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CN118853663A - 用于抑制marc1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途 - Google Patents

用于抑制marc1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途 Download PDF

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CN118853663A
CN118853663A CN202410514072.1A CN202410514072A CN118853663A CN 118853663 A CN118853663 A CN 118853663A CN 202410514072 A CN202410514072 A CN 202410514072A CN 118853663 A CN118853663 A CN 118853663A
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China
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ribonucleic acid
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stranded ribonucleic
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CN202410514072.1A
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翟蓓蓓
黄河
王岩
王书成
荣梅
周玲玲
林国良
产运霞
耿玉先
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Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本公开涉及用于抑制MARC1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途。具体来说，本公开涉及一种用于抑制MARC1基因表达的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药、药物组合物和用途，以及用于抑制细胞内MARC1基因表达的方法。本公开提供的双链核糖核酸，能够在细胞内结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，切割MARC1基因转录的mRNA，高效、特异地抑制MARC1基因的表达，用于治疗MARC1基因介导的疾病，在临床疾病治疗中具有重要应用前景。

Description

用于抑制MARC1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物 和用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种用于抑制MARC1基因表达的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药、药物组合物和用途，以及用于抑制细胞内MARC1基因表达的方法。
背景技术
肝病在世界范围内的死亡和残疾中占导着主要原因，慢性疾病会逐渐破坏肝细胞的再生乃至摧毁，导致肝纤维化和肝硬化。而非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattyliver disease,NAFLD)是世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻了一番，现在估计影响大约20-30％的世界人口，造成非酒精性脂肪性肝病的病理是有一系列因素构成。在一些个体中，肝脏中异位脂肪的积累，称为脂肪变性，引发炎症和肝细胞损伤，导致进一步的疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)。NASH被定义为具有细胞损伤、炎症和不同程度的疤痕或纤维化表象的脂质聚集。
线粒体偕胺肟还原成分1(mitochondrial amidoxime reducing component 1,MARC1)是一种能够还原N-羟基化化合物的含钼酶，并与线粒体外膜相关联。MARC1基因中一种常见的错义变体最近被证明可以保护肝脏免受脂肪肝和各种原因引起的肝硬化的侵袭。报道称(Luukkonen P.K.,Juuti A.,Sammalkorpi H.,et al.MARC1 variantrs2642438increases hepatic phosphatidylcholines and decreases severity ofnon-alcoholic fatty liver disease in humans.Journal of Hepatology,2020,73:696–739.)，与非携带者(n＝65)相比，MARC1变异体携带者(n＝53)具有更高的肝脏多不饱和磷脂酰胆碱浓度，然而这一点可能与NASH相关的发病因素相关。此外，研究表明通过敲除患者体内MARC1基因的表达，从而治疗患者中的高血糖症、糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗(胰岛素不敏感性)、葡萄糖耐量异常、高血糖水平、肺动脉高血压和/或由任何前述引起的病症。
综上，通过抑制患者体内MARC1基因的表达能够预防和治疗肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征。目前还没有仅针对此类基因表达的相关药物上市，因此开发靶向MARC1靶点药物具有重要的价值。本发明旨在提供siRNA组合物，该组合物有效应用于MARC1基因的RNA转录本的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的切割，从而能够选择性及有效地抑制MARC1基因的表达，实现疾病治疗的目的。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，需要开发更多MARC1抑制剂，用于治疗包括肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征等在内的MARC1相关疾病以及其他尚未鉴定的相关病症、病理或综合征。本公开旨在提供一系列用于抑制MARC1基因表达的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药及药物组合物，能够抑制MARC1基因表达，在临床疾病治疗中具有重要应用前景。
用于解决问题的方案
[1].一种双链核糖核酸，所述双链核糖核酸包括正义链和反义链，所述正义链与所述反义链反向互补和/或基本上反向互补形成所述双链核糖核酸的双链区；
其中，所述正义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的差异不超过3个核苷酸的序列A，所述反义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的反向互补序列的差异不超过3个核苷酸的序列B；
所述靶标序列选自如SEQ ID NO:1～9和812～817任一项所示的核苷酸序列和SEQID NO:1～9和812～817任一项中包含的至少15个连续核苷酸组成的序列。
[2].根据[1]所述的双链核糖核酸，其中，所述靶标序列选自如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列，所述正义链包含如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸组成的序列A，所述反义链包含如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸组成的序列反向互补和/或基本上反向互补的序列B。
[3].根据[1]或[2]所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链由15-28个核苷酸组成，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
[4].根据[3]所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链的核苷酸序列是与SEQ IDNO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中的15-28个连续核苷酸组成的序列相比差异不超过1个核苷酸的序列A，优选19-25个连续核苷酸，更优选19-23个连续核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
[5].根据[1]-[4]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链由15-28个核苷酸组成，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
[6].根据[5]所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链的核苷酸序列是与SEQ IDNO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中的15-28个连续核苷酸组成的序列的反向互补序列相比差异不超过1个核苷酸的序列B，优选19-25个连续核苷酸，更优选19-23个连续核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
[7].根据[1]-[6]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链区的长度为15-25个核苷酸，优选19-23个核苷酸，更优选19-21个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
[8].根据[1]-[7]任一项所述的双链核糖核酸，其中，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述反义链的3’末端形成平末端；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述正义链的3’末端形成平末端；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均形成平末端。
[9].根据[1]-[8]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表1、表1-1所示的任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链；
优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表1所示的siRNA 262、264和330中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
[10].根据[1]-[9]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链中每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸，和/或，所述反义链中每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。
[11].根据[1]-[10]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，和/或，所述反义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接。
[12].根据[1]-[11]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或，所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
[13].根据[1]-[12]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链核糖核酸为siRNA。
[14].根据[1]-[13]任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链核糖核酸为用于抑制MARC1基因表达的siRNA。
[15].一种双链核糖核酸修饰物，其为如[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸的修饰物，所述双链核糖核酸修饰物包含如下至少一种的化学修饰：
(1)正义链中至少一个核苷酸的修饰，
(2)正义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰，
(3)反义链中至少一个核苷酸的修饰，
(4)反义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰；
任选地，所述双链核糖核酸的正义链中序列A的3’末端连接由1-2个核苷酸组成的序列D，优选由1-2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成的序列D；和/或，所述双链核糖核酸的反义链中序列B的3’末端连接由1-2个核苷酸组成的序列E，优选由1-2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成的序列E；和/或，所述双链核糖核酸的正义链中序列A的3’末端排除1-2个核苷酸后形成序列A’；
可选地，所述双链核糖核酸修饰物的正义链和反义链选自如下的序列组合：
所述正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。
[16].根据[15]所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸的修饰选自2’-氟代修饰、2’-烷氧基修饰、2’-取代的烷氧基修饰、2’-烷基修饰、2’-取代的烷基修饰、2’-脱氧修饰、核苷酸衍生物修饰或其中任意两种以上的组合。
[17].根据[15]或[16]所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸的修饰选自2’-F修饰、2’-O-CH3修饰、2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰、2’-O-CH2-CH＝CH2修饰、2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰、2’-脱氧修饰，核苷酸衍生物修饰或其中任意两种以上的组合。
[18].根据[16]或[17]所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸衍生物修饰中的核苷酸衍生物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。
[19].根据[15]-[18]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第7位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
[20].根据[15]-[19]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
[21].根据[15]-[20]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中任意奇数位置处的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，所述反义链中任意偶数位置处的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第7位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
[22].根据[15]-[21]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链的5’末端的核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或，所述反义链的5’末端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
[23].根据[15]-[22]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
[24].根据[15]-[23]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物的正义链具有如(a1)-(a5)任一项所示的结构：
(a1)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(a2)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(a3)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(a4)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-3’，
(a5)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，
大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，
小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，
小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，
-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接。
[25].根据[15]-[24]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物的反义链具有如(b1)-(b27)任一项所示的结构：
(b1)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b2)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b3)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b4)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b5)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b6)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-N20f-(s)-mN21-3’，
(b7)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b8)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b9)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b10)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b11)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-N20f-mN21-(s)-N22f-(s)-mN23-3’，
