倒平板。
含有半乳糖的麦康凯平板：取麦康凯培养基40g溶于1L ddH2O中，煮沸1min，加入10mL 20％半乳糖，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃左右时，加入氯霉素至终浓度为30μg/mL，并倒平板。
洗涤液：取2000mL PBS溶液，加入1mL Tween-20，混匀后室温保存。
封闭液：5g脱脂奶粉溶解到100mL洗涤液中。
终止液：量取浓硫酸30mL加入到240mL蒸馏水中，配制2mol/L稀硫酸。
实验室保存物品：Fiber2包被抗原，LMH细胞，HVT-BAC感染性克隆，SW102菌株，pDC315载体，pcDNA3.1+载体，peGFP-galK质粒由实验室保存。
试验动物：SPF鸡和鸡胚均购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。
表1试剂或耗材
表2序列信息表
所有引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
第一部分H9N2亚型禽流感病毒的分离及HA基因同源性分析
1.1H9N2亚型禽流感病毒的分离
2022年从重庆采集样品中分离到1株H9N2亚型禽流感病毒。提取病毒RNA，经反转录后，使用HA开放阅读框引物H9-F/R(表1)扩增后，获得H9基因序列，对分离到的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行遗传演化分析显示(图1)，分离到的H9N2亚型禽流感病毒属于当前流行的G3抗原群，命名为A/chicken/chongqing/120101/2022(CQ/22)株。
1.2不同毒株的HA蛋白氨基酸同源性分析
经氨基酸同源性分析发现，分离的CQ/22株基因序列与先前流行的H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白抗原性发生了较大的变化(图2A，图2B)，尤其是在关键氨基酸同源性上的差异可能导致抗原性发生了较大的变化。
1.3CQ/22株种毒制备
筛选A/chicken/chongqing/120101/2022(CQ/22)株作为候选株进行进一步研究。将分离的CQ/22病毒接种9～11日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，作为种毒。
第二部分nVarIBDV的分离及VP2基因同源性比较
2.1nVarIBDV的分离
2020-2022年从山东、河北等地采集样品中分离到3株IBDV毒株。提取病毒RNA，经过反转录后，使用VP2开放阅读框引物VP2-F/R(表1)扩增后，获得VP2基因序列，对分离到的IBDV毒株的VP2基因进行遗传演化分析显示，分离到的3株IBDV均为nVarIBDV，分别命名为HB/1208/2020、XT/1203/2021和WD/0106/2022(图3)。
2.2不同毒株的VP2基因同源性分析
经同源性分析发现，分离的3株nVarIBDV基因序列均已与经典毒株BC6/85发生了较大的变化(图4A)，并且VP2高变区产生了12个氨基酸突变(图4B)，抗原性可能发生了较大的变化。
2.3nVarIBDV动物感染模型建立和种毒制备
通过将三株nVarIBDV接种鸡胚后，增殖病毒，然而这三株病毒在鸡胚上复制能力差，经过传代后，无法获得病毒。最后将分离的3株nVarIBDV接种于3周龄SPF鸡体内，接种后第5天采集攻毒鸡法氏囊，研磨后收集研磨组织上清作为nVarIBDV种毒。
选择上述三株IBDV病毒作为进一步研究。HB/1208/2020、XT/1203/2021的VP2基因分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
接下来，分别以CQ/22的HA基因和WD/22株的VP2基因为例构建重组病毒，其余重组病毒参考该方法进行制备即可。
第三部分nVarIBDV定量及动物攻毒模型建立
由于nVarIBDV在鸡胚上复制能力有限，选择使用SPF鸡对nVarIBDV病毒进行定量。将收获的WD株法氏囊研磨液进行10倍系列稀释，每个稀释度接种5只SPF鸡，通过统计接种鸡体重和法氏囊重，计算囊重比，并最终计算法氏囊指数(BBIX，BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡平均囊重比)，以BBIX＜0.7作为感染发病，经过定量，本次增殖的WD病毒含量为1×104BID50。
