CN118695846A

CN118695846A - 包括自发酵步骤的获得植物提取物的方法、包含此类提取物的组合物及其化妆品用途

Info

Publication number: CN118695846A
Application number: CN202380020769.7A
Authority: CN
Inventors: E·奥热; L·伯杰龙; L·穆雷; F·拉巴拉德; J-M·博托; Y·费雷拉; M·布吕拉
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2023-02-06
Publication date: 2024-09-24
Also published as: FR3132436A1; WO2023152080A1

Abstract

本发明涉及制备植物提取物的方法，其包括自发酵步骤和任选地提取步骤，所述提取步骤使得提取物富集小分子量RNA。本发明还涉及包含此类提取物的组合物及其化妆品用途，用于对抗皮肤衰老迹象、对抗皮肤紧致度或色调的丧失、改善皮肤的屏障功能和水合作用功能、美白皮肤或改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

Description

包括自发酵步骤的获得植物提取物的方法、包含此类提取物的组合物及其化妆品用途

技术领域

本申请涉及化妆品领域，更具体地说，涉及用于化妆品制剂的植物来源的活性提取物的制备，所述化妆品制剂用于对抗皮肤衰老迹象、对抗皮肤紧致度丧失、改善皮肤屏障功能和保湿或美白皮肤。

背景技术

可使用化学和植物化学中已知的所有纯化技术，例如使用极性或非极性有机溶剂的提取方法(EP3682865)，制备可用于化妆品的植物提取物。

然而，我们观察到消费者越来越渴望转向含有尽可能少的合成成分的天然产品。为了满足这一新要求，本申请中描述的提取物是100％天然的。

一种方法是利用微生物来协调植物的生物转化。文献中描述了许多涉及选择的或改良的微生物的方法，这些方法已在工业环境中使用。最广泛使用的方法基于发酵，发酵长期以来被认为是一种食品保鲜方法。发酵的主要优点是保鲜、改善口味或甚至提高食品的营养质量，因为其中存在较大量的易于吸收的生物活性分子。

在化妆品领域，微生物因其对皮肤的直接有益作用或者用于生产发酵的或生物转化的植物提取物而被广泛使用。例如，我们可以引用文献EP3744339A1和CN110680774A，它们分别描述了植物(酸橙(Citrus auriantium)和茉莉花)的发酵方法，涉及接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种的酵母，或者引用文献CN101243897A，它描述了使用乳酸菌生产化妆品或食品花卉提取物。

在同一领域，文献FR3103826描述了由至少一种乳酸菌、一种酵母和一种醋酸菌组成的微生物聚生体的制备，所述聚生体用于制备富含活性化合物的植物提取物，其可用于制药、化妆品和食品领域。

还描述了利用合成营养培养基中的微生物生产感兴趣的化合物(如维生素、柠檬酸、乳酸或香草醛)的生物技术工艺(US20060269632)。

然而，上述方法涉及外源的微生物供应或特定营养素的供应，以刺激微生物的生长，从而确保植物材料的生物转化。

发酵还可以依赖于存在于植物表面或内部结构中的内源性微生物群。它是一个由细菌和真菌、互利或共生的微生物组成的群落，称为植物生物群(phytobiota)，其寄生于几乎所有植物或植物部分(果实、叶子、花朵、茎、根、种子、蘑菇、藻类)。然后我们谈论自然发酵或自发酵。

因此，文献US20060269632A1描述了一种有效的抗过敏药物的制备，该药物是通过将松树嫩枝与水和糖混合，并在厌氧条件下进行数月的自然发酵而获得的。

本发明要解决的问题是提供一种制备天然植物提取物的新方法，该方法操作简单，无需添加任何活的微生物、任何酶或任何外源营养素，但仍然具有显著的生物有效性，并且无毒性。

为了解决这个问题，发明人开发了一种方法，包括受控的自发酵步骤，该步骤基本上通过植物材料，特别是花、果实、叶子和根的植物生物群进行，无需任何外源输入。

在这些条件下，产生大量的有机酸和酚酸。获得的植物提取物含有广泛的植物分子，使其具有经过验证的生物有效性。

由此获得的提取物可用于化妆品中以用于皮肤护理，更具体地说，用于对抗皮肤衰老迹象，对抗紧致度或色调的丧失，改善皮肤的屏障功能和水合作用，美白皮肤，甚至改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

发明概述

本发明的主题是一种自发酵方法，该方法可以获得富含有机酸和酚酸的植物提取物，包括以下步骤：

a)将植物材料与水混合，

b)如果有必要，将pH值调节为4至9之间的值，

c)将混合物保持在20℃至60℃的温度下、在pH值4至7之间，轻轻搅拌6小时至48小时，以便在允许与大气进行气体交换的封闭环境中进行自发酵过程，

d)纯化在c)中获得的混合物以去除残留的固体植物材料并收获液体部分，

e)对在前一步骤中获得的液体部分进行至少一次过滤，

f)检查滤液的pH值，如果有必要，将其重新调节为4至8之间的值，优选4至7之间的值。

本发明还涉及一种自发酵方法，其与随后的提取相结合，所述提取允许富集小分子量RNA，所述方法包括以下步骤：

a)将植物材料与水混合，

b)如果有必要，将pH值调节为4至9之间的值，

d’)向步骤c)中获得的混合物中添加浓度为1mM至5mM之间的植酸，

e’)如果有必要，将pH值调节为10至11之间的值，

f’)在50℃至80℃的温度下，将混合物持续搅拌1至3小时，

g’)分离残留的植物材料，

h’)所得液体部分通过连续过滤纯化以澄清提取物，

i’)将所得混合物的pH值调节为6至8之间的值，

j’)任选地，用生理学上可接受的溶剂稀释提取物。

本发明还涉及稀释的植物提取物，有利地，所述提取物通过自发酵方法从新鲜茉莉花(Jasminum grandiflorum)中获得，所述方法与随后的提取相结合，所述提取允许富集上述小RNA，并且所述提取物包含至少300mg/kg的酚类化合物，包括至少140mg/kg的酚酸，和至少300mg/kg的有机酸，包括至少50mg/kg的莽草酸和10mg/kg的奎尼酸。

本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含有效量的通过前述方法之一获得的提取物和生理介质。

本发明还涉及前述组合物的化妆品用途，用于对抗皮肤衰老迹象、对抗紧致度丧失、改善皮肤屏障功能和水合作用、美白皮肤、缓解与年龄相关的机械感觉触觉受体(Piezo1)和催产素受体(OXTR)的数量或活性的降低，或者甚至改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

本发明还涉及包含本发明植物提取物的组合物，用于改善皮肤的先天免疫防御。

附图简述

[图1]HPLC获得的茉莉提取物的蛋白质谱。

[图2]茉莉提取物中存在的酚类化合物的HPLC分析。

[图3]茉莉提取物中存在的有机酸的HPLC分析。

[图4]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对重建表皮中Piezo1受体表达的影响。

[图5]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对人体皮肤活检样本中催产素受体(OXTR)表达的影响。

[图6]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对培养的角质形成细胞中催产素受体(OXTR)信使RNA表达的影响。

[图7]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对培养的角质形成细胞中viperin表达的影响。

[图8]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对用Piezo1活性阻断剂(Dooku1)预处理的人体皮肤活检样本中E-钙粘蛋白表达水平的影响。

[图9]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对培养的角质形成细胞中11β-HSD1酶的信使RNA表达水平的影响。

[图10]通过WHO问卷、唾液催产素的测定和情绪状态测定来评价富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对幸福感的影响。

[图11]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对隐性水分流失的影响。

[图12]评估富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对ITA(个体类型角)的影响。

[图13]评价富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对前额皮肤粗糙度的影响。

[图14]临床专家评价富含2％小RNA的自发酵茉莉提取物对皮肤状况的影响。

[图15]自发酵方法和与允许富集小分子量RNA的提取相结合的自发酵方法的图解。

发明详述

定义

除非另有说明，本说明书中使用的所有术语均具有最广为人知的含义。为了本发明的目的，以下术语定义如下：

“提取物”是指从植物材料中进行所有水提取方法的结果。

“植物生物群”是指植物材料表面或内部存在的所有微生物。

在本说明书中，“植物材料”或“植物”是指属于植物界并具有植物生物群的活的生物体，包括植物、苔藓、地衣和藻类等。

“新鲜植物材料”是指在提取过程中使用的植物材料未经过任何可能改变其植物生物群的化学或机械处理。例如，植物材料是在参与该过程之前不久收获的，或者在收获后迅速冷冻，或者在允许良好保存植物生物群的条件下干燥，例如在低温下干燥。新鲜植物材料可以包括加工后获得的植物残留物。