(b12)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b13)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b14)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b15)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b16)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b17)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b18)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b19)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b20)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b21)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b22)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b23)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b24)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b25)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b26)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b27)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，
大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，
小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，
小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，
P1表示该字母右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸，
EVP表示该字母组合右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸，
-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接，
[GNA]表示其右侧相邻的一个核糖核苷酸为存在GNA修饰的核糖核苷酸。
[26].根据[15]-[25]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物为siRNA修饰物。
[27].根据[15]-[26]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物为用于抑制MARC1基因表达的siRNA修饰物。
[28].根据[15]-[27]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表2所示的任意一种siRNA修饰物的正义链，所述反义链包含对应siRNA修饰物的反义链；
优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表2所示的siRNA 356-siRNA 363、siRNA 366-siRNA 373和siRNA 433-siRNA 440中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
[29].一种双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物包括如[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸，或如[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物；以及，缀合连接于所述双链核糖核酸或所述双链核糖核酸修饰物的缀合基团。
[30].根据[29]所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团具有如下任一所示的结构：
[31].根据[29]或[30]所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团连接于正义链的3’末端。
[32].根据[31]所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团通过磷酸二酯键与正义链的3’末端缀合连接；
优选地，所述双链核糖核酸缀合物的正义链与反义链互补形成所述双链核糖核酸缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
所述双链核糖核酸缀合物的正义链与反义链互补形成所述双链核糖核酸缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
[33].根据[29]-[32]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物具有如下所示结构：
其中，双螺旋结构为双链核糖核酸或双链核糖核酸修饰物。
[34].根据[29]-[33]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物为siRNA缀合物。
[35].根据[29]-[34]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物是用于抑制MARC1基因表达的siRNA缀合物。
[36].根据[29]-[35]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物由本文表1所示的任意一种siRNA与缀合基团连接形成，或者，所述双链核糖核酸缀合物由本文表1-1所示的任意一种siRNA与缀合基团连接形成，或者，所述双链核糖核酸缀合物由本文表2所示的任意一种siRNA修饰物与缀合基团连接形成；
优选地，所述双链核糖核酸缀合物中，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表3所示的任意一种siRNA缀合物的正义链，所述反义链包含对应siRNA缀合物的反义链；
更优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表3所示的siRNA 451-siRNA 456、siRNA 462-siRNA 467和siRNA 516-siRNA 521中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
[37].[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸、[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物或[29]-[36]任一项所述的双链核糖核酸缀合物的前药。
[38].一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括如下至少一项：如[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸，如[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，如[29]-[36]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，如[37]所述的前药。
[39].根据[38]所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体，以及任选地还包括一种或多种另外的治疗剂。
[40].根据[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸，根据[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，根据[29]-[36]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，根据[37]所述的前药或根据[38]或[39]所述的药物组合物在如下至少一项中的用途：
(1)在体内或体外抑制MARC1基因表达，或制备用于抑制MARC1基因表达的药物；
(2)用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病，或制备用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病的药物；
(3)用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者，或制备用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者的药物。
[41].根据[40]所述的用途，其中，所述与MARC1基因异常表达相关的疾病选自如下疾病组成的组：
肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征。
[42].一种用于在体内或体外抑制细胞内MARC1基因表达的方法，其中，所述方法包括将所述细胞与根据[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸，根据[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，根据[29]-[36]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，根据[37]所述的前药或根据[38]或[39]所述的药物组合物接触。
[43].根据[42]所述的方法，其中，所述细胞为体内细胞或体外细胞。
[44].根据[42]或[43]所述的方法，其中，所述细胞在受试者体内。
[45].根据[44]所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
[46].根据[44]或[45]所述的方法，其中，所述受试者具有如下至少一种特性：
体内MARC1基因异常表达，更具体地为MARC1基因异常高表达；
患有与MARC1基因异常表达相关的疾病；
患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病。
[47].如[1]-[14]任一项所述的双链核糖核酸，如[15]-[28]任一项所述的双链核糖核酸修饰物，如[29]-[36]任一项所述的双链核糖核酸缀合物，如[37]所述的前药或如[38]或[39]所述的药物组合物，用于治疗。
发明的效果
在一些实施方案中，本公开提供的双链核糖核酸，能够在细胞内结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，切割MARC1基因转录的mRNA，高效、特异地抑制MARC1基因的表达，用于治疗包括肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征等在内的MARC1相关疾病以及其他尚未鉴定的相关病症、病理或综合征。
进一步的，本公开中双链核糖核酸为siRNA，siRNA靶向结合并降解MARC1基因的转录产物mRNA，发挥RNA干扰的作用，抑制MARC1基因的蛋白表达，是一种抑制率高且特异性好的MARC1抑制剂。
在一些实施方案中，本公开对双链核糖核酸进行修饰，得到双链核糖核酸修饰物，双链核糖核酸修饰物的稳定性高，适合体内疾病治疗中的应用。
进一步的，双链核糖核酸修饰物为siRNA修饰物，具有高的稳定性和较好的抑制活性。
在一些实施方案中，本公开在双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物上连接缀合基团得到双链核糖核酸或双链核糖核酸修饰物的缀合物，能够用于向组织、细胞中高效靶向递送，降低双链核糖核酸或双链核糖核酸修饰物对非靶向的正常组织、细胞的影响，提高其在临床疾病治疗中的安全性。
进一步的，双链核糖核酸缀合物为siRNA缀合物，在保持siRNA抑制活性、稳定性的同时，兼具器官或组织靶向性，可降低对其他组织或器官的影响以及减少siRNA分子使用量，可达到减轻毒性和降低成本的目的。
进一步的，本公开中的缀合基团为式I所示结构的基团(GalNAc)，GalNAc可用于向肝脏细胞、组织内的靶向递送，用于高效抑制肝脏内MARC1基因的表达。另外，本公开的siRNA缀合物毒性较低，具有优异的用药安全窗口。
具体实施方式
定义
除非有相反陈述，否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
在本发明的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试方法或装置所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本公开上下文中使用的术语“MARC1”，是指熟知的基因和多肽。MARC1基因、MARC1mRNA序列是例如使用以下容易获得的：基因库(GenBank)、数据库(UniProt)、人类孟德尔遗传在线(OMIM)等。
术语“MARC1基因”，可以是野生型MARC1基因，或存在序列变异的MARC1基因突变体。在MARC1基因中的许多序列变异已经被鉴别并且可以发现在例如NCBIdbSNP和UniProt(参见，例如，ncbi.nlm.nih.gov/snp)中。
术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
本公开上下文中使用的术语“靶标序列”是指在靶基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为对初级转录产物进行RNA加工的产物的mRNA。
在一些实施方案中，靶标序列是不少于16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、80、100或150个连续连接核苷组成的核苷酸序列。在一些可选的实施方案中，靶标序列中可以包含另一段较短的靶标序列。在一些实施方案中，靶标序列中可以包含一个或多个较短的靶标序列。应当认为，被包含于同一段靶标序列中的两个以上的较短靶标序列之间具有相同的特征。
在一些实施方案中，靶基因为MARC1基因。在一些实施方案中，序列的靶部分将会是至少足够地长，以在MARC1基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列部分处或其附近充当iRNA指导的切割的底物。
在本技术领域中，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的碱基，但本领域中也通常知晓，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常也代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸，这在表示脱氧核糖核酸序列和/或核糖核酸序列中是常见的方式，因此在本公开的上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”、“U”表示的含义包括上述各种可能的情形，然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。本领域人员可以意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如非限制性地，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包括腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明表征的dsRNA的核苷酸序列中由含有例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。含有这类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。
本公开上下文使用的术语“iRNA”、“RNAi试剂”、“iRNA试剂”、“RNA干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含siRNA，并且介导通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径的RNA转录物靶向切割。iRNA通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如抑制，靶基因在细胞(如受试者(如哺乳动物受试者)的细胞)中的表达。
本公开上下文使用的术语“双链核糖核酸”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA”可以互换地使用。术语“dsRNA”，是指核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包含两条反向平行的和基本上互补的核酸链，被称为相对于靶基因，例如MARC1基因，具有“正义”和“反义”定向。在一些实施例中，双链核糖核酸(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(在此称为RNA干扰或RNAi)触发靶RNA例如mRNA的降解。
通常，dsRNA分子的每条链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如本公开中所用，“双链核糖核酸”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸、磷酸骨架等等。这些修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。
本公开上下文使用的术语“异核苷酸”是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基不与核糖环的1’-位相连，而是与核糖环的2’-位或3’-位相连而形成的化合物。
在一些实施方案中，本公开的双链核糖核酸是siRNA，其与靶基因转录的mRNA序列(例如MARC1基因转录的mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。不希望受理论约束，引入细胞中的长双链RNA被称作Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，《基因与发育》(Genes Dev.)2001，15:485)。Dicer(核糖核酸酶III样酶)将dsRNA加工成至具有特征性双碱基3’突出端的19-23碱基对短干扰性RNA(Bernstein等人，(2001)自然(Nature)409:363)。这些siRNA随后掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(Nykanen等人，(2001)细胞(Cell)107:309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)《基因与发育》(Genes Dev.)15:188)。
本公开上下文使用的术语“突出的核苷酸”是指当双链核糖核酸的一条链的一个3’端延伸超出另一条链的5’端时从该dsRNA的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“平端”或“平末端”意指在该双链核糖核酸的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。一种“平末端的”双链核糖核酸是一种在其整个长度上都是双链、即在该分子的任一端处都无核苷酸突出端的dsRNA。
术语“反义链”是指双链核糖核酸中与靶标序列(例如，来源于人类MARC1 mRNA)基本上互补的一个区域的链。在该互补性区域不与该靶标序列完全互补的情况下，错配在末端区域是最为可容忍的，并且如果出现错配，它们通常在末端的一个或多个区域，例如5’和/或3末端的5、4、3、2或1个核苷酸之内。
术语“正义链”指的双链核糖核酸中含有与反义链区域基本上互补的区域的核酸链。
术语“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
术语“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配，即所涉及的两段核苷酸序列之间存在1个、2个或3个的碱基错配；“完全互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的正义链与反义链之间，或dsRNA的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。