为了评价疫苗的免疫保护效果，构建nVarIBDV感染SPF鸡动物模型来应用于对疫苗的评价。
选取WD/0106/2022和BC6/85作为IBDV感染动物模型攻毒毒株，根据我国IBDV疫苗免疫效果评价材料确定攻毒剂量为30BID50/羽，成功构建IBDV感染模型，相较于空白对照组鸡感染鸡的法氏囊均产生显著的萎缩(图5A)，并且感染鸡BBIX指数低于0.7(图5B)。
第四部分HVT-H9-IBD重组病毒的构建及鉴定
利用细菌人工染色体(BAC)技术，构建了火鸡疱疹病毒(HVT)的感染性克隆HVT-BAC，并利用galk筛选技术和CRISPR/Cas9技术构建了表达禽流感病毒HA基因的HVT-H9。随后，为了构建表达H9N2 AIV HA基因和传染性法氏囊病毒VP2基因的HVT-H9-IBD病毒，使用galk筛选技术，借助SW102基因工程菌，以构建的HVT-BAC-H9感染性克隆，分两步将VP2真核表达盒插入到HVT-BAC-H9感染性克隆中。对感染性克隆HVT-BAC的构建方法，本发明人于在先申请的专利CN109402071A一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒中已经作了详细描述，详见109-113段，故本申请不再展开。
简要来说，在SW102细菌中利用galk筛选技术，将含有CMV启动子和bgH终止子的H9真核表达盒插入到HVT-BAC感染性克隆中构建HVT-BAC-H9感染性克隆；随后将含有mCMV启动子和SV40终止子的VP2真核表达盒插入到HVT-BAC-H9感染性克隆中构建HVT-BAC-H9-VP2感染性克隆；进一步利用CRISPR/Cas9诱导的同源重组技术，在提供与HVT一致的外源供体基因donor的情况下，用donor基因替换BAC序列，从而获得仅插入HA和VP2基因真核表达盒的HVT-H9-IBD重组病毒，由于重组后的病毒HVT-H9-IBD不含有GFP绿色荧光蛋白，因此，可以通过筛选不含有绿色荧光的蚀斑而成功筛选HVT-H9-IBD。
4.1重组HVT-BAC-H9感染性克隆构建
为了构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因的HVT病毒，本实施例使用galk半乳糖激酶筛选技术，借助SW102基因工程菌，分两步将HA真核表达盒插入到HVT-BAC感染性克隆中。
具体步骤如下：
第一步，以peGFP-galk为模板，用含有50bp同源臂的引物homo-053galk-F/R(表1)扩增，并将PCR产物纯化后电转进含有HVT-BAC的SW102感受态中，进行重组并在半乳糖培养基中筛选含有HVT-BAC-053galk克隆的SW102菌。
本步骤中SW102基因工程菌和peGFP-galk记载于如下文献中：Warming S，Costantino N，Court D L，Jenkins N A，and Copeland N G.Simple and highlyefficient BACrecombineering using galK selection.2005；33：e36-e36.
第二步，以pcDNA-H9质粒为模板，用含有50bp同源臂的引物homo-053H9-F/R(表1)扩增，将PCR产物纯化后电转化到含有HVT-BAC-053galk的SW102感受态中，重组后在含有2-脱氧-半乳糖(DOG，含量2‰)的基础培养基中筛选，获得含有HVT-BAC-H9的SW102克隆。
galk筛选技术构建HVT-BAC-H9示意图如图6A、图6B所示。
具体操作如下：
4.1.1HVT-BAC-053galk感染性克隆制备:
步骤1：取500μl含有HVT-BAC载体的SW102菌液加入到10ml LBCm+完全培养基中过夜筛选培养，次日在含有阻挡物的250ml锥形培养瓶中，取5ml过夜培养菌液加入到150mlLBCm+完全培养基中，32℃水浴摇床培养至OD600值到0.55-0.6，得到培养液。
步骤2：然后将培养液放到42℃水浴摇床中热击诱导15分钟，得到菌液。
