CN118846036A - 一种包含特异性结合cd3和muc16的双特异性抗体的药物组合 - Google Patents
一种包含特异性结合cd3和muc16的双特异性抗体的药物组合 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种药物组合,其包含特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体以及特异性结合PD‑1、PD‑L1或PD‑L2的抗体。
Description
技术领域
本发明提供了一种药物组合,其包含特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体以及特异性结合PD-1或PD-L1或PD-L2的抗体。
背景技术
CD3是与T细胞受体复合物(TCR)结合的在T细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原,并且是T细胞活化所需要的。功能性CD3由以下四种不同链中的两种的二聚缔合形成:ε、ζ、δ和γ。CD3二聚体排列包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已显示针对CD3的抗体在T细胞上聚集CD3,从而以类似于通过肽负载的MHC分子参与TCR的方式引起T细胞活化。因此,已提出抗CD3抗体用于涉及T细胞活化的治疗目的。此外,已提出能够结合CD3和靶向肿瘤表面抗原的双特异性抗体能够将肿瘤细胞和T细胞衔接,从而直接活化T细胞,释放颗粒酶、穿孔素及细胞因子杀伤肿瘤,从而达到抑制肿瘤的治疗目的。
MUC16蛋白,自从发现以来一直被用做卵巢癌的特异性标记物,而且也被认为与卵巢癌的不良预后相关。MUC16是一种分子量巨大的一型跨膜糖蛋白,由胞外域、跨膜段和胞内部分组成;胞外域分为两部分,前半段发生高度的糖基化,胞外域的后半段由约60个串联的重复结构域组成,其中每个重复结构域有156个氨基酸。MUC16蛋白N端含有56个SEA结构域,MUC16蛋白在胞外域近膜端第一个或第二个SEA域发生截断并释放出游离的CA125(Das,S.and S.K.Batra(2015)."Understanding the Unique Attributes of MUC16(CA125):Potential Implications in Targeted Therapy."Cancer Res 75(22):4669-4674,CA125enters the circulation by being shed from the full-length MUC16 at the cellsurface,Das,S.,et al.(2015)."Membrane proximal ectodomain cleavage of MUC16occurs in the acidifying Golgi/post-Golgi compartments"Sci Rep 5:9759)。除了卵巢癌,CA125指标在其他肿瘤中也发现上升,如乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等。有研究显示MUC16促进肿瘤的侵入、转移和抑制免疫反应等,基于此MUC16可能是一个潜在的治疗癌症的靶点。虽然很早就有以MUC16为靶点的疗法进入临床研究,但是临床的结果都未能达到预期(Aithal,A.,et al.(2018),"MUC16 as a novel target for cancertherapy",Expert Opin Ther Targets 22(8):675-686),主要原因是已经开发的大部分抗体都能结合循环中游离的CA125,从而减少了抗体与膜MUC16的结合量,降低了抗体的肿瘤穿透能力。
近年来免疫检查点抑制剂(ICI)开启了肿瘤免疫疗法的新纪元,通过阻断免疫检查点分子(例如PD-1或者CTLA4)与配体的结合来解除免疫抑制,从而恢复T细胞的功能。截至目前免疫检查点抑制剂类的药物已经在一些适应症获得批准上市,如黑色素瘤、非小细胞肺癌、淋巴瘤等(Pico de Coana,Y.,et al.(2015)."Checkpoint blockade for cancertherapy:revitalizing a suppressed immune system."Trends Mol Med 21(8):482-491)(Bu,X.,et al.(2017)."Immune Checkpoint Blockade in Breast CancerTherapy."Adv Exp Med Biol 1026:383-402)(Hargadon,K.M.,et al.(2018)."Immunecheckpoint blockade therapy for cancer:An overview of FDA-approved immunecheckpoint inhibitors."Int Immunopharmacol 62:29-39)。尽管如此,只有很少部分的卵巢癌患者能够从免疫检查点抑制剂药物的治疗中获益(Borella,F.,et al.(2020)."Immune Checkpoint Inhibitors in Epithelial Ovarian Cancer:An Overview onEfficacy and Future Perspectives."Diagnostics(Basel)10(3))(Lorusso,D.,et al.(2020)."Emerging role of immune checkpoint inhibitors in the treatment ofovarian cancer."Expert Opin Emerg Drugs 25(4):445-453)。免疫系统主要通过T细胞来清除体内的肿瘤细胞,而肿瘤细胞通过多种方法来逃逸免疫系统的杀伤。T细胞链接器是一类双特异性抗体,它可以同时结合到T细胞的CD3和肿瘤细胞的肿瘤相关性抗原(TAA)上(Labrijn,A.F.,et al.(2019)."Bispecific antibodies:amechanistic review of thepipeline."Nat Rev Drug Discov 18(8):585-608.)(Ellerman,D.(2019)."BispecificT-cell engagers:Towards understanding variables influencing the in vitropotency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacyand safety"Methods 154:102-117)。这种双特异性抗体通过同时结合到T细胞和肿瘤细胞,驱动细胞间形成免疫突触,激活T细胞对肿瘤细胞进行杀伤。博纳吐单抗(blinatumomab)作为第一个上市的T细胞链接器已经证实了这个理论的可行性,更多的T细胞链接器已经处于早期开发中而且被广泛用于治疗血液瘤和实体瘤(Goebeler,M.E.andR.C.Bargou(2020)."T cell-engaging therapies-BiTEs and beyond."Nat Rev ClinOncol 17(7):418-434.)。
因此,本领域存在获得新的基于CD3的双特异性抗体,特别是基于CD3和MUC16的双特异性抗体的针对癌症的疗法,包括产品或方法。
发明内容
本发明提供了一种药物组合,其包含特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体以及特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
本发明还包括将特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体与特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体组合用于预防或治疗疾病,例如预防或治疗癌症。
本发明还包括特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体的用途,其用于与特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体组合预防或治疗疾病,例如预防或治疗癌症;或者用于制备药物,所述药物用于与特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体组合预防或治疗疾病,例如预防或治疗癌症。
附图说明
图1.人源化抗CD3抗体Roche-CD3/017-Roche-CD3、DA023AH23L2(图1A)和017-2(图1B)激活Jurkat/NFAT-luc报告基因系统的结果。
图2.鼠源抗MUC16抗体776.1及其突变体的SDS-PAGE电泳结果(左图是非还原型SDS-PAGE电泳结果,右图是还原型SDS-PAGE电泳结果)。
图3.鼠源抗人MUC16抗体776.1及其突变体与表达人Muc16蛋白的293T细胞结合的流式细胞术检测结果。
图4.鼠源抗人MUC16抗体776.1及其突变体与表达恒河猴MUC16蛋白的293T细胞结合的流式细胞术检测结果。
图5.人源化抗MUC-16抗体Hu-L4H7与表达人MUC16蛋白的293T细胞结合的ELISA结果。
图6.人源化抗MUC-16抗体Hu-L4H7不结合人CA125的ELISA结果。
图7.肿瘤组织中MUC16及CD8的免疫组化检测结果。
图8.双特异性抗体分子的结构示意图
图9.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体结合OVCAR3细胞。
图10.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体结合293T/恒河猴MUC16细胞。
图11.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体结合Jurkat细胞。
图12.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在OVCAR3肿瘤细胞存在时激活Jurkat/NFAT-luc细胞。
图13.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在293T细胞存在时不激活Jurkat/NFAT-luc细胞。
图14.A:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体特异性介导T细胞杀伤肿瘤细胞;B:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体特异性介导T细胞杀伤OVCAR3肿瘤细胞的活性,孵育72小时
图15.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体激活T细胞后诱导释放细胞因子的结果,其中比较了分别与OVCAR3或者293T细胞共培养细胞因子IFNγ、TNFα以及IL-6因子的释放情况。
图16A.给药后各组肿瘤体积增长结果。
图16B.给药后各组肿瘤相对体积增长结果。
图17.TDCC实验中T细胞激活、衰竭和凋亡检测。
图18.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体特异性介导T细胞重复杀伤肿瘤细胞。
图19.TDCC重复杀伤实验中T细胞激活、衰竭和凋亡检测。
图20.各组动物给药后的肿瘤体积变化。
图21.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联用抗PD-1抗体药效肿瘤体积变化。
发明详述
应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂,因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案,而并不意图限制本发明的范围,其仅会由所附权利要求书限制。
I.定义
为了解释本说明书,将使用以下定义,并且只要适当,以单数形式使用的术语也可以包括复数,并且反之亦然。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10%的下限和比指定数字数值大10%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用,术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项或全部。
如本文中所用,术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤,但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如,当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时,也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
在本文中当提及“第一”“第二”时,仅为了区分两个结构域或两条链,而不以任何方式表明两个结构域的位置。
本文所使用的术语“CD3”指表达在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分的抗原,即T细胞衔接抗原T细胞表面糖蛋白CD3,其是由下列四条受体链中的二条链所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成:CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人类CD3-ε(hCD3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot:P07766中所述的氨基酸序列。人类CD3-δ(hCD3δ)包含UniProtKB/Swiss-Prot:P04234中所述的氨基酸序列。在一些实施方案中,本发明所述的CD3是指来自人或猴(例如食蟹猴)的CD3。
本文所使用的术语“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”包含特异性识别单一CD3亚单元(例如ε、δ、γ或ζ)或与其结合的抗体和其抗原结合片段,以及特异性识别两个CD3亚单元的二聚复合物(例如,γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)以及与其连结的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可与可溶性CD3、结合CD3和/或细胞表面表达的CD3结合。可溶性CD3包含天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变异体,例如,缺乏跨膜区或另外不与细胞膜结合的单体和二聚体CD3结构。在一个实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段(例如ScFv)或双特异性抗体中的结合CD3中的抗原结合区可以对CD3或表达CD3的细胞(例如T细胞)具有较低的结合活性。可以通过流式细胞术检测或生物膜层光学干涉技术检测,例如实施例6.5或实施例10.2中所述测定试验,检测抗体对CD3的结合亲和力。优选地,在本发明的双特异性抗体分子中,结合CD3的抗原结合区对人或猴(食蟹猴)CD3的结合亲和力在1-1000nM之间。在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体中的结合CD3中的抗原结合区以较低的结合亲和力结合人类和/或猴(例如食蟹猴)CD3从而能够激活人类和/或猴(例如食蟹猴)的T细胞。
本文所适应的术语“特异性结合PD-1的抗体”或“抗PD-1抗体”或“PD-1抗体”包含与PD-1特异性结合的任何抗体,所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)PD-1以致所述抗体可以用作靶向(人)PD-1的治疗剂。在一个实施方案中,所述(人)PD-1抗体在体外或体内以高亲和力结合(人)PD-1。本领域已知能够用于治疗的多种抗PD-1抗体,例如商业上可获得的抗体,例如默沙东的帕博利珠单抗、恒瑞的卡瑞利珠单抗、百济神州的替雷利珠单抗、信达生物的信迪利单抗、君实生物的特瑞普利单抗和BMS的纳武利尤单抗,或者例如WO2019/219064中公开的抗PD-1抗体。
效应细胞包含效应T细胞(T淋巴细胞),例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1、Th2和调节T细胞(Tregs)。效应细胞还可以包含自然杀伤细胞、巨噬细胞、粒细胞、浆细胞或B细胞(淋巴细胞)。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR),其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成,从氨基端到羧基端以如下顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是显示出多种效应子功能。在一些实施方案中,本发明的抗体重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区,优选的IgG1的重链恒定区。在一些实施方案中,重链恒定区包含LALA突变。在一些实施方案中,重链恒定区包含D265A和P329A突变。在一些实施方案中,重链恒定区包含LALA突变和D265A和P329A突变。在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体分子的重链恒定区包含“结入扣突变”。在一些优选的实施方案中,本发明的抗体重链恒定区HC
(i)包含与选自SEQ ID NO:18或21的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:18或21的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:18或21的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,本发明的抗体轻链恒定区LC为Lambda或Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中,本发明的抗体轻链恒定区LC
(i)包含与选自SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中,抗体片段为抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段,其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)。所述Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段,例如,通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。此外,通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2,其为Fab’的二聚体,是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原,由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段(其它抗体片段的更详细的描述请参见:基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul编辑,Raven Press,N.Y.(1993))。所述Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码,但是使用重组方法,可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性连接肽连接,在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。可以通过化学方法、重组DNA方法或蛋白酶消化法获得所述抗体片段。
“Fab片段”或“Fab”在本文中可互换使用,用于指,由两条多肽链组成的、包含免疫球蛋白重链可变结构域VH、重链恒定结构域CH1、轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL的免疫球蛋白片段,其中,一条多肽链从N端到C端包含VH和选自CH1和CL的一个恒定区,另一条多肽链从N端到C端包含VL和选自CL和CH1的另一恒定区,其中所述VH结构域和VL结构域配对形成抗原结合位点。在本文中,包含重链恒定区CH1的Fab链也称作“Fab重链”;相应地,包含轻链恒定区CL的Fab链也称作“Fab轻链”。
术语“靶标”是指结合分子所针对的被结合物。靶标可以是抗原,也可以是配体或受体。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化,或两者兼有。技术人员将理解,任何大分子,包括基本上所有的蛋白质或肽,都可以用作抗原。此外,抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用,术语“表位”指抗原中与抗体分子特异性相互作用的部分。
如本文所用的术语“靶标结合区”是指多特异性结合分子,例如双特异性结合分子的结合特定靶标或抗原的部分。靶标结合区可以是例如抗体或免疫球蛋白本身或抗体片段。这种靶标结合区可以具有或可以不具有独立于双特异性抗体分子的剩余部分的三级结构,并且可以作为单独实体结合或不结合其靶标。靶标结合区还可以是受体或配体,或受体的能够结合配体的结构域。在多特异性抗体或双特异性抗体时,也将“靶标结合区”称为“抗原结合区”。在一个实施方案中,用于本发明双特异性抗体分子的抗原结合区包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)组成的VH/VL对,所述VH/VL对可以包含在单一多肽链(例如在scFv)中或包含在分离的两条多肽链(例如分别在Fab重链和Fab轻链)中。
如本文所用,术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体,所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。如本文所用,术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体,其中至少一个抗原位点,相对于其余的抗原结合位点,结合不同的抗原表位,例如,相同抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位。例如,本发明提供了针对CD3和MUC16的双特异性抗体。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如,IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端,每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH),也称作重链可变结构域,随后是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地,从N端至C端,每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL),也称作轻链可变结构域,随后是一个轻链恒定结构域(CL)。免疫球蛋白的重链可以归属5个类别之一,称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM),其中某些类别可以进一步划分成亚类,例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一,称作κ和λ。IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区(Fc二聚体)组成。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3,从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中,各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派方案的任一种或其组合确定,所述指派方案包括例如:基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883,Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997)),基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath),Contact(University College London),国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上),以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
除非另有说明,否则在本发明中,术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明,否则在本发明中,当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时,是指根据Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的Kabat编号系统的编号位置。
在一本实施方案中,本发明抗体中的HCDR和LCDR按照Kabat方案确定。
应该注意,基于不同的指派方案获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派方案下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此,在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时,所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体,其可变区序列包含所述的具体CDR序列,但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派方案规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