术语“抑制MARC1基因的表达”包括抑制任何MARC1基因(如例如小鼠MARC1基因、大鼠MARC1基因、猴MARC1基因、或人类MARC1基因)以及MARC1基因的变体(例如天然存在的变体)或突变体的表达。因此，该MARC1基因可以是野生型MARC1基因、突变MARC1基因、或在遗传操作的细胞、细胞群组或生物体的情形下的转基因MARC1基因。
“抑制MARC1基因表达”包括任何水平的MARC1基因的抑制，例如至少部分抑制MARC1基因的表达，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、羟基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基。
术语“烷基”包括直链、支链或环状的饱和烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、环已基等类似基团。示例性的，“C1-6烷基”中的“C1-6”是指包含有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链、支链或环状形式排列的基团。
术语“烷氧基”在本文中是指烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连(-O-烷基)，其中所述烷基如本文中所定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等。
术语“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药、药物组合物，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
术语“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本公开的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药、药物组合物，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
术语“有效量”指本发明的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药或药物组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“与MARC1基因异常表达相关的疾病”是与补体MARC1的参与相关联的疾病或障碍。术语“与MARC1基因异常表达相关的疾病”包括将从减少MARC1(即“MARC1-相关性疾病”)表达受益的疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，MARC1基因异常表达相关的疾病选自由以下组成的组：肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征。示例性地，参考以下科学文献但不限于此：Emdin C.A.,Haas M.E.,Khera A.V.,et al.Amissense variant in Mitochondrial Amidoxime Reducing Component 1gene andprotection against liver disease.PLoS Genet,2020,16(4):e1008629.；Ott G.,Reichmann D.,Boerger C.,et al.Functional characterization of protein variantsencoded by nonsynonymous single nucleotide polymorphisms in MARC1 and MARC2in healthy Caucasians.Drug Metab Dispos,2014,42:718–725.；Meroni M.,Longo M.,Tria G.,et al.Genetics is of the essence to face NAFLD.Biomedicines,2021,9:1359.；Parisinos C.A.,Wilman H.R.,Thomas E.L.,et al.Genome-wide and Mendelianrandomisation studies of liver MRI yield insights into the pathogenesis ofsteatohepatitis.Journal of Hepatology,2020,73:241–251.；Du X.,DeForest N.,Majithia A.R.Human genetics to identify therapeutic targets for NAFLD:challenges and opportunities.Front.Endocrinol.2021,12:777075.；Bence K.K.,Birnbaum M.J.Metabolic drivers of non-alcoholic fatty liver disease.Journalof molmet,2020,101143.；Luukkonen P.K.,Juuti A.,Sammalkorpi H.,et al.MARC1variant rs2642438increases hepatic phosphatidylcholines and decreasesseverity of non-alcoholic fatty liver disease in humans.Journal ofHepatology,2020,73:696–739.；Trépo E.,Valenti L.Update on NAFLD genetics:fromnew variants to the clinic.Journal of Hepatology,2020,7634.；Sparacino-WatkinsC.E.,Tejero J.,Sun B.,et al.Nitrite reductase and nitric-oxide synthaseactivity of the mitochondrial molybdopterin enzymes mARC1 and mARC2.TheJournal of Biological Chemistry,2014,289(15):10345–10358.；Luukkonen,Panu K etal.“Distinct contributions of metabolic dysfunction and genetic risk factorsin the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease.”Journal ofhepatology vol.76,3(2022):526-535.doi:10.1016/j.jhep.2021.10.013；Romeo,Stefano.“MARC1 and HNRNPUL1:Two Novel Players in Alcohol-related LiverDisease.”Gastroenterology vol.159,4(2020):1231-1232.doi:10.1053/j.gastro.2020.08.009；Rivera-Paredez,Berenice et al.“Association of MARC1,ADCY5,and BCO1 Variants with the Lipid Profile,Suggests an Additive Effectfor Hypertriglyceridemia in Mexican Adult Men.”International journal ofmolecular sciences vol.23,19 11815.5Oct.2022,doi:10.3390/ijms231911815；Gao,Chuan etal.“Genome-wide association analysis of serum alanine and aspartateaminotransferase,and the modifying effects of BMI in 388k Europeanindividuals.”Genetic epidemiology vol.45,6(2021):664-681.doi:10.1002/gepi.22392。
术语“药学上可接受的辅料”或“药学上可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
本公开中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
在本公开中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
本公开上下文中使用的术语“对应siRNA”是指前述提及的同一种siRNA，例如当述及“所述正义链包含本文表1、表1-1所示的任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链”时，是指所包含的正义链和反义链来自本文表1、表1-1所示的同一种siRNA，例如，当正义链包含5’-CCUACACAAAGGACCUACU-3’(SEQ ID NO:38)时，反义链包含5’-AGUAGGUCCUUUGUGUAGG-3’(SEQ ID NO:92)。类似地，术语“对应siRNA修饰物”是指前述提及的同一种siRNA修饰物，例如当述及“所述正义链包含本文表2所示的任意一种siRNA修饰物的正义链，所述反义链包含对应siRNA修饰物的反义链”时，是指所包含的正义链和反义链来自本文表2所示的同一种siRNA修饰物。类似地，术语“对应siRNA缀合物”是指前述提及的同一种siRNA缀合物，例如当述及“所述正义链包含本文表3所示的任意一种siRNA缀合物的正义链，所述反义链包含对应siRNA缀合物的反义链”时，是指所包含的正义链和反义链来自本文表3所示的同一种siRNA缀合物。另外，在这些上下文中，“包含”包括由这些序列组成的情况。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
双链核糖核酸
本公开的第一方面提供一种双链核糖核酸(dsRNA)，用于抑制MARC1基因的表达。双链核糖核酸的一条链为反义链，反义链与靶基因(也即，MARC1基因)在表达过程中形成的mRNA序列互补配对，用于指导靶mRNA(也即，MARC1基因的转录产物)的切割。双链核糖核酸中另一条正义链包括与反义链部分互补和完全互补形成双链核糖核酸的双链区。
在一些实施方案中，双链核糖核酸作为核酸内切酶(Dicer)的底物，被切割为小片段的dsRNA，也即siRNA。在一些实施方案中，双链核糖核酸为siRNA。siRNA通过装配形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)RISC复合体，切割靶mRNA，抑制MARC1基因的表达。
根据来源于人MARC1 mRNA(NM_022746.4)中的靶标序列，设计与靶mRNA结合的siRNA。在一些实施方案中，靶标序列选自如SEQ ID NO:1～9和812～817任一项所示的核苷酸序列。在一些更为具体的实施方案中，靶标序列选自如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:10～12和799～801所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:13～16、802和803所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:17～20和804所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:21～24、805和806所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:25～28所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:29～30和807所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:31～32和808所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:33～35和809所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:36～37810、811所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:812所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:818和819所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:813所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:820和821所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:814所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:822和823所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:815所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:824和825所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:816所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:826～828所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，SEQ ID NO:817所示的核苷酸序列包含SEQ ID NO:829和830所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，反义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的反向互补序列的差异不超过3个核苷酸的序列B。具体地，沿5’末端向3’末端的方向，在靶标序列中选择起始核苷酸，以包含起始核苷酸在内的向3’方向延伸的至少15个核苷酸作为siRNA的结合区域。反义链包含结合区域对应的核苷酸序列的反向互补序列。需要说明的是，起始核苷酸可以是靶标序列任意位置处的核苷酸，只要基于该起始核苷酸向靶标序列3’方向延伸，可以得到至少15个连续核苷酸(包含起始位置处的核苷酸)即可。
在本公开中，反义链的核苷酸序列与靶标序列可以是完全互补或基本上互补。当反义链的核苷酸序列与靶标序列基本上互补时，反义链的核苷酸序列中存在与靶标序列存在不超过3个的错配碱基。例如，错配碱基为1个、2个或3个。当反义链的核苷酸序列与靶标序列完全互补时，反义链的核苷酸序列与靶标序列不存在错配碱基。
进一步地，反义链由至少15个核苷酸组成。在一些实施方案中，反义链由15-28个核苷酸组成。例如，反义链的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸。
作为优选，反义链由19-25个核苷酸组成，更优选19-23个核苷酸，最优选19、21或23个核苷酸。
在一些可选的实施方案中，反义链包含的序列B与靶标序列上至少15个连续核苷酸组成的序列的反向互补序列相同。
在一些具体的实施方案中，反义链包含的序列B与靶标序列上15-28个连续核苷酸组成的序列的反向互补序列相同。优选靶标序列上19-25个连续核苷酸，更优选靶标序列19-23个连续核苷酸，最优选19、21或23个连续核苷酸。
在一些可选的实施方案中，反义链包含的序列B与靶标序列上至少15个连续核苷酸组成的序列的反向互补序列存在1个核苷酸的差异。
在一些具体的实施方案中，反义链包含的序列B与靶标序列上15-28个核苷酸组成的序列的反向互补序列存在1个核苷酸的差异。优选靶标序列上19-25个连续核苷酸，更优选靶标序列上19-23个连续核苷酸，最优选19、21或23个连续核苷酸。
在一些具体的实施方案中，存在差异的核苷酸位于序列B的3’末端。在另一些具体的实施方案中，存在差异的核苷酸位于序列B的5’末端。
在一些实施方案中，所述正义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的差异不超过3个核苷酸的序列A。正义链中包括与反义链互补的区域，正义链的核苷酸序列与反义链在靶标序列上结合区域的序列完全相同或基本完全相同。因此，正义链的核苷酸序列为靶标序列中结合反义链的至少15个连续核苷酸；或者，正义链的核苷酸序列与靶标序列中结合反义链的至少15个连续核苷酸相比，存在1个、2个或3个碱基不同的差异核苷酸。
进一步地，正义链由至少15个核苷酸组成。在一些实施方案中，正义链由15-28个核苷酸组成。例如，正义链的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸。
作为优选，正义链由19-25个核苷酸组成，更优选19-23个核苷酸，最优选19、21或23个核苷酸。
在一些可选的实施方案中，正义链包含的序列A与靶标序列上至少15个连续核苷酸组成的序列相同。
在一些具体的实施方案中，正义链包含的序列A与靶标序列上15-28个连续核苷酸组成的序列相同。优选靶标序列上19-25个连续核苷酸，更优选靶标序列上19-23个连续核苷酸，最优选靶标序列上19、21或23个连续核苷酸。
在一些可选的实施方案中，正义链包含的序列A与靶标序列上至少15个连续核苷酸组成的序列存在1个核苷酸的差异。
在一些具体的实施方案中，正义链包含的序列A与靶标序列上15-28个连续核苷酸组成的序列存在1个核苷酸的差异。优选靶标序列上19-25个连续核苷酸，更优选靶标序列上19-23个连续核苷酸，最优选靶标序列上19、21或23个连续核苷酸。
在一些具体的实施方案中，存在差异的核苷酸位于序列A的3’末端。在另一些具体的实施方案中，存在差异的核苷酸位于序列A的5’末端。
在本公开中，正义链的长度与反义链长度可以相同或不同。
在一些实施方式中，正义链与反义链的长度相同，具体地，正义链/反义链的长度比为15/15、16/16、17/17、18/18、19/19、20/20、21/21、22/22、23/23、24/24、25/25、26/26、27/27或28/28。作为优选，正义链/反义链的长度比为19/19、20/20、21/21、22/22、23/23、24/24或25/25，更优选19/19、20/20、21/21、22/22或23/23，最优选19/19、21/21或23/23。
在一些实施方式中，正义链与反义链的长度不同。例如，正义链/反义链的长度比为19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/19、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/19、21/20、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/19、22/20、22/21、22/23、22/24、22/25、22/26、23/19、23/20、23/21、23/22、23/24、23/25或23/26等等；在一些优选的实施方式中，正义链/反义链的长度比为19/21、20/22或21/23。
在本公开中，正义链与反义链可以是完全互补或基本上互补，当两者基本上互补时，正义链与反义链形成的双链区内存在不超过3个错配碱基。
在一些实施方案中，正义链与反义链互补形成双链区后，正义链、反义链或其组合具有延伸出所述双链区的突出的核苷酸。突出的核苷酸的数量可以是1个或多个，例如，1个或2个。另外，突出1-2个核苷酸可以位于任意反义链或正义链的5’末端、3’末端或两端，并且，每一个突出的核苷酸可以是任意类型的核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述反义链的3’末端形成平末端。
在一些实施方案中，所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述正义链的3’末端形成平末端。
在一些实施方案中，所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均形成平末端。