“自发酵”是指由本申请所述提取工艺中涉及的植物材料中或其表面上天然存在的自身植物生物群引起的发酵过程。

“蛋白质”是指由氨基酸链组成的大分子，也包括大小小于20kDa(或20kg/mol)的多肽和肽。

“小RNA”或“小分子量RNA”是指小分子量的非编码RNA(核糖核酸)的混合物，所述非编码RNA的最大长度为150个核苷酸，例如所有类型的单链和/或双链的小的非信使RNA，例如microRNA、干扰RNA、内含子、小核RNA或甚至任何RNA片段。

“有机酸”是指氨基酸、脂肪酸和糖的分解代谢的衍生物，其包含酸官能团。该组包括α-羟基化羧酸(AHA)或多羟基化酸，如乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸、源自水果糖类或植物任何其他部分的羧酸(如糖醛酸)，或甚至二酸(如琥珀酸)。

“酚类化合物”是指具有一个或多个带有一个或多个羟基的芳香环的所有分子，例如酚酸、黄酮类化合物或其衍生物、单宁类或任何其他多酚。

“酚酸”是指由苯甲酸和肉桂酸衍生的酚类化合物，这些分子具有单个芳香环。

“黄酮类化合物”是指具有相同的由三个碳原子连接的两个芳香环形成的基本结构的所有酚类化合物。

“糖基化的黄酮类化合物”是指与一种或多种糖连接的黄酮类化合物。

“糖”是指提取物中所含的所有糖类，如单糖和二糖以及寡糖和多糖。

“茉莉肽”(jasmintides)是指来自茉莉的肽，其特征是其组成富含半胱氨酸和非典型的二硫键。

“感兴趣的植物分子”是指本发明提取物中存在的所有分子，特别是蛋白质、糖、酚类化合物、有机酸、长度最多为150个核苷酸的小RNA。

当描述数值范围时，必须将此范围的限度理解为明确包括该范围的所有中间值。例如，1％至10％之间的数值范围必须理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，以及1％至10％之间的所有小数值。

除非另有说明，否则数值百分比是重量百分比，即化合物的重量相对于预期混合物的总重量。

本文所述的组合物可以“包含”基本化合物或任选成分、“由基本化合物或任选成分组成”或“基本由基本化合物或任选成分组成”。

术语“基本由......组成”是指组合物或组分可以包括额外成分，但前提是这些额外成分不会改变本申请中描述的组合物或用途的基本特征或新颖特性。

“生理学上可接受的介质”是指适合与皮肤或粘膜外层接触的载体，其不会引起毒性、刺激、过度过敏和类似反应或不耐受反应，并且与合理的效益/风险比相称。

“皮肤”是指面部和身体的皮肤，包括头皮(包括毛囊和毛囊间皮肤空间)和附属物(头发、体毛和指甲)。

“有效量”是指本发明提取物的最小量，该量是获得至少一种所需生物活性所必需的且该量无毒。

“皮肤水合作用”是指表皮上层的水分含量和分布。

“皮肤衰老迹象”是指由于衰老导致的皮肤外观的所有变化，例如皱纹和细纹、裂纹、眼袋、黑眼圈、萎蔫、皮肤弹性、紧致度和/或色调丧失、色素沉着症(例如老年性雀斑或日光性雀斑)，也包括任何不会系统性导致外观改变的皮肤内部变化，例如机械感觉触觉受体(Piezo1)和催产素受体(OXTR)的数量或活性减少、皮肤变薄，或因环境压力(例如污染和太阳辐射，包括紫外线)导致的任何皮肤内部损伤。

“内在幸福感”是指人的情绪状态、主观幸福感、催产素的生理产生以及行为或情绪表达的测量。

应当理解，本发明涉及哺乳动物，更具体地说是人类。

自发酵和提取方法以及获得的提取物

本发明的主题是一种获得富含有机酸和酚酸的植物提取物的方法，包括以下步骤：

a)将植物材料与水混合，

b)如果有必要，将pH值调节为4至9之间的值，

c)将混合物保持在20℃至60℃的温度下、在pH值4至7之间，轻轻搅拌6小时至48小时，

e)对在前一步骤中获得的液体部分进行至少一次过滤，

f)检查滤液的pH值，如果有必要，将其重新调节至4至8之间的值。

置于水中的新鲜植物材料为植物生物群的生长提供必需的营养。营养源足以让植物生物群发育并存活数天。

本发明的方法的实施无需在化妆品中添加外源营养物，也不使用洗涤剂或潜在有毒的溶剂。因此，该方法实施起来很简单，对环境的影响也较小。

在步骤c)中，适度搅拌使植物生物群的微生物悬浮在混合物中。

步骤c)的自发酵过程在开放环境中进行，以允许与大气进行气体交换，没有任何用来确保无菌的特殊限制，但也可以备选地在发酵罐中实施以控制气体交换。

当植物生物群的微生物通过其酶来代谢植物来源的营养物(例如糖、蛋白质、多酚)以产生富含各种更简单且更易于吸收的化合物(例如有机酸、肽和酚酸)的提取物时，发生自发酵。

对微生物生长动力学的研究和测试可以观察到在自发酵过程中培养基的显著变化，其特征是黄酮类化合物含量下降，糖类(特别是葡萄糖)浓度下降，发酵标志物(如酚类和有机酸)增加，这证明了微生物的发酵活性。

在特定实施方案中，所用的植物材料是木犀科(Oleaceae)、禾本科(Poaceae)或豆科(Fabaceae)植物。

在另一个特定实施方案中，所用的植物材料是木犀科植物，例如大花茉莉(Jasminum grandiflorum)种的茉莉。

在特定实施方案中，所用的植物部分选自花、果实、叶和根。

在优选实施方案中，所用的植物部分是花。

在另一个实施方案中，所用的植物材料是藻类。

在另一个特定实施方案中，所述植物材料是加工后获得的植物残渣，例如饼或酒糟(spent grains)。

在步骤a)中，我们使用蒸馏水、去离子水或富含矿物盐和/或微量元素的水。优选使用的水是蒸馏水。

步骤a)中使用的植物材料可以是完整的，也可以使用刀片研磨机进行机械粉碎，例如将颗粒尺寸减小到0.5毫米至几厘米，而不会影响植物、微生物的活力。研磨可以干磨或在水中进行。

当植物材料由花组成时，优选使用完整的花，也就是说不粉碎。事实上，在有或没有研磨的情况下进行的对比提取表明，花中所含化合物的被动扩散足够高，因此无需研磨。

另一方面，当起始植物材料太厚或由大碎片(例如整个藻类或根)组成时，优选在步骤a)之前将其粉碎。

在步骤a)中，植物材料/水的比例优选为3％w/w至30％w/w，更优选为3％至15％w/w，甚至更优选为3％、5％或15％w/w。

在步骤b)开始时，通过添加盐酸(HCl)、柠檬酸或氢氧化钠(NaOH)将pH控制并调节为4至9之间的值，优选6至8之间，甚至更优选为pH 7。随后在整个步骤b)中定期检查pH并可能重新调整。

当在此步骤中使用柠檬酸时，在计算提取物的最终有机酸浓度时，去除此量的柠檬酸。

在步骤c)中，混合物的搅拌有利地是适度搅拌的搅拌类型。温度调节并保持在20℃至60℃之间，更优选在20℃至40℃之间，甚至更优选在30℃至40℃之间。这些温度范围对于确保微生物的最佳发育是理想的，事实上，低于20℃时微生物生长会减慢，高于60℃时微生物的活力会降低。

步骤c)必须在最佳pH值和温度下进行，以使水提取溶液富含植物分子，并为混合物中存在的植物生物群的生长创造条件。在此阶段，pH值不得低于5。

自发酵步骤c)持续1小时至48小时，优选6小时至30小时，更优选15小时至30小时。微生物生长动力学研究表明，在工艺条件下生长旺盛，持续至少30小时，然后达到平台期。

任选地，在步骤c)结束时，可以压碎残留固体材料以释放微生物的细胞内容物，从而增加植物分子的提取产率。

为了进行步骤d)，可以使用本领域技术人员已知的任何方法。例如，可以将c)中获得的混合物在孔隙率大于30μm的过滤器上过滤。优选地，在c)中获得的混合物进行低速离心，例如在4000g下离心至少10分钟。