步骤3：将诱导的菌液放在冰水混合物中冷却，并转移到两个50ml离心管中，5000rpm，4℃离心5min。按照常规方法制备电转化感受态。
步骤4：以peGFP-galk为模板，采用homo-053galk-F(含有50bp同源臂)和homo-053galk-R(含有50bp同源臂)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1296bp的DNA片段，纯化，得到homo-053galk-F/R PCR产物。
步骤5：将纯化后的homo-053galk-F/R PCR产物与电转化感受态混匀并进行电转化，程序为0.1cm电击杯，参数为25μF、1.75kV、200Ω。
步骤6：电转化后，用450μl SOC重悬，32℃摇床中复壮细菌1-2h后10000rpm离心1min，使用1×M9盐水清洗菌两次，并涂布含有半乳糖的在基础培养基平板中，培养3-4天。
步骤7：使用含有2‰的半乳糖的麦康凯平板筛选纯化获得的含有HVT-BAC-053galk感染性克隆的SW102菌(类似方法可参考CN109402071A一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒，说明书128-133段)。
4.1.2HVT-BAC-H9感染性克隆制备:
首先使用引物H9-F/R(表1)，扩增H9开放阅读框(ORF)，并使用KpnI和BamHI酶切后连接到pcDNA3.1+中，构建H9真核表达载体pcDNA-H9。
为了获得HVT-BAC-H9感染性克隆，按照galk筛选第二步操作，进行电转化和重组。具体步骤如下：
步骤1：500μl含有HVT-BAC-053galk的SW102菌液加入到10ml LBCm+完全培养基中过夜培养，次日在含有阻挡物的50ml锥形培养瓶中，取5ml过夜培养菌液加入到150ml LBCm+完全培养基中，32℃水浴摇床培养至OD600值到0.5-0.6，得到菌液。
步骤2：然后转移菌液到42℃的水浴摇床中热击15分钟，进行诱导。
步骤3：将诱导的菌液放在冰水混合物中冷却，并转移到两个50ml离心管中，5000rpm，4℃离心5min，按照常规方法制备电转化感受态。
步骤4：用pcDNA-H9质粒为模板，homo 053H9-F/R引物对进行PCR扩增，得到约2834bp的DNA片段，纯化，得到homo H9 F/R扩增产物。
步骤5：将纯化后的homo H9 F/R扩增产物与电转化感受态混合后，使用0.1cm击杯中，参数为25μF、1.75KV、200Ω进行电转化。
步骤6：电转化后，用450μl SOC重悬，32℃摇床中复壮细菌1-2h后10000rpm离心1min，使用1×M9盐水清洗2次，涂布含有脱氧半乳糖(DOG)的基础培养基平板中，培养4天。最终获得含有HVT-BAC-H9的SW102细菌。
步骤7：提取含有重组质粒HVT-BAC-H9的SW102菌的质粒，得到重组质粒HVT-BAC-H9。
4.2重组HVT-BAC-H9-IBD感染性克隆构建
为了构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因和传染性法氏囊病毒VP2基因的HVT-H9-IBD病毒的HVT病毒，本实施例使用galk半乳糖激酶筛选技术，借助SW102基因工程菌，分两步将VP2真核表达盒插入到HVT-BAC-H9-IBD感染性克隆中。
具体步骤如下：
第一步，以peGFP-galk为模板，用含有50bp同源臂的引物homo-065galk-F/R(或homo-087galk-F/R)(表1)扩增，并将PCR产物纯化后电转进含有HVT-BAC的SW102感受态中，进行重组并在半乳糖培养基中筛选含有HVT-BAC-H9-065galk(或HVT-BAC-H9-087galk)克隆的SW102菌。
本步骤中SW102基因工程菌和peGFP-galk记载于如下文献中：Warming S，Costantino N，Court D L，Jenkins N A，and Copeland N G.Simple and highlyefficient BACrecombineering using galK selection.2005；33：e36-e36.