在一些具体的实施方式中，所述正义链包含如SEQ ID NO:38～91、411～497、499～502任一项所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ ID NO:92～145、503～589、591～594任一项所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方式中，所述正义链包含如SEQ ID NO:146～183任一项所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ ID NO:184～221任一项所示的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，双链核糖核酸选自如表1或表1-1中所示的任一siRNA。在一些具体的实施方案中，本公开的siRNA对MARC1基因的抑制率至少为约20％，可以至少为约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或这些数值任意二者之间的数值或范围。
本公开提供的siRNA，其与靶mRNA(MARC1 mRNA)结合的特异性高，具有较好的靶mRNA的沉默活性，可以显著抑制MARC1基因表达，用于治疗包括肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征以及其他尚未鉴定的相关病症、病理或综合征等在内的MARC1相关的疾病。
在一些实施方案中，本公开提供了一种siRNA组合物，其包含表1或表1-1中所示siRNA中的任意一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，正义链的每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链的每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，反义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接。
在一些实施方案中，所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
在本文中，反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团时，该5’末端核苷酸的结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基、2’-脱氧核苷酸。
示例性的，5’磷酸基团的结构为：5’磷酸衍生基团的结构包括但不限于：等。
位于反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团后，形成如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R’为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸。
双链核糖核酸修饰物
本公开的第二方面提供一种双链核糖核酸修饰物。进一步地，双链核糖核酸修饰物为siRNA修饰物。siRNA修饰物在保持较高MARC1 mRNA抑制活性的同时，可提高siRNA的稳定性。
在一些实施方案中，双链核糖核酸修饰物包含至少一个核苷酸的修饰。核苷酸的修饰选自核糖基团的修饰和碱基的修饰中的至少一种。在一些实施方案中，“核苷酸的修饰”是指核苷酸的核糖基团2’位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸衍生物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述核苷酸的修饰不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。通过核苷酸的修饰可以提高siRNA的稳定性，并保持其对MARC1基因的高抑制效率。
示例性的，修饰的核苷酸具有如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。核糖基团2’位的羟基被R取代。这些核糖基2’位的羟基可以为本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，2’-烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基(2’-OMe，2’-O-CH3)修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷基修饰的核苷酸为2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，核苷酸的修饰是碱基的修饰。碱基的修饰可以是本领域技术人员所知晓的各类型修饰。示例性的，碱基的修饰包括但不限于m6A、Ψ、m1A、m5A、ms2i6A、i6A、m3C、m5C、ac4C、m7G、m2,2G、m2G、m1G、Q、m5U、mcm5U、ncm5U、ncm5Um、D、mcm5s2U、Inosine(I)、hm5C、s4U、s2U、偶氮苯、Cm、Um、Gm、t6A、yW、ms2t6A或其衍生物。
在一些实施方案中，核苷酸衍生物是指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的化合物。在一些实施方案中，核苷酸衍生物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3’-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2’-、4’-位处以提供一个2’,4’-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET等。
LNA如式(1)所示，ENA如式(2)所示，cET如式(3)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(4)所示，GNA如式(5)所示：
上述式(4)和式(5)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
在一些实施方案中，核苷酸衍生物修饰是指核酸中的核苷酸被替代为核苷酸衍生物。示例性的，核苷酸衍生物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。
在一些实施方案中，核酸中的核苷酸被替代为异核苷酸，在本公开的上下文中，也称之为异核苷修饰。在一些实施方案中，异核苷修饰包括在欲修饰的siRNA的正义链和/或反义链的一个或多个位点掺入异核苷，以代替天然核苷在相应位置进行偶联。
在一些实施方案中，异核苷修饰采用D-异核苷修饰。在另一些实施方案中，异核苷修饰采用L-异核苷修饰。在又一些实施方案中，异核苷修饰采用D-异核苷修饰和L-异核苷修饰。
在一些实施方案中，双链核糖核酸修饰物包含至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰。在一些实施方式中，磷酸二酯键的修饰是指磷酸二酯键中至少一个氧原子被硫原子取代形成硫代磷酸二酯键。硫代磷酸二酯键可以稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的特异性。示例性的，硫代磷酸二酯键结构如下所示：
在一些实施方案中，双链核糖核酸修饰物包含如下至少一种的化学修饰：
(1)正义链中至少一个核苷酸的修饰，
(2)正义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰，
(3)反义链中至少一个核苷酸的修饰，
(4)反义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰。
进一步地，双链核糖核酸修饰物是包含(1)-(4)中至少一种化学修饰的siRNA修饰物。
在本公开中，正义链中的序列A与反义链中的序列B互补形成双链区后，序列A与序列B的3’末端可以为如下任意一种所示：
(1)序列A与序列B的3’末端均形成平末端；
(2)序列A的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，且序列B的3’末端形成平末端；
(3)序列B的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，且序列A的3’末端形成平末端；
(4)序列A的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，且序列B的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列。
在一些实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链与反义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链和反义链中至少一条链的3’末端添加1-2个核苷酸，作为突出的核苷酸。其中，连接于正义链的3’末端的1-2个核苷酸组成序列D，连接于反义链的3’末端的1-2个核苷酸组成序列E。相应地，正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。或者，正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。或者，正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列。
示例性的，在正义链的3’末端添加2个脱氧核糖核苷酸(TT)作为序列D，在反义链的3’末端添加2个脱氧核糖核苷酸(TT)作为序列E。或者，仅在反义链的3’末端添加2个脱氧核糖核苷酸(TT)作为序列E。或者，仅在正义链的3’末端添加2个脱氧核糖核苷酸(TT)作为序列D。
在一些实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链的3’末端添加由1-2个核苷酸组成的序列D，作为突出的核苷酸。然后，当序列A连接序列D形成的核苷酸序列在完成化学修饰后，排除由1-2个核苷酸组成的序列D。相应地，在双链核糖核酸修饰物中，正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列。或者，在双链核糖核酸修饰物中，正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。在一些实施方案中，当序列A在与序列B互补形成双链区后，序列A的3’末端具有延伸出双链区的突出的1-2个核苷酸时，将序列A中位于3’末端的突出的核苷酸排除后作为正义链的核苷酸序列。排除掉3’末端的突出的核苷酸的序列称为序列A’。相应地，双链核糖核酸修饰物的正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，双链核糖核酸修饰物的反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列。或者，双链核糖核酸修饰物的正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，双链核糖核酸修饰物的反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的正义链包括如下修饰：正义链中第7位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-氟代修饰的核糖核苷酸；正义链中其他位置的核糖核苷酸为2’-甲氧基修饰的核糖核苷酸。
在本文中，正义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基、2’-脱氧核苷酸。
示例性的，5’磷酸基团的结构为：5’磷酸衍生基团的结构包括但不限于：等。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的正义链包括如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间，5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间，3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间，以及3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的正义链包括如下位置处的硫代磷酸二酯键：5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间、5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在一些具体的实施方案中，siRNA修饰物正义链具有如(a1)-(a3)任一项所示的结构：
(a1)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(a2)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(a3)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接。
在另外一些具体的实施方案中，siRNA修饰物正义链具有如(a4)-(a5)任一项所示的结构：
(a4)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-3’，
(a5)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-3’；
其中，N1-N21彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的反义链包括如下修饰：所述反义链中任意奇数位置处的核糖核苷酸为2’-甲氧基修饰的核糖核苷酸，所述反义链中任意偶数位置处的核糖核苷酸为2’-氟代修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的反义链包括如下修饰：所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的反义链包括如下修饰：所述反义链中第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的反义链包括如下修饰：所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第7位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，siRNA修饰物的反义链包括如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间，5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间，3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间，以及3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在一些实施方案中，沿5’末端向3’末端方向，反义链的5’末端的核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
在本文中，反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团时，该5’末端核苷酸的结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基、2’-脱氧核苷酸。
示例性的，5’磷酸基团的结构为：5’磷酸衍生基团的结构包括但不限于：等。
在一些具体的实施方案中，siRNA修饰物反义链具有如下(b1)-(b27)任一项所示的结构：
(b1)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b2)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b3)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b4)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b5)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b6)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-N20f-(s)-mN21-3’，
(b7)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b8)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b9)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b10)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b11)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-N20f-mN21-(s)-N22f-(s)-mN23-3’，
(b12)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b13)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b14)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b15)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b16)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b17)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b18)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b19)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b20)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b21)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b22)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b23)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b24)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b25)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b26)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b27)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，P1表示该字母右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸，EVP表示该字母组合右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸，-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接，[GNA]表示其右侧相邻的一个核糖核苷酸为存在GNA修饰的核糖核苷酸。
在一些可选的实施方式中，所述正义链包含如SEQ ID NO:222～283和595～650任一项所示的核苷酸序列，并且所述反义链包含如SEQ ID NO:284～393、651～748、788～798、498和590任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，双链核糖核酸修饰物包括但不限于如表2中所示的siRNA修饰物。
在一些具体的实施方案中，本公开的siRNA修饰物对MARC1基因的抑制率至少为约20％，可以至少为约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或这些数值任意二者之间的数值或范围。在一些实施方案中，本公开的siRNA修饰物对MARC1基因的IC50小于约0.4nM，可以小于约0.3、约0.2、约0.1、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05、约0.04、约0.03、约0.02、约0.01nM。
