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CN118791612A - 靶向cd26的抗原结合蛋白及其药物应用 - Google Patents

靶向cd26的抗原结合蛋白及其药物应用 Download PDF

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CN118791612A
CN118791612A CN202310400063.5A CN202310400063A CN118791612A CN 118791612 A CN118791612 A CN 118791612A CN 202310400063 A CN202310400063 A CN 202310400063A CN 118791612 A CN118791612 A CN 118791612A
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cell
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曹锫沛
杭建花
张韬
葛晨楠
张梦寒
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ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
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Abstract

本发明涉及与人CD26结合的抗原结合蛋白，及它们在制备治疗高表达CD26肿瘤的药物中的应用。本发明首次揭示了与CD26的如SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列内的氨基酸残基结合的CD26抗原结合蛋白相比其他鼠抗及相应嵌合抗体或人源化抗体，显示出更好的抗原亲和力及良好的安全性、有效性。相比相关肿瘤的现有一线治疗方案(如BAVENCIO治疗肾癌)，亦显示出更突出的有效性、安全性。

Description

靶向CD26的抗原结合蛋白及其药物应用
技术领域
本发明涉及与人CD26结合的抗体或抗原结合蛋白，及其在制备治疗高表达CD26肿瘤的药物中的应用。
背景技术
CD26是一种多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，也可以以溶解形式存在于血浆中。CD26常以同源二聚体形式存在，其单体含766个氨基酸，相对分子质量约110kDa。CD26氨基酸残基从内向外分为5个部分：胞内区(1～6)、跨膜区(7～28)、高度糖基化区(29～323)、富含半胱氨酸区(324～551)和C端催化结构域(552～766)，其分子三维结构与功能密切相关。CD26(DPP4)抑制剂在临床上用于Ⅱ型糖尿病的治疗已有数十年的历史。CD26在多种肿瘤细胞表面的表达量明显升高，例如，如恶性间皮瘤，肾癌，前列腺癌，肺癌等，对于这类型CD26表达量较高的肿瘤，CD26是一种具有重要价值的作用靶点(CD26/DPP4-a potential biomarkerand target for cancer therapy,Pharmacology&Therapeutics(2019),198:135-159)。
目前以人CD26为靶点的靶向性抗癌药物研究进展最快的是Y’S Therapeutics公司的单克隆抗体YS110，已完成了I/Ⅱ期临床试验。但根据已有文献资料分析可知，YS110的临床前研究已存在体内外活性均较低的问题，如在文献“Ahumanized anti-CD26monoclonal antibody inhibits cell growth of malignant mesothelioma viaretarded G2/M cell cycle transition,Cancer Cell Int(2016)16:35”中，在YS110的浓度为250ug/ml，作用48h以后，对肿瘤细胞株生长的抑制率为18.3％，则IC50值远远高于250ug/ml，足见其体外的活性较低；又如在专利“抗CD26抗体及其使用方法(申请号：CN200680034937.4)”中，展示了YS110对多种CD26高表达细胞株的小鼠肿瘤模型的治疗，YS110仅能一定程度缩小肿瘤体积，缓解肿瘤生长，并不能完全抑制肿瘤生长实现肿瘤的治愈，可见其在动物模型中的活性仍然不理想。YS110已经完成的临床二期研究结果显示，YS110具有较好的耐受性，但疾病控制率未达到预期，这与YS110在临床前研究中所表现出来的低活性相对应。
尽管在文献资料中有报道CD26的广泛分布，但YS110的使用仍然具有较好的安全性，足见其在临床使用中的安全性有较好的保障。在YS110临床试验的31例患者中，未出现患者死亡，所表现出来的副作用主要为，16.1％的患者有输液不良反应，9.7％的患者出现呃逆，6.5％的患者出现腹泻等。(Phase 2Study of YS110,a Recombinant HumanizedAnti-CD26 Monoclonal Antibody,in Japanese Patients With Advanced MalignantPleural Mesothelioma,JTO Clinincal and Research Reports(2021),2(6))
综上所述，尽管CD26靶点的安全性已在临床试验中得到验证，但现有的以CD26为治疗靶点的抗体对肿瘤治疗难以取得较好的治疗效果。
在机体免疫应答过程中，抗原起着激发和始动的重要作用。抗原是指能刺激机体产生特异性免疫应答，并与免疫应答产物抗体或致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应的物质，通常包括免疫原性和反应原性两个固有属性。实际上，抗原并非通过其完整分子来发挥作用，其功能和特异性通常通过其表位来实现，免疫细胞通过结合和识别抗原分子上的表位来启动免疫反应。
表位又称抗原决定簇，是指存在于抗原分子中能够诱导免疫反应,由数个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构。一个抗原分子含有多种表位，其中既包括能激发机体产生保护性免疫反应的表位，也含有一些对保护性免疫反应不利的表位，如抑制性和毒性表位等。人们还认识到同一分子的众多表位中,各表位对抗原性的贡献不同,有优势表位和非优势表位之分。此外,表位间的相对位置、构象特征、表位侧翼顺序等也与表位功能的表达密切相关。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种更有效、更安全的CD26抗体或抗原结合片段。
本发明的结合CD26的抗原结合蛋白，其结合SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列内的氨基酸残基。
本发明的结合CD26的抗原结合蛋白，与包含SEQ ID NO:1所示HCDR1、SEQ ID NO:2所示HCDR2、SEQ ID NO:3所示HCDR3以及包含SEQ ID NO:4所示LCDR1、由Arg Met Ser组成的LCDR2和SEQ ID NO:5所示的LCDR3的抗原结合蛋白竞争结合CD26。
本发明的抗原结合蛋白与CD26结合的表位与包含SEQ ID NO:1所示HCDR1、SEQ IDNO:2所示HCDR2、SEQ ID NO:3所示HCDR3以及包含SEQ ID NO:4所示LCDR1、由Arg Met Ser组成的LCDR2和SEQ ID NO:5所示的LCDR3的抗原结合蛋白与CD26结合的表位相同。
本发明的结合CD26的抗原结合蛋白，与a)或b)任一项的抗原结合蛋白竞争结合CD26：a)包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区的抗原结合蛋白；b)包含SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白与CD26结合的表位，与a)或b)任一项的抗原结合蛋白与CD26结合的表位相同：a)包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区的抗原结合蛋白；b)包含SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
本发明的抗原结合蛋白为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv、双抗体或单链抗体分子。
本发明的抗原结合蛋白为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。
一种分离的核酸，选自a)、b)或c)任一项：
a)编码上述结合CD26的抗原结合蛋白的DNA；
b)与a)所述核酸完全互补的DNA；
c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。
一种载体，包含上述核酸的载体。
一种细胞，包含上述载体的细胞。
编码目标抗原结合蛋白的核酸分子可以作为病毒或非病毒载体的部分施用，利用载体向受试者递送编码目标抗原结合蛋白的核酸。已经成功地用于将核酸导入宿主的各种病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒等等。
一种组合物，包含上述任意一种抗原结合蛋白、核酸或细胞。
一种方法，用于治疗高CD26水平有关疾病的方法，给予受试者有效量的上述任意一种抗原结合蛋白、核酸或细胞。所述高CD26水平有关疾病包括但不限于肿瘤，所述高CD26水平的肿瘤包括但不限于肾癌、间皮瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌等。所述抗体或抗原结合片段单独给予，或者与其它抗癌剂联合给予。
本申请相比现有技术具有如下优势：
本专利首次揭示，与CD26的如SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列内的氨基酸残基结合的CD26抗体具有更好的抗肿瘤效果及安全性。具体而言：
第一个方面，本申请筛选的鼠源抗体优势明显。
实施例1数据表明本申请筛选的62号鼠源抗体对人源肿瘤细胞的裂解强度远远高于其他鼠源抗体。并且本申请筛选的鼠抗对人源肿瘤细胞的杀伤已经与完成临床二期的人源化抗体YS110相当，更充分证明了本申请鼠抗的优势。
此外，实施例5、8、10数据表明以62号鼠抗的可变区为基础改造获得的嵌合抗体或人源化抗体相比其他鼠抗来源的相应抗体点杂交活性更好、与抗原的亲和力更佳。
相比其他鼠抗来源的BiTE，以本申请62号鼠抗的可变区为基础改造获得的BiTE显示出更好的有效性。实施例11在体外比较BiTE介导的PBMC对不同靶细胞的细胞毒性作用时，本申请62号来源的BiTE对多种肿瘤细胞的杀伤均优于CD26抗体序列来源于YS110的BiTE。实施例17-22结果显示本申请BiTE在多种动物肿瘤模型中均能显著抑制肿瘤生长，部分模型能完全抑制肿瘤生长，显著优于CD26抗体序列来源于YS110的BiTE。
更进一步地，相比其他鼠抗来源BiTE，以本申请62号鼠抗的可变区为基础改造获得的BiTE显示出更好的安全性(实施例13)，引起细胞因子风暴的风险更低。
第二个方面，本申请靶向CD26的双特异性T细胞接合器相比现有CD26单克隆全长抗体更有效、更安全。
有效性方面，实施例11数据表明本申请BiTE结构的双特异性抗体对多种CD26阳性肿瘤细胞的杀伤效果均优于IgG全长抗体YS110。实施例23、24数据表明本申请BiTE结构的双特异性抗体在多种动物肿瘤模型中均显示出显著优于IgG全长抗体YS110的抑制肿瘤生长的作用。