术语“Fc结构域”或“Fc区”或“Fc片段”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如,在天然抗体中,免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域);或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明,否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5257969/)中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号,还参见http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html。在本文中,术语“Fc结构域”或“Fc区”或“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL,但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区,例如EPKSS或EPKSC。在一些实施方案中,适用于本发明的重链恒定区Fc来自抗体重链恒定区,例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区,优选来自IgG1的恒定区。在一些实施方案中,Fc区包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如LALA突变、D265A突变和/或P329A突变,优选地包含LALA突变和D265A和P329A突变。在一些实施方案中,Fc包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,或包含与其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。在本发明的一些实施方案中,Fc片段二聚化构成Fc二聚体。在一些实施方案中,Fc片段异二聚化为Fc异二聚体。在Fc片段异二聚化为异二聚体的情况下,Fc片段可以包含用于异二聚化的突变,例如结入扣突变。
免疫球蛋白的“效应子功能”的例子包括:C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子,其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换,从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如,酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接;或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如,小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区,该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性,同时如与原始小鼠抗体相比,具有在人类中降低的免疫原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性,同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即,将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用,术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对靶标或抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。结合位点与特定靶标或抗原结合的能力可以通过流式细胞术或酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)表示,解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是Kdis和Kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
氨基酸序列的“同一性百分数(%)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后,并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时,候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中,本发明考虑本发明抗体分子的变体,所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性,例如同一性为至少80%,85%,90%,95%,97%,98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性改变,或为保守性修饰变体。
对于多肽序列,“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加,但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如,保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中,术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80%,85%,90%,95%,98%,99%或更高,例如100-110%或更高的结合亲和力。
“knob-in-hole”突变或“结入扣”突变或“杵臼”在本文中用于指,利用“结入扣”技术,在第一Fc多肽和第二Fc多肽中分别引入突变,以在第一Fc多肽的界面上与在第二Fc多肽的界面上形成凸起(“结(knob)”)和互补的空穴(“扣(hole)”)。本领域已知,“结入扣”技术可在抗体分子的不同链之间改造界面,以促进抗体分子的各链正确缔合。通常,该技术涉及在一条链的界面引入“凸起/结”,在欲与之配对的另一条链的界面引入相应的“空穴/扣”,使得凸起可置于空穴中。一个优选的界面包含一条链的重链恒定结构域的CH3结构域和欲与之配对的另一条链的重链恒定结构域的CH3结构域。可通过将来自一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面的小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)来构建凸起。通过将大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸),在欲配对的另一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面构建与凸起相同或相似大小的补偿性空穴。另一可选的界面是上文所述Fab片段的包含轻链的CL结构域和重链的CH1结构域,通过构建凸起-空穴相互作用促进Fab片段的两条链之间发生正确的异二聚化。
“单链可变片段”或“scFv”在本文中用于指,包含由接头连接的重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL的单链抗体片段,其中VH和VL配对形成抗原结合位点。
在本文中,抗体恒定区或抗体恒定结构域,包括CH1,CL和Fc结构域以及构成Fc结构域的CH2,CH3和可选的CH4结构域,可以根据抗体分子的预期功能进行选择。例如,恒定区可以是IgA,IgD,IgE,IgG或IgM区,尤其是人IgG的免疫球蛋白恒定结构域,例如,人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的恒定结构域,优选人IgG1的恒定结构域。作为一个例子,抗体的Fab片段可以包含来自IgG1的CH和CL恒定区。作为再一例子,抗体的Fc区可以包含来自IgG1的CH2和CH3结构域。免疫球蛋白恒定区可以具有天然序列或变体序列。
如本文所用的术语“接头”是指使得能够直接连接双特异性结合分子的不同部分的任何分子。在不同分子部分之间建立共价连接的接头的实例包括肽接头和非蛋白质聚合物,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些实施方案中,接头是肽接头(又称为“连接肽”),其是指是指由氨基酸组成的短氨基酸序列,例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T),或来自免疫球蛋白的铰链区,用于将结合分子的第一部分的氨基酸序列连接至结合分子的第二部分。例如,肽接头可以将结合分子的第一靶标结合区连接至第二靶标结合区。例如,肽接头也可以将抗体的一部分连接至抗体的另一部分,诸如将轻链可变区连接至重链可变区。优选地,所述肽接头具有这样的长度,其足以连接两个实体,其方式使得它们维持它们相对于彼此的构象,使得不妨碍期望的活性。在一个实施方案中,连接肽具有5-50个氨基酸长度,例如,10,15,20,25,30个氨基酸长度。在一个实施方案中,连接肽包含氨基酸序列(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数。有用的接头还包括甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。在一些实施方案中,所述肽接头是(GGGGS)n,其中n=1、2、3或4,例如SEQ IDNO:12所示的序列。
在再一实施方案中,连接肽为来自免疫球蛋白的铰链区或铰链区部分,包括天然的铰链区或其部分,或者突变的铰链区或其部分。在一个实施方案中,连接肽例如是免疫球蛋白(例如IgG,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区或其部分(例如EPKSC)或是突变的铰链区或其部分,例如EPKSS。或者,可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构,或通过噬菌体展示方法,来合理地设计合适的柔性连接肽。
术语“半数有效浓度(EC50)”是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50%的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞,包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统,包括真核细胞,例如,哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞;和原核细胞,例如,大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞,也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体,其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件;用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些,包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如,裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如,慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用,是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。特别地,个体是人。
术语“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中,具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常,在癌症的背景中,术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前,特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤,例如癌症中有效的任何物质,包括化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学化合物。术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂,小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂或免疫激动剂。在一些实施方案中,本发明的免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂或免疫检查点激动剂。术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量,其以单一或多次剂量施用患者后,在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量,其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象,“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40%、甚至更优选地至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需预防结果的量。通常,由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用,故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。术语“肿瘤”涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“抗肿瘤作用”或“抑瘤作用”或“肿瘤抑制作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果,包括但不限于例如,肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物,其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药物组合或组合产品”是指非固定组合或固定组合(非固定组合产品或固定组合产品),包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如,(i)本发明的抗体、以及(ii)PD-1抗体)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者,其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择,从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式,其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂,例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者,这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外,这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下,治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织,像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品;血液或任何血液组分;体液,诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液;来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。在一些实施方案中,组织样品是肿瘤组织。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物,诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
II.药物组合物、药物组合和试剂盒
本发明一方面提供了一种药物组合物,其包含本文所述的特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明一方面提供了一种药物组合或药物组合产品,其包含本文所述的特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体或多特异性抗体或包含其的药物组合物或药物或制剂,以及特异性结合PD-1或PD-L1或PD-L2的抗体或包含其的药物组合物或药物或制剂。
在一些实施方案中,本发明的所述药物组合物或药物或制剂还可以包含合适的药用辅料,如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂,包括缓冲剂。如本文所用,“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药用辅料的使用及其用途,亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。本发明的药物组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型,如液态溶液剂(例如,注射液或滴眼液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物或制剂,例如以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明所述的药物组合还可以包含一种或多种其他治疗剂。在一些实施方案中,所述治疗剂是被治疗的特定适应证所需的,优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些治疗剂。例如,理想的是还提供其它治疗剂。
本发明还提供了药物组合或药物组合产品,其包含本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体,以及一种或多种其它治疗剂,例如特异性结合PD-1或PD-L1或PD-L2的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了包含所述药物组合的成套药盒,例如所述成套药盒在同一包装内包含:
-含有包含本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的药物组合物的第一容器;
-含有包含抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体的药物组合物的第二容器。
在一些实施方案中,所述成套药盒还可以包含含有其他治疗剂的药物组合物的第三容器。
在一些实施方案中,所述其他治疗剂例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂或免疫激动剂)。
本发明一方面提供了包含本文所述的任何双特异性抗体或多特异性抗体的免疫缀合物。优选地,所述免疫缀合物包含一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒素或小分子化合物)或标记物。可以理解,在本文所述的各种实施方案中,双特异性抗体或多特异性抗体可以被免疫缀合物所替换。
III.抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体或包含其的组合或组合产品的用途和应用其的方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗疾病的方法,包括向受试者施用本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体,或包含其的免疫缀合物、组合物或药物或制剂。在一些实施方案中,本发明提供了在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)的方法,包括向受试者施用本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体,或包含其的免疫缀合物、组合物或药物或制剂。在其他方面,本发明提供本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体或包含其的免疫缀合物或组合物在生产或制备药物中的用途,所述药物用于本文所述的用途,例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
本发明另一方面提供了在受试者中预防或治疗疾病的方法,包括向受试者施用本发明的药物组合或组合产品。在一些实施方案中,本发明提供了在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)的方法,包括向受试者施用本发明的药物组合或组合产品。在其他方面,本案发明提供了本发明的药物组合或组合产品在生产或制备药物中的用途,所述药物用于本文所述的用途,例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症或用于在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)。
本发明的另一方面提供了在受试者中预防或治疗疾病的方法,包括向受试者施用本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体,或包含其的免疫缀合物、组合物或药物或制剂,以及特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。在一些实施方案中,本发明提供了在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)的方法,包括向受试者施用本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体,或包含其的免疫缀合物、组合物或药物或制剂,以及特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
本发明的另一方面提供了本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的用途,其用于与特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体组合,用于本文所述的用途,例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症,或用于在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)
本发明的另一方面提供了本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的用途,其用于生产或制备药物,所述药物用于与特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体组合,用于本文所述的用途,例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症,或用于在受试者中特异性激活T细胞(例如进而增强、刺激或增加受试者中的免疫反应)。
在一些实施方案中,所述疾病例如肿瘤,例如癌症。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。在一些实施方案中,癌症可以是实体肿瘤或血液肿瘤。在一些实施方案中,所述癌症是卵巢癌、结肠癌、直肠癌或结直肠癌。
在一些实施方案中,所述的卵巢癌症是与卵巢细胞异常增殖相关的癌症,其包含一组异质性病变,最常见的是源自上皮细胞类型的那些病变。在一个实施方案中,卵巢癌症例如是卵巢癌,尤其是浆液性卵巢癌,例如卵巢浆液性囊腺癌、卵巢癌浆液性腺癌、卵巢癌粘液腺癌、子宫内膜样腺癌、卵巢癌透明细胞腺癌。
在一些实施方案中,所述疾病治疗将受益于激活CD3信号通路和/或激活T细胞。
在一些实施方案中,所述癌症是表征为具有升高的MUC16的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)的癌症,例如,所述癌症的肿瘤细胞中具有升高的MUC16的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高),例如相比健康受试者的相同组织中的MUC16的蛋白质水平和/或核酸水平,或相比患者肿瘤组织相邻的健康组织中的MUC16的蛋白质水平和/或核酸水平。
在一些实施方案中,所述癌症是表征为具有升高的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)的癌症,例如,所述癌症的肿瘤细胞中具有升高的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高),例如相比健康受试者的相同组织中的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平,或相比患者肿瘤组织相邻的健康组织中的PD-1、PD-L1或PD-L2的蛋白质水平和/或核酸水平。
在一些实施方案中,所述癌症是表征为具有升高的MUC16和PD-1(或PD-L1或PD-L2)的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)的癌症,例如,所述癌症的肿瘤细胞中具有升高的MUC16和PD-1(或PD-L1或PD-L2)的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高),例如相比健康受试者的相同组织中的MUC16和PD-1(或PD-L1或PD-L2)的蛋白质水平和/或核酸水平,或相比患者肿瘤组织相邻的健康组织中的MUC16和PD-1(或PD-L1或PD-L2)的蛋白质水平和/或核酸水平。患者或受试者可以是哺乳动物,例如,灵长类,优选地,高级灵长类,例如,人类(例如,患有本文所述癌症或具有患有本文所述癌症的风险的患者)。在某些实施方案中,受试者接受或已经接受过其它治疗,例如化疗治疗和/或放射疗法。