第二步，以pcDNA-H9质粒为模板，用含有50bp同源臂的引物homo-065VP2-F/R(或homo-087VP2-F/R)(表1)扩增，将PCR产物纯化后电转化到含有HVT-BAC-H9-065galk(或HVT-BAC-H9-087galk)的SW102感受态中，重组后在含有2-脱氧-半乳糖(DOG，含量2‰)的基础培养基中筛选，获得含有HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)的SW102克隆。
galK筛选技术构建HVT-BAC-H9示意图如图6A、图6B所示。
具体操作如下：
4.2.1HVT-BAC-H9-065galk(或HVT-BAC-H9-087galk)感染性克隆制备:
步骤1：取500μl含有HVT-BAC-H9载体的SW102菌液加入到10ml LBCm+完全培养基中过夜筛选培养，次日在含有阻挡物的250ml锥形培养瓶中，取5ml过夜培养菌液加入到150ml LBCm+完全培养基中，32℃水浴摇床培养至OD600值到0.55-0.6，得到培养液。
步骤2：然后将培养液放到42℃水浴摇床中热击诱导15分钟，得到菌液。
步骤3：将诱导的菌液放在冰水混合物中冷却，并转移到两个50ml离心管中，5000rpm，4℃离心5min。按照常规方法制备电转化感受态。
步骤4：以peGFP-galk为模板，采用homo-065galk-F(或homo-087galk-F)(含有50bp同源臂)和homo-065galk-R(或homo-087galk-R)(含有50bp同源臂)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1296bp的DNA片段，纯化，得到homo-065galk-F/R(或homo-087galk-F/R)PCR产物。
步骤5：将纯化后的homo-065galk-F/R(或homo-087galk-F/R)PCR产物与电转化感受态混匀并进行电转化，程序为0.1cm电击杯，参数为25μF、1.75kV、200Ω。
步骤6：电转化后，用450μl SOC重悬，32℃摇床中复壮细菌1-2h后10000rpm离心1min，使用1×M9盐水清洗菌两次，并涂布含有半乳糖的在基础培养基平板中，培养3-4天。
步骤7：使用含有2‰的半乳糖的麦康凯平板筛选纯化获得的含有HVT-BAC-H9-065galk(或HVT-BAC-H9-087galk)感染性克隆的SW102菌(类似方法可参考CN109402071A一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒，说明书128-133段)。
4.2.2HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)感染性克隆制备:
首先使用引物VP2-F/R(表1)，利用重叠PCR方法，将VP2基因与pDC315载体的mCMV启动子、SV40终止子融合，制备VP2真核表达载盒，并连接至T载体中构建p-T-VP2exp。
为了获得HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)感染性克隆，按照galk筛选第二步操作，进行电转化和重组。具体步骤如下：
步骤1：500μl含有HVT-BAC-H9-065galk(或HVT-BAC-H9-087galk)的SW102菌液加入到10ml LBCm+完全培养基中过夜培养，次日在含有阻挡物的50ml锥形培养瓶中，取5ml过夜培养菌液加入到150ml LBCm+完全培养基中，32℃水浴摇床培养至OD600值到0.5-0.6，得到菌液。
步骤2：然后转移菌液到42℃的水浴摇床中热击15分钟，进行诱导。
步骤3：将诱导的菌液放在冰水混合物中冷却，并转移到两个50ml离心管中，5000rpm，4℃离心5min，按照常规方法制备电转化感受态。
步骤4：用p-T-VP2 exp质粒为模板，homo-065VP2-F/R(或homo-087VP2-F/R)引物对进行PCR扩增，得到约2224(或2110)bp的DNA片段，纯化，得到homo-065VP2-F/R(或homo-087VP2-F/R)扩增产物。
步骤5：将纯化后的homo-065VP2-F/R(或homo-087VP2-F/R)扩增产物与电转化感受态混合后，使用0.1cm击杯中，参数为25μF、1.75KV、200Ω进行电转化。
步骤6：电转化后，用450μl SOC重悬，32℃摇床中复壮细菌1-2h后10000rpm离心1min，使用1×M9盐水清洗2次，涂布含有脱氧半乳糖(DOG)的基础培养基平板中，培养4天。最终获得含有HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)的SW102细菌。