安全性方面，实施例12数据表明抗CD26 IgG全长抗体不能有效诱导T细胞的激活，本申请BiTE结构的CD26-CD3双特异性抗体在未到达肿瘤部位时，不会引起明显的T细胞活化，抗体与肿瘤细胞结合后，才会引起肿瘤组织周围的T细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞，提高了作用的安全性。实施例23、24数据表明本申请BiTE结构的双特异性抗体在多种动物肿瘤模型中均显示出显著优于IgG全长抗体YS110的安全性。
第三个方面，相比相关肿瘤现有一线治疗方案(如BAVENCIO治疗肾癌)，本申请靶向CD26的双特异性T细胞接合器显示出更突出的有效性、安全性(实施例15、22、23)。
附图说明
图1：人源化双特异抗体点杂交活性检测
其中图1a是人源化双特异抗体18G272与18G278点杂交活性检测，图1b人源化双特异抗体19G294点杂交活性检测
图2：流式细胞术检测抗体与靶细胞抗原结合的特异性
图3：19G294同时与CD26蛋白、CD3蛋白的结合
图4：人源化双特异性抗体介导的PBMC细胞对PBMC细胞的细胞毒效应
图5：18G272、19G294在PC-3细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图6：18G272、19G294在PC-3细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物体重
图7：18G272在NCI-H596细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图8：19G294在NCI-H226细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图9：19G294在NCI-H226细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物体重
图10：19G294在A498细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积图11：17G29、19G295在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图12：18G272组、19G295在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图13：18G272组、19G295在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物存活率
图14：18G272在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图15：19G294在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图16：不同剂量组19G294、21G587在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图17：不同剂量组19G294、21G587在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中动物体重
图18：19G294、BAVENCIO联合阿昔替尼等在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图19：19G294、BAVENCIO联合阿昔替尼等在OS-RC-2细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中接种26天时的动物肿瘤体积
图20：19G294、BAVENCIO联合阿昔替尼等在A498细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中接种26天时的动物肿瘤体积
图21：19G294、BAVENCIO联合阿昔替尼等在A498细胞NOD/SCID小鼠皮下移植模型中接种65天后的动物肿瘤重量
图22：样品trypsin酶切氨基酸序列覆盖率检测TIC图
图23：样品trypsin酶切sequence coverage图
具体实施方式
除非在本文中明确定义，否则本文使用的技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
单数形式词语如“一个(a、an)”“所述(the)”包括它们对应的复数指示物。
术语“或”意指“和/或”，并可与“和/或”互换使用。
术语“CD26”又称二肽基肽酶(DPP4，dipeptidyl peptidase 4)，人CD26氨基酸序列能以登录号NP_001926.2在Genbank中找到，其cDNA序列能以登录号NM_001935.3在Genbank中找到。
术语“保守氨基酸取代”意指用新的氨基酸取代原始氨基酸，新的氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能特性，例如其对CD26的结合亲和力。氨基酸的常见保守取代是本领域熟知的，例如Ala可被保守取代为Gly、Ser；Arg可被保守取代为Lys、His；Asn可被保守取代为Gln、His等。术语“亲和力”是指抗体与抗原之间相互作用的强度。抗体可变区通过非共价力与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“抗体”是指可以非共价地、可逆地且以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白家族。例如，天然存在的IgG抗体是四聚体，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重链和两条轻链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL可以进一步细分为具有高变性的互补决定区(CDR，又称高变区)，以及更保守的框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。HCDR1、HCDR2、HCDR3为三个重链互补决定区，LCDR1、LCDR2、LCDR3为三个轻链互补决定区。CDR和框架区的位置可以使用各种本领域熟知的编号系统来确定，例如Kabat、Chothia、IMGT等，本申请采用IMGT确定。重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)负责抗原识别，尤其是其中的互补决定区(CDR)，通常对抗原的不同表位具有特异性。恒定区主要负责效应子功能。
术语“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留与抗原特异性结合能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段，包括但不限于Fab片段、FV片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、多特异性抗体等。
术语“单克隆抗体”意指基本上同质的抗体群体，即除了少量存在的可能天然发生的突变，群体中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的。相比之下，多克隆抗体通常包括在其可变结构域(特别是其互补决定区)中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体。单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得。本申请采用杂交瘤技术获得单克隆抗体，该方法是获得单克隆抗体已知的众多方法之一。
术语“鼠源抗体”指仅包含大鼠或小鼠免疫球蛋白序列的的抗体。
术语“嵌合抗体”的可变区来自非人(例如，鼠)抗体序列，其余部分来自人抗体序列。
术语“人源化抗体”CDR区来自非人(例如，鼠)抗体序列，其余部分来自人抗体序列。
术语“双特异性抗体”，是拥有两种相同或不同抗原的特异性抗原结合位点的抗体。
术语“BiTE”是一种双特异性抗体，全称“双特异性T细胞接合器(Bispecific Tcell engager)”，由两个具有抗原特异性的单链可变片断(single chain variablefragment，scFv)通过接头连接而成，其中一个scFv靶向识别肿瘤相关表面抗原，另一个scFv靶向识别T细胞表面CD3。单链可变片断(scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头连接而成。“接头”是用于将不同蛋白片段连接起来的氨基酸序列，针对接头的设计和选择已有诸多相关研究。在BiTE中，接头连接一个重链可变区与一个轻链可变区组成scFv，也串联两个scFv并允许它们自由旋转，一般由GGGGS重复结构组成(S代表丝氨酸，G代表甘氨酸)，甘氨酸分子量小、侧链短可增加侧链的柔韧性，丝氨酸较强的亲水性可增加肽链的亲水性。优化重复结构的数目不仅可以帮助scFv中轻链与重链以正确构象缔合，并可以通过影响两个scFv之间的距离以促进T细胞和靶细胞在免疫突触中的最佳交互作用(周冲等.双特异性单链抗体BiTE的研究进展[J].生物学杂志,2018”)。在scFv中连接重链可变区与轻链可变区的接头常用KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSTSGGGSGGGSGGGGSS(US20180326032)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(Preclinical Development of BivalentChimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22)等。在本申请具体的实施例中，连接一个重链与一个轻链组成scFv的柔性接头由3个GGGGS重复结构组成，串联两个scFv的柔性接头为GGGGS，本领域技术人员可以依据已有技术的教导，通过常规实验方法和有限次试验从已知接头中选择确定，可以对两种柔性接头中GGGGS的重复数量进行优化，也可以采用除GGGGS外的其他柔性接头。
CD3是T细胞信号传导的组成部分。当BiTE分子同时与T细胞和肿瘤细胞结合时，T细胞被激活，促进CD8+T细胞直接分泌穿孔素和颗粒酶，CD4+T细胞分泌细胞因子进一步招募活化杀伤性T细胞，从而杀伤肿瘤细胞。CD3抗体序列可选自OKT-3、L2K、TR66、UCHT1、SP34、IORT3、Catumaxomab、Blinatumomab、Solitomab、WBP3311_2.306.4(专利CN201880061333.1)等本领域已知的CD3抗体序列。在本申请具体的实施例中采用Solitomab、WBP3311_2.306.4的CD3抗体序列，本领域技术人员可以通过常规实验方法和有限次试验从其他已知CD3抗体中选择确定，而不局限于本申请具体实施例中特定的CD3抗体序列。
术语“嵌合BiTE双特异性抗体”在本文中指鼠源CD26 scFv通过接头连接人源化CD3 scFv。
术语“给予”(“administration”、“administering”)、“治疗”(“treating”和“treatment”)指外源性药剂、治疗剂、诊断剂与受试者的组织、器官、细胞或生物流体的接触。“治疗”指减缓或阻止疾病临床症状的发展，或者指缓解或改善至少一种物理参数，或者指预防疾病的进展。
实施例1.抗人CD26杂交瘤细胞株的制备与筛选
步骤1：动物免疫