在一个实施方案中,本文公开的抗MUC16抗体不结合循环中的游离CA125分子,仅结合细胞表面表达的与细胞膜结合的MUC16分子。治疗有效量的抗MUC16抗体或抗CD3×MUC16双特异性抗体可以特异性地结合表达MUC16分子的癌症细胞(例如特异性表达MUC16的癌症细胞,例如卵巢癌症细胞),有助于提高免疫系统对癌细胞的杀伤,从而达到治疗目的。
本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合或组合产品等)可以通过任何合适的方法给药,包括肠胃外给药,肺内给药和鼻内给药,并且,如果局部治疗需要,病灶内给药。肠胃外注射或输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下注射或输注。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定,可通过任何适合途径,例如通过注射,例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程,包括,但不限于,单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病,本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合或组合产品等)的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂(例如特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体或其抗原结合片段)组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答,和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂等)或本发明的药物组合或组合产品还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用,用于本文所述的方法或用途,例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中,所述治疗方式例如手术或放疗。
在一些实施方案中,所述其他治疗剂例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
IV.双特异性抗体
本发明的特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体或多特异性抗体包含针对MUC16的第一结合特异性和针对CD3的第二结合特异性,以及任选地一种或多种的针对其他分子的其他结合特异性。
因此,本发明的一个方面涉及一种双特异性抗体,其包含
第一抗原结合区和第二抗原结合区,其中第一抗原结合区特异性结合MUC16,和/或第二抗原结合区特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一抗原结合区来自抗MUC16抗体或其抗原结合片段,例如是抗MUC16抗体的Fab片段。在一些实施方案中,第一抗原结合区来自本文所述的抗MUC16抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,第二抗原结合区来自抗CD3抗体或其抗原结合片段,例如所述抗CD3抗体是SP34抗体或其人源化抗体,例如本文所述的抗CD3人源化抗体,例如是抗CD3抗体的scFv片段。
适用于本发明的双特异性抗体的第一抗原结合区可以包含本发明的抗MUC16全长抗体或其抗原结合片段,或由其组成,只要其能够特异性结合MUC16即可,包括但不限于,例如特异性结合MUC16的全长抗体、单链Fv、Fab、Fab'、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体等。
适用于本发明的双特异性抗体的第二抗原结合区可以包含抗CD3全长抗体或其抗原结合片段,或由其组成,只要其能够特异性结合CD3即可,包括但不限于,例如特异性结合CD3的全长抗体、单链Fv、Fab、Fab'、(Fab)2、单域抗体、VHH或重链抗体等。
在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体是IgG样双特异性抗体。本文所述的“IgG样双特异性抗体”是指包含Fc二聚体的双特异性抗体。因此,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体包含Fc二聚体。
在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体是IgG样双特异性抗体,其包含Fab片段作为一个抗原结合区和scFv片段作为另一个抗原结合区。在一些实施方案中,所述IgG样双特异性抗体包含特异性结合MUC16的Fab片段作为第一抗原结合区,且包含特异性结合CD3的scFv作为第二抗原结合区。
本发明的双特异性抗体结构
在一些实施方案中,本发明提供了一种双特异性抗体,其包含一个或两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
(1)特异性结合第一抗原的第一Fab片段在Fab重链的CH1的C末端融合至Fc异二聚体的Fc区之一(例如包含结的Fc区或包含扣的Fc区)的CH2或铰链区;特异性结合第一抗原的第二Fab片段在Fab重链的CH1的C末端融合特异性结合第二抗原的scFv片段的N末端(例如VH或VL的N末端),且所述scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc异二聚体的另一Fc区(例如包含扣的Fc区或包含结的Fc区)的CH2或铰链区;例如如图8A所示的结构;
(2)特异性结合第一抗原的Fab片段在Fab重链的CH1的C末端融合至Fc异二聚体的Fc区之一(例如包含结的Fc区或包含扣的Fc区)的CH2或铰链区;特异性结合第二抗原的scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc异二聚体的另一Fc区(例如包含扣的Fc区或包含结的Fc区)的CH2或铰链区;例如如图8B所示的结构;或
(3)特异性结合第一抗原的第一Fab片段在Fab重链的CH1的C末端融合至特异性结合第一抗原的第二Fab片段的VH的N末端,且所述第二Fab片段在Fab重链的CH1的C末端融合至Fc异二聚体的Fc区之一(例如包含结的Fc区或包含扣的Fc区)的CH2或铰链区;特异性结合第二抗原的scFv片段的C末端(例如VL或VH的C末端)融合至Fc异二聚体的另一Fc区(例如包含扣的Fc区或包含结的Fc区)的CH2或铰链区;例如如图8C所示的结构。
在一些实施方案中,融合包括直接融合或通过接头融合。
因此,在一些实施方案中,本发明涉及一种双特异性抗体,其为IgG样双特异性抗体,其包含两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
第二Fab片段的CH1的C末端融合所述scFv片段的VH的N末端,且所述scFv片段的C末端融合至第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
在另一些实施方案中,本发明涉及一种双特异性抗体,其为IgG样双特异性抗体,其包含一个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
所述Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至包含第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述Fab片段的VL-CL构成轻链。
在另一些实施方案中,本发明涉及一种双特异性抗体,其为IgG样双特异性抗体,其包含两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端,且第二Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;且
所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
在一些实施方案中,第一抗原选自MUC16(例如人MUC16)。在一些实施方案中,第二抗原为CD3(例如人CD3)。
在一些实施方案中,第一Fc区包含结突变(knob突变),且第二Fc区包含扣突变(hole突变)。在一些实施方案中,第一Fc区包含扣突变,且第二Fc区包含结突变。
在一些实施方案中,所述scFv片段的C末端为scFv片段的VL的C末端。在一些实施方案中,所述scFv片段的N末端为ScFv片段的VH的N末端。
适用于本发明的双特异性抗体的Fab片段
在一些实施方案中,作为双特异性抗体抗原结合区之一的Fab片段由包含抗体VH、CH1、VL和CL结构域的两条多肽链组成,其中所述VH与VL配对且所述CH1与CL配对以形成抗原结合区。在一些实施方案中,在Fab中,一条链从N端到C端包含VH和CH1(即,VH-CH1),另一条链从N端到C端包含VL和CL(即,VL-CL)。
在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,Fab可以通过包含VH的链的C端融合在抗体的Fc结构域的N端或通过另一抗原结合区例如scFv片段融合在抗体的Fc结构域的N端,其中Fc结构域可以包含或不包含铰链区(例如EPKSS或EPKSC)。优选地,所述Fab包含VH-CH1链和VL-CL链,并通过VH-CH1链的CH1的C末端与抗体Fc结构域融合,其中Fc结构域可以包含或不包含铰链区(例如EPKSS或EPKSC)。在本文中,与Fc二聚体连接的Fab链也称作Fab重链,而未与Fc二聚体连接的Fab链也称作Fab轻链。在一些实施方案中,所述融合是直接融合,或通过接头融合。
在一些实施方案中,Fab中的CH1还可以包含部分铰链区,例如EPKSS或EPKSC,以便于形成稳定结构,例如利于制备多特异性抗体。在与Fab的重链融合的Fc不包含该部分铰链区时,或者在Fab重链与非Fc结构域融合时,可以在CH1的C末端包含所述部分铰链区,以便于形成稳定结构。在与Fab的重链融合的Fc包含该部分铰链区时,所述Fab重链的CH1的C末端可以不包含所述部分铰链区。
在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体中包含的Fab片段特异性结合MUC16。在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体中包含的Fab片段来自本发明的抗MUC16抗体,其包含本发明的抗MUC16抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL。
在一些实施方案中,所述Fab重链包含VH和CH1,其中VH为本发明的抗MUC16抗体的VH。在一些实施方案中,所述CH1是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1,优选地来自IgG1的CH1。在一些实施方案中,所述CH1
(i)包含与选自SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:17的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个或10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,所述Fab轻链包含VL-CL,其中VL为本发明的抗MUC16抗体的VL。在一些实施方案中,所述CL是来自抗体kappa或lamda轻链的轻链恒定区,优选地来自Kappa轻链的轻链恒定区。在一些实施方案中,所述CL为本发明的抗MUC16抗体的轻链恒定区。在一些实施方案中,所述Fab轻链为本发明的抗MUC16抗体的轻链。
适用于本发明的双特异性抗体的scFv
在一些实施方案中,作为双特异性抗体结合区之一的scFv片段由包含抗体VH和VL结构域的一条多肽链组成,其中所述VH和VL连接(例如通过接头)以配对形成抗原结合位点。在一些实施方案中,所述scFv为反式构型,从N端到C端包含:VH、接头、和VL(VH-接头-VL)。在另一些实施方案中,所述scFv为顺式构型,从N端到C端包含:VL、接头、和VH(VL-接头-VH)。在一些实施方案中,接头为由氨基酸残基组成的肽接头。适宜的肽接头是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中,接头为5-50个氨基酸长度,例如5-30个氨基酸长,例如15个氨基酸或20个氨基酸长度。在一个实施方案中,接头包含氨基酸序列(G4S)n,其中n=1,2,3,4或5,优选地,n=3或4,更优选地,n=3。
在一些优选的实施方案中,包含在本发明抗体分子中的scFv抗原结合位点为二硫键稳定的scFv。
在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv可以通过链C端融合在抗体的Fc结构域的N端。在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv在链的N端融合在另一抗原结合区(例如Fab重链)的C端,且在链的C端融合在抗体Fc结构域的N端。
在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv可以通过包含VL的链C端融合在抗体的Fc结构域的N端。在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv在VH链的N端融合在另一抗原结合区(例如Fab重链)的C端,且在VL链的C端融合在抗体Fc结构域的N端。
在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv可以通过包含VH的链C端融合在抗体的Fc结构域的N端。在一些实施方案中,在所述双特异性抗体中,scFv在VL链的N端融合在另一抗原结合区(例如Fab重链)的C端,且在VH链的C端融合在抗体Fc结构域的N端。
在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体中包含的scFv特异性结合CD3。在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体中包含的scFv来自本发明的抗CD3抗体,其包含本发明的抗CD3抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL。
适用于本发明双特异性抗体的Fc二聚体
在一个实施方案中,本发明双特异性抗体中的两个Fc区二聚化形成二聚Fc。优选地,两个Fc区异二聚化形成异二聚Fc。
在一些实施方案中,第一和第二Fc区相同。在另一些实施方案中,第一Fc区和第二Fc区不同,两者配对并异二聚化。
适用于本发明抗体分子的Fc区片段可以是任何抗体Fc区。Fc区可以包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然序列Fc结构域涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc序列,例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区(Gestur Vidarsson等,IgG subclasses and allotypes:fromstructure to effector functions,20October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)。例如,本发明抗体的Fc区可以包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。在一些实施方案中,抗体Fc区还可以在N端带有IgG铰链区或部分IgG铰链区,例如,IgG1铰链区或部分IgG1铰链区。在所述铰链区中可以含有突变。在一些实施方案中,部分铰链区可以是EPKSS或EPKSC。
优选地,本发明抗体的Fc区从N端到C端包含:CH2-CH3,或从N端到C端包含:铰链区-CH2-CH3。在一些实施方案中,适用于本发明抗体或双特异性抗体的Fc区为人的IgG Fc,例如,人IgG1 Fc,人IgG2 Fc,人IgG3或人IgG4 Fc。在一个实施方案中,Fc区包含氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。
可以将本发明的抗体或双特异性抗体中的Fc区进行突变以获得所需的特性。本领域已知对Fc区的突变。
在一个实施方案中,在Fc区的效应子功能(例如Fc区的补体激活功能)的特性上修饰Fc区。在一个实施方案中,所述效应子功能相对于野生同种型Fc区已经被降低或消除。在一个实施方案中,通过选自以下的方法来降低或消除效应子功能:使用天然具有降低或消除的效应子功能的Fc同种型、和Fc区修饰。
在一个优选的实施方案中,Fc区具有减少的由Fc区介导的效应子功能,例如减少的或消除的ADCC或ADCP或CDC效应子功能,例如包含实现上述功能的突变。如本领域技术人员理解的,根据本发明抗体分子的预期用途,本发明抗体分子也可以在Fc结构域中包含改变对一种或多种Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中,所述Fc受体是Fcγ受体,特别地是人Fcγ受体。在一些实施方案中,所述Fc区包含降低与Fcγ受体结合的突变。例如,在一些实施方案中,用于本发明的Fc区具有降低与Fcγ受体结合的L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个。在一些实施方案中,用于本发明的Fc区具有降低与Fcγ受体结合的L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。在再一优选的实施方案中,Fc片段可以具有导致增加的血清半衰期的突变,例如改善Fc片段与FcRn结合的突变。在一些实施方案中,包含降低与Fcγ受体结合的突变的Fc区包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或与其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中,所述Fc区包含与SEQ ID NO:19具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。
如本领域技术人员理解的,为了促进本发明的双特异性抗体作为异二聚体的形成,本发明双特异性抗体所包含的Fc区可以包含利于异二聚化的突变。在一个实施方案中,在两个Fc区的CH3区中引入突变。
本领域已知促进Fc区异二聚化的方法。例如,第一Fc区的CH3区和第二Fc区的CH3区以互补方式进行工程化改造使得每个CH3区(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3区异二聚化(使得第一和第二CH3区异二聚化且两个第一CH3区或两个第二CH3区之间不形成同二聚体)。
优选地,基于结入扣(Knob-in-Hole)技术,在第一单体Fc区和第二单体Fc区中分别引入相应的结(knob)突变和扣(Hole)突变。此技术参见例如Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG."Nat Biotechnol 16(7):677-681。
在一个特定的实施方案中,在一个Fc区的CH3区中,第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)(结突变);而在另一个Fc区的CH3区中,第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)(扣突变),任选地366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照EU索引)。
在又一个实施方案中,在一个Fc区的CH3区中,结突变包括或由下述组成:第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)且第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换);而在另一个Fc区的CH3区中,扣突变包括或由下述组成:第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V),任选地366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照EU索引),任选地第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照EU索引)。在一个具体的实施方案中,一个Fc区包含氨基酸替代S354C和T366W(结突变),且另一个Fc区包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(扣突变)(编号方式依照EU索引)。
因此,在一个具体的实施方案中,本发明的双特异性抗体包含的两个Fc区异二聚化,其中
a)一个Fc-区多肽包含突变T366W,而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V,或
b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C,而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C,或
c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C,而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C;
任选地,所述Fc区还包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如,L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个;例如L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。
在一些实施方案中,Fc区还包含其他利于异二聚体纯化的突变。例如,可以将H435R突变(Eric J.Smith,,Scientific Reports|5:17943|DOI:10.1038/srep17943)引入异二聚体的Fc区之一中(例如,带Hole突变的Fc区),以利于使用蛋白A纯化异二聚体。在另一些实施方案中,对于包含铰链区的异二聚体单体,也可以在铰链区中引入突变,例如C220S,以利于异二聚体的形成。
在一个具体的实施方案中,本发明的双特异性抗体的两个Fc区异二聚化,其中
第一Fc区包含结突变,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或27或与其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成;在一些实施方案中,所述Fc区包含与SEQ ID NO:16或27具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和结突变(例如S354C和T366W);在一些实施方案中,所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC;
第二Fc区包含扣突变,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、15或26与其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中,所述Fc区包含与SEQ ID NO:14、15或26具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和结突变;在一些实施方案中,所述Fc区包含或不包含铰链区EPKSS或EPKSC。
V.人源化CD3抗体
本发明一方面提供一种人源化的CD3抗体,其具有更佳的与CD3的结合亲和力,从而更适用于构建双特异性抗体分子中的抗原结合区。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段以所需的亲和力结合CD3(例如人CD3或猴CD3例如食蟹猴CD3)。在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段能够既结合人CD3,又结合猴CD3例如食蟹猴CD3。在一些实施方案中,通过生物膜薄层干涉测定技术或表面等离子共振法测定抗体的亲和力。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体,以下平衡解离常数(KD)与人CD3或猴CD3例如食蟹猴CD3结合,所述KD在大约1nM-1000nM之间。在一些实施方中,本发明的抗CD3抗体,以大约10nM-100nM,或20nM-100nM或50nM-100nM之间的KD与猴CD3例如食蟹猴CD3结合。在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体大约100-1000nM之间(例如大约200、300、400或500-1000nM之间)的KD与人CD3结合。
在一些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段与效应细胞表面的CD3结合。在一些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段能够激活效应细胞。在一些实施方案中,效应细胞为T细胞。在一些实施方案中,利用流式细胞术检测所述结合。在一些实施方案中,利用报告基因检测系统(例如Jurkat/NFAT-luc报告基因系统)检测CD3抗体的激活作用。
在一些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段能够激活效应细胞诱导对肿瘤细胞的杀伤。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区HC。在一些实施方案中,本发明抗CD3抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区LC。在一些实施方案中,本发明抗CD3抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区HC和轻链恒定区LC。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体重链可变区VH