步骤7：提取含有重组质粒HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)的SW102菌的质粒，得到重组质粒HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)。
4.3重组活载体疫苗HVT-H9-065IBD(或HVT-H9-087IBD)制备
为了删除BAC序列，本实施例借助CRISPR/Cas9技术，首先设计合成sgRNA引物(sgRNA-F/R，表1)，并将sgRNA链接到pX458载体，构建含有sgRNA的CRISPR质粒pX458-sgRNA。操作步骤，本发明人于在先申请的专利CN109402071A一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒中已经作了详细描述，详见说明书138-145段。
为了完全删除BAC序列并使其与亲本病毒完全一致，本实施例提供与HVT亲本毒序列一致的donor基因(donor-F/R，表1)，利用CRISPR/Cas9切割形成的DNA双链断裂来诱导产生同源重组修复，使donor基因替换BAC序列，从而删除BAC序列，获得HVT-H9-065IBD(或HVT-H9-087IBD)病毒(图7A，图7B)。
donor基因的序列信息为：HVT(FC-126株)的基因组DNA的139462nt-141036nt，其具体的制备过程为：以HVT的基因组DNA为模板，采用donor-F和donor-R组成的引物对进行PCR扩增，得到的DNA片段(HVT(FC-126株)的基因组DNA的139462nt-141036nt)；
具体操作为，将构建好的pX458-sgRNA、HVT-BAC-H9-065IBD(或HVT-BAC-H9-087IBD)质粒与donor(以HVT的基因组DNA为模板，采用donor-F和donor-R组成的引物对进行PCR扩增，得到的DNA片段(HVT的基因组DNA的139462nt-141036nt))共转染提前长成90％密度的6孔CEF细胞，在转染后6-7天传代到新的CEF细胞中进行筛选，筛选没有绿色荧光的蚀斑，得到HVT-H9-065IBD(或HVT-H9-087IBD)病毒。
第五部分HVT-H9-IBD重组病毒蚀斑形态鉴定
将HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD病毒与HVT亲本病毒分别感染CEF细胞，在感染5天后使用倒置显微镜观察蚀斑形态(图8)。结果表明，重组病毒HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD与亲本病毒HVT蚀斑形态、大小相似。
第六部分重组病毒复制能力鉴定
制备CEF细胞，并铺6孔细胞板，次日每孔CEF细胞分别接种100PFU剂量的HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD和HVT亲本病毒；
在接种后24、48、72、96、120h分别收集3孔，并使用2倍倍比稀释法进行定量病毒，最终绘制生长曲线。
结果表明重组病毒HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD与亲本病毒HVT在体外生长复制能力没有差异(图9)，HVT-H9-087IBD略优于HVT-H9-065IBD。
第七部分HVT-H9-IBD外源基因HA和VP2表达的检测
7.1HA基因表达检测
7.1.1HA基因表达IFA检测
制备CEF细胞，接种HVT-H9-IBD病毒，感染72h后使用制备的HA蛋白鼠单克隆抗体作为一抗，并使用FITC标记的抗鼠二抗进行IFA染色。
将HVT-H9-IBD感染CEF细胞72h和正常CEF细胞72h(图10)，使用HA鼠单克隆抗体作为一抗，使用FITC标记的羊抗鼠荧光二抗进行IFA染色后，使用荧光显微镜观察，放大倍数100×。
结果表示，HVT-H9-IBD重组病毒能正确表达出HA基因。
7.1.2HA基因表达Western-blot检测
分别使用HVT-H9-IBD、CQ/22和HVT病毒感染CEF细胞，收集蛋白，使用鼠HA单克隆抗体作为一抗进行Western-blot染色。
在HVT-H9-IBD病毒感染细胞72h后，收集6孔板中蛋白，使用自制鼠单克隆抗体作为一抗进行Western-blot鉴定(图11A，图11C)，结果表明，用HVT-H9-IBD、CQ/22能够检测到62.9KD左右的HA条带，HVT病毒未检测到HA蛋白条带。
7.2VP2基因表达检测
7.2.1VP2基因表达IFA检测
制备CEF细胞，接种HVT-H9-087IBD病毒，感染72h后使用制备的VP2蛋白鼠多克隆抗体作为一抗，并使用FITC标记的抗鼠二抗进行IFA染色。