根据GenBank已公开的CD26的cDNA序列(GenBank登录号：NM_001935.3)设计rCD26表达载体，在密码子5’端引入组氨酸标签，进行全基因合成，连接到pCHO1.0质粒中，CHO-S宿主细胞表达、纯化。将制备的重组CD26靶蛋白按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
步骤2：细胞融合
(1).脾脏细胞的制备
将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
(2).饲养细胞的制备
取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；
取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。
(3).细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。
将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。
步骤3：抗CD26特异性杂交瘤细胞株筛选
(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组CD26靶蛋白至1μg/ml，包被96孔ELISA酶标板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％BSA的PBST缓冲液封闭(200μl/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。
(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μl/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔稀释后HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μl的2MH2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。
步骤4：CD26鼠单抗体活性评价
在786-0细胞反应体系中，786-0细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，每组设置3个复孔，在相应样品孔的反应孔中分别加入50ul终浓度为100ng/ml的CD26抗体，在空白对照孔中加入50ul培养基对照，在阳性对照孔中加入50ul终浓度为1％ Triton X-100，37℃培养箱中孵育30min，再按E/T为10:1的比例加入浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞(外周血单个核细胞)，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。细胞裂解率公式＝(Vsample-Vvehicle control)/(VTritonX-100-Vvehicle control)×100％。(其中Vsample为药物处理组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值，Vvehicle control为空白对照组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值，VTritonX-100为阳性对照组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值。)
表1抗体介导的PBMC对靶细胞786-0的细胞毒效应检测
抗体编号 72 160 62 51 212 79 YS110
细胞裂解率 8.6％ 13.0％ 53.1％ 12.3％ 11.3％ 48.8％ 56.6％
从上述结果可知，在抗体浓度为100ng/ml，作用5h的条件下，62号鼠抗介导的PBMC对靶细胞786-0的细胞裂解率为53.1％，对靶细胞786-0的裂解强度远远高于其它鼠源单克隆抗体72、160、51、212，已与人源化抗体YS110接近。
786-0是人源肿瘤细胞，理论上成功的人源化抗体与人源细胞的亲和力远超亲本鼠源抗体，对该肿瘤细胞也会有更强的裂解。本申请筛选到的62号鼠抗对人源肿瘤细胞的杀伤已经与完成临床二期的人源化抗体YS110相当，证明了62号鼠抗的优势。本领域技术人员可以合理预期，以62号鼠抗为亲本抗体的人源化抗体对人源肿瘤细胞的杀伤将优于62号鼠抗本身，也优于YS110，这在实施例11中也得到了验证。
实施例2.杂交瘤细胞株可变区序列测序筛选
步骤1.CD26杂交瘤细胞总RNA的提取
将杂交瘤细胞株传代至T75培养瓶中培养，至细胞汇合至90％左右消化、离心收集细胞，使用RNA提取试剂盒(购自Roche)对单克隆杂交瘤细胞株进行总RNA提取。然后分别以总RNA为模板，使用cDNA反转录试剂盒(购自Thermo)逆转录扩增其cDNA第一链，反应产物存放于-20℃，长期储存，需要储存于-70℃。
步骤2.PCR扩增重、轻链可变区基因
分别以杂交瘤细胞cDNA第一链为模板，在50μl反应体系中，分别加入cDNA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，上游及下游引物各1μl(25pmo1)，dNTP1μl，25mmol/LMgCl2 1μl，H2O 39μl，95℃预变性10min，加Taq酶1μl，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为94℃。变性1min，58℃。退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，然后72℃保温10min。取5μl PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。
步骤3.重链及轻链可变区基因的克隆和序列测定
按照pGM-T Fast连接试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司，VT207-02)，将重、轻链可变区基因分别与pGM-T载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，蓝白斑筛选，37℃培养12-16h。
将得到的白色菌落接种含有终浓度为100μl的氨苄青霉素1-5ml LB培养基中，37℃摇床振荡3-4h后，PCR筛选插入正确序列克隆。同时将PCR筛选阳性克隆测序，测定结果通过计算机网络基因库IMGT比较分析获得抗体的重链、轻链可变区、CDR区的氨基酸序列。
其中62号鼠抗包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ IDNO:3所示的HCDR3；SEQ ID NO:4所示的LCDR1、由Arg Met Ser组成的LCDR2(其中Arg表示精氨酸，Met表示甲硫氨酸，Ser表示丝氨酸)和SEQ ID NO:5所示的LCDR3。其重链可变区如SEQID NO:31所示、轻链可变区如SEQ ID NO:32所示。
实施例3.嵌合BiTE双特异性抗体设计
根据实施例1获得的鼠源单克隆抗体72、160、62、51经实施例2中的方法测序得到的重轻链序列，设计出同时靶向CD26与CD3的双特异性抗体：
靶向第一抗原CD26轻链可变区以连接短肽(如SEQ ID NO:12)连接靶向CD26的重链可变区进行融合成CD26单链抗体区，分别为源于72号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:16)，源于160号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:17)，源于62号鼠抗的单链抗体(如SEQ IDNO:18)，源于51号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:19)。
靶向第二抗原CD3蛋白的单链抗体序列由重链可变区(如SEQ ID NO:10)与轻链可变区(如SEQ ID NO:11)通过连接短肽(如SEQ ID NO:12)连接形成。
四种第一识别区序列与1种第二识别区序列以连接短肽(如SEQ ID NO:13)融合形成BiTE结构双特异性抗体，形成四种BiTE序列，分别为源于72号鼠抗的17G105(如SEQ IDNO:20)，源于160号鼠抗的17G108(如SEQ ID NO:21)，源于62号鼠抗的17G61(如SEQ ID NO:22)，源于51号鼠抗的17G131(如SEQ ID NO:23)。
实施例4.抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体的表达质粒构建、表达及纯化
将上述CD26单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO:16-19)的上游添加鼠(Musmusculus)IgG k信号肽序列(如SEQ ID NO:24)并按照哺乳动物细胞CHO密码子偏爱性进行优化，得到优化后的CD26单链抗体基因序列(SEQ ID NO：25-28)并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列。将Solitomab CD3单链抗体氨基酸序列进行密码子优化得到优化后基因序列(SEQ ID NO:29)，并在该基因上游添加连接短肽基因(如SEQ ID NO:30)，在基因下游添加终止密码子和BstZ17I酶切位点。即将上述优化后AvrII酶切位点、kozak序列、信号肽、CD26单链抗体序列分别与CD3单链抗体、终止密码子和BstZ17I酶切位点通过连接肽基因融合，形成4种嵌合BiTE基因，合成上述基因，构建至pUC57质粒中，形成多个长期保存质粒分别命名为pUC57-17G105，pUC57-17G108,pUC57-17G61,pUC57-17G131。
扩增目的基因，1％琼脂糖电泳回收PCR产物，对所得最终目的基因使用AvrII和BstZ17I双酶切PCR回收产物和pZHK 2.0载体，骨架载体pCHO 1.0购自Invitrogen公司，使用SfiI酶切去除“表达框1”后用T4连接酶环化，形成pZHK2.0载体。
T4连接酶连接双酶切PCR产物至pZHK 2.0载体中，并转化到Top10感受态细胞中，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中37℃过夜培养。第二天筛选阳性克隆菌，并测序比对，与预期序列完全一致。
将含有高表达CD26-CD3嵌合BiTE双特异性抗体稳定表达哺乳动物细胞株接种于Dynamis培养基(A2617501，购自Thermo Fisher公司)中，37℃，8％CO2，130rpm进行分批补料流加培养。取上清培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.45μm收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，进行层析纯化。得到目的产物大小约为55kDa，大小正确。
实施例5.抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体与CD26蛋白的亲和力检测