双链核糖核酸缀合物
本公开的第三方面提供一种双链核糖核酸缀合物，是本公开第一方面提供的双链核糖核酸或第二方面提供的双链核糖核酸修饰物与缀合基团缀合连接得到。
在本公开中，双链核糖核酸缀合物的正义链与反义链形成双链核糖核酸缀合物的双链区，并且，在双链核糖核酸缀合物的正义链的3’末端形成平末端。在一些实施方案中，双链核糖核酸缀合物的正义链的3’末端形成平末端，双链核糖核酸缀合物的反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸。在另外一些实施方案中，双链核糖核酸缀合物的正义链的3’末端形成平末端，双链核糖核酸缀合物的反义链的3’末端形成平末端。
在一些优选地实施方案中，双链核糖核酸缀合物由双链核糖核酸修饰物与缀合基团缀合连接得到。其中，双链核糖核酸修饰物的正义链与反义链互补形成双链核糖核酸修饰物的双链区，并且，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端形成平末端，缀合基团与具有平末端的正义链的3’末端缀合连接，形成双链核糖核酸缀合物。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A所示的序列，反义链为序列B连接序列E所示的序列。并且，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端形成平末端，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端连接缀合基团，形成双链核糖核酸缀合物。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A所示的序列，反义链为序列B所示的序列。并且，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端形成平末端，双链核糖核酸修饰物的正义链3’末端连接缀合基团，形成双链核糖核酸缀合物。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A连接序列D所示的序列，反义链为序列B连接序列E所示的序列。并且，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端具有突出的1-2个核苷酸组成的序列D，将双链核糖核酸修饰物中正义链的3’末端的序列D排除后，在序列A的3’末端连接缀合基团，形成双链核糖核酸缀合物。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A连接序列D所示的序列，反义链为序列B所示的序列。并且，双链核糖核酸修饰物的正义链的3’末端具有突出的1-2个核苷酸组成的序列D，将双链核糖核酸修饰物中正义链的3’末端的序列D排除后，在序列A的3’末端连接缀合基团，形成双链核糖核酸缀合物。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A所示的序列，反义链为序列B连接序列E所示的序列。其中，序列A的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于序列A中3’末端的突出的核苷酸排除后的序列(又称，序列A’)作为用于连接缀合基团的核苷酸序列。因此，双链核糖核酸缀合物的正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。
示例性地，双链核糖核酸修饰物的正义链为序列A所示的序列，反义链为序列B所示的序列。其中，序列A的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于序列A中3’末端的突出的核苷酸排除后的序列(又称，序列A’)作为用于连接缀合基团的核苷酸序列。因此，双链核糖核酸缀合物的正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列。
示例性地，如N-ER-FY025102M8L96所示的siRNA缀合物，其正义链的3’末端原本具有延伸出双链区的突出的核苷酸-smUsmA，将位于正义链中3’末端的突出的-smUsmA核苷酸排除后形成的mGsmUsmGmAmUmUCfmAGfUfGfmAmUmUmUmCmAmGmA平末端序列作为用于连接L96缀合基团的核苷酸序列(即在序列合成到平末端后通过磷酸二酯键连接L96)，因此，形成siRNA缀合物的序列为：正义链为mGsmUsmGmAmUmUCfmAGfUfGfmAmUmUmUmCmAmGmAL96(SEQID NO:756)，反义链为EVPmUsCfsmUmGmAAfmAmUmCmAmCmUmGAfmAUfmCmAmCsmUsmU(SEQ IDNO:671)。
在一些可选地实施方案中，双链核糖核酸缀合物的正义链具有如(d1)-(d2)任一项所示的结构：
(d1)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-L96-3’，
(d2)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-L96-3’；
其中，N1-N21彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接。L96也即式I所示的缀合物基团GalNAc。
在一些可选地实施方案中，双链核糖核酸缀合物的反义链具有如(b1)-(b27)任一项所示的结构：
(b1)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b2)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b3)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b4)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b5)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b6)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-N20f-(s)-mN21-3’，
(b7)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b8)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b9)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b10)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b11)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-N20f-mN21-(s)-N22f-(s)-mN23-3’，
(b12)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b13)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b14)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’
(b15)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b16)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b17)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b18)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b19)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b20)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b21)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b22)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b23)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b24)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b25)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b26)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b27)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，P1表示该字母右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸，EVP表示该字母组合右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸，-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接，[GNA]表示其右侧相邻的一个核糖核苷酸为存在GNA修饰的核糖核苷酸。
进一步地，双链核糖核酸缀合物为siRNA缀合物，其中siRNA缀合物中与缀合基团连接的siRNA分子可以是未修饰的siRNA，或siRNA修饰物。缀合基团修饰的siRNA分子在保持了较高的抑制活性和稳定性的同时，还具有较好的组织、器官靶向性和促进细胞内吞的能力，可降低对其他组织或器官的影响以及减少siRNA分子使用量，可达到减轻毒性和降低成本的目的。可选地，选择表1或表1-1或表2示出的任意一种siRNA分子与缀合基团连接，得到双链核糖核酸缀合物。
siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3’末端或5’末端，也可在反义链的5’端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3’末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2’-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3’-位羟基上，此时核苷酸之间采用2’,5’-磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7。
在本公开中，缀合基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体。在一些实施方式中，所述缀合基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在一些具体的实施方案中，所述缀合基团具有如下任一所示结构：
式I所示的缀合基团为GalNAc，GalNAc具有肝脏靶向性，可以将siRNA分子高特异性地递送于肝脏组织中，特异性抑制肝脏内MARC1基因的高表达。
在一些具体的实施方案中，GalNAc通过磷酸二酯键与正义链的3’末端缀合连接，得到如下所示结构的siRNA缀合物：
其中，双螺旋结构为未修饰的siRNA或siRNA修饰物。
在一些实施方案中，双链核糖核酸缀合物包括但不限于如表3中所示的siRNA缀合物。
在一些具体的实施方案中，本公开的siRNA缀合物对MARC1基因的抑制率至少为约20％，可以至少为约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或这些数值任意二者之间的数值或范围。
前药
本公开的第四方面提供一种前药。本公开的第一方面所述的双链核糖核酸、第二方面所述的双链核糖核酸修饰物，以及第三方面所述的双链核糖核酸缀合物还可以以前药的形式存在，前药可在体内或体外转化为本公开的双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物。
如本说明书所使用的，“前药”是指经过生物体内转化后才发挥药理作用的化合物。例如，本申请中M6是M2的前药，M2与M6的修饰区别就是反义链的5’末端是否有P1，无P1的M6在体内会磷酸化变为带P1的M2序列，从而发挥作用，同理，M7和M3的关系也是如此，因此，本文中siRNA包括其对应的前药。
药物组合物
本公开的第五方面提供一种药物组合物，包括第一方面所述的双链核糖核酸、第二方面所述的双链核糖核酸修饰物、第三方面所述的双链核糖核酸缀合物以及第四方面所述的前药中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有如上所述的siRNA或前药作为活性成分和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还含有一种或多种另外的治疗剂，例如对预防或治疗至少部分由MARC1基因表达介导的疾病、病症或症状有益的治疗剂。在本公开中，使用药物组合物的目的在于促进针对生物体的给药，有利于活性成分的吸收，进而发挥生物活性。本公开的药物组合物可以通过任何形式给药，包括注射(动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)、粘膜、口服(口服固体制剂、口服液体制剂)、直肠、吸入、植入、局部(例如眼部)给药等。口服固体制剂的非限制性实例包括但不限于散剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、片剂等。口服或粘膜给药的液体制剂的非限制性实例包括但不限于混悬剂、酊剂、酏剂、溶液剂等。局部给药制剂的非限制性实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药制剂的非限制性实例包括但不限于注射用溶液剂、注射用干粉剂、注射用悬浮液、注射用乳剂等。本公开的药物组合物还可以制成控制释放或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。
在本公开中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
医药用途
本公开的第六方面提供双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药和药物组合物的如下至少一种用途：
(1)抑制MARC1基因表达，或制备用于抑制MARC1基因表达的药物；
(2)用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病，或制备用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病的药物；
(3)用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者，或制备用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者的药物。
本公开进一步提供了siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)或其前药或药物组合物在上述(1)-(3)至少一种中的用途。
在本公开中，MARC1基因异常表达，引发如下一种或多种MARC1基因异常表达相关疾病：肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征等。
siRNA分子致使MARC1基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％，实现对MARC1基因异常表达相关疾病的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供一种抑制细胞内MARC1基因表达的方法，包括将双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药或药物组合物与细胞接触。
进一步地，抑制细胞内MARC1基因表达的方法，是将siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物引入细胞内。
在一些实施方案中，所述细胞为体内细胞或体外细胞。在一些具体的实施方案中，所述细胞在受试者体内。
在一些实施方案中，本公开提供预防或治疗疾病的方法，包括向受试者或患者施用双链核糖核酸、双链核糖核酸修饰物、双链核糖核酸缀合物、前药或药物组合物。
进一步地，预防或治疗疾病的方法是向受试者或患者施用siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物。
在本公开中，“受试者”包括或者人或者非人类动物，优选脊椎动物，并且更优选哺乳动物。受试者可以包括转基因生物体。最优选地，受试者是人。进一步地，受试者具有如下至少一种特性：
(1)体内MARC1基因异常表达，更具体地为MARC1基因异常高表达；
(2)患有与MARC1基因异常表达相关的疾病；
(3)患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病。如罹患或倾向于患上与MARC1基因异常表达相关的疾病的人。
本公开的siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物的用量可以根据患者的体重、年龄、性别、疾病的严重程度等来确定。以其中所含的双链核糖核酸的量计，本公开的siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物的施用剂量为约1-300mg/kg体重。
给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每1个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年，1次或多次。
施用本公开的siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物的总次数可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次。例如，本公开的siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药或药物组合物可施用约1、2、3、4次。
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药、药物组合物和任选地其他治疗剂可被包装在试剂盒中，试剂盒中siRNA分子(包括未修饰的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物)、前药、药学上可接受的载体和任选地其他治疗剂可以以液体形式或干燥形式提供。在一些实施方案中，所述试剂盒包含说明书，以说明如何将siRNA分子或前药与药学上可接受的载体或其他成分进行混合。
表1siRNA序列信息
表1-1siRNA序列信息
表2siRNA修饰物
上述表格中大写字母“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸；mA、mU、mC、mG：表示2-甲氧基修饰的核苷酸；Af、Gf、Cf、Uf：表示2-氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸二酯键连接；P1：表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸；EVP表示其右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸；[GNA]表示其右侧相邻的一个核糖核苷酸为存在GNA修饰的核糖核苷酸。
表3siRNA缀合物
上述表格中L96也即式I所示的缀合物基团GalNAc。
表1、表1-1、表2和表3中，正义链、修饰的正义链和连接缀合基团的修饰的正义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有P1或EVP，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，其结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基、2’-脱氧核苷酸。