将HVT-H9-IBD感染CEF细胞72h和正常CEF细胞72h(图10)，使用VP2鼠多克隆抗体作为一抗，使用FITC标记的羊抗鼠荧光二抗进行IFA染色后，使用荧光显微镜观察，放大倍数100×。
结果表示，HVT-H9-IBD重组病毒能正确表达出VP2基因。
7.2.2VP2基因表达Western-blot检测
分别使用HVT-H9-IBD、WD/22和HVT病毒感染CEF细胞，收集蛋白，使用鼠VP2多克隆抗体作为一抗进行Western-blot染色。
在HVT-H9-IBD病毒感染细胞72h后，收集6孔板中蛋白，使用自制鼠多克隆抗体作为一抗进行Western-blot鉴定(图11B，图11D)，结果表明，用HVT-H9-IBD、WD/22能够检测到48.66KD左右的VP2条带，HVT病毒未检测到VP2蛋白条带。
第八部分HVT-H9-IBD体外遗传稳定性检测
为了检测HVT-H9-IBD病毒的遗传稳定性，本实施例将100PFU HVT-H9-IBD病毒感染CEF细胞，并在感染后1h弃掉细胞上清，使用PBS清洗2次细胞，更换含有1％ FBS的DMEM细胞维持液，培养3-4天后，消化细胞，取一定量病毒接种到新的CEF细胞上。重复此操作，连续传代20代，每5代收集病毒。对收集的病毒DNA使用H9-F/R和VP2-F/R引物(表1)进行PCR鉴定(图12A，图12B，图12C，图12D)，并对病毒HA和VP2蛋白表达使用Western-blot检测(图13A，图13B，图13C，图13D)。
结果表明HVT-H9-IBD的中HA和VP2基因能够稳定遗传。
第九部分HVT-H9-IBD重组病毒免疫保护评价
9.1H9N2部分免疫保护评价
9.1.1HI抗体水平检测
将HVT-H9、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD分别免疫1日龄SPF鸡，2000PFU/羽，同时设置HVT免疫的阴性对照。采集免疫后14日、21日、28日、35日的血液制备血清，通过血凝抑制试验检测免疫诱导的HI抗体水平(图14)。
HVT-H9的制备参考CN109402071A的方法制备HVT-H9，HVT-H9的HA基因的序列与本发明所用HA基因序列相同。
结果显示HVT-H9和HVT-H9-087IBD产生的HI抗体水平相似，HVT-H9-065IBD产生的HI抗体水平相对较低。
9.1.2H9N2禽流感同源病毒攻毒保护评价
在免疫后28日，将上述HVT-H9、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD免疫鸡各取出10只，静脉注射2×106EID50/0.2mL剂量CQ/22，同时设置HVT载体病毒为攻毒对照。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将同一只鸡的喉头和泄殖腔拭子混合为一个样品，每个样品经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2mL，37℃孵育观察96小时，无论活胚、死胚均测定鸡胚液的血凝(HA)效价。每份混合拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的胚液HA效价不低于1:16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传1次后再进行判定，两次分离均为阴性则判定为保护，任意一次分离为阳性则判定为不能保护(图15)。
结果显示HVT-H9和HVT-H9-087IBD均能保护同源病毒攻毒，攻毒后第5日保护率达到100％，HVT-H9-065IBD能部分保护同源病毒攻毒，攻毒后第5日保护率达到70％，HVT攻毒对照组的保护率为0。
9.2IBD部分免疫保护评价
9.2.1传染性法氏囊同源病毒攻毒保护评价
将HVT-065IBD、HVT-087IBD、HVT-H9-065IBD、HVT-H9-087IBD分别免疫1日龄SPF鸡，2000PFU/羽，免疫1日龄SPF鸡，2000PFU/羽。免疫后28日攻毒30BID50剂量WD/0106/2022，同时设置HVT载体病毒为攻毒对照和空白对照。
在攻毒后7天称重鸡体重，并剖检取法氏囊，称取法氏囊体重，计算法氏囊指数(BBIX)(囊重比＝(法氏囊重/体重)×1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡平均囊重比)。依据BBIX＞0.7作为保护阈值，从图16A中看HVT-IBD、HVT-H9-087IBD免疫后攻毒BBIX明显大于0.7，HVT-H9-065IBD免疫后攻毒BBIX部分大于0.7，对照组BBIX小于0.7。统计各组鸡的发病和死亡情况，从图16B中看出HVT-IBD、HVT-H9-087IBD免疫保护率达100％，HVT-H9-065IBD攻毒保护率达90％，而攻毒对照组的保护率为0％。