(i)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体轻链可变区VL
(i)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明抗CD3抗体的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:3中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中,本发明抗CD3抗体的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:4中任一项所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体中,
HCDR1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;HCDR2包含SEQID NO:6的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和/或LCDR3包含SEQID NO:10的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含VH和VL,其中
所述VH含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,和所述VL含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:3中所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,和如SEQ IDNO:4所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:5所示的HCDR1、如SEQ ID NO:6示的HCDR2、如SEQ ID NO:7示的HCDR3;如SEQ IDNO:8示的LCDR1、如SEQ ID NO:9示的LCDR2和如SEQ ID NO:10的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中,本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在优选的实施方案中,本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地,本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。优选的,本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换,优选地保守置换。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性:
(i)显示与本发明抗体对CD3相同或相似的结合亲和力和/或特异性;
(ii)抑制(例如,竞争性抑制)本发明抗体与CD3的结合;
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位;
(iv)与本发明抗体竞争结合CD3;
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体,例如,为IgG1形式的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗CD3抗体的轻链恒定区为kappa或lamda轻链恒定区,例如lamda轻链恒定区。
在一些实施方案中,抗CD3抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,抗CD3抗体是人源化的。
在一个实施方案中,本发明的抗CD3抗体还涵盖其抗体片段(例如抗原结合片段),优选地选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
在一个实施方案中,本发明的抗CD3抗体片段是scFv,包含本文所述的VH和VL,以及连接肽,其中例如连接肽为(GGGGS)n,其中n=1、2、3、4或5,例如n=3或4,例如SEQ IDNO:12所示的接头。在一些实施方案中,scFv包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,或包含与其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中,本发明的抗CD3抗体是单链抗体,其包含抗CD3抗体片段scFv和重链恒定区Fc(任选地所述Fc区包含铰链区),或由scFv和重链恒定区Fc(任选地所述Fc区包含铰链区)组成。
在一些实施方案中,本发明的抗CD3单链抗体包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,或包含与其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一个方面,本发明提供了靶向人CD3的抗CD3抗体或其抗原结合片段,其具有如下优点:
1)高特异性结合人CD3以及表达人CD3的靶细胞;
2)适合作为基因工程构件;
3)低免疫原性。
在一个实施方案中,所述抗CD3抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一个具体的实施方案中,所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含:
1)序列如SEQ ID NO:3所述的重链可变区(VHCD3)或与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链可变区;和
2)序列如SEQ ID NO:4所述的轻链可变区(VLCD3)或与SEQ ID NO:4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链可变区。
在另一个具体的实施方案中,所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含:
1)序列如SEQ ID NO:1所示的重链(H)或与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链;和
2)序列如SEQ ID NO:2所述的轻链(L)或与SEQ ID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链。
在一个实施方案中,所述抗CD3抗体的抗原结合片段是Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2;线性抗体;单链抗体(例如scFv)。在一个具体实施方案中,所述抗CD3抗体的抗原结合片段是scFv,其包含如SEQ ID NO:11所示的序列或与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。在另一个实施方案中,所述抗CD3抗体包含scFv和Fc区,其包含如SEQ ID NO:13所示的序列或与SEQ ID NO:13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。
VI.MUC16抗体
本发明提供了靶向人MUC16的抗MUC16抗体、其具有以下一种或者多种优点:
(1)高亲和力结合MUC16(例如人或猴MUC16)、表达人MUC16的靶细胞;
(2)不结合循环中游离的CA125;
(3)适合作为基因工程构件;
(4)低免疫原性;
(5)表达纯度高;
(6)人源化之后仍然具有高亲和力。
在一个实施方案中,所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区HC。在一些实施方案中,本发明抗MUC16抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区LC。在一些实施方案中,本发明抗MUC16抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区HC和轻链恒定区LC。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体重链可变区VH
(i)包含与SEQ ID NO:30或51的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:30或51的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:30或51的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体轻链可变区VL
(i)包含与SEQ ID NO:34、38、40或52的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:34、38、40或52的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:34、38、40或52的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明抗MUC16抗体的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:30或51中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中,本发明抗MUC16抗体的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:34、38、40或52中任一项所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体中,
HCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;HCDR2包含SEQID NO:32的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;HCDR3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;LCDR1包含SEQ ID NO:35、39或41的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;LCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;和/或LCDR3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含VH和VL,其中
所述VH含有SEQ ID NO:30或51所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,和所述VL含有SEQ ID NO:34、38、40或52所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:30或51中所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,和如SEQ ID NO:34、38、40或52所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:31所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32示的HCDR2、如SEQ ID NO:33示的HCDR3;如SEQ ID NO:35、39或41示的LCDR1、如SEQ ID NO:36示的LCDR2和如SEQ ID NO:37的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中,本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在优选的实施方案中,本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地,本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。优选的,本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换,优选地保守置换。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性:
(i)显示与本发明抗体对MUC16相同或相似的结合亲和力和/或特异性;
(ii)抑制(例如,竞争性抑制)本发明抗体与MUC16的结合;
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位;
(iv)与本发明抗体竞争结合MUC16;
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体,例如,为IgG1形式的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗MUC16抗体的轻链恒定区为kappa或lamda轻链恒定区,例如lamda轻链恒定区。
在一些实施方案中,抗MUC16抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,抗MUC16抗体是人源化的。
在一个实施方案中,本发明的抗MUC16抗体还涵盖其抗体片段(例如抗原结合片段),优选地选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
在一个具体的实施方案中,所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含VH和VL,其中:
1)所述VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,所述VL包含如SEQ ID NO:35所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;或
2)所述VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,所述VL包含如SEQ ID NO:39所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;或
3)所述VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,所述VL包含如SEQ ID NO:41所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;或
在一个具体的实施方案中,所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含:
1)序列如SEQ ID NO:30所述的VH或与SEQ ID NO:30具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH;和序列如SEQ ID NO:34所述的VL或与SEQ ID NO:34具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL;或
2)序列如SEQ ID NO:30所述的VH或与SEQ ID NO:30具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH;和序列如SEQ ID NO:38所述的VL或与SEQ ID NO:38具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL;或
3)序列如SEQ ID NO:30所述的VH或与SEQ ID NO:30具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH;和序列如SEQ ID NO:40所述的VL或与SEQ ID NO:40具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL;或
4)序列如SEQ ID NO:51所述的VH或与SEQ ID NO:51具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VH;和序列如SEQ ID NO:52所述的VL或与SEQ ID NO:52具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的VL。
在另一个具体的实施方案中,所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包含:1)序列如SEQ ID NO:44所示的重链(H)或与SEQ ID NO:44具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链,和序列如SEQ IDNO:45所述的轻链(L)或与SEQ ID NO:45具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链;或
2)序列如SEQ ID NO:44所示的重链(H)或与SEQ ID NO:44具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链,和序列如SEQ ID NO:46所述的轻链(L)或与SEQ ID NO:46具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链;或
3)序列如SEQ ID NO:44所示的重链(H)或与SEQ ID NO:44具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链,和序列如SEQ ID NO:47所述的轻链(L)或与SEQ ID NO:47具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链;或
4)序列如SEQ ID NO:53所示的重链(H)或与SEQ ID NO:53具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的重链,和序列如SEQ ID NO:54所述的轻链(L)或与SEQ ID NO:54具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的轻链。
在一些实施方案中,所述抗体包含氨基酸改变。在本发明的一个实施方案中,本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在优选的实施方案中,本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地,本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。优选的,本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换,优选地保守置换。
在某些实施方案中,本发明的抗体可以是经半胱氨酸工程改造的抗体,例如“硫代mAb”,其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。VII.示例性的双特异性抗体分子本发明提供了一种同时靶向人CD3和人MUC16的双特异性抗体(抗CD3×MUC16双特异性抗体),其具有以下优点:
(1)高特异性结合人CD3、表达人CD3的靶细胞和同时高亲和力结合人MUC16、表达人MUC16的靶细胞;
(2)不结合循环中游离的CA125,同时将更多的T细胞靶向表达MUC16的癌细胞;
(3)激活T细胞,并引发对表达MUC16的癌细胞的细胞毒活性,从而有效杀伤癌细胞;
(4)低免疫原性;
(5)优异的抑瘤效果。
在一个实施方案中,本发明提供了一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其包含:
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点;或
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点。
在一个实施方案中,本发明提供了一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其包含:
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:35所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2如SEQ IDNO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含识别CD3的VH(为了与识别MUC16的VH相区别,在本文称为VHCD3)和识别CD3的VL(为了与识别MUC16的VL相区别,在本文称为VLCD3),其中所述VHCD3包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2如SEQ IDNO:10所示的LCDR3;或
1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:39所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ IDNO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3;或
1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:41所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ IDNO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3;
或者
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:35所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ IDNO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3;或
1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:39所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3;或
1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:41所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3;
或者
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQ ID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:35所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQ ID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ IDNO:10所示的LCDR3,或
1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:39所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ IDNO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3,或
1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含如SEQID NO:31所示的HCDR1,如SEQ ID NO:32所示的HCDR2和如SEQ ID NO:33所示的HCDR3,识别MUC16分子的VL包含如SEQ ID NO:41所示的LCDR1,如SEQ ID NO:36所示的LCDR2和如SEQID NO:37所示的LCDR3;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含如SEQ IDNO:5所示的HCDR1,如SEQ ID NO:6所示的HCDR2和如SEQ ID NO:7所示的HCDR3并且VLCD3包含如SEQ ID NO:8所示的LCDR1,如SEQ ID NO:9所示的LCDR2和如SEQ ID NO:10所示的LCDR3。
在一个具体的实施方案中,本发明提供了一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其包含:
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含选自SEQ ID NO:30或51的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:34、38、40或52的序列;识别CD3分子的scFv包含识别CD3的VH(为了与识别MUC16的VH相区别,在本文称为VHCD3)和识别CD3的VL(为了与识别MUC16的VL相区别,在本文称为VLCD3),其中所述VHCD3包含SEQ IDNO:3所示的序列并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列。
