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CN118750491A - 一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物或制备治疗肺损伤药物中的应用 - Google Patents

一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物或制备治疗肺损伤药物中的应用 Download PDF

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CN118750491A
CN118750491A CN202410982901.9A CN202410982901A CN118750491A CN 118750491 A CN118750491 A CN 118750491A CN 202410982901 A CN202410982901 A CN 202410982901A CN 118750491 A CN118750491 A CN 118750491A
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CN
China
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naamidine
marine
lung injury
alkaloid
inflammatory
Prior art date
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Pending
Application number
CN202410982901.9A
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English (en)
Inventor
李序文
庞涛
高成龙
宋锦乾
杨泽楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Provincial Laboratory For Yantai New Drug Creation
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Original Assignee
Shandong Provincial Laboratory For Yantai New Drug Creation
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物或治疗肺损伤药物中的应用，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：海洋生物碱naamidine尤其是naamidine J可显著降低巨噬细胞系炎症模型中TNF‑α的表达，在有效剂量下均无明显的毒性，并且海洋生物碱naamidine J可以通过抑制巨噬细胞中炎症因子的表达，来达到改善小鼠急性肺损伤的效果。

Description

一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物或制备治疗肺损 伤药物中的应用
技术领域
本发明专利涉及生物医药技术领域，尤其是指一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物或制备治疗肺损伤药物中的应用。
背景技术
急性炎症性疾病由局部或全身炎症引起，是全球重症、危重症患者死亡的主要病因，临床上以脓毒血症(sepsis)、急性肺损伤(acute lung iinjury,ALI)和更为严重的急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)等急性炎症性疾病最为常见。其中，急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症是急性炎症的肺部表现形式，其表现特征有严重的低血氧、肺渗透性增加、肺水肿、肺部炎症浸润和肺泡微血管膜损伤等，其中炎症损伤是急性肺损伤最明显的特征。急性肺损伤患者肺部会出现大量的炎性细胞浸润，这些炎性细胞的浸润和进一步的损伤刺激导致更多炎症介质的释放，造成细胞因子风暴、急性肺水肿，最终造成严重的急性呼吸衰竭和患者死亡。急性肺损伤的死亡率高。造成急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症和脓毒血症病死率高的原因主要是各种炎症细胞因子的过度释放导致的急性细胞和器官损伤，进而导致患者迅速死亡。然而，目前临床上针对急性肺损伤尚无有效的治疗策略和治疗药物，主要通过氧疗或机械通气辅助抗感染药物、激素、营养支持等非特异性联合措施对症治疗，其中糖皮质激素(地塞米松、氢化可的松、泼尼松等)是临床上应用最多的药物。糖皮质激素可以抑制多种免疫细胞，因此能非常有效地控制炎症反应。但是激素的副作用大，长期使用容易造成二次感染、糖尿病、骨质疏松、高血压和骨坏死等严重的副作用。
发明内容
本发现的海洋生物碱均分离于海绵，其中海洋生物碱naamidine J是从南海海绵(Pericharax heteroraphis)中分离得到的新型咪唑生物碱，其结构新颖，但是含量极低，约为海绵总量的百万分之二。经过发明人的研究发现，其在作为药物前驱体方面具有广阔的应用前景。
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物中的应用，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
在本发明的一个或多个实施例中，炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS中的至少一种。
在本发明的第二方面，本发明提供一种海洋生物碱naamidine在制备治疗肺损伤药物中的应用，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
在本发明的一个或多个实施例中，所述肺损伤为急性肺损伤，所述急性肺损伤包括外周炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤、支气管哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肺纤维化。
在本发明的一个或多个实施例中，所述急性肺损伤为脓毒症所致急性肺损伤。
在本发明的第三方面，本发明提供一种药物组合物在制备抗炎药物中的应用，所述药物组合物包括海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
在本发明的第四方面，本发明提供一种药物组合物在制备治疗肺损伤药物中的应用，所述药物组合物包括海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
在本发明的一个或多个实施例中，所述药物组合物中，所述海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体的给药剂量为每天20mg每kg受体重量。
