CN118613268A - 用于调节tmem106b表达的反义寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本公开涉及能够调节靶细胞中TMEM106B的表达的反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸与TMEM106B mRNA杂交。本公开进一步涉及使用本文所述的反义寡核苷酸的方法。

Description

用于调节TMEM106B表达的反义寡核苷酸

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以XML格式以电子方式提交并且通过引用整体并入本文。所述XML副本创建于2023年1月18日，命名为51527-003WO2_SL.xml，并且大小为450,030字节。

技术领域

本公开涉及与跨膜蛋白106B(TMEM106B)信使RNA(mRNA)互补并且能够抑制TMEM106B蛋白的表达的反义寡核苷酸。对TMEM106B表达的调节对于一系列医学疾患(诸如神经性疾患，例如，神经变性疾患，诸如，例如，额颞叶变性)是有益的。

背景技术

跨膜蛋白106B(TMEM106B)是一种主要位于内体和溶酶体的膜中的单程2型整合膜糖蛋白。TMEM106B在神经元、神经胶质和内皮细胞中表达。据信其参与树突形态发生(诸如树突分支)以及溶酶体功能。已将几种常见的神经变性疾患(包括额颞叶变性(FTLD))与失调的TMEM106B表达相关联。神经变性疾患表示主要的一类神经性病症，缺乏针对其的治愈性疗法。因此，需要用于治疗应用的调节TMEM106B表达的药剂。

发明内容

本公开提供了在体外和体内减少TMEM106B表达的反义寡核苷酸(ASO)。本公开鉴定了靶向人TMEM106B前体mRNA中的区的特定ASO化合物，其强力地抑制TMEM106B表达。本公开还提供了能够减少TMEM106B表达的ASO序列、修饰基序、化合物、缀合物和盐。本公开还提供了治疗以神经变性为特征的疾病或疾患(诸如，例如，额颞叶变性(FTLD)、帕金森氏病(或帕金森症)、髓鞘形成低下性脑白质营养不良、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多系统萎缩症(MSA)、阿尔茨海默病(AD)、运动神经元病(MND)、皮质基底综合征(CBS)、进行性核上性麻痹(PSP)和神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL))的方法。此类疾患可通过失调的(例如，增加的)TMEM106B表达或活性来表征。

在一方面，本公开提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸为选自由以下项组成的组的化合物：

其中非斜体大写字母为β-D-氧基LNA核苷，斜体大写字母为2′-O-甲基核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：26。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMPID NO：8_3。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：8_4。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：12。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：24_3。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：24_1。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：29_5。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：8_1。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMPID NO：10_4。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：6。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：29_3。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：14。在一些实施例中，反义寡核苷酸为CMP ID NO：15。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为哺乳动物TMEM106B靶核酸。在一些实施例中，哺乳动物TMEM106B靶核酸为人TMEM106B靶核酸。

另一方面，本公开提供了一种缀合物，其包含本文所述的反义寡核苷酸中的任一种以及共价附接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。

另一方面，本公开提供了本文所述的反义寡核苷酸中的任一种的药用盐。另一方面，本公开提供了本文所述的缀合物中的任一种的药用盐。另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所述的反义寡核苷酸中的任一种以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐或辅助剂。另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所述的缀合物中的任一种以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐或辅助剂。

另一方面，本公开提供了一种用于调节表达TMEM106B的靶细胞中的TMEM106B表达的体内或体外方法，其包括向所述细胞施用有效量的本文所述的药物组合物中的任一种。

另一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防疾病的方法，其包括：向罹患或易患该疾病的受试者施用治疗上或预防上有效量的本文所述的药物组合物中的任一种。