采用Fortebio分子间相互作用Octet QKe仪检测嵌合抗体与抗原蛋白CD26的亲和力。首先将氨基偶联生物传感器AR2G用EDC/s-NHS活化，活化后的生物传感器AR2G置于用10mM乙酸钠(pH 5.0)溶液稀释的CD26蛋白溶液中固化；将固定好CD26蛋白的生物传感器置于1M乙醇胺(pH8.5)溶液中淬灭；再置于1×动力学溶液中平衡；平衡后与人源化双特异性抗体溶液结合；置于1×动力学溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算亲和力常数(KD)，结合速率常数值(kon)和解离速率常数值(kdis)。Response值表示能与抗原发生结合的抗体分子的数量；kon表示抗体与相应受体的结合速率；kdis表示抗体与相应受体的解离速率；NA表示无有效的数据。
表2嵌合抗体与CD26蛋白的亲和力检测
样品编号 检测浓度(nM) Response KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
17G61 181.8 0.8493 1.73E-08 1.91E+04 3.31E-04
17G105 181.8 0.4979 3.93E-08 3.20E+04 1.26E-03
17G131 181.8 0.1496 4.36E-08 1.90E+04 8.29E-04
17G108 181.8 0.0395 NA NA NA
从上述数据可知，嵌合抗体能与CD26蛋白发生结合和解离。17G61(源于62号鼠抗的抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体)与CD26蛋白具有最高的响应值(response)，代表了在相同的浓度条件下，有更多的17G61分子与CD26蛋白发生了结合，17G105(源于72号鼠抗的抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体)、17G131(源于51号鼠抗的抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体)与CD26蛋白结合后，响应值均明显低于17G61。17G61与CD26的KD值更小，故17G61与CD26蛋白的亲和力更强。
实施例6.抗CD26鼠抗人源化
根据实施例1中具有高CD26亲和力与对CD26高表达肿瘤细胞有强杀伤活性的候选62与212号鼠源抗体序列进行人源化设计。对62号鼠抗重链(如SEQ ID NO：31所示)轻链(如SEQ ID NO：32所示)可变区，及212号鼠抗重链(如SEQ ID NO：33所示)轻链(如SEQ ID NO：34所示)可变区进行人源化分析。经计算预测，每个抗体各得到多对人源化重轻链组合，62号鼠抗人源化后得到四组不同重轻链氨基酸序列：18G272-VL(SEQ ID NO：7)，18G272-VH(SEQ ID NO：6)，19G292-VL(SEQ ID NO：35)，19G292-VH(SEQ ID NO：36)，19G293-VL(SEQID NO：37)，19G293-VH(SEQ ID NO：38),19G294-VL(SEQ ID NO：9)，19G294-VH(SEQ ID NO：8)。
212号人源化后得到四组不同重轻链氨基酸序列：18G278-VL(SEQ ID NO：39)，18G278-VH(SEQ ID NO：40)，19G295-VL(SEQ ID NO：41)，19G295-VH(SEQ ID NO：42)，19G296-VL(SEQ ID NO：43)，19G296-VH(SEQ ID NO：44)，19G297-VL(SEQ ID NO：45)，19G297-VH(SEQ ID NO：46)。
人源化的YS110抗体为阳性对照，其重轻链代号及序列如下所示，YS110-VL(SEQID NO：47)，YS110-VH(SEQ ID NO：48)。
实施例7.人源化双特异性抗体的表达质粒构建、稳定表达及纯化
将上述每组人源化后的CD26抗体(18G272、19G292、19G293、19G294、18G278、19G295、19G296、19G297)的轻链与重链各自通过一段连接短肽(SEQ ID NO：12)相连，下游添加连接短肽(SEQ ID NO：13)，并按照哺乳动物细胞CHO密码子偏爱性进行优化，得到优化后的CD26单链抗体基因序列(SEQ ID NO：49-56)，并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列，下游添加CD3单链抗体基因(SEQ ID NO：29)、终止密码子和BstZ17I酶切位点。得到人源化CD26-CD3BiTE基因序列，直接合成并构建至pUC57质粒中，命名为pUC57-18G272、pUC57-19G292、pUC57-19G293、pUC57-19G294、pUC57-18G278、pUC57-19G295、pUC57-19G296、pUC57-19G297。
同时将YS110抗体的轻链与重链也通过一段连接短肽(SEQ ID NO：12)相连，下游添加连接短肽(SEQ ID NO：13)，并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列，下游添加CD3单链抗体基因(SEQ ID NO：29)、终止密码子和BstZ17I酶切位点。得到人源化CD26-CD3 BiTE基因序列，直接合成并构建至pUC57质粒中，命名为pUC-17G29。
另外，设计将19G294轻链与重链通过连接短肽(SEQ ID NO：12)相连，下游添加连接短肽(SEQ ID NO：13)，与来源于WBP3311_2.306.4的CD3抗体重链与轻链通过连接短肽(SEQ ID NO：12)相连形成的单链抗体(SEQ ID NO：57)连接，按照CHO密码子偏爱性进行优化。并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列，下游添加终止密码子和BstZ17I酶切位点。直接合成构建至pUC57质粒中，命名为pUC57-21G587。
扩增目的基因，1％琼脂糖电泳回收PCR产物，并用AvrII和BstZ17I双酶切PCR回收产物和pZHK2.0载体，T4连接酶连接双酶切产物至pZHK2.0载体中，并转化到Top10感受态细胞中，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中37℃过夜培养。第二天筛选阳性克隆菌，并测序比对，与预期序列完全一致，即得到了人源化CD26-CD3 BiTE双特异性抗体表达质粒。
将含有高表达CD26-CD3人源化BiTE双特异性抗体稳定表达哺乳动物细胞株接种于Dynamis培养基中，37℃，8％CO2，130rpm进行分批补料流加培养。收获上清培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.45μm收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，进行层析纯化。得到目的产物大小均约为55kDa。
采用类似方法制备79号鼠抗来源的人源化BiTE双特异性抗体19G300，氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示。
实施例8.人源化双特异性抗体纯化样品的点杂交检测
将纯化样品稀释成不同浓度梯度，取2ul稀释好的样品点在NC膜上，阳性对照样品为17G29，待吸收完全，用5％脱脂奶粉封闭液，室温水平摇床封闭1小时，用TBST洗3次，每次5min。按1:1000将CD3-HRP蛋白加入到2.5％脱脂奶粉封闭液中(配制的50mL 2.5％脱脂奶粉封闭液中加入50ul CD3-HRP)，室温水平摇床1小时，用TBST洗3次，每次5min。按1:1000将CD26-HRP蛋白加入到2.5％脱脂奶粉封闭液中(配制的50ml 2.5％脱脂奶粉封闭液中加入50uL CD26-HRP)，室温水平摇床1小时，用TBST洗3次，每次5min。将膜上的TBST溶液用擦手纸吸干，加显色液(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate)，显色1min，用擦手纸吸干显色液，置于凝胶成像系统曝光，选择连续曝光程序，设置为15s/张，连续曝光12张。对18G272(62号鼠抗人源化)及18G278(212号鼠抗人源化)进行点杂交检测，发现18G272在不同浓度下对CD26及CD3结合活性均接近阳性对照17G29(源于YS110的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体)，显著高于18G278(图1-a)。对19G292-19G297(源于62号、212号鼠抗的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体)共计6个样品进行点杂交检测，发现19G292-19G297均具有对CD26与CD3的结合活性，19G292-19G296与CD26的结合活性与阳性对照17G29接近，其中19G294甚至优于阳性对照(图1-b)。
实施例9人源化双特异性抗体与靶细胞抗原结合的特异性研究
1、CD26阳性和CD26阴性细胞的筛选
用T75细胞培养瓶培养靶细胞，待细胞融合到80％以上时，胰蛋白酶消化细胞并收集，用PBS清洗一次，血球计数板进行计数，分为5×105个细胞每份；用抗CD26单克隆抗体作为一抗，与靶细胞于室温共孵育约40min，孵育结束后，离心弃上清，细胞沉淀用PBS重悬，再次离心弃上清，收集细胞沉淀；再用相应的抗体Alexa Fluor 488鼠抗人IgG1做为二抗，重悬细胞沉淀，于室温避光孵育约30min，孵育结束后，用PBS清洗两次，离心弃上清，收集细胞沉淀；用约200ul的PBS溶液将细胞沉淀重悬，在1h内用流式细胞仪进行检测并分析CD26阳性率。
经流式细胞仪鉴定，CD26阳性的细胞株有786-0、OS-RC-2、A498、NCI-H226、NCI-H2052、NCI-H596、HCC 827、Huh-7、PC-3，CD26阴性的细胞株有G401、A-375。其阳性率如表4所示。CD26阳性细胞株与参考文献一致(中国专利申请号CN200680034937.4，CD26/DPP4-apotential biomarker and target for cancer therapy,Pharmacology&Therapeutics(2019),198:135-159)。
表4靶细胞的CD26阳性率
2、FITC标记抗体：
称取荧光素FITC，用DMSO溶液溶解至终浓度为1mg/ml，另取500ul 18G272抗体，调整至终浓度为1mg/ml，并加入1/10体积1M Na2CO3溶液混匀，并加入15ul FITC溶液，混合均匀，于室温避光孵育3.5h，结束后用截留直径为10KDa的超滤浓缩管离心，彻底去除未与18G272结合的FITC，收集浓缩管中的溶液。
3、流式细胞仪检测：
将于T75细胞培养瓶中培养至80％左右的细胞，用胰蛋白酶消化并收集；用适量PBS重悬，并用血球计数板计数，每份5×105cells，离心收集细胞沉淀；用FITC标记的18G272重悬靶细胞，置于混匀仪上，于室温避光孵育30min；孵育结束后，用PBS重悬，离心弃上清，并重复操作一次；用500ul PBS溶液重悬细胞沉淀。阴性对照的设置：在另一份样品中，标记过程不加入抗体样品，其余步骤均与上述过程平行操作，所得的溶液为FITC标记的阴性对照。采用BD Accuri C6流式细胞仪进行检测，分析FITC标记的阳性率。
结果显示，人源化双特异性抗体18G272与CD26阳性的786-0细胞，NCI-H226细胞，PC-3细胞，HCC 827细胞等均发生结合，而与CD26阴性的A375细胞无结合。其与CD26靶点的结合具有特异性。
采用相同方法检测人源化双特异性抗体19G294与靶细胞抗原结合的特异性，19G294与CD26阳性的786-0细胞，NCI-H226细胞，PC-3细胞，OS-RC-2细胞等均发生结合，而与CD26阴性的G401细胞无结合。人源化双特异性抗体19G294与CD26阳性的细胞结合，与CD26阴性的细胞不结合，与CD26抗原靶点的结合具有特异性。