在本发明的一个或多个实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一个或多个实施例中，所述药物组合物的剂型选自注射剂、吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。
实施例及说明书附图中，naamidine A为化合物Ⅰ-1；naamidine B为化合物Ⅰ-2；naamidine G为化合物Ⅰ-3；naamidine H为化合物Ⅰ-4；naamidine J为化合物Ⅰ-5，naamidine J简称NJ；pyronaamidine为化合物Ⅰ-6。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物中的应用，炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等，海洋生物碱naamidine尤其是naamidine J可显著降低巨噬细胞系炎症模型中TNF-α的表达，在有效剂量下均无明显的毒性。
2、本发明提供一种海洋生物碱naamidine在制备治疗肺损伤药物中的应用，海洋生物碱naamidine尤其是海洋生物碱naamidine J可以显著缓解脓毒症诱导的急性肺损伤，通过抑制巨噬细胞中炎症因子的表达，来达到改善小鼠急性肺损伤的效果，显著提高了急性肺损伤模型小鼠肺组织的损伤程度。。
3、本发明提供一种药物组合物，用于制备抗炎药物或治疗肺损伤药物。
附图说明
图1为海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)及空白组在5μM浓度下对RAW264.7的细胞活力的影响数据统计图；
图2为海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)及空白组、模型组在5μM浓度下对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子TNF-α表达释放的影响数据统计图；
图3为不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J及空白组对RAW264.7的细胞活力的影响数据统计图；
图4为不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J及空白组、模型组对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子TNF-α表达释放的影响数据统计图；
图5为不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J及空白组、模型组对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症基因(TNF-α、IL-1β、IL-6)表达水平的影响数据统计图；
图6为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)、模型组、阳性对照组(DXMS(5mg/kg))对腹腔注射脂多糖引起脓毒症合并肺损伤小鼠的肺脏器系数的影响数据统计图；图中，vehicle代表溶媒，溶媒由DMSO、Kolliphor HS15(15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯)、生理盐水按1：3：16配制；
图7为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)以及模型组、阳性对照组(DXMS(5mg/kg))对腹腔注射脂多糖(LPS)引起脓毒症合并肺损伤小鼠肺组织病理的对比切片图；
图8为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)以及模型组、阳性对照组(DXMS(5mg/kg))对腹腔注射脂多糖(LPS)引起脓毒症合并肺损伤小鼠的肺脏器系数对比图及血清中炎症因子TNF-α表达的影响数据统计图；
图9为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)以及模型组、阳性对照组(DXMS(5mg/kg))对腹腔注射脂多糖引起脓毒症合并肺损伤小鼠肺组织中炎症基因(TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS)mRNA表达水平的影响数据统计图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
脂多糖(LPS)购于碧云天生物技术有限公司，其他试剂为市售的分析纯试剂。细胞：RAW264.7巨噬细胞系购于中国典型培养物保藏中心。动物：C57BL/6J小鼠购自于南京华创生物科技有限公司。试剂盒：TNF-α的ELISA试剂盒购于美国R&D Systems公司，RNA提取试剂盒和SYBR试剂均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
实施例及说明书附图中，naamidine A为化合物Ⅰ-1；naamidine B为化合物Ⅰ-2；naamidine G为化合物Ⅰ-3；naamidine H为化合物Ⅰ-4；naamidine J为化合物Ⅰ-5，naamidine J简称NJ；pyronaamidine为化合物Ⅰ-6。
实施例1
海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5)的合成按照如下参考文献中Naamidine J的制备方法(路线如Scheme 1所示)制备，FU P-P,WANG Q,ZHANG Q,et al.Bioactivity-Driven Synthesis of the Marine Natural Product Naamidine J and ItsDerivatives as Potential Tumor Immunological Agents by Inhibiting ProgrammedDeath-Ligand 1[J].J Med Chem,2023,66(8):5427-38，其余化合物均为海洋天然产物，均从海绵中分离得到。
所得海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)的结构及相关数据如下：
Ⅰ-1(naamidine A)：Pale yellow oily,Yield 40％,C23H23N5O4,1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝8.6Hz,2H),6.82(d,J＝5.7Hz,2H),6.80(d,J＝6.2Hz,2H),6.74(d,J＝8.5Hz,2H),3.89(s,2H),3.86(s,2H),3.77(s,3H),3.36(s,3H),3.17(s,1H),3.17(s,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ163.3,158.4,157.2,155.0,146.5,134.4,131.2,129.5,129.2,128.6,126.9,115.9,114.2,55.4,31.9,29.9,28.7,25.0,24.9；HRMS(ESI):[M+H]+calcdfor C23H24N5O4,434.1823；found,434.1828.