另一方面，本公开提供了本文所述的药物组合物，其用于治疗或预防疾病。

定义

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”和“ASO”被定义为包含两个或更多个共价联接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。ASO通常是在实验室中通过先经固相化学合成后再加以纯化和分离而制备的。当提及ASO的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本公开的ASO是化学合成的并且通常是经纯化或经分离的。本公开的ASO可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如经2′糖修饰的核苷或逆向核苷等。ASO能够与靶多核苷酸诸如mRNA分子(例如，TMEM106BmRNA)杂交，并且通过RNA干扰来促进多核苷酸的降解。本公开的ASO能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达。ASO基本上不是双链的并且因此不是siRNA或shRNA。本公开的ASO是单链的。应当理解的是，本公开的单链ASO可形成发夹或分子间双链体结构(同一ASO的两个分子之间的双链体)，只要互补性程度小于ASO的全长的50％即可。有利地，本公开的单链ASO不合有RNA核苷，因为RNA核苷酸的掺入会降低核酸酶抗性。

优选地，本公开的ASO包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如经2′糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。

如本文所用，术语“连续核苷酸序列”是指与TMEM106B靶核酸或靶序列互补的ASO的区。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和“反义寡核苷酸基序序列”可互换地使用。ASO的所有核苷酸可构成连续核苷酸序列。ASO可包含连续核苷酸序列，诸如本文所述的F-G-F′间隔聚体区(gapmer region)，并且可任选地包含额外的核苷酸，诸如，例如，可用于将官能团附接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可与TMEM106B靶核酸互补或可不与其互补。应当理解的是，ASO的连续核苷酸序列不能比ASO长，并且ASO不能比连续核苷酸序列短。

核苷酸为ASO和多核苷酸的结构单元，并且出于本公开的目的包括天然存在和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸，包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地被称为“单元”或“单体”。

如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或核碱基的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一些情况下，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语“经修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”可互换地使用。

术语“经修饰的核苷间键”被定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本公开的ASO可包含经修饰的核苷间键。不希望受理论束缚，当与磷酸二酯键相比时，经修饰的核苷间键可增加ASO的核酸酶抗性。对于天然存在的ASO，核苷间键包括在相邻核苷之间形成磷酸二酯键的磷酸基团。经修饰的核苷间键在使ASO稳定以供体内使用中是特别有用的，并且可用于在本公开的ASO中的DNA或RNA核苷的区处(诸如，例如，在间隔聚体ASO的间隔区G内)以及在经修饰的核苷的区(诸如，例如，区F和F′)中进行保护以防核酸酶裂解。

本公开的ASO可包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个)由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，诸如，例如对核酸酶攻击更具抗性的一个或多个经修饰的核苷间键(例如，硫代磷酸酯键)。核酸酶抗性可通过在血清中孵育ASO或通过使用核酸酶抗性测定(例如，蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者在本领域中均是众所周知的。能够增强ASO的核酸酶抗性的核苷间键被称为“抗核酸酶性核苷间键”。本公开的ASO剂可包含相对于ASO内的核苷间键的总数至少50％(例如，至少51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的经修饰的核苷间键。在一些情况下，ASO或其连续核苷酸序列的所有核苷间键均为经修饰的。应当认识到的是，将本公开的ASO与非核苷酸官能团(诸如缀合物)联接的核苷可以为磷酸二酯。在一些情况下，ASO或其连续核苷酸序列的所有核苷间键均为抗核酸酶性核苷间键。

经修饰的核苷间键可选自包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)的组。在一些实施例中，经修饰的核苷间键与至ASO的RNA酶H募集相容。核苷间键可包含硫(S)原子，如硫代磷酸酯核苷间键中的情况那样。硫代磷酸酯核苷间键由于它们赋予核酸酶抗性、有益药代动力学和易制性的能力而是特别有用的。本文所公开的ASO可包含至少50％(例如，至少51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的硫代磷酸酯键。本公开的ASO也可包含全部为硫代磷酸酯核苷间键的核苷间键。在一些情况下，本公开的ASO包含硫代磷酸酯核苷间键和至少一个磷酸二酯键，诸如，例如，2个、3个或4个磷酸二酯键。间隔聚体寡核苷酸中的磷酸二酯键(当存在时)合适地不位于间隔区G中的连续DNA核苷之间。