表1、表1-1、表2和表3中，反义链和修饰的反义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有P1或EVP，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，其结构也如式X所示。
表1、表1-1、表2和表3中，正义链和修饰的正义链的3’末端核苷酸、反义链和修饰的反义链的3’末端核苷酸的3’位置为羟基。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
下述实施例涉及的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物由天霖生物科技(上海)有限公司合成，实施例中使用的细胞、试剂如表4所示：
表4
实施例1：siRNA的合成
1.1siRNA序列设计
根据人MARC1基因mRNA序列，选择不同位点设计多对MARC1 siRNAs，设计的所有单个siRNA均能靶向靶基因的所有转录本(如表5)，这些多对siRNA经序列相似性软件比对与其他所有非靶标基因序列有最低同源性。
表5
靶基因 物种 Gene ID NM_ID
MARC1 Homo sapiens 64757 NM_022746.4
用于设计siRNA的靶标序列如下所示，靶标序列来源于MARC1的基因mRNA序列(参见NM_022746.4)。
靶标序列I：
AGGTTTTGGCTTGTGATCAACCAGGAGGGAAACATGGTTACTGCTCGCCAGGAACCTCGCCTGGTCCTGATTTCCCTGACCTGCGATGGTGACACCCTGACTCTCAGTGCAGCCTACACAAAGGACCTACTACTGCCTATCAAAACG(SEQ ID NO:1)
靶标序列I-1：
AGGTTTTGGCTTGTGATCAA(SEQ ID NO:10)
靶标序列I-2：
GGTTACTGCTCGCCAGGAACCTCGCCTGGTCCTGATTT(SEQ ID NO:11)
靶标序列I-3：
AGCCTACACAAAGGACCTACTACTGCCTATCAAAACG(SEQ ID NO:12)
靶标序列I-4：
TGGCTTGTGATCAACCAGGAGGGAAACATGG(SEQ ID NO:799)
靶标序列I-5：
GAACCTCGCCTGGTCCTGATTTCCCTGACCTG(SEQ ID NO:800)
靶标序列I-6：
TCAGTGCAGCCTACACAAAGGAC(SEQ ID NO:801)
靶标序列II：
AGTGCACGGCCTGGAGATAGAGGGCAGGGACTGTGGCGAGGCCACCGCCCAGTGG
ATAACCAGCTTCCTGAAGTCACAGCCCTACCGCCTGGTGCACTTCGAGCCTCACATGCGACCGAGACGTCCTCATCAAATAGCAGACTTGTTCCGACCCAAGGACCAGATTGCTTACTCAGACACCAGCCCATTCTTGATCC(SEQ ID NO:2)
靶标序列II-1：
AGTGCACGGCCTGGAGATAGAGGGCAGGGACT(SEQ ID NO:13)
靶标序列II-2：
GGATAACCAGCTTCCTGAA(SEQ ID NO:14)
靶标序列II-3：
ACCGAGACGTCCTCATCAAATAGCAGACTTGT(SEQ ID NO:15)
靶标序列II-4：
CAGATTGCTTACTCAGACACCAGCCCATTCTTGATCC(SEQ ID NO:16)
靶标序列II-5：
CCTGGTGCACTTCGAGCCTCACATGCGACCGAGAC(SEQ ID NO:802)
靶标序列II-6：
CAGACTTGTTCCGACCCAAGGACCAGATTGCTT(SEQ ID NO:803)
靶标序列III：
GGATCTCAACTCCAGGCTAGAGAAGAAAGTTAAAGCAACCAACTTCAGGCCCAATATTGTAATTTCAGGATGCGATGTCTATGCAGAGGATTCTTGGGATGAGCTTCTTATTGGTGACGTGGAACTGAAAAGGGTGATGGCTTGTTCCAGATGCATTTTAACCACAGT(SEQ ID NO:3)
靶标序列III-1：
GGATCTCAACTCCAGGCTAGAGAAGAAAGTTAAA(SEQ ID NO:17)
靶标序列III-2：
CAACCAACTTCAGGCCCAATA(SEQ ID NO:18)
靶标序列III-3：
GATGTCTATGCAGAGGATTCTTGGGATGAGCTTCTTATTGGTGACGTGGAACTGAAAA(SEQ ID NO:19)
靶标序列III-4：
GGTGATGGCTTGTTCCAGATGCATTTTAACCACAGT(SEQ ID NO:20)
靶标序列III-5：
GCAACCAACTTCAGGCCCAATATTGTAATTTCAGGATGCGATGTCTATGCAGAGGAT(SEQ ID NO:804)
靶标序列IV：
GAAGGAACCGCTGGAAACACTGAAGAGTTATCGCCAGTGTGACCCTTCAGAACGAAAGTTATATGGAAAATCACCACTCTTTGGGCAGTATTTTGTGCTGGAAAACCCAGGGACCATCAAAGTGGGAGACCCT(SEQ ID NO:4)
靶标序列IV-1：
GAAGGAACCGCTGGAAACA(SEQ ID NO:21)
靶标序列IV-2：
GAAGAGTTATCGCCAGTGTGACCCTTCAGAACGAAAGTTATA(SEQ ID NO:22)
靶标序列IV-3：
ACCACTCTTTGGGCAGTAT(SEQ ID NO:23)
靶标序列IV-4：
CATCAAAGTGGGAGACCCT(SEQ ID NO:24)
靶标序列IV-5：
GCTGGAAACACTGAAGAGTTA(SEQ ID NO:805)
靶标序列IV-6：
TATGGAAAATCACCACTCTTTGGGCAGTATTTTGTGCTGGAAAAC(SEQ ID NO:806)
靶标序列V：
GAACTGAGACCTCTACATTTTCTTTAAATTTGTGATTTTCACATTTTTCGTCTTTTGGACTTCTGGTGTCTCAATGCTTCAATGTCCCAGTGCAAAAAGTAAAGAAATATAGTCTCAATAACTTAGTAGGACTTCAGTAAGTCACTTAAATGACAAGACAGGATTCTGAAAACTCCCCGTTTAACTGATTATGGAA(SEQ ID NO:5)
靶标序列V-1：
GAACTGAGACCTCTACATTTTCTTTA(SEQ ID NO:25)
靶标序列V-2：
GGTGTCTCAATGCTTCAAT(SEQ ID NO:26)
靶标序列V-3：
CTTAGTAGGACTTCAGTAAGTCACTTAAAT(SEQ ID NO:27)
靶标序列V-4：
CGTTTAACTGATTATGGAA(SEQ ID NO:28)
靶标序列VI：
CTGTCACTACCACTCGTTAGAGAAAGAGAAGAAGAGAAAGAGGAAGAGTGGGTGGGCTGGAAGAATATCCTAGAATGTGT(SEQ ID NO:6)
靶标序列VI-1：
CTGTCACTACCACTCGTTAGAGAAAGAGAAGA(SEQ ID NO:29)
靶标序列VI-2：
GGCTGGAAGAATATCCTAGAATGTGT(SEQ ID NO:30)
靶标序列VI-3：
GAGAAAGAGAAGAAGAGAAAGAG(SEQ ID NO:807)
靶标序列VII：
CTAGCTTTTGAAATGGCATAAAGACTGAGGTGACCTTCAGGAAGCACTGCAGATATTAATTTTCCA(SEQ ID NO:7)
靶标序列VII-1：
CTAGCTTTTGAAATGGCATAAAGAC(SEQ ID NO:31)
靶标序列VII-2：
GGAAGCACTGCAGATATTAATTTTCCA(SEQ ID NO:32)
靶标序列VII-3：
CTGAGGTGACCTTCAGGAAGCAC(SEQ ID NO:808)
靶标序列VIII：
GGAGAAGAAAAGTGATTCAGTGATTTCAGATAGACTACTGAAAACCTTTAAAGGGGGAAAAGGAAAGCATATGTCAGTTGTTTAAAACCCAATATCTATTTTTTAACTGATTGTATAACTCTAAGATCTGATGAAGTAT(SEQID NO:8)
靶标序列VIII-1：
GGAGAAGAAAAGTGATTCAGTGATTTCAGATAGACTACT(SEQ ID NO:33)
靶标序列VIII-2：
GCATATGTCAGTTGTTTAA(SEQ ID NO:34)
靶标序列VIII-3：
CTAAGATCTGATGAAGTAT(SEQ ID NO:35)
靶标序列VIII-4：
GTCAGTTGTTTAAAACCCAAT(SEQ ID NO:809)
靶标序列IX：
TTTGTCCTTTGATTATATTGGGAAGTTGACTAAACTTGAAAAATGTTTTTAAAACTGTGAATAAATGGAAGCTACTTTGACTAGTTTCA(SEQ ID NO:9)
靶标序列IX-1：
TTTGTCCTTTGATTATATTGGGAAGTTGACTAAACTTGAA(SEQ ID NO:36)
靶标序列IX-2：
GCTACTTTGACTAGTTTCA(SEQ ID NO:37)
靶标序列IX-3：
GGAAGTTGACTAAACTTGAAAAATGTTTTTAA(SEQ ID NO:810)
靶标序列IX-4：
ACTGTGAATAAATGGAAGCTA(SEQ ID NO:811)
靶标序列X：
GATCTACCCTGTGAAATCCTGCAAGG(SEQ ID NO:812)
靶标序列X-1：
GATCTACCCTGTGAAATCC(SEQ ID NO:818)
靶标序列X-2：
CCTGTGAAATCCTGCAAGG(SEQ ID NO:819)
靶标序列XI：
TTCCAGATGCATTTTAACCACAGTGGACCCAGACACCGGTGTCATGAGCAGGAAGG
AACCGCTGGAAACACTGAAGAGTTATCGCCAGTGTGACCCTTCAGAACGAAAGTTA
TATGGAAAATCACCACTCTTTGGGCAGTATTTTGTGCTGGAAAACCCAGGGACCATCAAAGTGGGAGACCCTGTGTACCTGCTGGGCCAGTAATGG(SEQ ID NO:813)靶标序列XI-1：
TTCCAGATGCATTTTAACCACAGTGGACCCAGACAC(SEQ ID NO:820)
靶标序列XI-2：
AAGTGGGAGACCCTGTGTACCTGCTGGGCCAGTAATGG(SEQ ID NO:821)
靶标序列XII：
ACACTTGAAGCATGGTGTTTCAGAACTGAGACCTCTACA(SEQ ID NO:814)靶标序列XII-1：
ACACTTGAAGCATGGTGTTTCAGAACTG(SEQ ID NO:822)
靶标序列XII-2：
GTGTTTCAGAACTGAGACCTCTACA(SEQ ID NO:823)
靶标序列XIII：
CATCCTGTCACTACCACTCGTTAGAGAAAGAGAAGAAGAGAAAGAGGAAGAGTGGGTGGGCTGGAAGAATATCCTAGAATGTGTTATTGCCCCTG(SEQ ID NO:815)
靶标序列XIII-1：
CATCCTGTCACTACCACTC(SEQ ID NO:824)
靶标序列XIII-2：
GAAGAATATCCTAGAATGTGTTATTGCCCCTG(SEQ ID NO:825)
靶标序列XIV：
AAGCCCCGGGCTAGCTTTTGAAATGGCATAAAGACTGAGGTGACCTTCAGGAAGCACTGCAGATATTAATTTTCCATAGATCTGGATCTGGCCCTGCTGCTTCTCAGACAGCATTGGATTTCCTAAAGGTGCTCAGGAGGATGGTTGTGTAGTCATGGAGGACCCCTGGATCCTTGCCATTCCCCTCAGCTAATGAC(SEQ ID NO:816)
靶标序列XIV-1：
AAGCCCCGGGCTAGCTTTT(SEQ ID NO:826)
靶标序列XIV-2：
GCTGCTTCTCAGACAGCATTGGATTTCCTAAAGGTGCT(SEQ ID NO:827)
靶标序列XIV-3：
AGGACCCCTGGATCCTTGCCATTCCCCTCAGCTAATGAC(SEQ ID NO:828)
靶标序列XV：
GATTCAGTGATTTCAGATAGACTACTGAAAACCTTTAAAGGGGGAAAAGGAAAGCATATGTCAGTTGTTTAAAACCCAATATCTATTTTTTAACTGATTGTATAACTCTAAGATCTGATGAAGTATATTTTTTATTGCCATTTTGTCCTTTGATTATAT(SEQ ID NO:817)
靶标序列XV-1：
GATTCAGTGATTTCAGA(SEQ ID NO:829)
靶标序列XV-2：
TGCCATTTTGTCCTTTGATTATAT(SEQ ID NO:830)
1.2合成方法描述：
通过固相亚磷酰胺法，按照核苷酸排布顺序自3'-5'方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、氧化或硫化、盖帽四步反应。其中，两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、氧化、盖帽四步反应。两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、硫化、盖帽四步反应。本发明根据合成目标序列选取核苷酸单体，选取的核苷酸单体为本领域技术人员常用的核苷酸单体，例如合成A的核苷酸单体可以为但不限于选择腺苷-3-磷酸。应理解这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5’-3’磷酸二酯键或者5’-3’硫代磷酸酯基互相连接，当例如按5’到3’方向最后一个核苷酸3’位置为羟基时，根据本领域技术常规手段实现。
1.3合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％ V/V),二氯乙酸与固相载体上4,4’-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干得到正义链和反义链；最后将两条链进行加热退火得到产品，冻干，得到冻干粉。
合成的siRNA如表1和表1-1所示，合成的siRNA修饰物如表2所示。
实施例2：siRNA缀合物(GalNAc-siRNA)的合成
2.1siRNA缀合物具有如下式II所示的结构：
2.2siRNA缀合物的合成过程
第一步，通过将DMTr-L96和丁二酸酐反应，得到化合物L96-A：
制备过程：将DMTr-L96、丁二酸酐、4-二甲基氨基吡啶和二异丙基乙胺加入二氯甲烷中，25℃下搅拌反应24小时，然后用0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷洗涤三次，合并有机相减压蒸干得粗品。然后柱层析纯化得到纯品L96-A。
第二步，将L96-A与NH2-SPS反应得到L96-B：
制备过程：将L96-A、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)混合溶于乙腈中，室温搅拌5分钟得到均一溶液，加入氨甲基树脂(NH2-SPS,100-200目)至反应液体中，25℃下开始摇床反应，反应18小时后过滤，滤饼依次用二氯甲烷和乙腈洗涤，得滤饼。所得滤饼用CapA/CapB混合溶液进行盖帽反应得到L96-B，即为含有缀合分子的固相载体，然后在偶联反应下将核苷单体连接至缀合分子，随后按照前文所述的siRNA分子合成方法合成连接至缀合物分子的siRNA正义链，采用前文所述的siRNA分子合成方法合成siRNA反义链，退火生成本申请的siRNA缀合物。
合成的siRNA缀合物如表3所示。
实施例3：siRNA及siRNA修饰物抑制MARC1基因表达
3.1实验材料：
HepG2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号SCSP-510；
RNA提取试剂盒，96Kit，货号QIAGEN-74182；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号13778-150；
MEM培养基，购自Gibco，货号41090036；
逆转录试剂盒(Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper))，购自Vazyme，货号R312-02；
TaqManTM基因表达预混液,购自Applied Biosystems，货号4369016；
Opti-MEM：减血清培养基，购自Gibco，货号31985070；
Target MARC1 primer and probe set，购自Thermo，Hs00224227_m1；
TaqMan Gene Expression Assay(GAPDH),购自Thermo,ID-Hs99999905_m1。
3.2实验方法：
3.2.1将HepG2细胞铺于96孔板的新鲜MEM培养基中培养48小时，将所培养的细胞用无PS(青霉素链霉素混合液)的MEM培养基重悬，制成密度为1.11×105/mL的细胞悬液，铺到96孔板中，每孔加90μL细胞悬液，即10000个细胞/孔。
3.2.2将待测siRNA及siRNA修饰物(为便于描述，本实施例实验过程描述中统称为siRNA)的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水(ULtraPure Distilled Water)溶解，配制成100μM siRNA母液。
3.2.3配制200nM的siRNA转染稀释液Z和2nM的siRNA稀释液W
(1)10μM siRNA贮备液Q制备和0.1μM的siRNA贮备液E：
a、取上述步骤3.2.2中制得的100μM siRNA母液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为10μM的siRNA贮备液Q；
b、取步骤a)中制得的10μM的siRNA贮备液Q 2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为1μM的siRNA贮备液Y；
c、取步骤b)中制得的1μM的siRNA贮备液Y 2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.1μM的siRNA贮备液E；
(2)取上述配置好的siRNA贮备液E 2μL，加入98μL Opti-MEM，得到2nM的siRNA稀释液W；取上述配置好的siRNA贮备液Q 2μL，加入98μL Opti-MEM，得到200nM的siRNA稀释液Z；
3.2.4转染HepG2细胞
(1)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-MEM，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤3.2.3中制得的2nM siRNA稀释液W以1:1体积比混合，静置5分钟，将10μL的转染混合物加入到96孔板中转染步骤3.2.1中所培养的HepG2细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为0.1nM)。
(2)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-MEM，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤3.2.3中制得的200nM siRNA稀释液Z以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染步骤3.2.1中培养的HepG2细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为10nM)。
上述转染后培养48小时；每个浓度(10nM和0.1nM)设置2个重复。
3.2.5按照RNA提取试剂盒说明书提取步骤3.2.4中获得的HepG2细胞中的总RNA。
3.2.6对步骤3.2.5中获得的总RNA，利用逆转录试剂盒进行逆转录至cDNA，按照以下步骤进行：
a)按照下表用gDNA酶除去gDNA；
表6
体积/μL
5×gDNA Buffer 2
Sample(RNA) 8
42℃，2min；4℃，静置
b)如下所述进行逆转录程序：
表7
体积/μL
步骤a)所得的混合液 10
10×RT Mix 2
HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2
Oligo(dT)20VN 1
Random hexamers 1
RNase-free ddH2O 4
50℃，15min；85℃，5s。
c)将步骤b)所得逆转录产物储存在4℃以进行实时PCR分析。
3.2.7进行实时PCR分析
a)如下表所示制备qPCR反应混合物，在整个操作过程中，所有试剂都放置在冰上；
表8
b)如下所述进行qPCR程序
50℃，2分钟，95℃，10分钟；
95℃，15秒，60℃，1分钟(该操作40个循环)。
3.2.8结果分析
a)使用Quant Studio 6Flex软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(MARC1基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt。
Mock组：和检测样品组相比，未加入siRNA的组
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
3.3沉默实验结果
选取浓度0.1nM和10nM进行测试，结果如下表9、表10所示。
表9
由表9可以看出，在HepG2细胞实验中，本公开的siRNA对MARC1基因的抑制率至少为约21％，分布在约21％-约97％之间，10nM的浓度普遍比1nM的浓度显示出更高的对MARC1基因的抑制率，显示了剂量依赖效应。其中，0.1nM的N-ER-FY025096对MARC1基因的抑制率为约89％，10nM为约93％；0.1nM的N-ER-FY025102对MARC1基因的抑制率为约89％，10nM为约92％；0.1nM的N-ER-FY025175对MARC1基因的抑制率为约90％，10nM为约94％；表明这几种siRNA对MARC1基因具有很强的抑制。
表10
由表10可以看出，在HepG2细胞实验中，本公开的siRNA修饰物对MARC1基因的抑制率至少为约30％，分布在约30％-约98％之间，10nM的浓度普遍比1nM的浓度显示出更高的对MARC1基因的抑制率，显示了剂量依赖效应。其中，0.1nM的N-ER-FY025096M2、N-ER-FY025096M3、N-ER-FY025096M6、N-ER-FY025096M7、N-ER-FY025096M8、N-ER-FY025096M9对MARC1基因的抑制率为约81％-约85％，10nM为约90％-约95％；0.1nM的N-ER-FY025102M2、N-ER-FY025102M3、N-ER-FY025102M4、N-ER-FY025102M5、N-ER-FY025102M6、N-ER-FY025102M7、N-ER-FY025102M8、N-ER-FY025102M9对MARC1基因的抑制率为约69％-约90％，10nM为约90％-约95％；0.1nM的N-ER-FY025175M4、N-ER-FY025175M5、N-ER-FY025175M2、N-ER-FY025175M3、N-ER-FY025175M6、N-ER-FY025175M7、N-ER-FY025175M8、N-ER-FY025175M9对MARC1基因的抑制率为约89％-约94％，10nM为约91％-约95％；表明这些siRNA修饰物对MARC1基因具有很强的抑制。
3.4IC50测定结果
下述待测siRNA测定浓度范围设置(nM)为：10nM起，3倍稀释，8个浓度梯度：10nM，3.33nM，1.11nM，0.37nM，0.12nM，0.041nM，0.014nM，0.0045nM；再按照与3.2相似的方法进行IC50测定。
结果分析：
a)使用Quant Studio 6Flex软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(MARC1基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)–ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
计算过程：以siRNA浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 8的“log(抑制剂)vs.响应–变量斜率”，来拟合量效曲线，从而得出各个siRNA的IC50值。
拟合公式为：Y＝Bottom+(Top–Bottom)/(1+10^((logIC50–X)×HillSlope))
其中：Top表示顶部平台处的百分比抑制率，曲线的Top标准一般在80％至120％；Bottom表示底部平台处的百分比抑制率，曲线的Bottom一般在-20％至20％之间；HillSlope表示百分比抑制率曲线的斜率。
结果如下表11所示。
表11
实施例4：siRNA缀合物抑制MARC1基因表达的抑制率测定
4.1试验材料：
人原代肝细胞PHH细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供；
PHH培养液：invitroGRO CP Medium，购自Bioreclamation货号：S03316；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号：13778-150；
96Kit，购自QIAGEN，货号：QIAGEN-74182；
FastQuant RT Kit(含gDNase)，购自TianGen，货号：KR116-02；
FastStart Universal Probe master，购自Roche，货号：04914058001；
HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，购自Vazyme，货号R323-01；
The MARC1 primer and probe由Sangon Biotech合成；
TaqMan Gene Expression Assay(GAPDH),购自Thermo,ID-Hs02786624_g1。
4.2试验方法
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为2nM和0.2nM，复孔)通过转染进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时应用RNAiMax转染试剂将siRNA缀合物转入细胞，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔加入PHH培养液100μL。细胞置于5％ CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为200nM和10nM，复孔)通过自由摄取进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时加入siRNA缀合物，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔加入PHH培养液100μL。细胞置于5％ CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
利用逆转录试剂盒进行逆转录至cDNA，按照以下步骤进行：
(1)按照下表12用gDNA酶除去gDNA；
表12
体积/μL
4×gDNA wiper Mix 4
RNase-free ddH2O 4
Sample(RNA) 8
42℃，2min；4℃，静置
(2)将4μL 5×HiScript III qRT SuperMix直接加入步骤(1)中的反应板。运行程序:37℃持续15分钟，85℃持续5秒钟。
(3)通过qPCR检测目的基因cDNA。
表13
体积/μL
FastStart Universal Probe Master(Rox) 5.0
MARC1 Forward primer(10μM) 0.4
MARC1 Reverse primer(10μM) 0.4
MARC1 probe(10μM) 0.2
cDNA 2.0
RNase-Free Water 2.0
表14
如下所述进行qPCR程序
95℃，10分钟；
95℃，15秒，60℃，1分钟(该操作40个循环)。
结果分析：
a)使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(MARC1基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)–ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA缀合物的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
实验结果如表15所示。
表15 siRNA缀合物抑制MARC1基因表达的抑制率
由表15可以看出，在pHH细胞实验中，本公开的siRNA缀合物对MARC1基因的抑制率至少为约36％，分布在约36％-约94％之间，在转染和自由摄取两种方式下，均显示了剂量依赖效应；其中，在自由摄取方式下，10nM的N-ER-FY025096M2L96、N-ER-FY025096M3L96、N-ER-FY025096M6L96、N-ER-FY025096M7L96、N-ER-FY025096M8L96、N-ER-FY025096M9L96对MARC1基因的抑制率为约72％-约77％，200nM为约84％-约89％，在转染方式下，0.2nM的N-ER-FY025096M2L96、N-ER-FY025096M3L96、N-ER-FY025096M6L96、N-ER-FY025096M7L96、N-ER-FY025096M8L96、N-ER-FY025096M9L96对MARC1基因的抑制率为约70％-约74％，2nM为约87％-约89％；在自由摄取方式下，10nM的N-ER-FY025102M2L96、N-ER-FY025102M3L96、N-ER-FY025102M6L96、N-ER-FY025102M7L96、N-ER-FY025102M8L96、N-ER-FY025102M9L96对MARC1基因的抑制率为约81％-约83％，200nM为约85％-约89％，在转染方式下，0.2nM的N-ER-FY025102M2L96、N-ER-FY025102M3L96、N-ER-FY025102M6L96、N-ER-FY025102M7L96、N-ER-FY025102M8L96、N-ER-FY025102M9L96对MARC1基因的抑制率为约80％-约84％，2nM为约83％-约90％；在自由摄取方式下，10nM的N-ER-FY025175M2L96、N-ER-FY025175M3L96、N-ER-FY025175M6L96、N-ER-FY025175M7L96、N-ER-FY025175M8L96、N-ER-FY025175M9L96对MARC1基因的抑制率为约87％-约93％，200nM为约88％-约94％，在转染方式下，0.2nM的N-ER-FY025175M2L96、N-ER-FY025175M3L96、N-ER-FY025175M6L96、N-ER-FY025175M7L96、N-ER-FY025175M8L96、N-ER-FY025175M9L96对MARC1基因的抑制率为约86％-约88％，2nM为约90％-约93％；表明这些siRNA缀合物对MARC1基因具有很强的抑制。
实施例5：siRNA缀合物在表达人MARC1(hMARC1)基因的小鼠体内沉默效果
5.1AAV构建过表达hMARC1基因小鼠模型
6-8周龄的C57BL/6小鼠(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)进入设施，适应性喂养3-5天后，尾静脉单次注射hMARC1基因的腺相关病毒pAAV[Exp]-CBh>SEAP:{MARC1 part 3'UTR}(病毒由云舟生物科技(广州)股份有限公司制备，病毒ID：VB230627-1558gqe)进行靶基因过表达造模，给药体积：100μL(3*1011vg)/只，随后普通饲料喂养。
5.2针对hMARC1小鼠模型体内沉默siRNA药效考察
AAV病毒注射14日后，分组(每组6只)，小鼠皮下给药单一1，3，10mg/kg(mpk)剂量的N-ER-FY025096M2L96、N-ER-FY025102M2L96、N-ER-FY025103M2L96、N-ER-FY025096M6L96、N-ER-FY025102M6L96、N-ER-FY025172M6L96、N-ER-FY025173M6L96、N-ER-FY025174M6L96、N-ER-FY025175M6L96、N-ER-FY025096M8L96、N-ER-FY025177M6L96、N-ER-FY025177M8L96、N-ER-FY025102M8L96、N-ER-FY025174M8L96和N-ER-FY025175M8L96，给药体积为5μL/g，溶剂为无RNA酶的无菌PBS，空白组注射同等体积的无RNA酶的无菌PBS。给药后第7天、14天、21天、28天、35天、42天和49天进行检测SEAP蛋白表达量(即hMARC1蛋白表达量)。
hMARC1的抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(1-检测样品组SEAP蛋白相对表达量/空白组SEAP蛋白相对表达量)*100％
表16 siRNA缀合物对hMARC1的抑制率
从表16可以看出，本申请的siRNA缀合物在体内对hMARC1基因具有较高的抑制活性，能够长时间降低hMARC1蛋白水平。从药物N-ER-FY025096M2L96和N-ER-FY025102M2L96不同剂量下的实验结果可知，siRNA缀合物剂量越高，抑制率越高，抑制时间越长。此外，在第14天，3mpk剂量下，药物N-ER-FY025096M6L96、N-ER-FY025096M8L96、N-ER-FY025102M8L96、N-ER-FY025175M8L96均能达到80％以上的抑制率。siRNA缀合物剂量越高，抑制率越高，抑制时间越长。其中，N-ER-FY025096M2L96的1mpk剂量，对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约29％-约60％，3mpk在第7-49天内为约55％-约79％，10mpk在第7-49天内为约71％-约87％；N-ER-FY025102M2L96的1mpk剂量，对hMARC1的抑制率在第7-49内为约24％-约60％，3mpk在第7-49天内为约47％-约78％，10mpk在第7-49天内为约76％-约84％；3mpk的N-ER-FY025096M6L96对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约70％-约82％；3mpk的N-ER-FY025102M6L9对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约36％-约71％；3mpk的N-ER-FY025175M6L96对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约53％-约82％；3mpk的N-ER-FY025096M8L96对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约68％-约83％；3mpk的N-ER-FY025102M8L96对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约73％-约87％；3mpk的N-ER-FY025175M8L96对hMARC1的抑制率在第7-49天内为约68％-约86％。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (47)

1.一种双链核糖核酸，所述双链核糖核酸包括正义链和反义链，所述正义链与所述反义链反向互补和/或基本上反向互补形成所述双链核糖核酸的双链区；
其中，所述正义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的差异不超过3个核苷酸的序列A，所述反义链包含与靶标序列中至少15个连续核苷酸的反向互补序列的差异不超过3个核苷酸的序列B；
所述靶标序列选自如SEQ ID NO:1～9和812～817任一项所示的核苷酸序列和SEQ IDNO:1～9和812～817任一项中包含的至少15个连续核苷酸组成的序列。
2.根据权利要求1所述的双链核糖核酸，其中，所述靶标序列选自如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列，所述正义链包含如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸组成的序列A，所述反义链包含如SEQ ID NO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸组成的序列反向互补和/或基本上反向互补的序列B。
3.根据权利要求1或2所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链由15-28个核苷酸组成，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链的核苷酸序列是与SEQ IDNO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中的15-28个连续核苷酸组成的序列相比差异不超过1个核苷酸的序列A，优选19-25个连续核苷酸，更优选19-23个连续核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链由15-28个核苷酸组成，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
6.根据权利要求5所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链的核苷酸序列是与SEQ IDNO:10～37、799～811和818～830任一项所示的核苷酸序列中的15-28个连续核苷酸组成的序列的反向互补序列相比差异不超过1个核苷酸的序列B，优选19-25个连续核苷酸，更优选19-23个连续核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
7.根据权利要求1-6任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链区的长度为15-25个核苷酸，优选19-23个核苷酸，更优选19-21个核苷酸，更优选19、21或23个核苷酸。
8.根据权利要求1-7任一项所述的双链核糖核酸，其中，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述反义链的3’末端形成平末端；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸，所述正义链的3’末端形成平末端；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；或者，
所述正义链与所述反义链互补形成所述双链区，且所述正义链与所述反义链的3’末端均形成平末端。
9.根据权利要求1-8任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表1、表1-1所示的任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链；
优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表1所示的siRNA 262、264和330中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
10.根据权利要求1-9任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链中每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸，和/或，所述反义链中每个核苷酸彼此独立地为修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。
11.根据权利要求1-10任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述正义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，和/或，所述反义链中任意相连的两个核苷酸由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接。