Ⅰ-2(naamidine B)：Pale yellow oily,Yield 36％,C24H25N5O5,1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ7.12(d,J＝8.6 Hz,2H),6.81(d,J＝8.6 Hz,2H),6.72(d,J＝8.3 Hz,1H),6.58(d,J＝2.2 Hz,1H),6.46(dd,J＝8.3,2.1 Hz,1H),3.88(s,2H),3.86(s,5H),3.78(s,3H),3.49(s,3H),3.17(s,3H)；13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ162.49,158.33,155.91,146.61,146.04,145.58,145.30,135.73,131.55,130.38,129.49,126.88,119.40,114.30,114.17,110.95,56.15,55.44,32.33,30.10,28.95,24.84；HRMS(ESI):[M+H]+calcd for C24H26N5O5,464.1929；found,464.1936.
I-3(naamidine G)：Pale yellow oily,Yield 47％,C24H25N5O4,1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ7.11(d,J＝8.6 Hz,2H),6.90(d,J＝8.6 Hz,2H),6.81(d,J＝8.6 Hz,2H),6.79(d,J＝8.7 Hz,2H),3.90(s,2H),3.89(s,2H),3.77(s,3H),3.77(s,4H),3.48(s,3H),3.16(s,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ162.4,158.6,158.3,155.8,146.5,145.1,135.7,131.5,129.5,129.1,129.0,127.0,114.3,114.1,55.4,32.3,30.1,28.7,24.8；HRMS(ESI):[M+H]+calcd for C24H26N5O4,448.1979；found,448.1985.
I-4(naamidine H)，Pale yellow oily,C25H27N5O6,1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝8.6Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),6.39(d,J＝8.6Hz,1H),6.32(d,J＝8.6Hz,1H),3.91(s,3H),3.90(s,2H),3.88(s,2H),3.82(s,3H),3.77(s,3H),3.56(s,3H),3.16(s,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ162.7,158.3,151.4,147.2,135.6,129.5,126.7,123.4,114.1,103.9,61.2,56.0,55.43,53.6,31.9,30.1,29.9,24.9,23.0；HRMS(ESI):[M+Na]+calcdfor C2H27N5NaO6,516.1859；found,516.1835
I-5(naamidine J)：Pale yellow oily,Yield 65％,C25H27N5O5,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(d,J＝8.6Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),6.74(d,J＝8.2Hz,1H),6.55(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.41(d,J＝1.9Hz,1H),3.92(s,4H),3.84(s,3H),3.77(s,3H),3.67(s,3H),3.50(s,3H),3.18(s,3H)；13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.1,158.4,155.3,149.5,148.2,144.4,135.7,131.5,129.5,129.4,127.1,120.1,114.2,111.5,111.2,56.1,55.9,55.4,32.1,30.2,29.3,24.9；RMS(ESI):[M+H]+calcd for C25H28N5O5,478.2085；found,478.2083.
I-6(pyronaamidine)：Pale yellow oily,C25H27N5O6 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.58(d,J＝8.9Hz,2H),6.56(d,J＝8.9Hz,2H),6.50(d,J＝8.6Hz,1H),6.35(d,J＝8.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.86(d,J＝20.1Hz,2H),3.82(s,3H),3.72(d,J＝16.6Hz,1H),3.71(s,3H),3.67(s,3H),3.36(d,J＝16.7Hz,1H),2.94(s,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ164.98,161.38,158.00,154.11,151.42,147.94,147.21,135.60,132.89,130.14,128.78,126.99,123.41,116.08,113.44,103.93,61.12,55.98,55.16,31.14,30.34,24.50,23.04.HRMS(ESI):[M+H]+calcd for C24H26N5O5,494.2034；found,494.2018.