为了进行步骤e)，优选通过将过滤阈值从30μm降低到1μm来进行连续过滤，以澄清混合物。优选地，使用孔隙率范围为30μm、4μm、2μm和1μm的过滤器进行至少4次过滤。

在步骤f)中，检查滤液的pH值，必要时重新调整为4至8之间的值，优选调整为4至7之间的值。可以通过添加氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)溶液或任何其他与化妆品用途相容的等效酸(例如柠檬酸)来调整pH值。此步骤对于避免感兴趣的植物分子(例如糖、酚类化合物、有机酸、蛋白质)沉淀并由此获得稳定的提取物很重要。优选将pH值调整为4至7之间的值。

在步骤g)中，可以任选地通过本领域技术人员已知的任何方法对滤液进行灭菌，例如通过蒸汽灭菌或优选通过在0.2μm至0.45μm过滤器上进行除菌过滤。

在步骤f)或g)结束时，获得浓缩的自发酵提取物。

这种浓缩的自发酵提取物的特征在于干重为4g/kg至30g/kg，糖为0.5g/kg至6g/kg，有机酸为300mg/kg至900mg/kg，包括50mg/kg-500mg/kg莽草酸和10mg/kg至100mg/kg奎尼酸，酚类化合物为300mg/kg至2000mg/kg，包括100mg/kg至200mg/kg酚酸，蛋白质为1g/kg至10g/kg。然而，所获得的提取物可能表现出显著的变异性，具体取决于收获地点或年份、季节、气候条件、生物胁迫等因素。

自发酵提取物不含乙醇，因为本发明的方法不是酒精型发酵。

h)如此获得的浓缩自发酵提取物可在生理上可接受的溶剂中稀释，以用于化妆品用途。

自发酵方法可使提取物中富含由多酚转化产生的酚酸以及有机酸，如奎尼酸、琥珀酸、莽草酸和乳酸。

因此，高效液相色谱分析表明，出乎意料的是，通过上述方法获得的浓缩的自发酵提取物含有至少300mg/kg的酚类化合物，包括至少100mg/kg的酚酸，和至少300mg/kg的有机酸，包括至少50mg/kg的莽草酸和10mg/kg的奎尼酸。

事实上，一般来说，花朵中，特别是薰衣草花朵中所含的有机酸的分析不含莽草酸和奎尼酸。

在步骤h)中，生理上可接受的溶剂可包括：水、甘油、乙醇、丙二醇及其来自玉米的天然形式、丁二醇、二丙二醇、乙氧化或丙氧化的二甘醇类、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。除了精确获得所需浓度的植物分子外，这种稀释液的优点之一是可以提高自发酵植物提取物的稳定性和保存期。

优选地，浓缩的自发酵提取物用丁二醇、丙二醇或甚至甘油稀释，甚至更优选地通过添加30％丙二醇来稀释，以通过防止污染而确保其稳定性和长期保存。浓缩的提取物也可以通过添加30％甘油以及所有类型的水溶性防腐剂(如最终浓度为0.5％的苯甲酸钠或山梨酸钾或最终浓度为1.5％的苯氧乙醇)来稀释。

这种所谓的稀释的提取物包含按重量计占提取物总重量的2g/kg至20g/kg干燥提取物、0.2g/kg至4g/kg糖、100mg/kg至700mg/kg有机酸(包括50mg/kg至350mg/kg莽草酸和10mg/kg至70mg/kg奎尼酸)、100mg/kg至1300mg/kg酚类化合物(包括70mg/kg至140mg/kg酚酸)和0.1g/kg至5g/kg蛋白质。

因此，本发明的提取物包含多种植物分子，这些植物分子可以对皮肤产生有益作用，而不会引起皮肤刺激或其他健康损害的风险。

在该特定实施方案中，植物材料有利地是来自木犀科、禾本科或甚至豆科的植物。

在该特定实施方案中，植物材料甚至更有利地是新鲜茉莉花，优选是大花茉莉种的新鲜茉莉花。

此外，在步骤c)之后，可以根据本领域技术人员已知的任何方法进行额外的提取步骤。

在这些额外的提取步骤中，我们可以引用专利FR 1670672和US11,021,505中描述的能够富集小分子量RNA的提取方法。

为实施该方法，进行以下步骤：

步骤d’)向步骤c)中获得的混合物中添加浓度为1mM至5mM之间的植酸。

步骤e’)如果有必要，将pH调整为10至11之间的值。

步骤f’)在50℃至80℃之间，优选80℃的温度下，将混合物持续搅拌1小时至3小时，优选2小时。

步骤g’)去除残留的植物材料。

步骤h’)获得的液体级分通过连续过滤纯化，以澄清提取物。

步骤i’)将所得混合物的pH值调整为6至8之间的值。

将自发酵方法与允许富集小RNA的补充提取方法相结合的优点之一是与通过自发酵获得的提取物相比，提取产率至少增加到2倍。蛋白质、糖、有机酸和总酚类化合物的浓度也增加到约2至3倍。

因此，通过上述方法获得的富含小RNA的浓缩提取物的干重比通过简单的自发酵获得的提取物的干重高至少两倍，并且含有至少500mg/kg的酚类化合物，和至少600mg/kg的有机酸。

该浓缩提取物的特征在于干重为4g/kg至60g/kg，并且包括0.5g/kg至10g/kg糖、600mg/kg至1200mg/kg有机酸(包括50mg/kg至700mg/kg莽草酸和20mg/kg至200mg/kg奎尼酸)、500mg/kg至3000mg/kg酚类化合物(包括200mg/kg至300mg/kg酚酸)、2g/kg至20g/kg蛋白质以及10mg/kg至100mg/kg小分子量RNA。

在该特定实施方案中，植物材料甚至更有利地是新鲜茉莉花，优选是大花茉莉花种的新鲜茉莉花。

当植物材料是新鲜茉莉花(大花茉莉)时，所获得的提取物的干重至少比通过简单自发酵所获得的提取物的干重高2倍，并且包含至少500mg/kg的酚类化合物、至少600mg/kg的有机酸和至少一种茉莉肽。

茉莉肽属于环肽家族，在健康和抗衰老作用方面具有与催产素具有相近的活性(Adriano Mollica et al.2015,Cyclotides:a natural combinatorial peptidelibrary or a bioactive sequence player？Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry,30:4,575-580)。

步骤j’)任选地，将提取物用生理学上可接受的溶剂稀释。

为了进行该稀释步骤，所述生理学上可接受的溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇及其来自玉米的天然形式、丁二醇、二丙二醇、乙氧化或丙氧化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。除了获得精确所需浓度的植物分子外，这种稀释的优点之一是提高自发酵植物提取物的稳定性和保存期。

优选地，富含浓缩的小RNA的自发酵提取物用丁二醇、丙二醇或甚至甘油稀释，甚至更优选地通过添加30％丙二醇来稀释，以通过防止污染而确保其稳定性和长期保存。浓缩的提取物也可以通过添加30％甘油以及所有类型的水溶性防腐剂(如最终浓度为0.5％的苯甲酸钠或山梨酸钾或最终浓度为1.5％的苯氧乙醇)来稀释。

用生理学上可接受的溶剂稀释后，这种提取物的特征是干重为2g/kg至40g/kg，并且包括0.2g/kg至5g/kg糖；300mg/kg至900mg/kg有机酸，包括50mg/kg至500mg/kg莽草酸和10mg/kg至200mg/kg奎尼酸；300mg/kg至2000mg/kg酚类化合物，包括140mg/kg至210mg/kg酚酸，2g/kg至10g/kg蛋白质以及至少10mg/kg至60mg/kg小分子量RNA。

当植物材料是新鲜茉莉花(Jasminum grandiflorum)时，所述提取物还包含至少一种茉莉肽。

化妆品组合物

本发明的另一个目的是包含有效量的至少一种根据本申请中描述的方法获得的植物提取物的化妆品组合物。

有利的是，本发明的植物提取物以稀释形式使用，并以相对于组合物总重量按重量计0.05％至5％的浓度添加到生理学上可接受的介质中，优选以相对于组合物总重量按重量计0.1％至2.5％的浓度添加到生理学上可接受的介质中。

本发明可用的组合物被配制成可通过任何合适的途径施用，特别是口服或外用，并且本领域技术人员将调整组合物的配方。

优选地，本发明的组合物为适合局部施用的形式。因此，这些组合物必须包含生理上可接受的环境，该环境与皮肤和附属物相容，并且在施用过程中没有不适的风险，并且涵盖所有合适的化妆品形式。