在一些实施例中，ASO包含一个或多个中性核苷间键，诸如选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛(formacetal)或硫代甲缩醛(thioformacetal)的核苷间键。其他的核苷间键公开于WO2009/124238中(以引用方式并入本文中)。在一些情况下，核苷间键选自WO2007/031091(通过引用并入本文)中所公开的接头。特别地，核苷间键可选自-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)₂-S-、-O-PO(R^H)-O-、0-PO(OCH₃)-0-、-O-PO(NR^H)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^H)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-NR^H-CO-O-和-NR^H-CO-NR^H-，或者核苷间接头可选自由以下项组成的组：-O-CO-O-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^HCO-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-CO-和-CH₂-NCH₃-O-CH₂-，其中R^H选自氢和C1-4-烷基。

抗核酸酶性键(诸如硫代磷酸酯键)在能够在与TMEM106B靶核酸形成双链体时募集核酸酶的ASO区(诸如针对间隔聚体的区G)中是特别有用的。硫代磷酸酯键在ASO的非核酸酶募集区或亲和力增强区(诸如间隔聚体中的区F和F′)中也可以是有用的。间隔聚体ASO可在区F或F′或者区F和F′两者中包含一个或多个磷酸二酯键，其中区G中的所有核苷间键均可以为硫代磷酸酯。

在一些实施例中，本公开的ASO包含磷酸二酯逆向核苷间键。术语“逆向核苷”或“反向核苷”或“DNA X^INV”(X＝A，T，C，G)是指包含与正常情况反向的二甲氧基三苯甲基(DMT)和亚磷酰胺基团的核苷；DMT基团附接至核糖的3′-OH，并且亚磷酰胺附接至核糖的5′-OH。在本文的材料和方法部分中描述逆向寡核苷的合成。

如本文所用，术语“核碱基”是指存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交期间形成氢键。在本公开的上下文中，术语核碱基还涵盖经修饰的核碱基，其可与天然存在的核碱基不同，但在核酸杂交期间具有功能性。在本上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基(诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤)以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人，Accounts of Chemical Research 45：2055(2012)以及Bergstrom，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1(2009)中。

可通过将嘌呤或嘧啶改变成经修饰的嘌呤或嘧啶(诸如，例如，经取代的嘌呤或经取代的嘧啶)来修饰核碱基部分，例如，选自以下项的核碱基：5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、N⁴-甲基胞嘧啶、N³-甲基胞嘧啶、N⁴-乙基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-氨基胞嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、吡咯并胞嘧啶、5-氨甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、萘啶、5-甲氧基尿嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、4-硫胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-氨甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、噻吩并鸟嘌呤、N¹-甲基鸟嘌呤、N²-甲基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、8-甲氧基鸟嘌呤、8-烯丙氧基鸟嘌呤、7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、咪唑并吡啶并嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、N¹-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N⁶-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-甲基腺嘌呤或8-叠氮基腺嘌呤。

可通过针对每个对应核碱基的字母代码(例如，A、T、G、C或U)来指示核碱基部分，其中每个字母可任选地包括具有等同功能(即，互补性)的经修饰的核碱基。例如，在例示的ASO中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA间隔聚体，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

术语“经修饰的反义寡核苷酸”描述包含一个或多个经糖修饰的核苷、经修饰的核碱基或经修饰的核苷间键的ASO。术语“嵌合ASO”已在文献中用于描述带有经修饰的核苷的ASO。

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，ASO可包含带有经修饰的核碱基的核苷。例如，5-甲基胞嘧啶经常用于代替胞嘧啶，并且因此，术语“互补性”涵盖未修饰的核碱基与经修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对。

如本文所用，术语“％互补”是指核酸分子(例如本公开的ASO)中与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的连续核苷酸序列的核苷酸的比例。通过以下来计算互补性的百分比：对两个序列之间互补的对准的核碱基的数量进行计数(当与靶序列5′至3′和从3′到5′的ASO序列比对时)，将该数量除以ASO中的核苷酸的总数并乘以100。在此类比较中，未对准(即，未形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配的核碱基/核苷酸。在连续核苷酸序列的百分比互补性的计算中不考虑插入和缺失。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了核碱基形成沃森克里克碱基配对的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，出于计算％同一性的目的，认为5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。术语“完全互补”是指100％互补性。