实施例2六种海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)的细胞毒性测试
1)实验方法：
将RAW264.7细胞按1×105/mL的密度均匀地铺在96孔细胞培养板内，待细胞生长至密度为70％～80％时，分别用5uM的多种海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)(溶剂为DMSO)及空白组(空白溶剂DMSO)孵育处理RAW264.7细胞24h，24h后使用CCK-8法测定细胞活力以评价化合物对细胞的毒性。2)实验结果：
结果参见表1和图1。
表1六种海洋生物碱naamidine对RAW264.7细胞活力的影响
组别 CCK-8占空白组百分比(％)
空白组(Control) 100.000±1.849
naamidine A(5μM) 49.358±1.011***
naamidine B(5μM) 94.543±1.605
naamidine G(5μM) 48.884±1.259***
naamidine H(5μM) 97.274±1.944
naamidine J(NJ)(5μM) 98.217±1.374
pyronaamidine(5μM) 103.230±1.630
注：与空白组相比，***p<0.001。
由表1及图1的结果可见，海洋生物碱naamidine A和naamidine G在5μM下对RAW264.7细胞可见明显毒性，其余生物碱在5μM下对RAW264.7细胞未见明显毒性。
实施例3巨噬细胞系炎症模型抗炎活性药物体外筛选
1)实验方法：
将RAW 264.7细胞按1×105/mL的密度均匀地铺在96孔细胞培养板内，待细胞生长至密度为70％～80％时，分别用5uM的海洋生物碱naamidine(化合物Ⅰ-1、化合物Ⅰ-2、化合物Ⅰ-3、化合物Ⅰ-4、化合物Ⅰ-5、化合物Ⅰ-6)(溶剂为DMSO)及空白组(空白溶剂DMSO)、模型组(空白溶剂DMSO)孵育处理RAW 264.7细胞3h，3h后除空白组Control孔外均加入脂多糖(LPS)(100ng/mL)作用2h，收集上清备用，按照商品化ELISA试剂盒的指导说明检测细胞上清中炎症因子TNF-α的表达水平。
2)实验结果：
结果参见表2和图2。
表2多种海洋生物碱naamidine对巨噬细胞系炎症模型的抗炎活性
注：与空白组相比，***代表P<0.001；与模型组相比，###代表P<0.001。
由表及图的结果可见，脂多糖能显著造成巨噬细胞RAW264.7中炎症因子TNF-α的表达上调，naamidine A，naamidine G和naamidine J在5μM下可以降低巨噬细胞中TNF-α炎症因子的表达，但是naamidine A和naamidine G在5μM下对RAW 264.7细胞可见明显的毒性，因此在无毒剂量下只有naamidine J具有良好的抗炎活性，能很好地抑制巨噬细胞中TNF-α炎症因子的表达。
实施例4海洋生物碱naamidine J的细胞毒性测试
1)实验方法：
将RAW264.7细胞按1×105/mL的密度均匀地铺在96孔细胞培养板内，待细胞生长至密度为70％～80％时，分别用不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，溶剂为DMSO)及空白组(空白溶剂DMSO)孵育处理RAW264.7细胞24h，24h后使用CCK-8法测定细胞活力以评价化合物对细胞的毒性。
2)实验结果：
结果参见表3和图3。
表3海洋生物碱naamidine J对RAW264.7细胞活力的影响
组别 CCK-8占空白组百分比(％)
空白组(Control) 100.000±2.446
naamidine J(1μM) 97.917±0.720
naamidine J(2μM) 100.271±2.289
naamidine J(5μM) 100.045±1.707
由表及图的结果可见，在终浓度5μM下，海洋生物碱naamidine J对RAW264.7细胞未见明显毒性。
实施例5巨噬细胞系炎症模型海洋生物碱naamidine J抗炎活性炎症因子表达测定
1)实验方法：
将RAW264.7细胞按1×105/mL的密度均匀地铺在96孔细胞培养板内，待细胞生长至密度为70％～80％时，分别用不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，溶剂为DMSO)及空白组(空白溶剂DMSO)、及模型组(空白溶剂DMSO)孵育处理RAW264.7细胞3h，3h后除空白组Control孔外均加入脂多糖LPS(100ng/mL)作用2h，收集上清备用，按照商品化ELISA试剂盒的指导说明检测细胞上清中炎症因子TNF-α的表达水平。
实验结果：
结果参见表4和图4。
表4海洋生物碱naamidine J对巨噬细胞系炎症模型的抗炎活性
组别 TNF-α占模型组百分比(％)
空白组(Control) 18.161±1.440
模型组(Model) 100.000±0.918***
NJ(1μM) 95.316±2.092