9.2.2传染性法氏囊强毒株攻毒保护评价
选取HB/1208/2020、XT/1203/2021的VP2基因作为替换片段，利用相同的构建策略，使用galk筛选技术和CRISPR/Cas9技术，将含有CMV启动子和bgH终止子的HA真核表达盒插入HVT-BAC-H9感染性克隆的087和088之间，分别构建HVT-H9-087IBD/HB和HVT-H9-087IBD/XT。
将HVT-H9-087IBD、HVT-H9-087IBD/HB和HVT-H9-087IBD/XT分别免疫1日龄SPF鸡，2000PFU/羽。免疫后28日攻毒30BID50剂量BC6/85检验用强毒株，同时设置HVT载体病毒为攻毒对照和空白对照。
在攻毒后7天称重鸡体重，并剖检取法氏囊，称取法氏囊体重，计算法氏囊指数(BBIX)(囊重比＝(法氏囊重/体重)×1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡平均囊重比)。依据BBIX＞0.7作为保护阈值，从图17A中看HVT-H9-087IBD、HVT-H9-087IBD/HB和HVT-H9-087IBD/XT免疫后攻毒鸡BBIX大于0.7，对照组BBIX小于0.7。统计各组鸡的发病和死亡情况，从图17B中看出HVT-H9-087IBD免疫保护率达90％，HVT-H9-087IBD/HB和HVT-H9-065IBD/XT攻毒保护率达80％和70％，而攻毒对照组的保护率为0％。
第十部分结果分析
1.通过上述实验可见，采用本发明的HA基因、VP2基因与HVT结合，能够制备出针对nVarIBDV和H9N2亚型禽流感提供良好的免疫保护效果的重组病毒。
2.本发明的VP2基因的高变区产生了12个氨基酸突变，相比于同时分离的XT株和HB株，其免疫保护效果更好；
同时：现有技术中，已有的HVT-IBD，都是针对强毒株的，并没有针对新型变异株的HVT-IBD重组疫苗，先前文献表明针对强毒株的HVT-IBD重组疫苗对当前的新型变异株保护效果不好；
IBDV新型变异株是在临床肉鸡中早期感染，是影响肉鸡生产性能的重要疾病，本发明的HVT-H9-IBD是针对肉鸡的疫苗最为有效的疫苗。
本发明的HA基因为典型的G3抗原群的H9N2亚型禽流感病毒，属于当前市面上流行的抗原亚群，通过将HA基因转入火鸡疱疹病毒，验证了其具有极强的保护力。
3.本发明惊奇的发现，即使在HVT的不同的非编码区插入相同的基因，其产生的效果也是截然不同的，如在UL区的065位点插入的基因不仅仅影响VP2基因的免疫保护效果，还影响了HA基因的免疫保护效果。
4.本发明的通过近期采集的较为流行的多株H9N2亚型禽流感病毒、nVarIBDV，并利用其HA基因和VP2基因构成重组病毒，我们发现其在免疫保护力上存在明显的区别，产生该现象的可能原因在于：1.选择合适的目标基因是存在一定的难度和偶然性；2.保护效果和插入位点具有紧密关联性。
综上所述，本发明得到的重组病毒的复制能力与亲本病毒一致，且能够为H9N2亚型禽流感病毒和IBDV新型变异株提供良好免疫保护，符合疫苗候选株要求。
Claims (5)
1.表达两种外源基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD，其特征在于，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间和HVT065位点和HVT066位点之间分别插入目标基因1和目标基因2；
或，于火鸡疱疹病毒的UL区的HVT053位点和HVT054位点之间和HVT087位点和HVT088位点之间分别插入目标基因1和目标基因2；
所述目标基因1为带有启动子和终止子的HA基因，所述目标基因2为带有启动子和终止子的VP2基因，分别得到重组病毒1和重组病毒2。
2.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD，其特征在于，HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD，其特征在于，插入的HA基因所述启动子为CMV启动子，所述终止子为bgH终止子；插入的VP2基因所述启动子为mCMV启动子，所述终止子为SV40终止子。
4.采用如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD制备用于预防H9N2亚型禽流感和传染性法氏囊病新型变异株感染的疫苗的用途。
5.一种疫苗，其特征在于，含有如权利要求1至3任一所述的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9-IBD。
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