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如，本公开的ASO)中与参考序列(例如，序列基序)相同的连续核苷酸序列的核苷酸的比例(以百分比表达)。通过以下来计算同一性百分比：对两个序列之间相同的对准的核碱基的数量进行计数，将该数量除以ASO中的核苷酸的总数并乘以100。在连续核苷酸序列的同一性百分比的计算中，不考虑插入和缺失。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了核碱基形成沃森克里克碱基配对的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，出于计算％同一性的目的，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

如本文所用，术语“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridizes)”应当理解为两条核酸链(例如，ASO和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而在这两条链之间形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。通常根据解链温度(T_m)来描述它，该解链温度被定义为ASO的一半与TMEM106B靶核酸在其处形成双链体的温度。在生理条件下，T_m与亲和力并不严格成比例(Mergny和Lacroix，Antisense oligonucleotides 13：515-537(2003))。标准状态Gibbs自由能ΔG^○为结合亲和力的更精确表示，并且通过ΔG^○＝-RTln(K_d)与反应的解离常数(K_d)相关，其中R为气体常数并且T为绝对温度。因此，ASO与TMEM106B靶核酸之间的反应的非常低的ΔG^○反映了ASO与靶核酸之间的强杂交。ΔG^○为与反应相关联的能量，其中溶质的水性浓度为1M，pH为7并且温度为37℃。ASO与靶核酸的杂交为自发反应，对于该自发反应，ΔG^○小于零，并且因此在热力学上是有利的。可例如通过使用如Hansen等人，Chem.Comm.36-38(1965)和Holdgate等人，Drug Discov Today(2005)中所述的等温滴定量热法(ITC)方法通过实验来测量ΔG^○。本领域普通技术人员将理解商业设备可用于ΔG^○测量。也可通过使用如Santa Lucia，PNAS 95：1460-1465(1998)所述的最近邻模型，使用Sugimoto等人，Biochemistry 34：11211-11216(1995)以及McTigue等人，Biochemistry 43：5388-5405(2004)所述的适当地导出的热力学参数在数值上估计ΔG^○。为了通过杂交来结合其预期的核酸靶标，对于长度为10至30个核苷酸的ASO，本公开的ASO与靶核酸以低于-10kcal的估计的ΔG^○值杂交。可通过ΔG^○来衡量杂交的程度或强度。对于长度为8至30个核苷酸的ASO，ASO可与靶核酸以低于-10kcal的范围，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal以及诸如低于。25kcal的估计的ΔG^○值杂交。在一些情况下，ASO与靶核酸以-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal、诸如-18至-25kcal的估计的ΔG^○值杂交。

如本文所用，术语“靶核酸”为编码哺乳动物(例如，人)TMEM106B的核酸，并且可以例如为基因、RNA、成熟mRNA、前体mRNA或cDNA序列。因此，靶标可被称为“TMEM106B靶核酸”或简称为“TMEM106B”。本公开的寡核苷酸可例如靶向哺乳动物TMEM106B RNA的外显子，或者可靶向TMEM106B前体mRNA中的内含子(参见表1)。寡核苷酸可靶向mRNA中的外显子-外显子边界之间并且可靶向前体mRNA中的外显子-内含子边界。

表1：人TMEM106B外显子(e)和内含子(i)靶区

合适地，TMEM106B靶核酸编码TMEM106B蛋白，特别是哺乳动物TMEM106B蛋白，诸如人TMEM106B蛋白。表2和表3提供了针对人和猴TMEM106B的mRNA和前体mRNA序列。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：1、2、3和4或它们的天然存在的变体，包括SNP变体。TMEM106B序列SEQ ID NO：1的已知单核苷酸多态性(SNP)列于表4中。如果在研究或诊断中采用本公开的寡核苷酸，则TMEM106B靶核酸可以为cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