用于实施本发明的组合物可以特别地是水溶液、水醇溶液或油溶液、水包油乳液、油包水乳液或多重乳液的形式；它们还可以是悬浮液或甚至粉末的形式，适合施用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或头发。

这些组合物可以大致上是流体，也可以具有乳膏剂、洗剂、乳液、精华液、软膏、凝胶、糊状物或泡沫的外观。它们也可以是固体形式，如棒状或以气溶胶形式应用于皮肤上。

作为在预期的应用领域中常用的生理上可接受的介质，例如，制剂所需的辅助剂，如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染料、防晒剂、自晒黑剂、色素、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。

在所有情况下，本领域技术人员将确保这些辅助剂及其比例的选择不会损害本发明组合物的期望的有利特性。这些辅助剂可以例如占组合物总重量的0.01％至20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂肪相可以占组合物总重量的5重量％至80重量％，优选5重量％至50重量％。组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂选自所考虑领域中常规使用的乳化剂和辅助乳化剂。例如，它们可以以占组合物总重量的0.3重量％至30重量％的比例使用。

根据本发明的另一个有利实施方案，本发明的植物提取物可被封装或包含在化妆品载体，例如化妆品领域中使用的脂质体或任何其他纳米胶囊或微胶囊中，或吸附在粉状有机聚合物、矿物支持物例如滑石粉和膨润土上。

有利地，除了根据本发明的植物提取物之外，本发明的组合物还可包含至少一种具有与本发明的化妆品效果相似和/或互补的化妆品效果的其他活性剂。

例如，其他活性剂可选自：抗衰老剂、紧致剂、亮肤剂、保湿剂、排水剂、微循环促进剂、去角质剂、脱屑剂、刺激细胞外基质剂、激活能量代谢剂、抗细菌剂、抗真菌剂、舒缓剂、抗自由基剂、抗紫外线剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、提供热感剂、提供清新感剂、减肥剂。

此类其他活性剂可从以下组中选择：

-维生素(维生素A及其衍生物；维生素B3、B5、B6和B12；维生素C；维生素E、F、H、K、PP或甚至辅酶Q10)；

-金属蛋白酶抑制剂或TIMP激活剂；

-DHEA、其前体和衍生物；

-氨基酸、天然或合成肽；

-丰年虫(Artemia salina)提取物，以GP4G^TM名称销售(FR2817748，)；

-植物肽提取物、酵母提取物、多酚提取物；

-脱氢乙酸(DHA)；

-合成或天然来源的植物甾醇；

-水杨酸及其衍生物、α-和β-羟基酸、硅烷醇；

-氨基糖类和多糖类；

-脂质，例如神经酰胺类或磷脂类；

-环AMP及其衍生物、甲基黄嘌呤。

化妆品用途

本发明还涉及包含本发明植物提取物的组合物的化妆品用途，其用于皮肤护理，更具体地说，用于对抗皮肤衰老迹象、对抗皮肤紧致度丧失、改善皮肤屏障功能和水合作用、美白皮肤、缓解与年龄相关的机械感觉触觉受体(Piezo1)和催产素受体(OXTR)的数量或活性的降低，或改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

优选地，本发明的化妆品用途涉及通过在健康皮肤上局部应用的美容处理方法。

在特定实施方案中，本发明涉及新鲜茉莉花(Jasminum grandiflorum)的自发酵提取物的化妆品用途。

有利地，本发明的主题是包含新鲜茉莉花(Jasminum grandiflorum)提取物的组合物的化妆品用途，所述提取物通过自发酵方法与允许富集小分子量RNA的提取方法(专利FR 1670672和US11,021,505中描述的方法)相结合而获得。

本发明的植物提取物在与衰老和水合作用相关的生物标志物(如胶原蛋白和透明质酸的表达)上进行了测试，结果显示其比常规对照植物提取物更有效。

本发明的植物提取物在与皮肤紧致度或色调相关的生物标志物(如E-钙粘蛋白)上进行了测试，结果显示其比常规对照植物提取物更有效。

本发明的植物提取物在酪氨酸酶(一种与黑色素合成相关并因此与皮肤色素沉着有关的酶)上进行了测试，结果显示，其比常规的对照植物提取物具有更强的酪氨酸酶抑制活性。

包含本发明的植物提取物的化妆品组合物可以缓解与年龄有关的机械感觉触觉受体(Piezo 1)的数量或活性的下降。

包含本发明植物提取物的化妆品组合物能够刺激催产素受体的表达，催产素受体是一种参与预防皮肤衰老的分子。

在这个特定的实施方案中，茉莉花提取物已经证明了它们能够刺激viperin的表达，viperin是一种与皮肤的先天免疫防御有关的分子。

在这个特定的实施方案中，由健康志愿者局部应用的含有2％本发明提取物的组合物对内在幸福感产生了积极的效果。在这个测试中，情绪状态通过三个不同的内容进行评估：主观幸福感、唾液催产素产生和行为或情绪状态的测量(Don Hockenbury andSandra E.Hockenbury,Discovering psychology,5th edition,Page 344,chapter 8,Worth Publishers)。

在一个特定的实施方案中，本发明还涉及一种包含本发明植物提取物的组合物，用于改善皮肤的免疫防御。

实施例

下面通过示例的方式描述本发明方法的实施方案的实施例。

实施例1：新鲜的自发酵茉莉花(Jasminum grandiflorum)提取物的制备

大花茉莉种属于茉莉属，在工业中广泛用作香料或芳香剂。

在第一步a)中，将200g完整新鲜茉莉花与1800g蒸馏水混合，即在方法中使用10％的原料和90％的水，总重量为2kg。

b)将pH值调整为7。

c)将混合物置于30℃的开放式烧杯中，以保持24小时的有氧环境，其有利于微生物的生长。在此阶段，定期检查pH值，以便我们注意到与微生物生长相关的环境酸化，但pH值不得低于5。

d)将所得混合物在4000g下离心10分钟，使残留植物材料沉淀在沉淀物中，并收集上清液。

e)然后通过将过滤阈值从30pm降低到0.2pm，对所得混合物进行连续过滤。

f)使用10％浓柠檬酸将所得滤液的pH值调节至6.3。

g)通过过滤对滤液进行灭菌。

未稀释的提取物干重为11.7g/kg，含有总糖浓度为5.2g/kg，蛋白质浓度为3.7g/kg，总有机酸浓度为411.1mg/kg，总酚类化合物浓度为630mg/kg。

h)用植物来源的甘油稀释提取物，得到最终浓度为30％的甘油和70％的自发酵茉莉花提取物。

稀释的提取物的干重为8.1g/kg，具有总糖浓度为3.6g/kg，蛋白质浓度为2.6g/kg，总有机酸浓度为287.7mg/kg，总酚类化合物浓度为441mg/kg。

实施例2：通过自发酵与能够富集小RNA的二次提取方法的组合来制备新鲜茉莉花(Jasminum grandiflorum)提取物

根据实施例1的步骤a)至c)进行自发酵。

将2g/L或3mM植酸添加到混合物中。

将pH值调整为pH 11，以便在提取物中富集小分子量RNA以及各种植物分子。

在搅拌下将混合物在80℃下加热2小时。

然后使用孔隙率为30μm的过滤器过滤混合物，以将固体物质与滤液分离。

然后在孔隙率递减的多个过滤器上进行顺序过滤以澄清植物提取物，直到在1μm孔隙率下过滤。

使用柠檬酸溶液将pH值调整为6.3。

在此阶段，提取物的干重为17.5g/kg，总糖浓度为6.4g/kg，蛋白质浓度为6.6g/kg，总有机酸浓度为802.9mg/kg，总酚类化合物浓度为1301mg/kg，小分子量RNA浓度为45mg/kg，并且不含DNA。

DNA酶测试表明不存在DNA，DNA酶是一种特异性降解DNA而不降解RNA的酶。DNA酶作用后的电泳图谱没有改变，这表明提取物中存在的核酸对DNA酶不敏感，因此不是DNA。

然后用植物来源的丙二醇稀释提取物，以获得最终浓度为30％的丙二醇和70％的自发酵并提取的茉莉花提取物。

稀释的提取物的干重为11.7g/kg，总糖浓度为4.1g/kg，蛋白质浓度为4.6g/kg，总有机酸浓度为562.5mg/kg，总酚类化合物浓度为874mg/kg，小分子量RNA浓度为31mg/kg。