流式细胞术检测抗体与靶细胞抗原结合的特异性代表性附图见图2，详细数据见表5，表6。
表5流式细胞术检测抗体18G272与靶细胞抗原结合的特异性
细胞名称 786-0 NCI-H226 PC-3 HCC 827 A375
特异性结合比例 74.6％ 80.7％ 64.9％ 41.7％ 0.1％
表6流式细胞术检测抗体19G294与靶细胞抗原结合的特异性
细胞名称 786-0 NCI-H226 NCI-H2052 PC-3 OS-RC-2 G401
特异性结合比例 79.0％ 79.5％ 70.4％ 50.6％ 91.6％ 0.0％
本发明其他人源化双特异性抗体也与CD26阳性细胞结合，与CD26阴性细胞不结合，与CD26抗原靶点的结合具有特异性。
实施例10人源化双特异性抗体与CD26蛋白的亲和力分析
1、与CD26蛋白的亲和力研究
首先将CD26蛋白用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin进行生物素化；用SA生物传感器固定生物素化的CD26蛋白；置于1×Kinetics溶液中平衡；与待检测抗体分子溶液结合，待检测分子的浓度梯度为31.3nM，62.5nM，125nM，250nM，500nM；置于1×Kinetics溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算亲和力常数值。
表7人源化双特异性抗体与CD26蛋白的亲和力
从上述数据可知，当抗CD3部分相同时，62号鼠抗来源的人源化抗体(19G292、19G293、19G294)的亲和力常数均小于212鼠抗或者YS110来源的人源化抗体，表明前者与CD26的亲和力更高。此外，19G294、21G587的抗CD26部分相同，抗CD3部分不同，两者与CD26蛋白具有同等水平的亲和力。
结合上述抗体与CD26蛋白的亲和力数据(表7)，CD3抗体部分相同时，62鼠抗来源的人源化双特异性抗体(19G292、19G293、19G294)相比212鼠抗来源的人源化双特异性抗体(19G296、19G297)及YS110人源化双特异性(17G29)显示出更好的CD26蛋白结合能力。CD3抗体部分不相同时，62号鼠抗来源的人源化双特异性抗体(19G294、21G587)结合与CD26蛋白具有同等水平的结合能力，本申请抗体对CD26蛋白表位的识别和结合没有未受到融合不同CD3抗体部分与CD3蛋白结合的影响。
2、双特异性抗体同时与CD26蛋白和CD3蛋白的结合观察
首先将19G294蛋白用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin进行生物素化；用SA生物传感器固定生物素化的19G294蛋白；置于1×Kinetics溶液中平衡；先与400nM的CD26蛋白溶液结合，再置于含有400nMCD3蛋白的CD26溶液(400nM)中；或先与400nM的CD3蛋白溶液结合，再置于含有400nMCD26蛋白的CD3溶液(400nM)中，用Fortebio Data Analysis 8.0软件观察结合情况。
如图3所示采用SA传感器固定19G294，与CD26结合达饱和后，在CD26溶液中，能继续与CD3蛋白发生结合(如图3SensorG9所示曲线)；与CD3结合达饱和后，在CD3溶液中，能继续与CD26蛋白发生结合(如图3SensorH9所示曲线)；图3SensorF9所示为阴性对照，证明传感器未与溶液发生非特异性结合。结果表明19G294先与CD26蛋白或者CD3蛋白结合后，仍然能与CD3蛋白或CD26蛋白的继续发生结合，没有结合上的先后顺序，与CD3蛋白的结合不会影响人源化双特异性抗体对CD26表位的识别和结合。
实施例11人源化双特异性抗体介导PBMC对靶细胞的细胞毒性评价1、人肾癌细胞786-0细胞模型
在786-0细胞反应体系中，786-0细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
2、人肾癌细胞OS-RC-2细胞模型
在OS-RC-2细胞反应体系中，OS-RC-2细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，OS-RC-2细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
3、人间皮瘤NCI-H226细胞模型
在NCI-H226细胞反应体系中，NCI-H226细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，NCI-H226细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
4、人间皮瘤NCI-H2052细胞模型
在NCI-H2052细胞反应体系中，NCI-H2052细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，NCI-H2052细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
5、人前列腺癌PC-3细胞模型
在PC-3细胞反应体系中，PC-3细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，PC-3细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
6、人非小细胞肺癌HCC 827细胞模型
在HCC 827细胞反应体系中，HCC 827细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，HCC 827细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
7、实验结果
细胞裂解率＝(Vsample-Vvehicle control)/(VTritonX-100-Vvehicle control)×100％。(其中Vsample为药物处理组的荧光信号读数的平均值，Vvehicle control为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，VTriton-100为阳性对照组荧光信号读数的平均值。)
将细胞裂解率和样品浓度值用GraphPad Prism 7.00软件计算样品所介导的PBMC对靶细胞的IC50值。
表9不同人源化双特异性抗体介导的PBMC对不同靶细胞的细胞毒效应的IC50值(pg/ml)
细胞名称 18G272 19G292 19G293 19G294 19G295 19G296 19G297 17G29 YS110
786-0 2275 805.5 974 260.0 无活性 无活性 无活性 1034 ＞100ng/ml
OS-RC-2 283.7 1043 2246 544.9 无活性 无活性 无活性 958.1 ＞100ng/ml
NCI-H226 142.8 1102 404.6 752.3 无活性 无活性 无活性 917.6 ＞100ng/ml
PC-3 378.8 339.2 564.9 219.6 无活性 无活性 无活性 1140 ＞100ng/ml
HCC 827 — — — 546.4 — — — — —
NCI-H2052 — — — 5053 — — — — —
—：代表未检测该项数据。
源于62号鼠抗的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体如18G272、19G292、19G293、19G294均可介导PBMC细胞对多种CD26阳性肿瘤细胞的细胞毒效应，在体外试验中具有杀伤活性。源于212号鼠抗的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体如19G295、19G296、19G297均不能介导PBMC细胞对CD26阳性肿瘤细胞产生细胞毒效应。
由此可见，一方面本申请筛选的鼠抗对CD26阳性肿瘤细胞具有更优的杀伤活性，源于62号鼠抗的抗CD26-CD3人源化抗体对多种CD26阳性肿瘤的杀伤作用均优于具有相同CD3抗体部分的17G29(源于YS110的抗CD26-CD3人源化抗体)、具有相同CD3抗体部分的源于212号鼠抗的抗CD26-CD3人源化抗体。另一方面本申请的62号鼠抗经过人源化，可应用于BiTE结构的双特异性抗体(18G272、19G292、19G293、19G294、17G29)，对多种CD26阳性肿瘤细胞的杀伤效果均优于IgG全长抗体YS110。
实施例12人源化双特异性抗体在介导PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中对PBMC细胞的激活
PBMC细胞+双抗体体系：收集PBMC细胞，计数，重悬至1×106cells/ml，200ul每孔加入到12孔细胞培养板中，抗体稀释到终浓度为1ng/ml，共孵育24h。PBMC细胞+双抗体+OS-RC-2细胞体系中：收集PBMC细胞，计数，重悬至6×105cells/ml，100ul/孔加入到12孔细胞培养板中，抗体稀释到终浓度为1ng/ml，OS-RC-2细胞稀释到9×106cells/ml，100ul/孔加入到相应的12孔细胞培养板中，共孵育24h。
孵育结束后，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬，加入anti-CD25-APC抗体(购自Miltenyl公司)、anti-CD69-PE抗体(购自Miltenyl公司)，于4℃冰箱孵育10min，结束后用PBS清洗两次，用PBS重悬后，BD ACCURI C6流式细胞仪检测。
在“PBMC细胞+双特异性抗体”体系中，双特异性抗体没有诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调；在“PBMC细胞+双特异性抗体+OS-RC-2细胞”体系中，双特异性抗体诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调，促进了PBMC细胞的活化；在“PBMC细胞+YS110+OS-RC-2细胞”体系中，YS110不能诱导PBMC细胞的CD25，CD69表达水平上调。见表10。
表10流式细胞术检测抗体在介导的PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中PBMC细胞的CD25、CD69的表达
在786-0等其他CD26阳性肿瘤细胞中也观察到相同现象，即在“PBMC细胞+双特异性抗体”体系中，双特异性抗体没有诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调；在“PBMC细胞+双特异性抗体+其他CD26阳性肿瘤(786-0等)细胞”中诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调。
CD25，CD69是T细胞活化时的重要标志物，上述结果证明了IgG全长抗体YS110不能有效诱导T细胞的激活，CD26-CD3双特异性抗体在未到达肿瘤部位时，不会引起明显的T细胞活化，抗体与肿瘤细胞结合后，才会引起肿瘤组织周围的T细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞，提高了作用的安全性。
实施例13人源化双特异性抗体在介导PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中的细胞因子检测