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含选自SEQ ID NO:30或51的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:34、38、40或52的序列;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含SEQ ID NO:3所示的序列并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含选自SEQ ID NO:30或51的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:34、38、40或52的序列;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含SEQ ID NO:3所示的序列并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一个实施方案中,上述双特异性抗体中所包含的2个识别MUC16分子的抗原识别位点可以具有相同的VH/VL序列,或不同的VH/VL序列。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其包含:
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含SEQID NO:51的序列或者包含与SEQ ID NO:51具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:52的序列或者包含与SEQ ID NO:52具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含SEQ ID NO:3所示的序列或者包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列或者包含与SEQ ID NO:4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列;或
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含选自SEQ ID NO:51的序列或者包含与SEQ ID NO:51具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:52的序列或者包含与SEQ ID NO:52具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含SEQ ID NO:3所示的序列或者包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列或者包含与SEQ ID NO:4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中识别MUC16分子的VH包含选自SEQ ID NO:51的序列或者包含与SEQ ID NO51具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,识别MUC16分子的VL包含选自SEQ ID NO:52的序列或者包含与SEQ ID NO:52具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列;识别CD3分子的scFv包含VHCD3和VLCD3,其中所述VHCD3包含SEQ ID NO:3所示的序列或者包含与SEQ IDNO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列,并且VLCD3包含SEQ ID NO:4所示的序列或者包含与SEQ ID NO:4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性且具有相同CDR的序列。
在一个实施方案中,如本发明上述所提供的一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其中所述Fc区可以选自现有技术中已知的任何IgG、IgA、IgM类抗体的天然Fc区,例如共有或者胚系IgG Fc区。在一个具体实施方案中,IgG Fc区可以来自同种型人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个具体实施方案中,IgG Fc区是人IgG1的Fc序列。在进一步的实施方案中,所述Fc区包含突变,例如增加双特异性抗体二聚体稳定性的突变(例如杵入臼结构)、减少或者增加效应子功能的突变。
在以上任一个实施方案中,本发明抗CD3×MUC16双特异性抗体的scFv通过接头与Fc或CH1连接,所述接头可以是本领域已知或者将来获得的任何通用的柔性序列,通常是短的柔性氨基酸序列,例如,GGGSG;GGSGG;GSGGG;SGGGG;GGTGS;GTSPGG;GNGGGS;G4S-GGSGG-G4S-SGGGG;GGG;DGGGS;TGEKP;GGRR;EGKSSGSGSESKVD;KESGSVSSEQLAQFRSLD;GGRRGGGS;LRQRDGERP;LRQKDGGGSERP;GSTSGSGKPGSGEGSTKG等。在一个具体实施方案中,所述接头是(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是1、2、3、4、5、6、7、8、9的整数。在一个具体实施方案中,接头选自(G4S)3。
在再一个实施方案中,本发明提供了一种抗CD3×MUC16双特异性抗体,其包含:
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:56所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:59所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:56所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:57所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
VIII.特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体或其抗原结合片段
任何本领域技术人员已知的特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段均适用于本发明的组合疗法或组合产品。在一些实施方案中,特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段是特异性结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,特异性结合PD-1的抗体包括但不限于已经公开的抗体,或商业上可获得的抗体,例如公开在如下专利或专利申请中的抗体:WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1。在一些实施方案中,商业上可获得的抗PD-1抗体选自例如帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、恒瑞的卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、百济神州的替雷利珠单抗(Tislelizumab)、信达生物的信迪利单抗(Sintilimab)、君实生物的特瑞普利单抗(Toripalimab)、誉衡生物的赛帕利单抗、正大天晴的派安普利单抗、乐普生物的普特利单抗、复宏汉霖的斯鲁利单抗或BMS的纳武利尤单抗(Nivolumab)。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体的轻链恒定区为kappa或lamda轻链恒定区。
在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体是人源化的。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体是人抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体是全长抗体。
在一个实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)例如选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
在本发明的一个实施方案中,所述针对PD-1的抗体或其抗原结合片段为WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR(优选3个CDR,即HCDR1、HCDR2H和HCDR3;或LCDR1、LCDR2和LCDR3,更优选6个CDR,即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3),或包含WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH和/或VL,或包含所述抗体的重链和/或轻链。
在本发明的一个实施方案中,所述针对PD-1的抗体或其抗原结合片段为帕博利珠单抗,卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、赛帕利单抗、派安普利单抗、普特利单抗、斯鲁利单抗或纳武利尤单抗或其抗原结合片段。在一个实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含任何商业上可获得的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR(优选3个CDR,即HCDR1、HCDR2H和HCDR3;或LCDR1、LCDR2和LCDR3,更优选6个CDR,即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3),或包含任何商业上可获得的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH和/或VL,或包含所述抗体的重链和/或轻链。
在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含抗体重链。在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体重链包含重链可变区和重链恒定区。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链。在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。
在一些实施方案中,重链可变区是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链可变区。在一些实施方案中,轻链可变区是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的轻链可变区。在一些实施方案中,重链可变区CDR1、CDR2或CDR3是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链可变区CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中,轻链可变区CDR1、CDR2或CDR3是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的轻链可变区CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中,重链是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链。在一些实施方案中,轻链是WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的轻链。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自WO2019219064A1(例如21F12-1F6)、CN108473977B、CN104250302B、CN105531288B、CN105026428B、WO2008156712A1或WO2006121168A1中公开的任何抗体或任何商业上可获得的抗PD-1抗体的重链和轻链。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自帕博利珠单抗的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自帕博利珠单抗的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自帕博利珠单抗的重链和轻链。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自纳武利尤单抗的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自纳武利尤单抗的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含来自纳武利尤单抗的重链和轻链。
任何本领域技术人员已知的特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段均适用于本发明的组合疗法或组合产品。在一些实施方案中,特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段是特异性结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段。
任何本领域技术人员已知的特异性结合PD-L2的抗体或其抗原结合片段均适用于本发明的组合疗法或组合产品。在一些实施方案中,特异性结合PD-L2的抗体或其抗原结合片段是特异性结合人PD-L2的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体的轻链恒定区为kappa或lamda轻链恒定区。
在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是人源化的。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是人抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体是全长抗体。
在一个实施方案中,适用于本发明的抗PD-L1或抗PD-L2抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)例如选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
IX.编码抗体的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面,本发明提供了编码以上任何抗CD3抗体或MUC16或双特异性抗体或其任一条链的核酸。
例如,本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:1、2、3、4、11、13、30、34、38、40、44-47、51-57或59中任一项所示氨基酸序列的核酸,或编码与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、11、13、30、34、38、40、44-47、51-57或59中任一项所示的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸。
如本领域技术人员明了的,因为密码子简并性,每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法,例如通过从头固相DNA合成,或通过PCR扩增而产生。
在一方面,本发明提供编码以上任何抗体或任何抗体链的核酸。当从适宜的表达载体表达时,由所述核酸编码的多肽能够显示人CD3和/或MUC16抗原(和/或猴(例如恒河猴或食蟹猴))结合能力。
在再一方面,本发明提供编码以上任何双特异性抗体的核酸。当从适宜的表达载体表达时,由所述核酸编码的多肽能够显示人或猴(例如恒河猴或食蟹猴)CD3和另一抗原(例如人或猴(例如恒河猴或食蟹猴)MUC16抗原)的结合能力。在一个实施方案中,编码双特异性抗体的各条链的核酸可以在相同的载体中或在不同的载体中。在再一实施方案中,编码双特异性抗体的各条链的核酸可以引入相同或不同的宿主细胞以表达。因此,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗体的生产方法包括步骤:在适于表达所述分子的各条链的条件下,培养包含编码所述各条链的核酸的宿主细胞,产生本发明双特异性抗体。
在一个实施方案中,提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中,载体是表达载体,例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中,载体是例如pcDNA载体,例如pcDNA3.1。
在一个实施方案中,提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞,例如用于克隆或表达编码抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的载体。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中,宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞例如CHO细胞(例如CHO-S,如ExpiCHO-S)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是原核的,例如是细菌,例如大肠杆菌。
在一个实施方案中,宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中,宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。例如,真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如,糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如,可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞、CHO-S细胞、ExpiCHO等;以及骨髓瘤细胞系如Y0,NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。
X、本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的生产和纯化
在一个实施方案中,提供了制备本发明抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的方法,其中所述方法包括,在适合抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体或其链表达的条件下,培养包含编码所述抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞,如上文所提供的,和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体。
可以将编码本发明抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种核酸分子的表达载体,则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的,例如,原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、尺寸排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素,并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度,所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
XI、对抗CD3抗体或抗MUC16双特异性抗体的测定法。
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体进行鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面,对本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体测试其靶标(例如抗原,例如游离的抗原或在细胞上表达的抗原)结合活性,例如通过已知的方法诸如生物膜薄层干涉技术、ELISA、流式细胞术等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CD3和/或抗MUC16抗体(或细胞上表达的CD3和/或MUC16)的结合,本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中,使用放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法(BLI)或电化学发光(ECL)或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术(FACS)测量。
本发明还提供了用于鉴定抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的生物学活性的测定法。生物学活性选自本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或双特异性抗体的性质。
例如,对于本发明的抗体分子对表达CD3和/或MUC16的细胞的结合活性,可以通过本领域已知的方法,例如荧光报道分子和流式细胞术,或本文实施例公开的示例性方法测定,例如通过如实施例2或4所示的方法测定本发明的抗体分子与细胞上表达的CD3和/或MUC16的结合。
例如,对于本发明的抗体分子对T细胞的激活活性,可以通过本领域已知的方法,例如T细胞激活试验系统,例如NFAT-luc报告基因系统如Jurkat/NFAT-luc报告基因系统测定,例如通过实施1或4或6或7或8所示的方法,通过检测T细胞中的CD3信号通路或通过检测激活T细胞后细胞因子(例如干扰素,如IFNγ;肿瘤坏死因子如TNFα和/或白细胞介素如IL-6)的释放来测定。
例如,对于本发明抗体分子对肿瘤的抑制活性或结构安全性,可以通过本领域已知的方法,例如针对小鼠肿瘤模型进行肿瘤抑制实验,例如通过实施例5或9或11所示的方法来测定。
供任何上述体外测定法使用的细胞为原代细胞或细胞系,包括天然表达或过表达CD3(例如人或猴(例如食蟹猴))或MUC16(例如人或猴(例如食蟹猴)MUC16)的细胞,例如过表达CD3或MUC16的细胞,例如T细胞或293细胞或CHO细胞或Jurkat细胞或卵巢癌细胞,例如HEK293或CHO-K1或Jurkat/NFAT-Luc细胞或OVCAR3。
可以理解的是,能够使用本发明的抗体和别的活性剂的组合来进行任何上述测定法。
XII、诊断和检测
在一个方面,本发明还涉及对抗CD3抗体或MUC16或双特异性抗体的用于诊断和检测(例如用于诊断或非诊断目的)的方法和包含其的用于诊断和检测的组合物。
在某些实施方案中,本文中提供的抗MUC16抗体可以用于检测MUC16在生物样品中的存在。在某些实施方案中,本文中提供的双特异性抗体可以用于检测CD3和/或MUC16在生物样品中的存在。
在某些实施方案中,本文中提供的双特异性抗体可以用于检测第一抗原和/或第二抗原在生物样品中的存在。在某些实施方案中,本文中提供的双特异性抗体可以用于检测第一抗原和/或第二抗原在生物样品中的存在。
术语“检测”用于本文中时,包括定量或定性检测,示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如,FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如,RT-PCR)。在某些实施方案中,生物样品是体液,例如血液、血清或血浆。
在某些实施方案中,所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗MUC16抗体或双特异性抗体在允许其与MUC16结合的条件下接触,并检测在该抗MUC16抗体或双特异性抗体和MUC16之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在MUC16。该方法可以是体外或体内方法。
在某些实施方案中,提供标记的抗MUC16抗体或双特异性抗体。标记包括但不限于,被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记),以及被间接检测的部分,如酶或配体,例如,通过酶促反应或分子相互作用。在一些实施方案中,所述标记例如生物素或hFc等标记物。
在本文中提供的一些实施方案中,样品是在用本发明的抗CD3抗体或抗MUC16抗体或或双特异性抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中,样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中,样品是在用其他疗法治疗过程中,或者用其他疗法治疗后获得的。
在一些实施方案中,在治疗之前,例如,在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测MUC16。
在一些实施方案中,在治疗之前,例如,在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测第一抗原和/或第二抗原。
XIII.具体实施方案
在一些方面,本发明涉及以下具体的实施方案:
1、一种药物组合,其包含一种特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体和一种特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体,其中所述双特异性抗体包含
第一抗原结合区和第二抗原结合区,其中第一抗原结合区特异性结合MUC16,且第二抗原结合区特异性结合CD3,
其中所述第二抗原结合区是抗CD3抗体的scFv,所述scFv包含VH和VL,任选地,所述VH和VL经由接头连接,所述接头例如包含氨基酸序列(G4S)n,其中n=1,2,3,4或5,优选地,n=3或4,更优选地,n=3。