实施例3：制备作为对比要素的茉莉花提取物

1/使用常规方法提取新鲜茉莉花：

为了进行比较，使用与实施例1或2中相同数量的完整新鲜茉莉花(即，在蒸馏水中10％的植物原料)生产常规提取物。

然后将混合物在25℃下加热1小时，然后通过30μm的大孔隙率过滤器进行第一次过滤，以从液体部分中去除固体残留植物材料。然后在孔隙率递减的多个过滤器上进行顺序过滤，以澄清植物提取物，直到在0.2μm孔隙率下进行除菌过滤。

在上一步中获得的液体部分构成常规对照提取物。

因此可以生成对比分析数据，如[图1]、[图2]、[图5]和实施例所示。

2/通过能够富集小RNA的方法提取新鲜茉莉花：

该方法在专利FR 1670672和US11,021,505中有详细描述。

为了获得富含小RNA的新鲜花提取物，使用与实施例1和2中相同数量的完整新鲜茉莉花，即，在蒸馏水中10％的植物原料。

将2g/L或3mM植酸加入混合物中。

在搅拌下将混合物在80℃下加热2小时。

然后在孔隙率递减的多个过滤器上进行顺序过滤，以澄清植物提取物，直至在1μm孔隙率下过滤。

用柠檬酸溶液将pH值调整为6.3。

上一步获得的液体部分包含富含小对照RNA的提取物。

因此可以生成对比分析数据，如[图1]、[图2]、[图5]所示。

实施例4：实施例1和2中的茉莉花提取物相比实施例3中的常规提取物和富含小RNA的提取物的分析。

对稀释前的实施例1和2中的提取物、实施例3中的常规提取物和富含小RNA的提取物进行了分析。

方法学

用酚类还原Folin-Ciocalteu试剂后，在760nm处用分光光度法测定提取物中酚类化合物的总含量。使用没食子酸标准曲线进行定量，结果以没食子酸当量表示。

用缩二脲与Folin-Ciocalteu试剂组合进行量热反应后，在550nm处用分光光度法测定总蛋白质含量。使用BSA(牛血清白蛋白)标准曲线进行定量。

使用与固定于254nm的紫外检测器耦合的液相色谱法对酚类化合物的详细组成进行分析。样品通过Agilent 1200HPLC系统(Agilent Technologies)在UPTISPHERE CSEVOLUTION C18-AQ柱上分离。流动相由0.1％甲酸和甲醇溶液组成。

使用与固定于254nm的紫外检测器耦合的尺寸排阻色谱法对蛋白质的分子量分布谱进行分析。样品通过Agilent 1200HPLC系统(Agilent Technologies)在YMC Pack Diol60柱(DL06503-2543WT)上分离。流动相由0.05％ NaN₃、0.2M NaCl、0.1M磷酸盐缓冲液(pH7)的水溶液组成。

有机酸的表征和定量通过高效液相色谱偶联配备阴离子模式电喷雾离子源的质谱仪(Acquity Qda，Waters)进行检测。样品通过Agilent 1260HPLC系统(AgilentTechnologies)在EC 150/4.6Nucleoshell RP 18plus-5ljm柱(Macherey Nagel:763236.46)上分离。流速为0.3ml/min。流动相由0.01％甲酸和乙腈溶液组成。

糖的表征和定量通过高效液相色谱偶联配备有阴离子模式电喷雾离子源的质谱仪(Acquity Qda，Waters)进行检测。样品通过Agilent 1260HPLC系统(AgilentTechnologies)在Luna Omega Sugar 100A-3μm柱(Phenomenex:00F-4775-E0)上分离。流速为0.8ml/min。流动相由10mM乙酸铵的水溶液和10mM乙酸铵的乙腈溶液组成。

通过超高效液相色谱偶联高分辨率质谱仪对茉莉肽进行鉴定。将样品变性，然后在Aurora柱(15cm x 75m x 1.6μm x 120A)上分离。流速为0.3ml/min。流动相由0.1％甲酸水溶液和含0.1％甲酸的乙腈组成。通过与Swissprot数据库的比较，对茉莉肽进行了鉴定。

通过气相色谱法(GC)偶联质谱仪(MS)对提取物进行全面筛选。样品用(N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生，然后在Optima 5HT柱(Macherey Nagel 726104.15)上以3℃/min的梯度从50℃到300℃进行分离。

结果

提取物的蛋白质谱如[图1]所示。常规提取物的分子量分布在7200g/mol至170g/mol之间。相比之下，实施例1的自发酵方法使提取物中蛋白质分子量分布变宽，分子量在15800g/mol至170g/mol范围内。蛋白质谱的比较表明，对于分子量大于1000g/mol的蛋白质，与常规提取物相比，发酵过程中蛋白质数量增加。

实施例2的方法(自发酵结合提取的方法)增加了提取物的复杂性，与常规提取物相比，出现了分子量约19000g/mol的蛋白质，并且分子量约1000g/mol的小分子的信号增加。总蛋白质的定量显示实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)和富含小RNA的提取物之间增加了50％。

因此，自发酵过程改变了提取物的蛋白质谱，并且与提取步骤的结合使得可以增加总蛋白质浓度。

酚类化合物总量分析表明，实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)比常规提取物(实施例3)含有更多的酚类化合物。[图2]显示了在发酵过程中对复杂酚类化合物(黄酮类化合物或糖基化黄酮类化合物)的有针对性的消耗和简单酚类化合物如酚酸的出现。[图2]表明常规提取物和自发酵提取物之间存在的酚酸增加了120％，富含小RNA的提取物和实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)之间酚酸增加了23％。[图2]还表明常规提取物和自发酵提取物之间存在的黄酮类化合物减少了87％，富含小RNA的提取物和实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)之间存在的黄酮类化合物减少了93％。

如[图3]所示，提取物中所含有机酸的分析表明，在发酵过程中乳酸、琥珀酸、莽草酸、奎尼酸和乙醇酸的浓度增加。

[表1]详细说明了自发酵提取物中乳酸和奎尼酸的存在，相比而言，常规提取物中不存在乳酸和奎尼酸，并且自发酵提取物中琥珀酸和莽草酸与常规提取物相比分别增加了72％和79％。它还详细说明了自发酵结合提取的方法的提取物与富含小RNA的提取物相比，乳酸、琥珀酸、莽草酸、乙醇酸和奎尼酸的浓度分别增加了75％、31％、12％、66％和27％。

在发酵过程中，苹果酸的浓度经历了降低，与常规提取物相比，自发酵提取物中苹果酸的浓度降低了38％，而与富含小RNA的提取物相比，自发酵结合提取的方法的提取物中苹果酸的浓度降低了19％。

与不含发酵步骤的富含小RNA的常规提取物相比，自发酵结合提取的方法的提取物中的有机酸总浓度更高。

糖的分析表明，与富含小RNA的提取物相比，实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)中的葡萄糖减少了54％，这是由于自发酵的提取物以及随后的提取中微生物的糖消耗。

与单独的自发酵提取物相比，与提取结合的自发酵提取物中酚酸的总浓度高57％。

茉莉肽的分析表明，在实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)中存在至少一种茉莉肽，以及在常规提取物中不存在茉莉肽。

通过GCMS对提取物的分析表明，自发酵步骤可以增加提取物中存在的分子多样性。事实上，在自发酵提取物的谱上检测到109种分子，而常规提取物中检测到95种分子。在实施例2的提取物(自发酵结合提取的方法)中检测到165种分子，而在富含小RNA的提取物中检测到132种分子。将自发酵方法与提取相结合可以获得比常规提取具有更多样化组成的提取物，并且富含小RNA。

[表1]:茉莉花提取物中的化合物分析

[表2]:茉莉花提取物中的酚类化合物分析(曲线下面积)

实施例5：证明植物生物群在茉莉花(Jasminum grandiflorum)的自发酵中的作用

新鲜茉莉花在121℃下高压灭菌10分钟以杀死微生物。然后，将这种去除其活的植物生物群的植物材料用于实施例1中描述的方法，以构成对照提取物。

物理化学分析表明，酚类化合物和蛋白质的水平在自发酵过程中急剧下降，而在对照条件下则保持稳定。

这些结果表明，在本申请中，特别是实施例1中描述的自发酵方法过程中，植物生物群的微生物直接负责酚类化合物和蛋白质的代谢消耗。

[表3]：自发酵或对照(杀死植物生物群)情况下酚类化合物和蛋白质的消耗的比较

实施例6：体外评估根据实施例1和3获得的新鲜茉莉花提取物的透明质酸酶抑制能力

透明质酸酶催化透明质酸(一种在皮肤真皮中大量存在的具有保湿和抗衰老特性的糖胺聚糖)分解为单糖或二糖以及较小的透明质酸片段。

透明质酸在酸性白蛋白溶液存在下能产生浑浊，这可用分光光度计在600nm处测量。

方案：将酶与根据实施例1和3获得的提取物在选定浓度(v/v稀释度)下在37℃的温度下孵育。将酶的底物透明质酸添加到混合物中。将整体缓慢匀浆，然后在37℃下孵育整整45分钟。然后将混合物中剩余的透明质酸与酸性白蛋白溶液接触10分钟，然后在分光光度计上读取600nm的透光率。