本公开的ASO通常能够抑制表达TMEM106B靶核酸的细胞中的TMEM106B靶核酸的表达。本公开的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与TMEM106B靶核酸(完全或部分地)互补，如跨ASO的长度所测量的，任选地除一个或两个错配以外，并且任选地排除可将ASO与任选的官能团(诸如缀合物)联接的基于核苷酸的接头区或其他非互补末端核苷酸(例如区D’或D″)。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸可以为成熟mRNA或前体mRNA。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为编码哺乳动物TMEM106B蛋白(诸如人TMEM106B蛋白)的RNA，例如人TMEM106B前体mRNA序列(诸如公开为SEQ ID NO：1的序列)，或人成熟mRNA(诸如SEQ ID NO：2中所公开的)。表1至表3中提供了示例性靶核酸。

表2：跨物种的针对TMEM106B的基因组和组装信息

Fwd＝正向链。Rv＝反相链。基因组坐标提供了前体mRNA序列(基因组序列)。NCBI参考提供了mRNA序列(cDNA序列)。

表3：跨物种的针对TMEM106B的序列详细信息

如本文所用，术语“靶序列”是指存在于TMEM106B靶核酸中的核苷酸的序列，其包括与本公开的寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由TMEM106B靶核酸上带有与本公开的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区组成。TMEM106B靶核酸的该区可以可互换地被称为靶核苷酸序列、靶序列或靶区。在一些实施例中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列长，并且可例如表示可被本公开的若干寡核苷酸靶向的TMEM106B靶核酸的优选区。

ASO与其互补或杂交的靶序列通常包含至少10个核苷酸(例如，至少11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或更多个核苷酸)的连续核碱基序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列为10至50个核苷酸，诸如10至30个核苷酸、诸如14至20个、诸如15至18个连续核苷酸。

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达TMEM106B靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可在体内或体外。在一些实施例中，靶细胞为哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞(诸如小鼠细胞或大鼠细胞)或灵长类动物细胞(诸如猴细胞或人细胞)。示例性靶细胞可包括神经元细胞，例如，表达TMEM106B的神经元细胞，诸如，星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和室管膜细胞。靶细胞可表达TMEM106B mRNA，诸如TMEM106B前体mRNA或TMEM106B成熟mRNA。对于ASO靶向作用，通常不考虑TMEM106B mRNA的聚A尾。在其中正执行测试以评定本公开的ASO的敲低功效的情况下，术语“靶细胞”可包括人SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)衍生神经元或神经胶质细胞或视网膜色素上皮细胞。

如本文所用，术语“天然存在的变体”是指：TMEM106B基因或其转录物的变体但可有所不同，例如，由于遗传密码的简并性而引起多重密码子编码相同的氨基酸(由于前体mRNA的替代性剪接或多态性(诸如SNP)的存在)；以及等位基因变体。天然存在的变体可与哺乳动物TMEM106B靶核酸(诸如选自由以下项组成的组的靶核酸：SEQ ID NO：1至4)具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更大)同源性。TMEM106B的天然存在的变体也可包括表4中列出的SNP。

表4：人TMEM106B基因中的已知SNP的示例

如本文所用，术语“对表达的调节”应理解为对于当与施用ASO之前的TMEM106B的量相比时ASO改变TMEM106B的量的能力的总称。另选地，表达的调节可以参照对照实验进行确定。普遍理解的是，对照为用盐水组合物处理的单独或靶细胞，或者用非靶向ASO处理的单独或靶细胞(置乱(scramble)或模拟对照)。一种调节类型为ASO(例如，通过降解mRNA或阻遏转录)抑制(inhibit)、下调、减少(reduce)、抑制(suppress)、去除、停止、封闭、防止、减少(lessen)、降低或终止TMEM106B的表达的能力。另一种调节类型为ASO(例如，通过修复剪接位点，或防止剪接，或者去除或封闭抑制机制，诸如微小RNA阻遏)恢复、增加或增强TMEM106B的表达的能力。在本公开的上下文中，本文所述的ASO起到减少或抑制TMEM106B表达的作用。