将OS-RC-2细胞重悬为6×105cells/ml，每孔100μl加入到12孔板中，将单独供体来源PBMC细胞收集，重悬为9×106cells/ml，每孔加入100μl，再分别加入0ng/ml，3ng/ml的19G294、18G272、17G29样品各100μl，终体积300μl，将反应体系置37℃培养下中共孵育2h，4h，6h，21h后，收集培养上清，离心后取上清进行ELISA检测。采用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ，TNF-α，L-4，IL-10。
ELISA试剂盒检测各样品的细胞因子含量如下表所示。
表11ELISA检测IFN-γ含量(pg/ml)
2h 4h 6h 21h
0ng/ml -7.65 143.7 -58.3 37.7
18G272 116.7 667.7 964.7 1181.7
19G294 91.7 337.7 303.7 398.7
17G29 341.7 1395.7 1777.7 2368.7
表12ELISA检测TNF-α含量(pg/ml)
2h 4h 6h 21h
0ng/ml 16.01 19.55 17.56 10.33
18G272 161.3 OVERFLOW* 192.51 158.73
19G294 111.88 166.88 111.79 47.22
17G29 165.43 182.13 183.73 180.33
表13ELISA检测IL-10含量(pg/ml)
2h 4h 6h 21h
0ng/ml 8.4 16.5 19.3 28.9
18G272 15.9 53.7 86.2 190.6
19G294 9.9 32.3 47.3 65.9
17G29 22.8 113.1 90.2 200.4
表14ELISA检测IL-4含量(pg/ml)
2h 4h 6h 21h
0ng/ml 3.56 4.08 3.44 3.05
18G272 7.67 19.21 21.64 6.64
19G294 3.69 10.74 11.38 3.69
17G29 23.82 58.69 57.79 43.44
*表示读值过高超出设备检测上限。
综上所述，在人源化双特异性抗体介导的PBMC对靶细胞的杀伤过程中，在相同的使用剂量条件下，源于62号鼠抗的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体19G294、18G272引起的PBMC细胞分泌的细胞因子在各个时间点含量均较17G29(源于YS110的抗CD26-CD3人源化双特异性抗体)低。这类型靶向于CD3并激活T细胞的分子结构，所引起的T细胞分泌细胞因子导致的细胞因子风暴相对较低时会具有更高的安全性(A FAD oncology analysis of CD3bispecific constructs and first-in-human dose selection(2017),RegulatoryToxicology and Pharmacology,90:144-152.)，在具有相同的CD3序列识别区的前提下，在同等条件下与17G29比较，本申请的双特异性抗体19G294、18G272具有诱导T细胞分泌的细胞因子量更低的优势，可能与其CDR区识别的CD26抗原表位与17G29不同有关，相比其他表位，本申请抗体识别的抗原表位与降低细胞因子风暴风险，提高安全性有关。
实施例14人源化双特异性抗体介导PBMC对PBMC的毒性
1、786-0细胞模型
PBMC细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
2、OS-RC-2细胞模型
PBMC细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，OS-RC-2细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的样品反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体18G272，在空白对照孔中加入50μl培养基，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
3、结果分析
细胞裂解率＝(Vsample-Vvehicle control)/(VTritonX-100-Vvehicle control)×100％。(其中Vsample为药物处理组的荧光信号读数的平均值，Vvehicle control为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，VTriton-100为阳性对照组荧光信号读数的平均值。)将细胞裂解率和样品浓度值用GraphPad Prism 7.00软件计算各样品所介导的PBMC细胞对PBMC细胞的IC50值。
在抗体18G272介导的PBMC对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导PBMC对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体18G272介导的PBMC(4#)对PBMC(4#)细胞的细胞毒效应IC50值约为99730000pg/ml；抗体18G272介导的PBMC(6#)对PBMC(6#)细胞无细胞毒效应。结果如图4所示。
在抗体18G272介导的PBMC对靶细胞OS-RC-2进行杀伤的过程中，不会介导PBMC对PBMC细胞发生杀伤。抗体18G272介导的PBMC(1#)对PBMC(1#)细胞无细胞毒效应；抗体18G272介导的PBMC(3#)对PBMC(3#)细胞无细胞毒效应。
在抗体19G294介导的PBMC对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导PBMC对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体19G294介导的PBMC(2#)对PBMC(2#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1915313pg/ml；抗体19G294介导的PBMC(3#)对PBMC(3#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1947224pg/ml。
在抗体19G294介导的PBMC对靶细胞OS-RC-2进行杀伤的过程中，介导PBMC对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体19G294介导的PBMC(2#)对PBMC(2#)细胞的细胞毒效应IC50值约为47920315pg/ml；抗体19G294介导的PBMC(3#)对PBMC(3#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1406115138pg/ml。
综上所述，CD26-CD3人源化双特异性抗体能准确识别PBMC，尽管有文献报道了T细胞表达CD26，但本申请的双特异性抗体18G272、19G294不会介导PBMC细胞对PBMC细胞产生明显的细胞毒效应，证明其具有较好安全性。
实施例15 19G294与B药(BAVENCIO，PD-L1抗体)的体外药效比较
用T75细胞培养瓶培养靶细胞，待细胞融合到80％以上时，胰蛋白酶消化细胞并收集，用PBS清洗一次，血球计数板进行计数，分为5×105个细胞每份；用PE标记的抗PD-L1单克隆抗体(购买自Sino Biological公司)与靶细胞于室温避光共孵育约40min，孵育结束后，离心弃上清，细胞沉淀用PBS重悬，再次离心弃上清，收集细胞沉淀，用约200ul的PBS溶液将细胞沉淀重悬，在1h内用流式细胞仪进行检测并分析PD-L1阳性率。
经流式细胞仪鉴定，786-0细胞株的PD-L1阳性率为66.2％，A498细胞PD-L1的阳性率为29.6％。
表15细胞PD-L1阳性率检测
786-0 A498
PD-L1 66.2％ 29.6％
人肾癌786-0-LUC细胞(786-0细胞中转入报告基因Luciference)、人肾癌A498-LUC细胞(A498细胞中转入报告基因Luciference)以3×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到白色底不透明96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的抗体，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为3×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育21h，反应结束后，离心，弃上清，加入100ul报告基因检测试剂(购买自Vazyme公司)，于400rpm在微孔板振荡器上振荡5min后，立即用酶标仪在Lum条件下进行检测。检测数据用GraphPad Prism7.00软件，报告基因降低水平与抗体剂量做4参数曲线，并计算EC50值，结果如表16所示。
表16抗体所介导的PBMC对靶细胞的杀伤作用(EC50 pg/ml)
786-0-LUC A498-LUC
19G294 2623 3211
BAVENCIO 1791039 3289316
从上述数据可知，19G294所介导的PBMC对两种靶细胞所产生的细胞毒效应EC50值远低于BAVENCIO，786-0，A498的PD-L1表达率分别为66.2％和29.6％，由此可见，无论对于何种PD-L1表达水平的细胞，19G294的活性要明显高于BAVENCIO。
实施例16 21G587与19G294的体外药效比较
人肾癌786-0-LUC细胞(786-0细胞中转入报告基因Luciference)、人肾癌A498-LUC细胞(A498细胞中转入报告基因Luciference)以3×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到白色底不透明96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的抗体，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为3×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育21h，反应结束后，离心，弃上清，加入100ul报告基因检测试剂(购买自Vazyme公司)，于400rpm在微孔板振荡器上振荡5min后，立即用酶标仪在Lum条件下进行检测。检测数据用GraphPad Prism7.00软件，报告基因降低水平与抗体剂量做4参数曲线，并计算EC50值，结果如表17所示。
表17抗体所介导的PBMC对靶细胞的杀伤作用(EC50 pg/ml)
786-0-LUC A498-LUC
21G587 2493 5397
19G294 1428 4153
从上述数据可知，本专利的抗CD26抗体序列与不同的抗CD3序列组合，19G294、21G587的抗CD26部分相同，抗CD3部分不同，两者具有同等水平的体外药效，本实验的体外药效实验进一步证明，本申请抗体对CD26蛋白表位的识别和结合未受到融合不同CD3抗体部分与CD3蛋白结合的影响。
实施例17人源化双特异性抗体18G272、19G294在荷有PC-3(前列腺癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中的药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，将5×106cells/0.1mlPC-3细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成3组，分别是Model组(PBS)、19G294组(30μg/只/次)、18G272组(30μg/只/次)，每组6只动物。Model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为D1、D2、D3、D4、D5；第二疗程为D8、D9、D10、D11、D12。给药频率为1天/次。