12.根据权利要求1-11任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或，所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
13.根据权利要求1-12任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链核糖核酸为siRNA。
14.根据权利要求1-13任一项所述的双链核糖核酸，其中，所述双链核糖核酸为用于抑制MARC1基因表达的siRNA。
15.一种双链核糖核酸修饰物，其为如权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸的修饰物，所述双链核糖核酸修饰物包含如下至少一种的化学修饰：
(1)正义链中至少一个核苷酸的修饰，
(2)正义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰，
(3)反义链中至少一个核苷酸的修饰，
(4)反义链中至少一个位置处的磷酸二酯键的修饰；
任选地，所述双链核糖核酸的正义链中序列A的3’末端连接由1-2个核苷酸组成的序列D，优选由1-2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成的序列D；和/或，所述双链核糖核酸的反义链中序列B的3’末端连接由1-2个核苷酸组成的序列E，优选由1-2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成的序列E；和/或，所述双链核糖核酸的正义链中序列A的3’末端排除1-2个核苷酸后形成序列A’；
可选地，所述双链核糖核酸修饰物的正义链和反义链选自如下的序列组合：
所述正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A连接序列D所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B所示的序列；
或者，所述正义链的核苷酸序列为序列A’所示的序列，所述反义链的核苷酸序列为序列B连接序列E所示的序列。
16.根据权利要求15所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸的修饰选自2’-氟代修饰、2’-烷氧基修饰、2’-取代的烷氧基修饰、2’-烷基修饰、2’-取代的烷基修饰、2’-脱氧修饰、核苷酸衍生物修饰或其中任意两种以上的组合。
17.根据权利要求15或16所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸的修饰选自2’-F修饰、2’-O-CH3修饰、2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰、2’-O-CH2-CH＝CH2修饰、2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰、2’-脱氧修饰，核苷酸衍生物修饰或其中任意两种以上的组合。
18.根据权利要求16或17所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述核苷酸衍生物修饰中的核苷酸衍生物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。
19.根据权利要求15-18任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第7位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
20.根据权利要求15-19任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
21.根据权利要求15-20任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中任意奇数位置处的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，所述反义链中任意偶数位置处的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第7位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
22.根据权利要求15-21任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链的5’末端的核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或，所述反义链的5’末端的核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
23.根据权利要求15-22任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸二酯键：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
24.根据权利要求15-23任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物的正义链具有如(a1)-(a5)任一项所示的结构：
(a1)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(a2)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(a3)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(a4)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-3’，
(a5)5’-mN1-(s)-mN2-(s)-mN3-mN4-mN5-mN6-N7f-mN8-N9f-N10f-N11f-mN12-mN13-mN14-mN15-mN16-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，
大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，
小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，
小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，
-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接。
25.根据权利要求15-24任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物的反义链具有如(b1)-(b27)任一项所示的结构：
(b1)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b2)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b3)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b4)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b5)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b6)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-(s)-N20f-(s)-mN21-3’，
(b7)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b8)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b9)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b10)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b11)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-N4f-mN5-N6f-mN7-N8f-mN9-N10f-mN11-N12f-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-N18f-mN19-N20f-mN21-(s)-N22f-(s)-mN23-3’，
(b12)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b13)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b14)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-[GNA]N6-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b15)5’-P1mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-[GNA]N7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b16)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b17)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b18)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b19)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-T-(s)-T-3’，
(b20)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b21)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b22)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b23)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-(s)-mN20-(s)-mN21-3’，
(b24)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b25)5’-mN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b26)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-mN8-mN9-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’，
(b27)5’-EVPmN1-(s)-N2f-(s)-mN3-mN4-mN5-N6f-mN7-N8f-N9f-mN10-mN11-mN12-mN13-N14f-mN15-N16f-mN17-mN18-mN19-mN20-mN21-(s)-mN22-(s)-mN23-3’；
其中，N1-N23彼此独立地选自碱基为A、U、C或G的核糖核苷酸，
大写字母T表示碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，
小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸，
小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，
P1表示该字母右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸，
EVP表示该字母组合右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸，
-(s)-表示前后相邻的两个核苷酸以硫代磷酸二酯键连接,
[GNA]表示其右侧相邻的一个核糖核苷酸为存在GNA修饰的核糖核苷酸。
26.根据权利要求15-25任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物为siRNA修饰物。
27.根据权利要求15-26任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述双链核糖核酸修饰物为用于抑制MARC1基因表达的siRNA修饰物。
28.根据权利要求15-27任一项所述的双链核糖核酸修饰物，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表2所示的任意一种siRNA修饰物的正义链，所述反义链包含对应siRNA修饰物的反义链；
优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表2所示的siRNA 356-siRNA 363、siRNA 366-siRNA 373和siRNA433-siRNA 440中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
29.一种双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物包括如权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸，或如权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物；以及，缀合连接于所述双链核糖核酸或所述双链核糖核酸修饰物的缀合基团。
30.根据权利要求29所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团具有如下任一所示的结构：
31.根据权利要求29或30所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团连接于正义链的3’末端。
32.根据权利要求31所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述缀合基团通过磷酸二酯键与正义链的3’末端缀合连接；
优选地，所述双链核糖核酸缀合物的正义链与反义链互补形成所述双链核糖核酸缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-2个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
所述双链核糖核酸缀合物的正义链与反义链互补形成所述双链核糖核酸缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
33.根据权利要求29-32任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物具有如下所示结构：
其中，双螺旋结构为双链核糖核酸或双链核糖核酸修饰物。
34.根据权利要求29-33任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物为siRNA缀合物。
35.根据权利要求29-34任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物是用于抑制MARC1基因表达的siRNA缀合物。
36.根据权利要求29-35任一项所述的双链核糖核酸缀合物，其中，所述双链核糖核酸缀合物由本文表1所示的任意一种siRNA与缀合基团连接形成，或者，所述双链核糖核酸缀合物由本文表1-1所示的任意一种siRNA与缀合基团连接形成，或者，所述双链核糖核酸缀合物由本文表2所示的任意一种siRNA修饰物与缀合基团连接形成；
优选地，所述双链核糖核酸缀合物中，其中，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表3所示的任意一种siRNA缀合物的正义链，所述反义链包含对应siRNA缀合物的反义链；
更优选地，所述正义链与所述反义链选自如下组合：
所述正义链包含本文表3所示的siRNA 451-siRNA 456、siRNA 462-siRNA 467和siRNA516-siRNA 521中任意一种siRNA的正义链，所述反义链包含对应siRNA的反义链。
37.权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸、权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物或权利要求29-36任一项所述的双链核糖核酸缀合物的前药。
38.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括如下至少一项：如权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸，如权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物，如权利要求29-36任一项所述的双链核糖核酸缀合物，如权利要求37所述的前药。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体，以及任选地还包括一种或多种另外的治疗剂。
40.根据权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸，根据权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物，根据权利要求29-36任一项所述的双链核糖核酸缀合物，根据权利要求37所述的前药或根据权利要求38或39所述的药物组合物在如下至少一项中的用途：
(1)在体内或体外抑制MARC1基因表达，或制备用于抑制MARC1基因表达的药物；
(2)用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病，或制备用于预防或治疗与MARC1基因异常表达相关的疾病的药物；
(3)用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者，或制备用于治疗患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病的受试者的药物。
41.根据权利要求40所述的用途，其中，所述与MARC1基因异常表达相关的疾病选自如下疾病组成的组：
肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、酒精相关的脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝酶水平升高(ALT、AST、ALP)、肝细胞癌、高胆固醇血症和相关的心血管疾病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、高血糖症、II型糖尿病和代谢综合征。
42.一种用于在体内或体外抑制细胞内MARC1基因表达的方法，其中，所述方法包括将所述细胞与根据权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸，根据权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物，根据权利要求29-36任一项所述的双链核糖核酸缀合物，根据权利要求37所述的前药或根据权利要求38或39所述的药物组合物接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述细胞为体内细胞或体外细胞。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中，所述细胞在受试者体内。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中，所述受试者具有如下至少一种特性：
体内MARC1基因异常表达，更具体地为MARC1基因异常高表达；
患有与MARC1基因异常表达相关的疾病；
患有将受益于MARC1基因表达降低的疾病。
47.如权利要求1-14任一项所述的双链核糖核酸，如权利要求15-28任一项所述的双链核糖核酸修饰物，如权利要求29-36任一项所述的双链核糖核酸缀合物，如权利要求37所述的前药或如权利要求38或39所述的药物组合物，用于治疗。
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