如本文所用，“高亲和力经修饰的核苷”为当掺入到ASO中时增强ASO针对其互补靶标的亲和力(例如，如通过T_m所衡量的)的经修饰的核苷酸。本公开的高亲和力经修饰的核苷可将T_m增加每个经修饰的核苷约+0.5至+12℃、+1.5至+10℃、或+3至+8℃。许多高亲和力经修饰的核苷在本领域中是已知的，并且包括例如经2′取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见Freier等人，Nucl.Acid Res.25：4429-43(1997)以及Uhlmann，Curr.Opinion in DrugDevelopment 3：293-213(2000)。

本公开的寡聚物可包括具有经修饰的糖部分的一种或多种核苷。已制备了许多带有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善ASO的某些特性，诸如亲和力、核酸酶抗性或药代动力学。此类修饰包括这样的修饰，其中核糖环结构被修饰，例如，通过用己糖环(HNA)、或双环(其通常在核糖环上的C2与C4碳之间具有双自由基桥)(LNA)、或未联接的核糖环(其通常在C2与C3碳之间缺少键)(例如UNA)进行替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括这样的核苷，其中用非糖部分来替换糖部分，例如，在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括经由将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2′-OH基团而进行的修饰。取代基可被引入在糖部分的2′、3′、4′或5′位置处。

如本文所用，“经2′糖修饰的核苷”是这样的核苷，其在2′位置处具有除H或-OH以外的取代基(例如，经2′取代的核苷)或者包含能够在核糖环中的2′碳与另一个碳之间形成桥的2′联接双自由基，诸如LNA(2′-4′双自由基桥连)核苷。已发现，许多经2′取代的核苷在掺入到ASO中时具有有益的特性。例如，经2′修饰的糖可增强ASO的结合亲和力或增加其核酸酶抗性。经2′取代的经修饰的核苷的实例为2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例(参见例如Freier等人，Nucl.Acid Res.25：4429-4443(1997)和UhlmannCurr.Opinion in Drug Development 3：293-313(2000)以及Deleavey等人，Chemistryand Biology 19：937(2012)。下面示出了一些经2′修饰的核苷的示意图。

“LNA核苷”为经2′修饰的核苷，该核苷包含联接所述核苷的核糖糖环的C2′和C4′的双自由基(也被称为“2′-4′桥”)，该双自由基约束或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当LNA被掺入到ASO中时，核糖的锁定与增强的杂交亲和力(双链体稳定化)相关联。这可常规地通过测量反义寡核苷酸/靶双链体的解链温度来确定。

LNA核苷的非限制性实例公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：73-6(2002)、Seth等人，J.Org.Chem.75：1569-81(2010)、Mitsuoka等人，Nucleic Acid Res.37：1225-38(2009)以及Wan等人，J.Med.Chem.59：9645-67(2016)中。下面的方案1中公开了其他示例性LNA核苷。

方案1

LNA核苷可以为β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA为β-D-氧基-LNA。

示例性核苷，带有HELM注释：

虚线表示每个核苷与5′或3′硫代磷酸酯核苷间键之间的共价键。在5′末端核苷处，5′点划线表示与氢原子的键(形成5′末端-OH基团)。在3′末端核苷处，3′点划线表示与氢原子的键(形成3′末端-OH基团)。

核酸酶介导的降解是指ASO能够在与互补核苷酸序列形成双链体时介导此类序列的降解。在一些实施例中，ASO可经由TMEM106B靶核酸的核酸酶介导的降解来发挥作用，其中本公开的ASO能够募集核酸酶，特别地以及核酸内切酶，优选地核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制来操作的ASO设计的实例是这样的ASO，其通常包含至少5个或6个连贯DNA核苷的区并且在一侧或两侧上侧接有亲和力增强核苷，例如间隔聚体、头聚体(headmer)和尾聚体(tailmer)。