根据实施例1制备的自发酵茉莉花提取物具有显著强于根据实施例3的常规制备的提取物的酶抑制能力。结果如[表4]所示。

[表4]：常规和自发酵茉莉花提取物之间在体外获得的透明质酸酶抑制百分比的比较。

实施例7:浓稠乳膏剂配方

[表5]

制备方法

1.将主容器中的A相均质化并开始加热至75℃-80℃；

2.在30℃下，撒入B相，边加热边均质化；

3.在单独的烧杯中，制备C相，加热至75-80℃直至均匀；

4.在75℃下，将C相加入主容器中，并均质10分钟；

5.让温度冷却并添加D相至65℃。充分混合以均质化10分钟；

6.在将E相添加到主容器之前对其进行预混合；

7.在60℃下添加E相。充分混合以均质化10分钟；

8.在35℃下，预混F相，然后将其添加并充分混合；

9.在将G相添加到主容器之前对其进行预混合；

10.在35℃下添加G相。充分混合以均质化；

11.在单独的烧杯中，制备H相：在室温下将Natrosol^TM撒入水中，并在加热至60℃的同时均质化；

12.在30℃下添加H相。充分混合以均质化；

13.在25℃停止。

因此，组合物呈粉红色奶油乳膏的形式，pH在4.90和5.40之间，粘度(OD)为160,000cps-210,000cps(Brookfield RVT/Spindle D/5RPM/1分钟/25℃)。

实施例8：根据实施例2获得的茉莉花提取物对重建的表皮中Piezo 1受体表达的评价

Piezo 1和Piezo 2蛋白已被鉴定为介导哺乳动物细胞中机械感觉传导的离子通道(Coste,Bertrand等)“Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinctmechanically activated cation channels.”Science(New York.N.Y.)vol.330.6000(2010):55-60)。在皮肤中，角质形成细胞通过检测和编码感觉神经元的这种信息来帮助介导触觉。Piezo 1是角质形成细胞的主要机械传导器(Holt.Jesse R etal.Spatiotemporal dynamics of PIEZO1localization controls keratinocytemigration during wound healing.eLife vol.10e65415.27Sep.2021)。

原理：评估根据实施例2获得的茉莉花提取物离体调节人皮肤中Piezo 1机械受体表达的能力。

方案：通过对重建的表皮切片进行间接免疫荧光来评估Piezo 1受体的表达，所述表皮先前通过局部应用稀释至2％(v/v)的实施例2的茉莉花提取物处理48小时(每天一次)。在相同条件下平行孵育的重建对照表皮接受安慰剂(磷酸盐缓冲盐水，PBS)。孵育结束时，将重建的表皮固定并包埋在石蜡中以制作组织学切片。Piezo 1受体的检测是通过与抗Piezo 1一抗(Proteintech)一起孵育来进行的。孵育一个半小时并随后冲洗后，将切片在与荧光团偶联的抗兔二抗(Alexa 488，Invitrogen)存在下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查切片。然后通过图像分析(图像分析软件，Improvision)观察并量化Piezo 1受体的表达。

结果：如图4所示，当用2％茉莉花提取物处理活检组织时，Piezo 1受体的表达增加了39％。

结论：茉莉花提取物对Piezo 1受体的表达具有正向作用。

实施例9：根据实施例2获得的茉莉花提取物对人皮肤活检样品中催产素受体(OXTR)表达的评价

原理：本实验的目的是证明茉莉花提取物对培养的人体皮肤活检组织中催产素受体合成的影响。

方案：通过对皮肤活检组织进行间接免疫荧光来评估催产素受体(OXTR)的表达，所述活检组织先前通过局部施用稀释至2％(v/v)的实施例2的茉莉花提取物处理48小时(每天两次)。在相同条件下平行孵育的对照活检组织接受安慰剂(磷酸盐缓冲盐水，PBS)。孵育结束时，将活检组织固定并包埋在石蜡中以制备组织学切片。OXTR受体的检测通过与抗OXTR抗体(Proteintech)一起孵育来进行。孵育一个半小时并随后冲洗后，将切片在与荧光团偶联的抗兔二抗(Alexa 488，Invitrogen)存在下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查切片。然后通过图像分析(图像分析软件，Improvision)观察并量化OXTR受体的表达。

结果：如图5所示，当用2％茉莉提取物处理活检组织时，OXTR受体的表达增加了63％。

结论：茉莉提取物对嗅觉催产素受体OXTR的表达具有正向作用。

实施例10：根据实施例2获得的茉莉提取物对培养的角质形成细胞中催产素受体(OXTR)信使RNA表达的评价

催产素是一种天然肽，其控制其靶组织中从细胞生长和分化到繁殖和社会行为的广泛特定作用(Carter,C Sue et al.“Is Oxytocin"Nature's MedicinePharmacological reviews vol.72.4(2020):829-861)。许多科学出版物支持催产素在皮肤生理和衰老中的有益作用(Hayre,Nicole.“Oxytocin Levels Inversely Correlatewith Skin Age Score and Solar Damage.”Journal of drugs in dermatology:JDDvol.19.12(2020):1146-1148)。其他研究也强调了催产素受体在预防皮肤衰老中的重要性((Cho,S-Y et al.“Oxytocin alleviates cellular senescence through oxytocinreceptor-mediated extracellular signal-regulated kinase/Nrf2signaling.”TheBritish journal of dermatology vol.181.6(2019):1216-1225)。

原理：本实验的目的是证明茉莉提取物对人皮肤角质形成细胞中催产素受体的信使RNA合成的影响。

方案：通过qPCR(定量聚合酶链式反应)对培养物中的皮肤角质形成细胞评估OXTR催产素受体的信使RNA的表达水平，所述皮肤角质形成细胞预先用1％(v/v稀释)的在培养基中的根据实施例2获得的茉莉提取物处理48小时(每天一次)。培养结束时，裂解细胞，提取总RNA，然后通过逆转录反应将其转化为互补DNA(cDNA)。OXTR受体cDNA的定量通过qPCR使用TaqMan探针进行检测。Δ-ΔCt定量方法可以比较目的基因(OXTR)和参考基因(GADPH)之间的表达差异(ΔCt)。

结果：如图6所示，当用1％的实施例2中获得的茉莉提取物处理培养物中的角质形成细胞时，OXTR受体的信使RNA的表达增加了26％。

结论：茉莉提取物对OXTR受体的信使RNA的表达具有正向作用。

实施例15：根据实施例2获得的茉莉提取物对培养的角质形成细胞中viperin表达的评价

Viperin是角质形成细胞合成的先天免疫防御因子之一(Garcia.Magali et al.“Innate Immune Response of Primary Human Keratinocytes to West Nile VirusInfection and Its Modulation by Mosquito Saliva.”Frontiers in cellular andinfection microbiology vol.8 387.2Nov.2018.)。Viperin已被证明可以催化三磷酸胞苷(CTP)转化为3'-脱氧-3',4'-二脱氢-CTP(ddhCTP)，这是一种以前未知的核糖核苷酸类似物。ddhCTP的掺入会导致某些病毒中RNA合成的过早终止(Gizzi.Anthony S et al.“Anaturally occurring antiviral ribonucleotide encoded by the human genome.”Nature vol.558.7711(2018):610-614.)。

原理：本实验的目的是证明茉莉提取物对培养的角质形成细胞中viperin表达水平的影响。

方案：通过角质形成细胞的间接免疫荧光来评估Viperin表达。通过应用1％(v/v稀释)的根据实施例2获得的茉莉提取物处理培养的角质形成细胞48小时(每天一次)。培养结束时，将细胞固定。通过与抗viperin抗体(Sigma)一起孵育来检测viperin。孵育一个半小时并随后冲洗后，将细胞在与荧光团偶联的抗小鼠二抗(Alexa 488.Invitrogen)存在下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查细胞。然后通过图像分析(图像分析软件,Improvision)观察并量化viperin的表达。