2、实施方案1的组合,其中所述scFv包含的VH包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3,且所述scFv包含的VL包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如SEQ ID NO:3中所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,且LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如SEQ ID NO:4中所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
(ii)HCDR1由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成,HCDR2由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成,HCDR3由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成,LCDR1由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成,LCDR2由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成,且LCDR3由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成。
3、实施方案2的组合,其中
所述VH含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,
和/或所述VL含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
4、实施方案1-3中任一项的组合,其中所述第一抗原结合区是特异性结合第一抗原的Fab。
5、实施方案4的组合,其中所述Fab包含CH1,其中所述CH1是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1,优选地来自IgG1的CH1。
6、实施方案5所述的组合,其中所述CH1包含
(i)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或
(ii)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
7、实施方案1-6中任一项所述的组合,其中所述双特异性抗体是包含Fc二聚体的IgG样双特异性抗体,其中构成所述Fc二聚体的两个Fc区相同或不同。
8、实施方案7所述的组合,其中所述Fc区之一或二者包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如包含L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个,例如包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。
9、实施方案8所述的组合,其中所述Fc区之一或二者包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或22所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。
10、实施方案7-9中任一项所述的组合,其中所述两个Fc区不同,优选地,在第一单体Fc区和第二单体Fc区中分别引入相应的结(knob)突变和扣(Hole)突变。
11、实施方案10所述的组合,其中
a)一个Fc-区多肽包含结突变T366W,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A和Y407V,或
b)一个Fc-区多肽包含结突变T366W和Y349C,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A、Y407V和S354C,或
c)一个Fc-区多肽包含结突变T366W和S354C,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A、Y407V和Y349C;
任选地,所述Fc区还包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如,L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个;例如L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。
12、实施方案7-11中任一项所述的组合,其中所述Fc区之一或二者包含铰链区,例如EPKSS或EPKSC。
13、实施方案12所述的组合,其中
(i)第一Fc区包含结突变,其
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或27或由其组成;或
b)包含与SEQ ID NO:16或27具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和结突变(例如S354C和T366W)的氨基酸序列或由其组成;和/或
(ii)第二Fc区包含扣突变,其
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、15或26或由其组成;或
b)包含与SEQ ID NO:14、15或26具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和扣突变(例如Y349C,T366S,L368A和Y407V)的氨基酸序列或由其组成。
14、实施方案1-13中任一项的组合,其为IgG样双特异性抗体,其包含两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
第二Fab片段的CH1的C末端融合所述scFv片段的N末端,且所述scFv片段的C末端融合至包含第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
15、实施方案1-13中任一项的组合,其为IgG样双特异性抗体,其包含一个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
所述Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至包含第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述Fab片段的VL-CL构成轻链。
16、实施方案1-13中任一项的组合,其为IgG样双特异性抗体,其包含两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端,且第二Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;且所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
17、实施方案1-16中任一项的组合,其中第一抗原结合区包含
如SEQ ID NO:31所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32示的HCDR2、如SEQ ID NO:33示的HCDR3;如SEQ ID NO:35、39或41示的LCDR1、如SEQ ID NO:36示的LCDR2和如SEQ ID NO:37的LCDR3。
18、实施方案1-17中任一项的组合,其中第一抗原结合区包含重链可变区VH,其中所述重链可变区
包含与SEQ ID NO:30或51的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者包含SEQID NO:30或51的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
19、实施方案1-18中任一项的组合,其中第一抗原结合区包含轻链可变区VL,其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:34、38、40或42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者包含SEQ ID NO:34、38、40或42的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
20、实施方案1-19中任一项的组合,其中第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:30或51所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34、38、40或42所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
21、实施方案1-20中任一项的组合,其中第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且所述VL包含SEQ ID NO:34、38或42所示的氨基酸序列或由其组成;或
第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且所述VL包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或由其组成。
22、实施方案1-21中任一项的组合,其中所述双特异性抗体包含
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:56所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:59所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:56所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:59所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
23、实施方案1-22中任一项的组合,其中所述特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体是特异性结合人PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
24、实施方案实施方案1-23中任一项的组合,用于在受试者中预防或治疗癌症。
25、在受试者中预防或治疗癌症的方法,包括向受试者施用有效量的实施方案1-23中任一项所述的组合。
26、在受试者中预防或治疗癌症的方法,包括向受试者组合施用有效量的实施方案1-22中任一项所定义的双特异性抗体和特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
27、实施方案1-23中任一项所述的组合在制备用于在受试者中预防或治疗癌症的药物中的用途。
28、如实施方案1-22中任一项所定义的双特异性抗体在制备药物中的用途,所述药物与特异性结合PD-1的抗体组合用于在受试者中预防或治疗癌症。
29、实施方案26的方法或实施方案28的用途,其中所述特异性结合PD-1的抗体是如实施方案23所定义的抗体。
30、实施方案24的用于所述用途的组合或实施方案25、26或29的方法或者实施方案27-29中任一项的用途,其中所述癌症的肿瘤细胞中具有升高的MUC16的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)和/或升高的PD-1的蛋白质水平和/或核酸水平(例如表达升高)。
31、实施方案24或30的用于所述用途的组合或实施方案25、26和29-30中任一项的方法或者实施方案27-30中任一项的用途,其中所述癌症是实体肿瘤或血液肿瘤,例如卵巢癌(例如浆液性卵巢癌,例如卵巢浆液性囊腺癌、卵巢癌浆液性腺癌、卵巢癌粘液腺癌、子宫内膜样腺癌、卵巢癌透明细胞腺癌)、结肠癌、直肠癌或结直肠癌。
实施例
实施例1:人源化CD3抗体的制备和表征
1.1CD3抗体人源化准备
SP34抗体是特异性结合CD3epsilon亚基(CD3ε)的鼠源抗体,其与人、猴具有种属交叉活性(Pessano,S.,et al.(1985)."The T3/T cell receptor complex:antigenicdistinction between the two 20-kd T3(T3-delta and T3-epsilon)subunits."EMBO J4(2):337-344.)。本实施例以抗体SP34作为候选分子进行人源化的构建。
采用CDR移植技术(CDR grafting technology)对鼠抗SP34进行人源化。简言之:通过将上述SP34 VH及SP34 VL序列在IMGT数据库中检索比对,分别获得与SP34重链可变区和轻链可变区同源性较高的人胚系基因序列IGHV3-73*01和IGLV7-46*01,将其作为人源化抗体可变区的框架;分别将鼠抗SP34的CDR移植到相应的人源化抗体重轻链可变区框架中,形成人源化的抗CD3抗体可变区。为了维持鼠源抗体SP34的亲和力,需要对获得的人源化抗体可变区进行回复突变。
由此分别获得了SP34抗体的人源化重链可变区序列(hu34H1)和轻链可变区序列(hu34L2),并进而获得了SP34抗体人源化抗体,具体序列参见表1。
表1:人源化抗CD3抗体的序列(CDR序列均采用Kabat编码方式)
名称 | SEQ ID NO |
人源化SP34抗体hu34的重链hu34H1 | 1 |
人源化SP34抗体hu34的轻链hu34L2 | 2 |
人源化SP34抗体hu34的重链可变区VH(hu34H1) | 3 |
人源化SP34抗体hu34的轻链可变区VL(hu34L2) | 4 |
HCDR1 | 5 |
HCDR2 | 6 |
HCDR3 | 7 |
LCDR1 | 8 |
LCDR2 | 9 |
LCDR3 | 10 |
人源化的对照抗体(Roche-CD3/017-Roche-CD3)序列来自专利US 2016/0075785A1,其重链氨基酸序列为SEQ ID NO:24,轻链为SEQ ID NO:25,具体参见序列表。
将表1以及对照抗体Roche-CD3的可变区氨基酸序列送至通用生物系统(安徽)有限公司(General Biology System(Anhui)Co.,Ltd.)进行密码子优化和基因合成。将编码Roche-CD3抗体的VH区和VL区的基因依次插入含有人IgG1重链恒定区(氨基酸序列SEQ IDNO:18)编码基因和lambda轻链恒定区(氨基酸序列SEQ ID NO:20)编码基因的表达载体pcDNA3.1(+)中,以获得表达抗CD3人源化抗体017-2全长重链hu34H1(SEQ ID NO:1)的质粒和表达全长轻链hu34L2(SEQ ID NO:2)的质粒。同时将合成的VH区(hu34H1)和VL区(hu34L2)通过(G4S)3连接肽SEQ ID NO:12组成单链抗体23L2(23L2ScFv)(SEQ ID NO:11),插入含有人IgG1重链恒定区Fc区(氨基酸序列SEQ ID NO:19)编码基因的表达载体pcDNA3.1(+)中,获得表达DA023AH23L2(scFv-Fc)(SEQ ID NO:13)的质粒。使用的重链恒定区均含有L234A,L235A,D265A和P329A(根据Eu编码)位点的突变,以消除效应功能。
单链抗体(23L2)命名为23L2ScFv,氨基酸序列如下SEQ ID NO:11所示。合成的包含恒定区Fc结构域的抗CD3单链抗体命名为DA023AH23L2(VH-连接肽-VL-Fc),其序列为SEQID NO:13,其中VH-连接肽-VL的氨基酸序列为SEQ ID NO:11,Fc区的氨基酸序列为SEQ IDNO:19。
依据制造商产品手册说明,使用ExpiCHOTM表达系统(ThermoFisher,Cat#A29133)将上文获得的质粒共转染ExpiCHO-S细胞表达对照抗体Roche-CD3、017-2及DA023AH23L2。转染后培养细胞10-12天,当细胞存活率下降到60%至70%时,收集上清液,使用MabSelectSure蛋白A亲和层析系统(GE healthcare)纯化表达在上清液中的抗体。浓缩纯化的抗体,无菌过滤,通过SDS-PAGE和分子排阻检测抗体蛋白的纯度,结果表明抗体的纯度符合要求,可以用于下一步实验。
1.2检测人源化CD3抗体的激活作用
采用Jurkat/NFAT-luc(荧光素酶)报告基因系统检测CD3抗体的激活作用。按照厂商说明,通过Gene Pul Ser X Cell TM(BIO-RAD)电转方式将NFAT-luc2P(质粒:Promega,Cat#E8481)中的报告基因元件转染到Jurkat(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#SCSP-513)细胞中,然后用潮霉素B(Invitrogen,Cat#10687010)筛选得到NFAT-luc2P多克隆细胞株,多克隆细胞有限稀释后得到稳定且高表达NFAT-luc2P的单克隆细胞株Jurkat/NFAT-luc。
收集细胞,离心后去上清,用测试缓冲液(99%1640培养基+1%FBS)重悬细胞,使得细胞密度为5×105/mL。接种细胞于384孔板(Corning,Cat#3570)中,每孔40μl。然后加入梯度系列稀释的人源化抗CD3抗体DA023AH23L2、Roche-CD3(终浓度为起始20nM,3倍稀释,8个梯度),每孔10μl。将384孔板放置在37℃培养箱中,6小时后,每孔加入30μl One-Glo(Promega,Cat#E6130)试剂,最后用多功能酶标仪(Tecan Infinite F200PRO)检测发光信号,荧光素酶的表达情况直接反映了CD3抗体的激活作用。结果如图1所示,表明017-2和DA023AH23L2有激活作用。
实施例2人源化MUC16抗体的制备和表征
2.1制备鼠源抗MUC16抗体及序列优化
鼠源MUC16抗体776.1的序列公开于专利US 7429382 B2,776.1可以结合到人MUC16蛋白胞外域的C末端,并且具有人猴交叉反应。通过分析专利US 7429382 B2中FIG.8C及FIG.8D的序列,发现在776.1轻链中有一个未配对的半胱氨酸(C),重链的第三个框架区含有一个N糖基化位点。在序列优化阶段,将轻链第33位(kabat编码)的半胱氨酸(C)选择性的突变成丝氨酸(S)或丙氨酸(A),获得相应的轻链776.1LC(C33S)和776.1LC(C33A)。它们的DNA序列由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成。表2给出上述获得的各个鼠源抗MUC16抗体的可变区序列。
表2:MUC16抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列
kappa轻链恒定区:SEQ ID NO:23
将编码上述VH区和VL区的基因依次插入含有编码人IgG1重链恒定区和kappa轻链恒定区的基因的表达载体pcDNA3.1(+)中以获得相应的抗体重链和轻链。使用的重链恒定区均含有L234A,L235A,D265A和P329A(根据Eu编码)位点的突变,以消除效应功能。
将上文所述编码抗MUC16抗体的重轻链的质粒按照表3组合,共转染ExpiCHO-S细胞以表达如表3所述抗体,之后进行相应纯化(具体方法参见实施例1.1)。浓缩纯化的抗体,无菌过滤,通过SDS-PAGE和分子排阻检测抗体蛋白的纯度。
表3抗体名称以及对应重轻链的组合
抗体名称 | 重链名称 | 轻链名称 |
776.1 | 776.1HC(SEQ ID NO:44) | 776.1LC(SEQ ID NO:45) |
776.1(C33A) | 776.1HC(SEQ ID NO:44) | 776.1LC(C33A)(SEQ ID NO:46) |
776.1(C33S) | 776.1HC(SEQ ID NO:44) | 776.1LC(C33S)(SEQ ID NO:47) |
根据还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE确认了重链的N糖基化,在还原条件下所有抗体的重链在50kDa上下都有两个条带,见图2,结果说明重链第三个框架区N糖基化位点具有发生糖基化的可能性。
将人、食蟹猴和恒河猴MUC16蛋白胞外区近膜端氨基酸序列送至通用生物系统(安徽)有限公司进行基因合成,并使得各个蛋白在C末端融合了6x His标签。下表给出各个C末端具有His标签的融合蛋白的氨基酸序列。
表4重组MUC16氨基酸序列
将包含编码表4所述人、食蟹猴或恒河猴MUC16蛋白胞外区近膜端蛋白的质粒分别转染ExpiCHO-S细胞以表达如表4所述抗原(具体方法参见实施例1.1)并用HisTrapTM excel(GE,Cat#29048586)根据厂商说明进行纯化。浓缩纯化的蛋白,无菌过滤,通过SDS-PAGE检测纯化的蛋白纯度。
2.2抗MUC-16抗体对人和恒河猴MUC16蛋白的结合亲和力
利用ForteBio Octet RED96分别检测了抗MUC-16抗体对人MUC16蛋白胞外区近膜端(人MUC16-His,表4)和恒河猴MUC16蛋白胞外区近膜端(恒河猴MUC16-His,表4)结合亲和力。根据制造商的说明,将AHC传感器(ForteBio,Cat#18-5060)放进Running Buffer(1XPBS Hyclone,Cat#SH30256.01,含有0.02% Tween20,pH7.0),在室温下预平衡10min。在96孔板中,动力学实验方法按照以下步骤进行:a)用Running Buffer平衡基线100s,b)用Running Buffer稀释抗MUC-16抗体至5μg/mL,固化200s停止,c)用Running buffer平衡基线300s,d)人或恒河猴MUC16蛋白用Running Buffer稀释至50nM,结合200s,解离600s。实验数据使用Fortebio Data Analysis软件1:1结合模型进行拟合并计算。
结果如下表5所示。
表5.MUC-16抗体与人和恒河猴MUC16蛋白胞外区近膜端结合亲和力
2.3抗人MUC16抗体与表达在293T细胞表面的人MUC16蛋白或恒河猴MUC16蛋白的结合
通过细胞结合实验来判断本发明中的抗人MUC16抗体能否与稳定表达在293T细胞表面的人或猴的MUC16蛋白结合。首先采用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Cat#11668019)转染试剂将编码人MUC16蛋白(ECT_TM huMuc16:SEQ ID NO:65,包含近膜端、跨膜区以及胞内区,由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成,并克隆到稳转载体中)和恒河猴MUC16蛋白(ECT_TM RhMuc16:SEQ ID NO:66,包含近膜端、跨膜区以及胞内区,由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成,并克隆到稳转载体中)分别转染到293T细胞中,然后用0.3μg/mL嘌呤霉素(Gibco,Cat#A1113802)筛选,得到了高表达人MUC16的293T细胞(也称为293T/hMUC16细胞)或高表达恒河猴MUC16的293T细胞(也称为293T/恒河猴MUC16细胞,或称为293T/rhesus MUC16细胞)。将梯度稀释的本申请获得的抗人MUC16抗体(初始浓度为200nM,4倍稀释,共8个点)加入到细胞中,4℃孵育30分钟。PBS洗细胞两遍后加入荧光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098),4℃孵育30分钟。PBS洗细胞两遍后重悬细胞,最后用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式细胞仪检测荧光信号。
从图3-4所示的结果可知,776.1(C33A)、776.1(C33S)结合293T细胞上表达的人Muc16蛋白和恒河猴Muc16蛋白,其与未修饰抗体(776.1)具有相当的结合能力。
2.4MUC16抗体人源化
对鼠抗体776.1(C33S)进行人源化,方法如实施例1所述。简言之:将776.1(C33S)的序列在IMGT数据库中检索比对,分别获得与776.1(C33S)重链可变区同源性较高的人胚系基因序列IGHV1-18*01作为重链可变区人源化框架,选择与轻链可变区同源性较高的人胚系基因序列IGKV1-39*01作为轻链可变区人源化框架,将776.1(C33S)重轻链可变区的CDR移植到相应的人源化框架中,形成人源化的抗MUC16抗体可变区。为了维持鼠源抗体776.1(C33S)的亲和力,需要对获得的人源化抗体可变区进行回复突变。为了消除潜在的N糖基化位点,在第三个框架区引入N73T(kabat编码)。
由此分别获得相应人源化重链可变区和人源化轻链可变区序列,如表6所示。
将重链可变区氨基酸序列送至苏州金唯智生物科技有限公司和将轻链可变区氨基酸序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成。将编码抗体的VH区和VL区的基因依次插入含有人IgG1重链恒定区编码基因和kappa轻链恒定区的编码基因的表达载体pcDNA3.1(+)中,以获得表达抗MUC16人源化抗体全长重链的质粒和编码全长轻链的质粒。人源化后的MUC16抗体使用的重链恒定区均含有L234A,L235A,D265A和P329A(根据Eu编码)位点的突变,以消除效应功能。
将编码重轻链的质粒组合共转染ExpiCHO-S细胞以表达抗MUC16人源化抗体(Hu-L4H7,其重链序列如SEQ ID NO:53所示,轻链序列如SEQ ID NO:54所示),并进行相应纯化(具体方法参见实施例1.1)。浓缩纯化的抗体,无菌过滤,通过SDS-PAGE和分子排阻色谱(SEC)检测蛋白纯度。
2.5人源化抗MUC16抗体物理化学分析以及亲和力检测
对于获得的人源化抗MUC16抗体(Hu-L4H7),通过分子排阻色谱确认了抗体的纯度。具体而言,使用100mM磷酸钠+100mM Na2SO4(pH 7.0)作为运行缓冲液,将20μg样品注入到TSK G3000SWXL柱上。运行30分钟。收集的流出液采用Agilent 1220HPLC进行测量,并使用OpenLAB软件分析数据。