ASO的RNA酶H活性是指其在与互补RNA分子的双链体中时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。如果ASO在被提供互补靶核酸序列时具有在以下情况下所确定的初始速率的至少5％(诸如至少10％或超过20％)的初始速率(如以pmol/l/min来衡量)，则通常认为其能够募集RNA酶H：使用这样的ASO，该ASO具有与正被测试的经修饰的ASO相同的碱基序列，但仅含有在该ASO中的所有单体之间带有硫代磷酸酯键的DNA单体；并且使用由WO01/23613(据此通过引用并入本文)的实例91至95提供的方法论。为了用于确定RNA酶H活性，可从LubioScience GmbH，Lucerne，Switzerland获得重组人RNA酶H1。

本公开的ASO或其连续核苷酸序列可以为间隔聚体，也被称为间隔聚体ASO或间隔聚体设计。反义间隔聚体一般用于经由RNA酶H介导的降解来抑制靶核酸。间隔聚体ASO包含至少三个不同的结构区：5′侧翼、间隔和3′侧翼，即在‘5-＞3′取向上的F-G-F′。“间隔”区(G)包含一段使得ASO能够募集RNA酶H的连续DNA核苷酸。该间隔区侧接有包含一个或多个经糖修饰的核苷(优选地高亲和力经糖修饰的核苷)的5′侧翼区(F)，以及包含一个或多个经糖修饰的核苷(优选地高亲和力经糖修饰的核苷)的3′侧翼区(F′)。区F和F′中的一个或多个经糖修饰的核苷增强ASO针对TMEM106B靶核酸的亲和力(即，其为增强亲和力的经糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区F和F′中的一个或多个经糖修饰的核苷为经2′糖修饰的核苷，诸如高亲和力2′糖修饰，诸如独立地选自LNA和2′-MOE。

在间隔聚体设计中，间隔区的5′和3′最末端核苷为DNA核苷，并且分别定位成与5′(F)或3′(F′)区的经糖修饰的核苷相邻。侧翼可进一步被定义为在距间隔区最远的端部处(即，在5′侧翼的5′端处以及在3′侧翼的3′端处)具有至少一个经糖修饰的核苷。

区域F-G-F′形成连续核苷酸序列。本公开的ASO或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F′的间隔聚体区。

间隔聚体设计F-G-F′的整体长度可以为例如12至32个核苷、诸如13至24个、诸如14至22个核苷、诸如14至17个、诸如16至18个核苷、诸如16至20个核苷酸。

举例而言，本公开的间隔聚体ASO可由下式来表示：F_1-8-G_6-16-F′_2-8，诸如，例如，F_2-8-G_6-14-F′_2-8，诸如，例如，F_3-8-G_6-14-F′_2-8；附带条件是间隔聚体区F-G-F′的整体长度为至少10个、诸如至少12个、诸如至少14个核苷酸的长度。

在本公开的一方面，ASO或其连续核苷酸序列由式5′-F-G-F′-3′的间隔聚体组成或包含该式的间隔聚体，其中区F和F′独立地包含1至8个核苷或由该核苷组成，其中2至4个为经2′糖修饰的且定义F和F′区的5′和3′端，并且G为能够募集RNA酶H的6至16个核苷的区。区F、G和F′在下文被进一步定义并且可被并入到F-G-F′式中。

间隔聚体的区G(间隔区)为核苷(通常为DNA核苷)的区，其使得ASO能够募集RNA酶H，诸如人RNA酶H1。RNA酶H是一种识别DNA和RNA之间的双链体并酶促裂解RNA分子的细胞酶。适当的间隔聚体可具有长度为至少5或6个邻接DNA核苷，诸如5-16个邻接DNA核苷，诸如6-15个邻接DNA核苷，诸如7-14个邻接DNA核苷，诸如8-12个邻接DNA核苷酸，诸如长度为8-12个邻接DNA核苷酸的缺口区域(G)。在一些实施例中，缺口区G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个邻接DNA核苷组成。在一些情况下，间隔区中的胞嘧啶(C)DNA可被甲基化，此类残基被标注为5′-甲基胞嘧啶(^meC或用E代替C)。如果间隔中存在CG二核苷酸以改善治疗安全性，则间隔中的胞嘧啶DNA的甲基化是优选的，该修饰对ASO的功效没有显著影响。据报道有5’取代的DNA核苷，诸如5’甲基DNA核苷可用于DNA缺口区域(EP 2 742 136)。