结果：如图7所示，根据实施例2获得的茉莉提取物对培养的角质形成细胞中viperin的表达显示出+40％的正向作用。

结论：茉莉提取物对viperin表达具有正向作用。

实施例16：评价根据实施例2获得的茉莉提取物对用Piezo 1活性阻断剂(Dooku1)预处理的人皮肤活检组织上E-钙粘蛋白的表达水平的影响

原理：本实验的目的是证明茉莉提取物对培养的人体皮肤活检组织中E-钙粘蛋白(一种参与组织张力的分子)表达水平的影响。

方案：通过对皮肤活检组织进行间接免疫荧光来评估E-钙粘蛋白的表达，所述皮肤活检组织用Piezo 1活性阻断剂(Dooku 1)预处理，然后通过局部应用根据实施例2获得的茉莉提取物处理48小时(每天两次)，或使用Piezo 1活化剂(Jedi 1)处理48小时(每天一次)。在相同条件下平行培养的对照活检组织接受安慰剂(磷酸盐缓冲盐水，PBS)。培养结束时，将活检组织固定并包埋在石蜡中以制作组织学切片。E-钙粘蛋白的检测通过与抗E-钙粘蛋白抗体(Abcam)一起孵育来进行。孵育一个半小时后，进行冲洗，将切片在与荧光团偶联的抗兔二抗(Alexa 488.Invitrogen)存在的情况下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查切片。然后通过图像分析(图像分析软件，Improvision)观察并量化OXTR受体的表达。

结果：如图8所示，当用Piezo 1活性阻断剂(Dooku 1)预处理活检组织时，观察到E-钙粘蛋白表达下降了-44％。当用Piezo 1活化剂(Jedi 1)处理活检组织时，E-钙粘蛋白的表达增加了23％。当用茉莉提取物处理活检组织时，E-钙粘蛋白的表达增加了95％。

结论：根据实施例2获得的茉莉提取物通过模拟Piezo 1受体活化剂(Jedi 1)的作用，而对E-钙粘蛋白的表达显示出正向的作用。

实施例17：根据实施例2获得的茉莉提取物对培养的角质形成细胞中的酶11β-HSD1的信使RNA的表达水平的评价

原理：本实验的目的是证明茉莉提取物对培养的人皮肤角质形成细胞中的酶11β-HSD1(也称为可的松还原酶)的信使RNA表达水平的影响。11β-HSD1酶表达的增加与皮肤衰老过程中表皮屏障功能的退化有关(Kim.B.J.et al.Increased Expression of 11-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1Contributes to Epidermal PermeabilityBarrier Dysfunction in Aged Skin.Int.J.Mol.Sci.2021.22.5750.)。

方案：通过qPCR(定量聚合酶链式反应)在培养的人皮肤角质形成细胞上评估酶11β-HSD1的信使RNA的表达水平，所述培养物预先用1％的在培养基中的根据实施例2获得的茉莉提取物处理48小时(每天一次)。培养结束时，裂解细胞，提取总RNA，然后通过逆转录反应将其转化为互补DNA(cDNA)。使用TaqMan探针进行检测，通过定量聚合酶链式反应对酶11β-HSD1 cDNA进行定量。Δ-ΔCt定量方法可以比较目的基因(11β-HSD1)和参考基因(GADPH)之间的表达差异(ΔCt)。

结果：如图9所示，当用1％的根据实施例2获得的茉莉提取物处理培养的角质形成细胞时，11β-HSD1酶的mRNA的表达水平降低达-24％。

结论：茉莉提取物对11β-HSD1酶的表达水平具有抑制作用。

实施例18：评估根据实施例2获得的茉莉提取物对抗皮肤衰老迹象、改善皮肤屏障功能、皮肤光度和内在幸福感的作用

原理：研究获得的2％茉莉提取物的有效性

方案：设置安慰剂对照，进行双盲比较研究，该研究在34名志愿者(年龄36岁至66岁)的面部和前臂上进行，所述志愿者根据年龄和性别被均匀地分为两组，每组17名志愿者。治疗组接受表6详述的在皮肤护理配方中配制的2％的实施例2的茉莉提取物，安慰剂组接受相同的护理配方但不含茉莉提取物。产品分配是根据随机数生成器创建的随机化队列进行的。

[表6]：临床试验中使用的含有2％的来自实施例2的茉莉提取物的护理配方

研究持续时间：28天，包括在D0(研究第一天)、D14(施用14天后)和D28(施用28天后研究结束)进行3次对照访视。

-在D0和D28通过三种不同方法测量幸福感：

a.世界卫生组织(WHO)设计的幸福指数的匿名调查问卷。

b.通过ELISA(酶联免疫吸附测定)方法定量唾液中的催产素。催产素是一种九肽，其在多种生理功能(例如排乳)以及某些类型的行为调节(例如依恋、社会认可和焦虑)中发挥着关键作用。多项研究表明，愉快的触摸与催产素的释放有关，并引起放松的行为效果。彻底漱口30秒后，将2毫升志愿者的唾液收集在预充气的管中，并立即储存在-80℃下。使用ELISA试剂盒(Enzo Life Science)对唾液催产素进行定量。

c.使用公司获得专利的Emotion 系统测量情绪状态。这种生物识别技术使用3个不同的传感器来实时测量一个人的压力状态：

i.通过皮肤敏感的电流传感器测量汗腺的离子电荷的变化；

ii.通过光学传感器测量心脏变化；

iii.通过皮肤温度传感器测量皮肤温度的变化。

随后，将所有收集到的数据都通过ICONIK开发的算法进行标准化和处理，计算出志愿者的情绪状态及其压力率。

-隐性水分流失(TEWL)-使用AF200通过密闭室方法在前臂上测量；

-皮肤色调-使用CM-700d分光光度计CM-700d(Konica Minolta Sensing.Inc.)测量面部。ITA°(个体类型角)参数通过以下公式计算：ITA°＝(Arc tan L*-50/b*)x 180/π)。

L*：皮肤亮度值

b*：蓝色和黄色之间的值(负值表示蓝色，正值表示黄色)

-通过硅胶复制品对前额皮肤进行形貌绘制，并通过光栅投影和立体测量技术的组合用系统进行分析。计算了皮肤纹理的不同参数，如表面粗糙度参数和轮廓粗糙度参数。此外，皮肤形貌的2D和3D展示可以用该同一系统产生。

-面部的彩色照片。这些照片是用HeadScan*V03工作台(Orion Concept*)拍摄的。

-由专家根据触摸和以下参数的视觉外观在0到100的范围内评估面部皮肤状况：

-皮肤色调：0对应于非常暗淡的皮肤，100对应于完美的亮度和肤色。

-皮肤的均匀性：0对应于有发红和斑点的非均匀皮肤，100对应于没有发红和斑点的非常均匀的皮肤。

-皮肤水合作用：0对应于非常干燥的皮肤，100对应于非常润泽的皮肤。

-鱼尾纹细纹：0对应于没有细纹的光滑皮肤，100对应于有明显纹理和可见细纹的皮肤。

-皮肤总体外观：0对应于皮肤保湿不良、非常粗糙、没有光泽且外观不均匀，100对应于非常润泽、有光亮、均匀且光滑的皮肤。

所有测量均在受测者在温度(21℃+/-1)和相对湿度(50％+/-5)受控的房间内休息15分钟后进行。

幸福感测量结果：如[图10]所示，结果表明，施用一个月后，治疗组志愿者的幸福感改善。对世界卫生组织幸福指数问卷的分析显示，与D0相比，治疗组的幸福感增加了20％，而安慰剂组未出现此情况。与安慰剂组相比，治疗组唾液中的催产素也显著增加，这表明茉莉提取物的应用可有助于改善催产素的释放。最后，治疗组在D0和D28之间的情绪状态显示出显著改善，志愿者感到压力减轻，而安慰剂组则没有显著改善。

幸福感测量结论：这些结果表明，2％的配制的茉莉提取物可以提高内在幸福感。

隐性水分流失(TEWL)的测量结果：如[图11]所示，从施用14天到研究结束，治疗组的不可察觉的水分流失显著低于安慰剂组。

隐性水分流失测量结论：该结果表明，施用2％的配制的茉莉提取物14天后，皮肤屏障得到加强。

皮肤色调测量结果：[图12]显示，施用含有2％茉莉提取物的乳膏剂1个月后，与安慰剂相比，ITA°显著增加。

皮肤色调测量结论：该结果表明，2％的配制的茉莉提取物有助于改善面部肤色。

前额皮肤形貌测量结果及面部彩色照片：如[图13]所示，与安慰剂组相比，施用14天后，治疗组前额的表面粗糙度和轮廓参数有所下降。此外，与安慰剂组的志愿者不同，治疗组的志愿者的3D照片中可以观察到更光滑的皮肤和更不明显的纹理。这些结果通过观察面部彩色照片得到证实。