表7结果显示,人源化抗MUC16抗体Hu-L4H7在SEC上的主峰高于99%,而对照776.1(C33S)的主峰为56.9%,这表明纯化的人源化抗体具有更高的纯度和完整性,这也显示了人源化的抗体已经成功的去除了N糖基化。
表7人源化抗体纯度
mAb ID | Purity(%) |
Hu-L4H7 | 99.1 |
776.1(C33S) | 56.9 |
利用ForteBio Octet RED96分别检测了人源化抗MUC-16抗体对人和恒河猴MUC16蛋白结合亲和力。检测分析方法参见实施例8.1,检测结果参见表8。
表8.人源化的抗MUC-16抗体与人和恒河猴MUC16蛋白结合亲和力
通过细胞结合实验来判断本发明的人源化抗MUC16抗体能否与稳定表达在293T细胞表面的人MUC16蛋白结合。具体检测分析步骤参见实施例2.1。图5显示了人源化MUC-16抗体能够与表达在293T细胞表面的人MUC16蛋白结合。
为了进一步验证人源化的抗MUC16抗体能够特异性的结合到MUC16近膜端而不与游离CA125结合,将4000U/mL的人CA125(桂林英美特生物技术有限公司,Cat#KAY0023,病人腹水提取的CA125)以50μL/孔包被在96孔板上,4℃孵育过夜。用封闭缓冲液(含有1%BSA的PBS溶液)将板在37℃孵育,封闭1h。封闭后,用PBST溶液(含有0.05%吐温20的PBS溶液)将板洗涤1次。用稀释液梯度稀释生物素化的Hu-L4H7、Sofituzumab(重链:SEQ ID NO:63;轻链:SEQ ID NO:64,阳性对照)、IgG(阴性对照),加入板中,在37℃孵育1h。孵育结束后用PBST溶液洗板。用稀释液稀释二抗(辣根过氧化物酶HRP标记链霉亲和素,Jackson ImmunoResearch,Cat#016-030-084),加入板中在37℃孵育1h,孵育结束后再次清洗,用TMB显色,之后用1M H2SO4终止,之后于酶标仪中读取OD450nm-OD620nm的吸光值,结果见图6。结果显示人源化抗体Hu-L4H7不结合人CA125。
实施例3:肿瘤组织中MUC16及CD8的免疫组化检测
卵巢癌组织切片(百意欣,Cat#FOV1006)通过二甲苯以及乙醇进行脱蜡,并复水5分钟。将组织切片浸没在抗原修复液(赛维尔,Cat#G1202-250ML)中煮沸15分钟。冷却组织切片,并加入3%双氧水室温孵育10分钟,然后在PBS溶液(索莱宝,Cat#P1010)中洗涤两次,在5%BSA封闭液(索莱宝,Cat#SW3015)中室温封闭1小时。然后将组织切片在封闭缓冲液中与8.7ug/mL Hu-L4H7或1:300倍稀释的CD8抗体(Abcam,Cat#ab209775)4℃孵育过夜。用PBS溶液洗涤3次后,将组织切片与1:3000在封闭液中稀释的山羊抗人IgG Fc特异性(JacksonImmunoReasearch,Cat#109-035-098)抗体室温孵育1小时。然后用PBS溶液洗涤组织切片两次,在室温下利用DAB(赛维尔,Cat#G1212-200T)进行检测,显色时间10分钟。然后用苏木素(赛维尔,Cat#G1004-100ML)对组织切片进行复染。再通过乙醇和二甲苯进行脱水处理,中性树胶(赛维尔,Cat#WG10004160)封片覆盖盖玻片,最后进行扫描。
结果如图7所示,其中图7A、7B为来自卵巢癌浆液性腺癌的切片样品(T1aN0M0,Grade3),图7C、7D为来自卵巢癌粘液腺癌的切片样品(T3aN0M0,Grade 3),图7E、7F为来自子宫内膜样腺癌的切片样品(T1aN0M0,Grade3),图7G、7H为来自卵巢癌透明细胞腺癌的切片样品(T1aN0M0,Grade2)。图7A、7C、7E及7G采用CD8抗体进行染色,图7B、7D、7F及7H采用本申请获得的Hu-L4H7抗体进行染色,阳性结果如箭头所示。图7的结果说明卵巢癌中存在一定数量的CD8 T细胞,以及本申请获得的Hu-L4H7抗体可与卵巢癌中表达MUC16的细胞结合。由此预测基于本申请获得的Hu-L4H7与CD3抗体的双特异性抗体在卵巢癌中可通过桥联作用提高肿瘤细胞杀伤效率,从而达到抑制肿瘤生长的效果。
实施例4:抗CD3/MUC16双特异性抗体
4.1构建双特异性抗体
本发明构建了如图8所示的三种不同非对称结构的双特异性抗体,其中各个双特异性抗体的抗MUC16部分来源于上述人源化MUC16抗体,抗CD3部分来源于上述人源化CD3抗体,双特异性抗体恒定区均包含杵臼结构(knob-in-hole,KIH)(Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG."Nat Biotechnol 16(7):677-681.)。这类双特异性抗体在本文中也称为“抗CD3/MUC16双特异性抗体”或“抗CD3/抗MUC16双特异性抗体”,有时简称为“双特异性抗体分子、双抗”。抗CD3/MUC16双特异性抗体的抗MUC16部分靶向表达MUC16的细胞,而抗CD3部分活化T细胞。双抗同时结合肿瘤细胞上的MUC16和T细胞的CD3有助于通过经活化的T细胞定向杀伤肿瘤细胞。
本申请使用标准构建方法获得了如图8所示结构的3种抗CD3/MUC16双特异性抗体,其氨基酸序列在下表9中列出。其中双特异性抗体的重链按照从N端到C端的顺序依次以来源序列进行命名,例如23L2ScFv-Hole表示该序列从N段到C端依次包括来源于23L2的ScFv和含有臼结构的恒定区;2MCH7-KIH-Knob表示该序列从N段到C端依次包括2个来源于MCH7的序列和含有杵结构的恒定区。
如下构建各个双特异性抗体分子:
23L2ScFv-Hole:将编码抗CD3单链抗体23L2的核苷酸序列克隆到带有Fc(Hole)的pcDNA3.1(+)载体中,表达获得23L2ScFv-Hole分子。
MCH7-23L2ScFv-Hole:以人源化抗MUC16抗体重链编码序列为模板扩增编码重链可变区和重链恒定区CH1段的核苷酸序列,并采用重叠PCR技术将该序列与编码完整的23L2ScFv-Hole的核苷酸序列直接拼接(两段序列之间没有连接肽),将拼接完成的核苷酸序列克隆到表达载体pcDNA3.1(+)载体中,表达获得MCH7-23L2ScFv-Hole分子。
MCH7-KIH-Knob:将编码人源化抗MUC16抗体重链可变区和重链恒定区CH1段的核苷酸序列克隆到带有Fc(Knob)的pcDNA3.1(+)载体中,表达获得MCH7-KIH-Knob分子。
MCL4 LC:将编码人源化抗MUC16抗体轻链的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1(+)载体中,表达获得MCL4 LC分子。
2MCH7-KIH-Knob:采用重叠PCR技术,将2个编码人源化抗MUC16抗体重链可变区和重链恒定区CH1段的核苷酸序列直接串联拼接(2个编码片段之间没有连接肽),再将拼接好的序列克隆到带有Fc(Knob)的pcDNA3.1(+)载体中,表达获得2MCH7-KIH-Knob分子。
根据表9所示的具体组成,将上述各个表达载体相应组合,在合适的条件下表达获得图8中的双特异性抗体。
对照抗体REGN4018来自于专利US20190389966A1,由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成并克隆到表达载体中。
双特异性抗体的构建、表达、纯化、初步分析步骤同实施例1.1。
表9抗CD3/MUC16双特异性抗体的组成
4.2双特异性抗体与人/食蟹猴CD3蛋白、MUC16蛋白的亲和力实验
在本实验中,根据厂商说明,利用ForteBio Octet RED96检测了双特异抗体与人CD3蛋白(Cat#CT038-H2508H,Sinobiological)、食蟹猴CD3蛋白(Cat#CDD-C52W4,Acrobiosystems)、人MUC16蛋白(人MUC16全长、MUC16胞外区近膜端(表4))和食蟹猴MUC16蛋白(食蟹猴MUC16全长、MUC16胞外区近膜端(表4))的结合亲和力。
简要地,将AHC传感器(ForteBio,Cat#18-5060)放进Running Buffer(1X PBSHyclone,Cat#SH30256.01,包含0.02% Tween20,pH7.0),在室温条件下进行预平衡10min。在96孔板中,动力学实验方法按照以下步骤进行:a)用Running Buffer平衡基线100s,b)加入用Running Buffer稀释的抗人CD3和MUC-16双特异抗体,终浓度5μg/mL,固化200s,c)用Running buffer平衡基线300s,d)向各孔中加入如下浓度的用Running Buffer稀释的人和食蟹猴的CD3和MUC16蛋白:100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM,结合200s,解离600s。实验数据使用Fortebio Data Analysis软件1:1结合模型进行拟合并计算。
表10总结了双特异性抗体MCH7-23L2-MCH7与人和食蟹猴CD3蛋白结合亲和力。表33总结了双特异性抗体MCH7-23L2-MCH7与人和食蟹猴MUC16蛋白结合亲和力。
表10 MCH7-23L2-MCH7与人和食蟹猴CD3蛋白结合亲和力
表11 MCH7-23L2-MCH7与人和食蟹猴MUC16蛋白结合亲和力
表10-11表明本申请构建的双特异性抗体可以特异地结合来自人或者食蟹猴的CD3蛋白和MUC16蛋白,具有种属交叉活性。本申请获得的双特异性抗体针对CD3蛋白的KD值比针对MUC16蛋白低一个数量级。
目前业内共识CD3抗体对CD3复合体ε链的亲和力强弱是CD3双抗是否构建成功的关键因素,最佳的CD3亲和力应维持在1-100nM的范围内,且对T细胞的激活处于合适的范围。通常针对CD3蛋白的亲和力优选低于针对其他靶标的亲和力。可见,本申请获得的抗CD3/抗MUC16双特异性抗体保留了最佳的CD3亲和力,符合上述要求。
4.3双特异性抗体与表达人CD3蛋白、MUC16蛋白的细胞的结合实验
(1)通过细胞结合实验来判断本发明中的抗CD3/抗MUC16双特异性抗体能否与内源性表达在人类卵巢癌细胞(OVCAR3)(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#TCHu228)上的MUC16蛋白结合。
本实验采用流式细胞术进行测定。消化离心收集OVCAR3细胞,PBS溶液重悬细胞后接种至96孔板(Corning,Cat#3799),每孔1×105个细胞,96孔板离心后弃上清,将100μl梯度稀释的待测双特异性抗体(最高浓度为200nM,随后从100nM开始,5倍稀释,总共9个浓度点)加入到OVCAR3细胞中,4℃孵育30分钟后离心(1000rpm,5分钟)弃上清。每孔加入100μlPBS溶液将细胞洗两遍后再加入100μl 1:200稀释的荧光二抗R-PE-conjugatedAffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098),4℃孵育30分钟。用PBS溶液将细胞洗两遍后每孔加入100μl PBS溶液重悬细胞,最后用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式细胞仪根据厂商说明检测荧光信号。采用REGN4018作为阳性对照。
从图9所示的结果可知,测试的双特异性抗体可以与OVCAR3细胞上表达的MUC16分子结合。测试的双特异性抗体在高浓度条件下与OVCAR3细胞上表达的MUC16分子的结合强度优于对照REGN4018。
(2)通过细胞结合实验来判断本发明中的抗CD3/抗MUC16双特异性抗体能否与稳定表达在293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#SCSP-502)表面的食蟹猴MUC16蛋白结合。首先采用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Cat#11668019)转染试剂,根据厂商说明,将编码食蟹猴的MUC16蛋白(ECT_TM cyMuc16:SEQ ID NO:58),包含近膜端、跨膜区以及胞内区,由通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化和基因合成,并克隆到稳转载体pIRESpuro3中)的真核表达载体转染到293T细胞中,转染后48小时用0.3μg/mL嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride,Gibco,Cat#A1113802)筛选3~5天,得到了高表达食蟹猴MUC16蛋白的293T细胞。流式细胞术参见上文,将梯度稀释的待测双特异性抗体(初始浓度为100nM,5倍稀释,9个点)加入到细胞中,4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后加入荧光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragmentSpecific,4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后重悬细胞,最后用BD Accuri C5(BDBioscience)流式细胞仪检测荧光信号。
从图10所示的结果可知,测试的双特异性抗体可以与293T细胞上表达的食蟹猴MUC16蛋白质结合。
(3)通过细胞结合实验来判断本发明中的抗CD3/抗MUC16双特异性抗体能否与内源性表达在Jurkat细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#SCSP-513)上的CD3蛋白结合。采用上文描述的流式细胞术进行检测,区别如下:待测双特异性抗体的稀释梯度为:最高浓度为200nM,随后第二个浓度从100nM开始,5倍稀释,10个点)加入到Jurkat细胞中,4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后加入荧光二抗R-PE-conjugatedAffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific,4℃孵育30分钟。用PBS将细胞洗两遍后重悬细胞,最后用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式细胞仪检测荧光信号。
从图11所示的结果可知,测试的双特异性抗体可以与细胞表达的人CD3分子结合。
4.4抗CD3/抗MUC16双特异性抗体对T细胞的激活以及对肿瘤细胞的杀伤活性
本实施例检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体MUC16抗原依赖的对Jurkat/NFAT-luc报告基因系统(质粒:Promega,Cat#E8481)的激活作用。检测系统中的靶细胞为内源性表达人MUC16的OVCAR3肿瘤细胞株或者293T阴性细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#SCSP-502)。
抗CD3/抗MUC16双特异性抗体同时与OVCAR3细胞表面的MUC16和Jurkat T细胞表面的CD3结合,通过MUC16抗原依赖性的CD3交联,激活T细胞,荧光素酶的表达情况直接反映了抗CD3/抗MUC16双特异性抗体对Jurkat/NFAT-luc细胞的激活作用。
根据厂商说明,收集Jurkat/NFAT-luc细胞,离心后去上清,用测试缓冲液(90%1640培养基+10%FBS)重悬细胞,使得效应细胞密度为1E6/mL。消化收集OVCAR3肿瘤细胞株以及293T阴性细胞株,离心后去上清,用测试缓冲液(90%1640培养基+10% FBS)重悬细胞,使得靶细胞密度为5E5/mL。然后分别将效应细胞和靶细胞悬液接种于384孔板(Corning,Cat#3570)中,每孔接种20μl效应细胞和20μl靶细胞,加入梯度稀释(最高检测浓度为30nM,依次往下3倍稀释,总共9个浓度点)的待测双特异性抗体,每孔10μl。将384孔板放置在37℃培养箱中,6小时后,每孔加入30μl One-Glo(Promega,Cat#E6130)试剂,最后用多功能酶标仪(Tecan,Cat#F200)检测发光信号。
结果在图12-13中示出,结果表明所有抗CD3/抗MUC16双特异性抗体均能在表达人MUC16的细胞(OVCAR3细胞)存在时激活CD3信号通路。
图13表明当检测体系中没有MUC16存在时(293T阴性细胞株),所有抗CD3/抗MUC16双特异性抗体均不能激活CD3信号通路。
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体介导T细胞杀伤肿瘤细胞的活性,我们建立了原代T细胞依赖的细胞毒性试验系统,以内源性表达人MUC16的OVCAR3为靶细胞,人外周血单个核细胞PBMCs为效应细胞。
(1)复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3以及MUC16阴性细胞293T,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行3倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。实验同时设置靶细胞最大杀伤(靶细胞中加2%Triton100裂解液)、最小杀伤(靶细胞中加测试缓冲液)及自然杀伤(靶细胞中加效应细胞)对照,每孔加入50μL。最后加入100μL的含IL2的PBMC效应细胞悬液,使得最终细胞密度至1×106/mL(效应细胞E:靶细胞T=10:1),然后在细胞培养箱继续孵育24h,其中PBMC效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出实验板,2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底,小心吸取50μL上清至新的96孔板,加入50μL LDH检测液(Roche,Cat#11644793001)室温孵育,颜色变化时在F50酶标仪上读板,检测波长为OD492nm,背景波长为OD650nm,当最大杀伤孔的OD492nm值介于0.4~1.0之间时进行检测分析。结果见图14A,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体能够特异性诱导T细胞杀伤OVCAR3肿瘤细胞,而对MUC16阴性细胞293T完全没有ADCC效应。
(2)复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午收集PBMC细胞悬液,按T细胞分离试剂盒(Stemcell,Cat#17951RF)操作分选出所有T细胞备用。胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。实验同时设置靶细胞最大杀伤(靶细胞中加2%Triton100裂解液)、最小杀伤(靶细胞中加测试缓冲液)及自然杀伤(靶细胞中加效应细胞)对照,每孔加入50μL。最后加入100μL的含IL2的T效应细胞悬液,使得最终细胞密度至1×105/mL(效应细胞E:靶细胞T=1:1),然后在细胞培养箱继续孵育72h,其中T效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出实验板,2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底,小心吸取50μL上清至新的96孔板,加入50μL LDH检测液(Roche,Cat#11644793001)室温孵育,颜色变化时在F50酶标仪上读板,检测波长为OD492nm,背景波长为OD650nm,当最大杀伤孔的OD492nm值介于0.4~1.0之间时进行检测分析。结果见图14B,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在低E:T,延长孵育时间条件下仍然能够特异性诱导T细胞杀伤OVCAR3肿瘤细胞。
4.5抗CD3/抗MUC16双特异性抗体激活T细胞后诱导细胞因子释放
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体介导T细胞杀伤肿瘤细胞同时的因子分泌情况,我们建立了原代T细胞依赖的细胞毒性试验系统,以内源性表达人MUC16的OVCAR3为靶细胞,人外周血单核细胞PBMCs为效应细胞。
复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3以及MUC16阴性细胞293T,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍最终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行3倍梯度系列稀释共获得8个浓度点。PBMC效应细胞悬液中加入200IU/mL IL2(江苏金丝利药业有限公司),最后每孔加入100μL含IL2的PBMC效应细胞悬液,使得最终细胞密度至1×106/mL(效应细胞E:靶细胞T=10:1),然后在细胞培养箱继续孵育24h。孵育结束后,取出实验板,2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底,小心吸取100μL上清至新的96孔板,分别检测上清中的人IFNγ(Cisbio,Cat#62HIFNGPEH)、人TNFα(R&D,Cat#DY210)以及人IL-6(R&D,Cat#DY206)因子水平。结果见图15,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体以及阳性对照抗体REGN4018在OVCAR3或者293T体系中能够诱导T细胞释放不同水平的人IFNγ、人TNFα以及人IL-6因子,其中人IFNγ因子在两个批次PBMC(Lot2104200250和Lot2110210241)和293共培养体系中释放水平低于检测下限,未显示图谱。
实施例5.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体体内抑制肿瘤
本实施例通过在携带小鼠结肠癌细胞系MC38的C57BL/6-hCD3转基因小鼠中评价了抗CD3/抗MUC16双特异性抗体对小鼠皮下移植瘤的抑制作用。
首先,构建高表达人MUC16的小鼠结肠癌细胞系MC38。采用慢病毒感染方法将编码人MUC16蛋白的核苷酸(ECT_TM huMuc16(SEQ ID NO:65)由通用生物合成)感染到MC38细胞中,然后用4μg/mL Puromycin Dihydrochloride(Gibco,Cat#A1113802)筛选,得到了高表达人MUC16的多克隆细胞,进而通过有限稀释法获得高表达人MUC16的单克隆MC38细胞株,命名为MC38-hMUC16。
收集并计数MC38-hMUC16细胞,按1:1体积比添加基质胶(Matrigel)混匀后放在湿冰盒内低温保存使用。实验动物为42只6-8周龄的C57BL/6-hCD3小鼠(Biocytogen,Cat#110008),接种前用3-4%异氟烷将小鼠麻醉。然后以200μL的接种体积,按每只小鼠1.5×106个MC38-hMUC16细胞,皮下注射(i.v.)接种于小鼠背部右边靠近腋下。其中5只小鼠接种肿瘤细胞当天同时给药(G6组)。选取荷肿瘤体积生长至约60-80mm3左右的小鼠共25只,将25只小鼠根据肿瘤大小和体重随机分5组(G1~G5:每组5只),分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表12所示:
表12.分组和给药方案
每天观察记录小鼠的外观及行为,自分组开始连续观察最多4周。分组后每周测量肿瘤体积两次。肿瘤体积(V)的计算方法如下:V=(长×宽2)/2。每只小鼠相对肿瘤体积(RTV)的计算方法是:RTV=Vt/V0,其中Vt为每次的测量体积,V0为治疗开始时的体积。结果以平均值±S.E.M的方式呈现。使用Dunnett’s multi-comparison test进行两组间比较,如果p<0.05则认为有统计学显著性差异。
结果见图16A和图16B,相对于阴性对照(G1组),各组都具有良好的抑瘤作用,其中G3组(MCH7-23L2-MCH7 5mg/kg)在第21天时相比G1组有显著差异(P<0.05),此外G3组的抑瘤作用好于G5组(相对肿瘤抑制率TGITV:41.52%vs 28.32%)。G2~G6组在第11天时相比G1组有显著差异(P<0.05),G3~G6组在第14天时相比G1组有显著差异(P<0.05)。
实施例6.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在TDCC实验中对T细胞功能的影响
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在TDCC杀伤体系中对T细胞功能的影响,我们测试了杀伤实验中T细胞表达CD25(Biolegend,Cat#302612)、CD69(Biolegend,Cat#310904)、PD1(Biolegend,Cat#329908)、TIM3(Biolegend,Cat#345006)以及T细胞凋亡(Zombie VioletTMFixable Viability Kit,Biolegend,Cat#423114)指标。
复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午收集PBMC细胞悬液,按T细胞分离试剂盒(Stemcell,Cat#17951RF)操作分选出所有T细胞备用。胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。最后加入100μL的含IL2的T效应细胞悬液,使得最终细胞密度至1×105/mL(效应细胞E:靶细胞T=1:1),然后在细胞培养箱继续孵育72h,其中T效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出实验板,收集每孔细胞进行流式分析,测试T细胞激活(CD25和CD69表达)、T细胞功能衰竭(PD1和TIM3表达)以及T细胞凋亡指标变化情况。结果见图17,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在低E:T,延长孵育时间条件下相比对照抗体REGN4018,对T细胞激活更弱,但诱导T细胞功能衰竭和诱导T细胞凋亡活性也更弱。
实施例7.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体对肿瘤细胞的重复杀伤活性