NJ(2μM) 81.541±1.180###
NJ(5μM) 57.241±2.135###
注：与空白组相比，***代表p<0.001；与模型组相比，###代表p<0.001。
由表及图的结果可见，脂多糖能显著造成巨噬细胞RAW264.7中炎症因子TNF-α的表达上调，海洋生物碱naamidine J可以浓度梯度依赖性地抑制巨噬细胞中炎症因子TNF-α的表达，具有良好的抗炎活性。
实施例6巨噬细胞系炎症模型海洋生物碱naamidine J抗炎活性基因表达水平测定
1)实验方法：
将RAW264.7细胞按1×105/mL的密度均匀地铺在24孔细胞培养板内，待细胞生长至密度为70％～80％时，分别用不同浓度(1μM、2μM、5μM)的海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，溶剂为DMSO)及空白组(空白溶剂DMSO)、及模型组(空白溶剂DMSO)孵育处理RAW264.7细胞3h，3h后除空白组Control孔外均加入脂多糖LPS(100ng/mL)作用2h，弃去上清，用Trizol充分裂解板底细胞，按照RNA提取说明书进行RNA提取，经逆转录成cDNA后，按95℃、5min，(95℃、10s，60℃、30s)×40个循环的扩增方法进行qRT-PCR，最终以2-ΔΔCt法进行统计计算。
2)实验结果：
结果参见表5和图5。
表5海洋生物碱naamidine J对巨噬细胞系炎症基因表达水平的影响
组别 TNF-α变化倍数 IL-1β变化倍数 IL-6变化倍数
空白组(Control) 1.000±0.026 1.000±0.049 1.000±0.227
模型组(Model) 16.974±0.648*** 3960.775±421.862*** 431.763±45.864***
NJ(1μM) 17.040±0.317 3599.984±99.433 414.988±15.615
NJ(2μM) 15.026±0.383# 2240.719±107.564### 201.764±7.340###
NJ(5μM) 8.016±0.168### 763.032±56.931### 25.933±0.323###
注：与空白组相比，***代表p<0.001；与模型组相比，#代表p<0.05，#代表#p<0.01，###代表p<0.001。
由表5及图5的结果可见，脂多糖可引起巨噬细胞RAW264.7中炎症相关基因TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达的显著上调，而海洋生物碱naamidine J给药后能显著缓解这一上调趋势，且能剂量依赖性地抑制炎症基因地表达，即海洋天然产物naamidine J具有良好的抗炎活性。
实施例7海洋生物碱naamidine J改善脓毒症所致急性肺损伤的药效评价
1、肺脏器系数
动物给药分组：实验动物为雄性C57BL/6J小鼠，根据小鼠体重按照随机分组原则进行随机分组，随机分为5组，分别是对照组、模型组、阳性药组、低剂量给药组和高剂量给药组；空白组、模型组腹腔注射溶媒(溶媒由DMSO、Kolliphor HS15(15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯)、生理盐水(0.9％的氯化钠水溶液)按1：3：16配制)，阳性药组腹腔注射5mg/kg地塞米松(Dexamethasone，DXMS)，给药组腹腔注射10mg/kg和20mg/kg的海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5)，地塞米松和naamidine J均溶于上述的溶媒，并呈澄清透明状，注射；连续给药3天，每天1次，末次给药2h后除对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余各组腹腔注射LPS(10mg/kg)，阳性药及给药组以溶媒为溶剂制备注射液给药。体重、肺脏器系数：在第3天给药2h后除对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余各组腹腔注射LPS(10mg/kg)，6h后称重小鼠并解剖小鼠取肺脏器并称重记录，结果参见表6和图6。
表6小鼠肺脏系数
组别 肺脏器系数(％)
空白组(Control) 87.722±1.676
模型组(Model) 100.000±1.459***
DXMS(5mg/kg) 92.372±1.253#
NJ(10mg/kg) 93.836±1.764
NJ(20mg/kg) 88.426±1.860###
注：与对照组相比，**代表*p<0.001；与模型组相比，#代表p<0.05，###代表p<0.001。
2、肺病理和血清炎症因子测定