一般临床观察：检疫期和试验期间每天至少观察一次，包括肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有动物(荷瘤)死亡或濒死，精神状态、行为活动及其它异常情况。
体重：每周检测2～3次。
肿瘤体积：每周检测2～3次，采用游标卡尺分别量取肿瘤长径与短径，肿瘤体积(mm3)＝长径*短径2/2。相对肿瘤抑制率：TGI(％)＝(1-T/C)×100％。公认地T表示给药组某一时间点的相对肿瘤体积(当次测量的肿瘤体积与分组时肿瘤体积比值)，C表示模型组某一时间点的相对肿瘤体积(当次测量的肿瘤体积与分组时肿瘤体积比值)。而本申请实验接种当天根据体重分组，计算TGI时T、C分别表示给药组、模型组当次实际测量的肿瘤体积。
瘤重：末次检测结束后动物实施安乐死，剥离肿瘤块，生理盐水冲洗并用滤纸吸干水分，称量瘤块重量，并拍照。相对肿瘤抑制率TGI(％)＝(1-TTW/CTW)×100％，TTW表示治疗组实验终结时平均瘤重，CTW表示模型组实验终结时平均瘤重。
结论：18G272在30μg/只的剂量下有抑制PC-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长的趋势，19G294几乎可以完全抑制PC-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图5、表18所示。供试品19G294、18G272在30μg/只的剂量下，动物体重呈上升趋势，与模型组动物体重相当，治疗期间耐受良好，结果如图6、表18所示。
表18PC-3人前列腺癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组。
实施例18人源化双特异性抗体18G272在荷有NCI-H596(肺癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，将8×106cells/0.1mlNCI-H596细胞悬液与1.6×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(PBS，6只/组)、18G272组(30μg/只/次，6只/组)。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积检测同实施例17。
结论：供试品18G272在30μg/只的剂量下，可显著抑制人肺腺鳞癌模型小鼠的肿瘤增长；供试品18G272在30μg/只的剂量下，动物体重呈上升趋势，治疗期间耐受良好。结果如图7、表19所示。
表19NCI-H596人肺鳞癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
注：*：P＜0.05，vs Model组。
实施例19人源化双特异性抗体19G294在荷有NCI-H226(间皮瘤)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，将5×106cells/0.1mlNCI-H226细胞悬液与1.5×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(PBS，5只/组)、19G294组(60μg/只/次，5只/组)。给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积检测同实施例17。
结论：供试品19G294在60μg/只的剂量下，可显著抑制人肺腺鳞癌(间皮瘤)模型小鼠的肿瘤增长，如图8所示；供试品19G294在60μg/只的剂量下，动物体重呈上升趋势，治疗期间耐受良好。结果如图9、表20所示。
表20NCI-H226人肺鳞癌(间皮瘤)细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
注：*：P＜0.05，vs Model组。a：表示TGI根据细胞接种后第57天瘤重计算。
实施例20人源化双特异性抗体19G294在荷有A498(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，将1×107cells/0.1mlA498细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(PBS)、19G294组(30μg/只/次)，每组5只动物。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积、瘤重检测同实施例17。
结论：供试品19G294在30μg/只的剂量下，可完全抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图10、表21所示；供试品19G294在30μg/只的剂量下，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好。
表21A498人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组。a：表示TGI根据细胞接种后第61天瘤重计算。
实施例21人源化双特异性抗体18G272、19G294等在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
实验一：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，5×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成3组，分别是Model组(PBS)、17G29组(15μg/只/次)、19G295组(15μg/只/次)；每组8只动物。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积检测同实施例17。
结论：17G29、19G295在15μg/只的剂量下，在D15时均可以显著抑制肿瘤增长，见图11；而在D39时，17G29、19G295均无法抑制肿瘤生长，彼此无显著性差异。此外，OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，而17G29、19G295在15μg/只的剂量下，均可提高小鼠的中位生存期，两者之间无统计学差异。
表22OS-RC-2人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组；D15后各组动物因肿瘤生长开始死亡或安乐。
实验二：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，3×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成3组，分别是Model组(PBS，6只)、18G272组(30μg/只/次，6只)、19G295组(30μg/只/次，6只)。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积检测同实施例17。
结论：相比模型组，18G272在30μg/只的剂量下，D22时可以显著抑制小鼠的肿瘤增长，而19G295有肿瘤抑制趋势，但无显著性差异；D30时18G272组对肿瘤仍有很好的抑制作用，具有极显著差异，而19G295组有抑制肿瘤的趋势，但与模型组相比无显著性差异，见图12、表23。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，而供试品18G272在30μg/只的剂量下没有动物死亡，而19G295组出现动物死亡，见图13、表23。综上，18G272抗肿瘤作用优于19G295。
表23OS-RC-2人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、生存统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组。D22后各组动物因肿瘤生长开始死亡或安乐。a：表示TGI根据细胞接种后第22天肿瘤体积计算。
实验三：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，3×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(PBS)、18G272组(30μg/只/次)；每组6只动物。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积、瘤重检测同实施例17。
结论：18G272在30μg/只的剂量下，可显著抑制OS-RC-2人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图14、表24所示。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，18G272在30μg/只的剂量下，可显著提高OS-RC-2人肾癌模型小鼠的中位生存期(MST)，降低动物死亡率，治疗期间耐受良好，结果如表24所示。
表24OS-RC-2人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组；D15后各组动物因肿瘤生长开始死亡或安乐。a：表示TGI根据细胞接种后第29天瘤重计算。
实验四：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，3×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(PBS)、19G294组(30μg/只/次)；每组5只动物。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积检测同实施例17。
结论：19G294在30μg/只的剂量下，可显著抑制OS-RC-2人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图15、表25所示。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，19G294可降低动物死亡率、延长动物生存期，治疗期间耐受良好，结果如表25所示。
表25OS-RC-2人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组；D23后动物开始死亡或安乐
结合上述四个实验结果，在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠模型中，药效方面：17G29与19G295相当，19G295不及18G272，19G294与18G272相当都能显著抑制甚至完全抑制肿瘤生长；安全性方面：与19G295优于17G29相当，19G295不及18G272，19G294与18G272相当。由此可见18G272，19G294具有比17G29更优的体内药效及安全性。
实施例22不同剂量人源化双特异性抗体19G294、21G587在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，3×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成5组，分别是Model组(PBS)、19G294组(5μg/只/次)、19G294组(15μg/只/次)、19G294组(30μg/只/次)、21G587组(30μg/只/次)；每组3只动物。