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体介导T细胞重复杀伤肿瘤细胞的活性,我们建立了原代T细胞依赖的细胞毒性试验系统,以内源性表达人MUC16的OVCAR3为靶细胞,人外周血单核细胞PBMCs中分离的T细胞为效应细胞。
复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午收集PBMC细胞悬液,按T细胞分离试剂盒(Stemcell,Cat#17951RF)操作分选出所有T细胞备用。胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。实验同时设置靶细胞最大杀伤(靶细胞中加2%Triton100裂解液)、最小杀伤(靶细胞中加测试缓冲液)及自然杀伤(靶细胞中加效应细胞)对照,每孔加入50μL。最后加入100μL的含IL2的T效应细胞悬液,使得最终细胞密度至5×105/mL(效应细胞E:靶细胞T=5:1),然后在细胞培养箱继续孵育24h,其中T效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出2块相同的实验板,2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底,其中一块小心吸取50μL上清至新的96孔板,加入50μL LDH检测液(Roche,Cat#11644793001)室温孵育,颜色变化时在F50酶标仪上读板,检测波长为OD492nm,背景波长为OD650nm,当最大杀伤孔的OD492nm值介于0.4~1.0之间时进行检测分析。另一块板弃去板内100μL上清,然后按前面的实验条件每孔再次加入50μL OVCAR3细胞悬液(每孔10,000个细胞)和50μL待测抗体,孵育48h后收集上清检测杀伤。
结果见图18,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体可以诱导T细胞连续杀伤OVCAR3肿瘤细胞,高E:T条件下,第一轮杀伤强度比阳性对照抗体弱,但第二轮杀伤强度比阳性对照REGN4018略强。
实施例8.抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在TDCC重复杀伤实验中对T细胞功能的影响
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在TDCC重复杀伤体系中对T细胞功能的影响,我们测试了杀伤实验中T细胞表达CD25(Biolegend,Cat#302612)、PD1(Biolegend,Cat#367604或Cat#329908)、TIM3(Biolegend,Cat#345006)以及T细胞凋亡(Biolegend,Cat#423114)指标。
复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2E6/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2激活过夜。第二天上午收集PBMC细胞悬液,按T细胞分离试剂盒(Stemcell,Cat#17951RF)操作分选出所有T细胞备用。胰蛋白酶消化培养的靶细胞OVCAR3,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的待测抗体,待测抗体最高检测浓度为10nM,进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。最后加入100μL的含IL2的T效应细胞悬液,使得最终细胞密度至5×105/mL(效应细胞E:靶细胞T=5:1),然后在细胞培养箱继续孵育24h,其中T效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出2块相同的实验板,收集其中一块板中的细胞进行流式分析,另一块板每孔弃去100μL上清,然后按前面的实验条件每孔再次加入50μL OVCAR3细胞悬液(每孔10,000个细胞)和50μL待测抗体,孵育48h后收集每孔细胞进行流式分析。测试指标为T细胞激活(CD25表达)、T细胞功能衰竭(PD1和TIM3表达)以及T细胞凋亡。结果见图19,表明抗CD3/抗MUC16双特异性抗体在两轮杀伤实验中相比对照抗体REGN4018,对T细胞激活更弱,但诱导T细胞功能衰竭和诱导T细胞凋亡活性也更弱,这可能是导致其在第二轮杀伤中比对照抗体杀伤更强的原因。
实施例9:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体的体内抗肿瘤作用
在C57BL/6-huCD3e转基因小鼠皮下荷瘤MC38-hMUC16模型中测试抗CD3/抗MUC16双特异性抗体单用以及与抗PD-1抗体联用的体内药效。
C57BL/6-huCD3e转基因小鼠购自百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司。
收集MC38-hMUC16(实施例5)细胞并计数,在每只C57BL/6-huCD3e转基因小鼠皮下接种2×106MC38-hMUC16细胞,并在肿瘤生长到平均约60mm3左右时,根据小鼠肿瘤大小和体重被随机分8组(每组7只)给药本发明抗体及对照(Vehicle对照/Anti-mPD1),Anti-mPD1为抗小鼠PD-1抗体(BioXcell,Cat#BE0146)。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表13所示,实验期间每日观察各组小鼠状态,每周两次称量小鼠体重,每周两次通过游标卡尺测量肿瘤体积。
表13.分组和给药方案
实验过程中,各组动物体重较稳定,均逐渐上升,无明显体重下降或动物异常情况发生,表明MCH7-23L2-MCH7在15mg/kg、5mg/kg和1.5mg/kg剂量下,无论是单独给药或是联合anti-mPD-1,动物都能良好耐受且无体重下降发生。
与G1对照组相比,G2 MCH7-23L2-MCH7 15mg/kg动物在Day21时TGI为65.41%;G3MCH7-23L2-MCH7 5mg/kg动物在Day21时TGI为52.99%;G4 MCH7-23L2-MCH7 1.5mg/kg动物在Day21时TGI为48.52%。
G5 Anti-mPD1 1mg/kg动物在Day21时TGI为73.55%;
G6 MCH7-23L2-MCH7+Anti-mPD1 5mg/kg+1mg/kg动物在Day21时TGI为85.61%。
G7 Anti-mPD1 5mg/kg动物在Day21时TGI为92.38%;
G8 MCH7-23L2-MCH7+Anti-mPD1 5mg/kg+5mg/kg动物在Day21时TGI为98.09%。
综上,在MC38-hMUC16细胞株C57BL/6-huCD3e转基因小鼠皮下移植瘤模型中,测试药MCH7-23L2-MCH7在测试剂量15mg/kg、5mg/kg和1.5mg/kg下,动物都能良好耐受,且产生了剂量依赖性的肿瘤抑制疗效;同时,MCH7-23L2-MCH7在5mg/kg剂量下与anti-mPD-11mg/kg或5mg/kg都能产生显著的协同抗肿瘤疗效。
各组动物肿瘤体积在给药后的变化见图20。
实施例10:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体对肿瘤细胞的杀伤活性
为了检测抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗体PD-1抗体介导T细胞杀伤肿瘤细胞的活性,我们建立了原代T细胞依赖的细胞毒性试验系统,以过表达人PD-L1的OVCAR3为靶细胞(人PD-L1基因序列号:SEQ ID NO:67)(OVCAR3/hPD-L1),人外周血单个核细胞PBMC为效应细胞。
复苏PBMC细胞,用1640+10%FBS完全培养基调整细胞密度至1~2×106/mL,加入终浓度为100IU/mL IL2(江苏金丝利药业有限公司)激活过夜。第二天上午收集PBMC细胞悬液备用。胰蛋白酶(Gibco,Cat#25200056)消化培养的靶细胞OVCAR3/hPD-L1,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用含1%FBS(Gibco,Cat#10099-141)的MEM-α(Gibco,Cat#41061-029)测试缓冲液调整靶细胞密度至2×105/ml,按每孔50μL(即每孔10,000个细胞)铺到96孔板(Corning,Cat#3599)中。准备4倍终检测浓度的抗CD3/抗MUC16双特异性抗体,最高检测浓度为10nM,进行5倍梯度系列稀释共获得8个浓度点,每孔加入50μL。准备4倍终检测浓度的抗PD-1抗体(专利申请公开号:WO2019219064A1中21F12-1F6或合成的帕博丽珠单抗),终检测浓度为50nM,每孔加入50μL。实验同时设置靶细胞最大杀伤(靶细胞中加2%Triton100裂解液)、最小杀伤(靶细胞中加测试缓冲液)及自然杀伤(靶细胞中加效应细胞)对照,每孔加入50μL。
最后每孔加入50μL的上述含IL2激活的PBMC效应细胞悬液,使得最终细胞密度至6×105/mL(效应细胞E:靶细胞T=3:1),然后在细胞培养箱继续孵育72h,其中PBMC效应细胞悬液中含有200IU/mL的IL2(江苏金丝利药业有限公司)。孵育结束后,取出实验板,2000rpm离心3min使所有细胞沉到板底,小心吸取50μL上清至新的96孔板,加入50μL LDH检测液(Roche,Cat#11644793001)室温孵育,颜色变化时在F50酶标仪上读板,检测波长为OD492nm,背景波长为OD650nm,当最大杀伤孔的OD492nm值介于0.4~1.0之间时进行检测分析,收集100μL上清用于检测人IFNγ(Cisbio,Cat#62HIFNGPEH)、人TNFα(R&D,Cat#DY210)以及人IL-6(R&D,Cat#DY206)细胞因子释放水平。同时收集每孔细胞进行流式分析,FACS测试T细胞激活(CD25和CD69表达)(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD25Antibody,Biolegend,Cat#302626/FITC anti-human CD69 Antibody,Biolegend,Cat#310904)、T细胞功能衰竭(TIM-3表达)(BV711 anti0human TIM-3.Biolegend,Cat#345024)以及T细胞凋亡指标(Zombie VioletTMFixable Viability Kit,Biolegend,Cat#423114)变化情况。
实施例11:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体的体内抗肿瘤作用
本研究在hPBMC-B-NDG小鼠OVCAR-3肿瘤模型中测试了CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体的体内抗肿瘤作用。
重度免疫缺陷小鼠B-NDG购自百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司;人外周血单核细胞(PBMC)购自上海澳能生物技术有限公司。
人卵巢癌OVCAR-3细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)。细胞培养在37℃、5% CO2的培养箱中,培养基成分为含有20%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基。
收集OVCAR-3细胞并计数,在每只重度免疫缺陷B-NDG小鼠皮下接种10×106OVCAR-3细胞,然后肿瘤接种的第二天,在小鼠尾静脉接种5×106个人外周血单核细胞/0.2mL RPMI 1640/只小鼠。并在肿瘤生长到平均约100mm3左右时,根据小鼠肿瘤大小和小鼠外周血hCD45+占比被随机分8组(每组6只)。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表14所示,实验期间每日观察各组小鼠状态,每周两次称量小鼠体重,每周两次通过游标卡尺测量肿瘤体积。
表14.分组和给药方案
实施例12:抗CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体的体内抗肿瘤作用
本研究在hPBMC-NOG小鼠OVCAR-3-PD-L1肿瘤模型中测试了CD3/抗MUC16双特异性抗体联合抗PD-1抗体的体内抗肿瘤作用。
重度免疫缺陷小鼠NOG购自北京维通利华实验动物技术有限公司;人外周血单核细胞(PBMC)购自上海澳能生物技术有限公司。
人卵巢癌OVCAR-3细胞购自ATCC(American Type Culture Collection),公司内部进行工程化构建过表达PD-L1(将编码PD-L1(SEQ ID NO:67)的编码核酸构建入慢病毒质粒,并且转染入OVCAR-3细胞,获得OVCAR-3-PD-L1)。细胞培养在37℃、5% CO2的培养箱中,培养基成分为含有20%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基。
收集OVCAR-3-PD-L1细胞并计数,在每只重度免疫缺陷NOG小鼠皮下接种10×106OVCAR-3-PD-L1细胞,然后肿瘤接种的第三天,在小鼠尾静脉接种5×106个人外周血单核细胞/0.2mL RPMI 1640/只小鼠。并在肿瘤生长到平均约88mm3左右时,根据小鼠肿瘤体积和小鼠外周血hCD45+占比随机分4组(每组6只)。分组给药当天定义为第0天,在分组后的第0、4、7、11和14天,分别向小鼠腹膜内施用空白对照PBS、本发明抗体MCH7-23L2-MCH7(1mg/kg)、抗PD-1抗体(3mg/kg)和本发明抗体MCH7-23L2-MCH7(1mg/kg)与抗PD-1抗体(3mg/kg)联用(抗PD-1抗体在图中标识为“PD-1”,根据IMGT数据库中帕博利珠单抗Pembrolizumab公布序列进行表达制备,具体方法参见实施例1.1)。实验期间每日观察各组小鼠状态,每周两次称量小鼠体重,每周两次通过游标卡尺测量肿瘤体积。
抗CD3/抗MUC16双特异抗体MCH7-23L2-MCH7单药组TGI为53.9%,PD-1单药组TGI为15.4%。而联用组TGI达到了105.6%。该结果证明抗CD3/抗MUC16双特异抗体和抗PD-1抗体具有显著的协同药效。结果如表15和图21所示。
表15.受试品对OVCAR-3-PD-L1肿瘤的生长抑制
注:a.平均数±标准误;b.TGI=(1-实验组的肿瘤体积变化/对照组的肿瘤体积变化)×100%。
本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。此外,本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
Claims (13)
1.一种药物组合,其包含一种特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗体和一种特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体,其中所述双特异性抗体包含
第一抗原结合区和第二抗原结合区,其中第一抗原结合区特异性结合MUC16,且第二抗原结合区特异性结合CD3,
其中所述第二抗原结合区是抗CD3抗体的scFv,所述scFv包含VH和VL,任选地,所述VH和VL经由接头连接,所述接头例如包含氨基酸序列(G4S)n,其中n=1,2,3,4或5,优选地,n=3或4,更优选地,n=3。
2.权利要求1中所述的组合,其中所述scFv包含的VH包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3,且所述scFv包含的VL包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如SEQ ID NO:3中所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,且LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如SEQ ID NO:4中所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
(ii)HCDR1由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成,HCDR2由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成,HCDR3由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成,LCDR1由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成,LCDR2由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成,且LCDR3由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成;其中优选地,所述VH含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,
和/或所述VL含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
3.权利要求1或2所述的组合,其中所述双特异性抗体是包含Fc二聚体的IgG样双特异性抗体,其中构成所述Fc二聚体的两个Fc区相同或不同;优选地,所述Fc区之一或二者包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如包含L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个,例如包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变;更优选地,
所述Fc区之一或二者包含氨基酸序列SEQ ID NO:19或22所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。
4.权利要求3所述的组合,其中所述两个Fc区不同,优选地,在第一单体Fc区和第二单体Fc区中分别引入相应的结(knob)突变和扣(Hole)突变;优选地,其中
a)一个Fc-区多肽包含结突变T366W,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A和Y407V,或
b)一个Fc-区多肽包含结突变T366W和Y349C,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A、Y407V和S354C,或
c)一个Fc-区多肽包含结突变T366W和S354C,而另一个Fc-区多肽包含扣突变T366S、L368A、Y407V和Y349C;
任选地,所述Fc区还包含降低与Fcγ受体结合的突变,例如,L234A/L235A突变、D265A突变或P329A突变中的一个或多个;例如L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变。
5.权利要求4所述的组合,其中
(i)第一Fc区包含结突变,其
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或27或由其组成;或
b)包含与SEQ ID NO:16或27具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和结突变(例如S354C和T366W)的氨基酸序列或由其组成;和/或
(ii)第二Fc区包含扣突变,其
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、15或26或由其组成;或
b)包含与SEQ ID NO:14、15或26具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性且包含L234A/L235A突变、D265A突变和P329A突变和扣突变(例如Y349C,T366S,L368A和Y407V)的氨基酸序列或由其组成。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合,其为IgG样双特异性抗体,其包含
(1)两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
第二Fab片段的CH1的C末端融合所述scFv片段的N末端,且所述scFv片段的C末端融合至包含第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同;
(2)一个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
所述Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至包含第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;
且
所述Fab片段的VL-CL构成轻链;或者
(3)两个特异性结合第一抗原的Fab片段、一个特异性结合第二抗原的scFv和Fc异二聚体,其中
所述Fab片段包含VH-CH1和VL-CL,所述scFv包含VH-接头-VL或VL-接头-VH,
第一Fab片段的CH1的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端,且第二Fab片段的CH1的C末端融合至第一Fc区的CH2或铰链区构成第一重链;
所述scFv片段的C末端融合至第二Fc区的CH2或铰链区,构成第二重链;且
所述第一和第二Fab片段的VL-CL分别构成两条轻链;
其中所述第一Fab和第二Fab片段相同或不同。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合,其中第一抗原结合区包含
如SEQ ID NO:31所示的HCDR1、如SEQ ID NO:32示的HCDR2、如SEQ ID NO:33示的HCDR3;如SEQ ID NO:35、39或41示的LCDR1、如SEQ ID NO:36示的LCDR2和如SEQ ID NO:37的LCDR3。
8.权利要求1-7中任一项所述的组合,其中第一抗原结合区包含重链可变区VH,其中所述重链可变区
包含与SEQ ID NO:30或51的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者包含SEQ IDNO:30或51的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
9.权利要求1-8中任一项所述的组合,其中第一抗原结合区包含轻链可变区VL,其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:34、38、40或42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者包含SEQ ID NO:34、38、40或42的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
10.权利要求1-9中任一项所述的组合,其中第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:30或51所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34、38、40或42所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
11.权利要求1-10中任一项所述的组合,其中
第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且所述VL包含SEQ ID NO:34、38或42所示的氨基酸序列或由其组成;或
第一抗原结合区包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且所述VL包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或由其组成。
12.权利要求1-11中任一项所述的组合,其中所述双特异性抗体包含
(i)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为VH-CH1-scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1和2的VH-CH1结构配对形成2个识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ IDNO:56所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:59所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
(ii)1条结构为VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和1条结构为VL-CL的轻链,其中轻链与重链1的VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:56所示的序列,重链2包含SEQ IDNO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列;或
(iii)1条结构为VH-CH1-VH-CH1-Fc的重链1,1条结构为scFv-Fc的重链2,和2条结构为VL-CL的轻链,其中2条轻链分别与重链1中的2个VH-CH1结构配对形成识别MUC16分子的2个抗原识别位点,scFv形成识别CD3分子的抗原识别位点,其中重链1包含SEQ ID NO:59所示的序列,重链2包含SEQ ID NO:55所示的序列,并且轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列。
13.权利要求1-12中任一项所述的组合,其中所述特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体是特异性结合人PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
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