在第3天腹腔注射LPS的6h后，眼眶收集全血，离心制备血清，-80℃冻存。用PBS灌流和多聚甲醛固定肺脏，固定的肺脏经脱水、石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色。结果见图7所示。将血清用商品化TNF-αELISA试剂盒测试，组织病理结果及数据统计见图8和表7。图8左为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)以及模型组、阳性对照组(DXMS)对腹腔注射脂多糖(LPS)引起脓毒症合并肺损伤小鼠的肺脏器系数对比图；图8右为不同给药剂量(10mg/kg、20mg/kg)海洋生物碱naamidine J(化合物Ⅰ-5，缩写为NJ)以及模型组、阳性对照组(DXMS)对腹腔注射脂多糖(LPS)引起脓毒症合并肺损伤小鼠的血清中炎症因子TNF-α表达的影响数据统计图。
表7肺病理和血清炎症因子数据统计
组别 肺组织评分 血清中TNF-α含量(％of Model)
空白组(Control) 0.000±0.000 42.082±1.956
模型组(Model) 26.900±0.623*** 100.000±6.648***
DXMS(5mg/kg) 17.600±0.763### 55.846±3.542###
NJ(10mg/kg) 18.100±0.849### 88.833±8.642
NJ(20mg/kg) 15.900±0.605### 70.698±6.279##
注：与空白组相比，***p<0.001；与模型组相比，##p<0.01，###p<0.001。
3、肺组织炎症相关基因表达水平测定
取少量冻存的肺组织，充分研磨，按照RNA提取试剂盒指导说明，利用qRT-PCR技术检测肺组织中炎症相关基因的表达，实验结果参见表8和图9。
表8肺组织中炎症相关基因的表达
组别 TNF-α变化倍数 IL-1β变化倍数 IL-6变化倍数 iNOS变化倍数
空白组(Control) 1.000±0.110 1.00±0.111 1.000±0.202 1.000±0.158
模型组(Model) 16.683±1.579*** 34.077±3.360*** 47.410±11.380*** 17.014±4.466***
DXMS(5mg/kg) 8.253±1.214## 20.321±3.267## 18.807±3.016# 6.668±1.203#
NJ(10mg/kg) 11.356±1.805 11.606±2.200### 12.754±3.555## 5.963±1.055#
NJ(20mg/kg) 6.263±0.747### 11.628±1.991### 12.493±3.693## 6.473±1.307#
注：与空白组相比，***代表p<0.001；与模型组相比，#代表p<0.05，##代表p<0.01，###代表p<0.001。
4、结果分析
除空白组各组给药小鼠腹腔注射脂多糖6h后，小鼠肺脏脏器系数显著上调，血清和肺组织中的TNF-α明显增多，肺组织明显受损，肺组织中相关炎症基因表达水平显著上升；海洋生物碱naamidine J(20mg/kg)给药组相较于Model组，能显著下调肺脏系数作用，明显降低血清中TNF-α的表达释放，降低肺组织中相关炎症基因的表达，并对肺部病理损伤有显著的改善作用。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
2.根据权利要求1所述的海洋生物碱naamidine在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS中的至少一种。
3.一种海洋生物碱naamidine在制备治疗肺损伤药物中的应用，其特征在于，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
4.根据权利要求3所述的海洋生物碱naamidine在制备治疗肺损伤药物中的应用，其特征在于，所述肺损伤为急性肺损伤，所述急性肺损伤包括外周炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤、支气管哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肺纤维化。
5.一种药物组合物在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
6.一种药物组合物在制备治疗肺损伤药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体，所述海洋生物碱naamidine选自如下结构：
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中，所述海洋生物碱naamidine或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体的给药剂量为每天20mg每kg受体重量。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自注射剂、吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。
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