前额皮肤形貌测量和面部彩色照片的结论：这些结果证明了2％的配制的茉莉提取物的抗衰老作用。

专家评估结果：根据[图14]，应用2％茉莉提取物14天后，专家观察到肤色、水合作用和皮肤整体外观的改善，而应用安慰剂14天后没有改善。同样，应用一个月后，专家注意到治疗组中志愿者评估的所有参数都有改善，而安慰剂组中志愿者没有改善。

专家评估结论：这些结果表明，2％的配制的茉莉提取物能够从视觉上减少面部细纹，同时改善面部水合作用和肤色。

测试结论：在现有条件下，上述结果表明，2％的配制的茉莉提取物改善了志愿者的幸福感，并减少皮肤衰老的影响。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.获得富含有机酸和酚酸的植物提取物的方法，其包括以下步骤：

a)将植物材料置于水中；

b)如果有必要，将pH值调节至4至9之间的值；

c)将混合物保持在20℃至60℃的温度下、在pH值4至7之间，轻轻搅拌6小时至48小时，以便在允许与大气进行气体交换的封闭环境中进行自发酵过程；

d)纯化在c)中获得的混合物以去除残留的固体植物材料并收集液体部分；

e)对在前一步骤中获得的液体进行至少一次过滤；

f)检查滤液的pH值，如果有必要，将其重新调节为4至8之间的值，优选4至7之间的值；

g)对滤液进行灭菌；

h)用生理学上可接受的溶剂稀释提取物以获得稀释的植物提取物，其特征在于，它们按重量计包含占提取物总重量的2g/kg至20g/kg干燥提取物、0.2g/kg至4g/kg糖、100mg/kg至700mg/kg有机酸(包括50mg/kg至350mg/kg莽草酸和10mg/kg至70mg/kg奎尼酸)、100mg/kg至1300mg/kg酚类化合物(包括70mg/kg至140mg/kg酚酸)和0.1g/kg至5g/kg蛋白质。

2.根据权利要求1的制备植物提取物的方法，其特征在于步骤c)的自发酵在30℃至40℃的温度下进行15小时至30小时的时间。

3.制备植物提取物的方法，其特征在于，所述方法包括根据权利要求1或2中任一项的步骤a)至c)，随后包括以下后续步骤：

e’)如果有必要，将pH值调节为10至11之间的值，

f’)在50℃至80℃的温度下，将混合物持续搅拌1小时至3小时，

g’)去除残留的植物材料，

h’)通过连续过滤纯化所得液体部分以澄清提取物，

i’)将所得混合物的pH值调节为6至8之间的值，

j’)任选地，用生理学上可接受的溶剂稀释提取物。

4.根据前述权利要求任一项所述的制备植物提取物的方法，其特征在于所用的植物材料是木犀科、禾本科、豆科的植物。

5.根据前述权利要求任一项所述的制备植物提取物的方法，其特征在于所用的植物材料是新鲜茉莉花，优选大花茉莉(Jasminum grandiflorum)种的新鲜茉莉花。

6.根据权利要求3的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于它们包含至少300mg/kg的酚类化合物，包括至少140mg/kg的酚酸和至少300mg/kg的有机酸，包括至少50mg/kg的莽草酸和10mg/kg的奎尼酸。

7.通过权利要求3的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于它们按重量计包含占提取物总重量的2g/kg至40g/kg干重；0.2g/kg至5g/kg糖；300mg/kg至900mg/kg有机酸，包括50mg/kg至500mg/kg莽草酸和10mg/kg至200mg/kg奎尼酸；300mg/kg至2000mg/kg酚类化合物，包括140mg/kg至210mg/kg酚酸，和2g/kg至10g/kg蛋白质，以及10mg/kg至60mg/kg小分子量RNA。

8.通过权利要求3的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于所用的植物材料是新鲜茉莉花，优选是大花茉莉种的新鲜茉莉花，并且它还包含至少一种茉莉肽。

9.组合物，其包含有效量的根据权利要求1-3中任一项的方法获得的提取物以及生理学上可接受的介质，优选包含占组合物总重量为0.05重量％至5重量％的所述提取物，甚至更优选包含占组合物总重量为0.1重量％至2.5重量％的所述提取物。

10.权利要求9的组合物的化妆品用途，用于对抗皮肤衰老迹象、对抗皮肤紧致度或色调的丧失、改善皮肤的屏障功能和水合作用、美白皮肤或改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

11.权利要求9的组合物的化妆品用途，用于减少皮肤中触觉受体(piezo 1)和催产素受体(OXTR)的与年龄相关的降低和提高内在幸福感。

12.根据权利要求9的组合物，其用于改善皮肤的先天免疫防御。

Claims

a)将植物材料置于水中，

b)如果有必要，将pH值调节为4至9之间的值，

e)对在前一步骤中获得的液体进行至少一次过滤，

3.根据权利要求1或2中任一项的制备植物提取物的方法，其特征在于该方法通过以下步骤继续进行：

g)对滤液进行灭菌，

h)用生理学上可接受的溶剂稀释提取物。

4.制备植物提取物的方法，其特征在于，所述方法包括根据权利要求1或2中任一项的步骤a)至c)，随后包括以下后续步骤：

e’)如果有必要，将pH值调节为10至11之间的值，

f’)在50℃至80℃的温度下，将混合物持续搅拌1至3小时，

g’)去除残留的植物材料，

h’)通过连续过滤纯化所得液体部分以澄清提取物，

i’)将所得混合物的pH值调节为6至8之间的值，

j’)任选地，用生理学上可接受的溶剂稀释提取物。

5.根据前述权利要求任一项所述的制备植物提取物的方法，其特征在于所用的植物材料是木犀科、禾本科、豆科的植物。

6.根据前述权利要求任一项所述的制备植物提取物的方法，其特征在于所用的植物材料是新鲜茉莉花，优选大花茉莉(Jasminum grandiflorum)种的新鲜茉莉花。

7.根据权利要求3的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于，它们按重量计包含占提取物总重量的2g/kg至20g/kg干燥提取物、0.2g/kg至4g/kg糖、100mg/kg至700mg/kg有机酸(包括50mg/kg至350mg/kg莽草酸和10mg/kg至70mg/kg奎尼酸)、100mg/kg至1300mg/kg酚类化合物(包括70mg/kg至140mg/kg酚酸)和0.1g/kg至5g/kg蛋白质。

8.根据权利要求4的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于它们包含至少300mg/kg的酚类化合物，包括至少140mg/kg的酚酸，和至少300mg/kg的有机酸，包括至少50mg/kg的莽草酸和10mg/kg的奎尼酸。

9.通过权利要求4的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于它们按重量计包含占提取物总重量的2g/kg至40g/kg干重；0.2g/kg至5g/kg糖；300mg/kg至900mg/kg有机酸，包括50mg/kg至500mg/kg莽草酸和10mg/kg至200mg/kg奎尼酸；300mg/kg至2000mg/kg酚类化合物，包括140mg/kg至210mg/kg酚酸，和2g/kg至10g/kg蛋白质，以及10mg/kg至60mg/kg小分子量RNA。

10.通过权利要求4的方法获得的稀释的植物提取物，其特征在于所用的植物材料是新鲜茉莉花，优选是大花茉莉种的新鲜茉莉花，并且它还包含至少一种茉莉肽。

11.组合物，其包含有效量的根据权利要求3或4中任一项的方法获得的提取物以及生理学上可接受的介质，优选包含占组合物总重量为0.05重量％至5重量％的所述提取物，甚至更优选包含占组合物总重量为0.1重量％至2.5重量％的所述提取物。

12.权利要求11的组合物的化妆品用途，用于对抗皮肤衰老迹象、对抗皮肤紧致度或色调的丧失、改善皮肤的屏障功能和水合作用、美白皮肤或改善皮肤的先天免疫防御和提高内在幸福感。

13.权利要求11的组合物的化妆品用途，用于减少皮肤中触觉受体(Piezo 1)和催产素受体(OXTR)的与年龄相关的降低和提高内在幸福感。

14.根据权利要求11的组合物，其用于改善皮肤的先天免疫防御。