给药途径，给药周期同实施例17。
一般临床观察、体重、肿瘤体积、瘤重检测同实施例17。
结论：供试品19G294在15、30μg/只剂量下、21G58730μg/只剂量下均显著抑制OS-RC-2人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，19G294低中高剂量组药效呈剂量依赖性。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物出现明显的体重下降或死亡，在本试验条件下，供试品19G294(5、15、30μg/只)、21G587(30μg/只)可改善肿瘤生长导致的动物状态下降，且降低动物死亡率，治疗期间耐受良好。结果如图16、图17、表26所示。
表26OS-RC-2细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组；D18后动物开始死亡或安乐。a：表示TGI根据细胞接种后第33天瘤重计算。
实施例23人源化双特异性抗体19G294、阿昔替尼联合BAVENCIO组合疗法、YS110在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，3×106cells/0.1ml OS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成5组，分别是Model组(PBS)、阳性对照组-A(BAVENCIO，1.8mg/只/次；阿昔替尼，30μg/只/次)、阳性对照组-B(BAVENCIO，1.8mg/只/次；阿昔替尼，60μg/只/次)、19G294组(30μg/只/次)、YS110组(205μg/只/次)；每组3～4只动物。阿昔替尼灌胃给药，BAVENCIO、供试品及PBS静脉注射给药。阿昔替尼、19G294、PBS接种当天开始给药，连续给药五日，停药两天后，进行第二疗程的给药(连续给药五日)，给药频率为1天/次(共10次)；BAVENCIO接种当天开始给药，1次/周，连续2周(共2次)；YS110接种当天开始给药，2次/周，连续2周(共4次)。
一般临床观察、体重、肿瘤体积、瘤重检测同实施例17。
结论：供试品19G294在30μg/只剂量下显著抑制OS-RC-2人肾癌模型小鼠的肿瘤增长。BAVENCIO(1.8mg/只)联合阿昔替尼(30μg/只、60μg/只)、YS110(205μg/只)均无显著抑制OS-RC-2人肾癌模型小鼠的肿瘤增长。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物出现明显的体重下降或死亡，在本试验条件下，供试品19G294(30μg/只)可改善肿瘤生长导致的动物状态下降，且降低动物死亡率，治疗期间耐受良好。BAVENCIO联合阿昔替尼(2个剂量组)、YS110均无上述改善作用。综上所述，在本实验条件下，19G294药效作用优于BAVENCIO联合阿昔替尼、YS110。结果如图18、图19、表27所示。
表27OS-RC-2人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组；D26后动物开始死亡或安乐。a：表示TGI根据细胞接种后第31天瘤重计算。
实施例24人源化双特异性抗体19G294、阿昔替尼联合BAVENCIO组合疗法、YS110在荷有A498(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD/SCID小鼠，7×106cells/0.1mlA498细胞悬液与7×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成5组，分别是Model组(PBS)、阳性对照组-B(BAVENCIO，1.8mg/只/次；阿昔替尼，60μg/只/次)、阳性对照组-C(BAVENCIO，1.8mg/只/次；阿昔替尼，120μg/只/次)、19G294组(30μg/只/次)、YS110组(205μg/只/次)；每组3只动物。阿昔替尼灌胃给药，BAVENCIO、供试品及PBS静脉注射给药。阿昔替尼、19G294、PBS接种当天开始给药，连续给药五日，停药两天后，进行第二疗程的给药(连续给药五日)，给药频率为1天/次(共10次)；BAVENCIO接种当天开始给药，1次/2周(共1次)；YS110接种当天开始给药，2次/周，连续2周(共4次)。
一般临床观察、体重、肿瘤体积、瘤重检测同实施例17。
脏器重量、脏器系数：末次检测结束后动物实施安乐死，分离小鼠脏器，生理盐水冲洗并用滤纸吸干水分，称量脏器重量，并拍照。脏器系数＝脏器重量/小鼠体重×100％(脏器重量、小鼠体重单位为g)。
结论：供试品19G294在30μg/只剂量下具有显著抑制A498人肾癌模型小鼠的肿瘤增长。BAVENCIO(1.8mg/只)联合阿昔替尼(60μg/只、120μg/只)、YS110(205μg/只)均无显著抑制A498人肾癌模型小鼠的肿瘤增长。供试品19G294(30μg/只)、BAVENCIO联合阿昔替尼(2个剂量组)、YS110治疗期间耐受良好。供试品19G294(30μg/只)、YS110对小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏及相应脏体系数无显著影响。BAVENCIO联合阿昔替尼(2个剂量组)对肝脏和/或脏体系数有显著影响，对肾脏、脾脏、肺脏及相应脏体系数无显著影响。综上所述，在本实验条件下，19G294药效作用优于BAVENCIO联合阿昔替尼、YS110，安全性优于BAVENCIO联合阿昔替尼。结果如图20、图21、表28、表29所示。
表28A498人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组。a：表示TGI根据细胞接种后第65天瘤重计算。
表29-1A498人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的脏器重量及脏体系数统计
表29-2A498人肾癌细胞小鼠皮下移植模型中的脏器重量及脏体系数统计
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
实施例25双特异性抗体活性评价
在786-0等细胞反应体系中，786-0等细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0等细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
细胞裂解率用公式为：(Vsample-Vvehicle control)/(VTriton-100-Vvehicle control)×100％。其中Vsample为药物处理组的荧光信号读数，Vvehicle control为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，VTriton-100为阳性对照组荧光信号读数的平均值。
将细胞裂解率和样品浓度值用GraphPad Prism 7.00软件计算样品所介导的PBMC对靶细胞的IC50值。
表30不同人源化双特异性抗体介导的PBMC对不同靶细胞的细胞毒效应的IC50值(pg/ml)
从上述结果可知，19G294样品比19G300具有更高的体外活性。
实施例26双特异性抗体与抗原的结合表位鉴定
步骤1：
将CD26蛋白溶液替换为Tris-HCl(100mM)溶液体系，按照25ug/50ul，加入2.5ulTrypsin体系，在37℃条件下酶切17h；
步骤2：
进样质谱建立数据库：将步骤1中的CD26酶切产物进行质谱分析，获得酶切CD26片段数据；
步骤3：
将抗体19G294用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin进行生物素化，与SA生物传感器偶联后，浸入到酶切CD26中，捕获能与之结合的抗体片段，再用0.4ul的0.1％三氟乙酸进行洗脱，重复操作10次，共收集40ul洗脱产物；
步骤4
将步骤3中获取的洗脱产物进行质谱分析获得数据，与步骤2中获取的数据库进行比对，确定垂钓到的CD26酶切片段。
数据如图22、23、表31所示，样品氨基酸序列覆盖率的检测结果表明，仅鉴定到GTWEVIGIEALTSDYLYYISNEYK肽段，因此推断19G294与CD26蛋白的结合片段为G400～G423(GTWEVIGIEALTSDYLYYISNEYK，SEQ ID NO：59)。此外Y’S Therapeutics公司的专利(申请号：CN200680034937.4)公布了CD26抗体的表位信息，与本申请19G294结合CD26的位置不一样。结合上述19G294在体内外活性、安全性方面相比19G300、YS110等其他CD26抗体具有优势的实验结果，说明结合在片段G400～G423的抗体，具有更高的活性。
表31样品抗原结合区域肽段信息

Claims (10)

1.结合CD26的抗原结合蛋白，其结合SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列内的氨基酸残基。
2.结合CD26的抗原结合蛋白，与包含SEQ ID NO:1所示HCDR1、SEQ ID NO:2所示HCDR2、SEQ ID NO:3所示HCDR3以及包含SEQ ID NO:4所示LCDR1、由Arg Met Ser组成的LCDR2和SEQ ID NO:5所示的LCDR3的抗原结合蛋白竞争结合CD26。
3.权利要求2所述的抗原结合蛋白与CD26结合的表位与包含SEQ ID NO:1所示HCDR1、SEQ ID NO:2所示HCDR2、SEQ ID NO:3所示HCDR3以及包含SEQ ID NO:4所示LCDR1、由ArgMet Ser组成的LCDR2和SEQ ID NO:5所示的LCDR3的抗原结合蛋白与CD26结合的表位相同。
4.权利要求2所述的抗原结合蛋白，与a)或b)任一项的抗原结合蛋白竞争结合CD26：a)包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区的抗原结合蛋白；b)包含SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。
5.权利要求2所述的抗原结合蛋白，其与CD26结合的表位，与a)或b)任一项的抗原结合蛋白与CD26结合的表位相同：a)包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区的抗原结合蛋白；b)包含SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。
6.一种分离的核酸，选自a)、b)或c)任一项：
a)编码上述结合CD26的抗原结合蛋白的DNA；
b)与a)所述核酸完全互补的DNA；
c)(a)或(b)的RNA，其中U替代了T。
7.一种载体，包含上述核酸的载体。
8.一种细胞，包含上述载体的细胞。
9.一种组合物，包含上述任意一种抗原结合蛋白、核酸或细胞。
10.一种方法，用于治疗高CD26水平有关疾病的方法，给予受试者有效量的上述任意一种抗原结合蛋白、核酸或细胞。所述高CD26水平有关疾病包括但不限于肿瘤，所述高CD26水平的肿瘤包括但不限于肾癌、间皮瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌等。所述抗体或抗原结合片段单独给予，或者与其它抗癌剂联合给予。
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