在一些实施例中，间隔区G可由6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连续硫代磷酸酯联接的DNA核苷组成。在一些实施方案中，缺口中的所有核苷间键为硫代磷酸酯键。

尽管传统的间隔聚体具有DNA间隔区，但是存在经修饰的核苷的许多实例，当这些核苷在间隔区内使用时，这些核苷允许RNA酶H募集。已经报道当包括在间隔区域内时能够募集RNA酶H的经修饰的核苷包括例如，α-L-LNA、C4′烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349以及Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300(两者均通过引用并入本文)所述)、阿糖衍生的核苷如ANA和2′F-ANA(Mangos等人，2003 J.AM.CHEM.SOC.125，654-661)、UNA(非锁核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039(其通过引用并入本文)中所述)。UNA是非锁定的核酸，通常是核糖的C2与C3之间的键已经被去除，从而形成未锁定的“糖”残基。在此类间隔聚体中使用的经修饰的核苷可以为当被引入到间隔区中时采取2′内式(类DNA)结构的核苷，即，允许RNA酶H募集的修饰)。在一些实施例中，本文所述的DNA间隔区(G)可任选地含有1至3个经糖修饰的核苷，该核苷当被引入到间隔区中时采取2′内式(类DNA)结构。

替代性地，存在将3′内式构象赋予到间隔聚体的间隔区中，同时保留一些RNA酶H活性的经修饰的核苷的插入的众多报告。带有包含一个或多个3′内式经修饰的核苷的间隔区的此类间隔聚体被称为“间隔破坏者(gap-breaker)”或“妨碍间隔的(gap-disrupted)”间隔聚体，参见例如WO2013/022984。间隔破坏者ASO在间隔区内保留足够的DNA核苷区以允许RNA酶H募集。间隔破坏者ASO设计募集RNA酶H的能力通常具有序列特异性或甚至化合物特异性-参见Rukov等人2015 Nucl.Acids Res.第43卷第8476至8487页，该文献公开了“间隔破坏者”ASO，其募集在一些情况下提供具有更大特异性的靶RNA裂解的RNA酶H。在间隔破坏者ASO的间隔区内使用的经修饰的核苷可以例如为赋予3′内式构象的经修饰的核苷，诸如2′-O-甲基(OMe)或2′-O-MOE(MOE)核苷，或β-DLNA核苷(核苷的核糖糖环的C2′与C4′之间的桥呈β构象)，诸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。

与上述含有区G的间隔聚体一样，间隔破坏者或妨碍间隔的间隔聚体的间隔区具有在间隔的5′端(与区F的3′核苷相邻)处的DNA核苷以及在间隔的3′端(与区F′的5′核苷相邻)处的DNA核苷。包含受妨碍的间隔的间隔聚体通常在间隔区的5′端或3′端处保留至少3个或4个连续DNA核苷的区。

针对间隔破坏者ASO的示例性设计包括：F_1-8-[D_3-4-E₁-D_3-4]-F′_1-8；F_1-8-[D_1-4-E₁-D_3-4]-F′_1-8；和F_1-8-[D_3-4-E₁-D_1-4]-F′_1-8；其中区G在括号[D_n-E_r-D_m]内，D为DNA核苷的连续序列，E为经修饰的核苷(间隔破坏者或妨碍间隔的核苷)，并且F和F′为如本文所定义的侧翼区，并且附带条件是间隔聚体区F-G-F′的整体长度为至少12个、诸如至少14个核苷酸的长度。在一些实施例中，妨碍间隔的间隔聚体的区G包含至少6个DNA核苷，诸如6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个DNA核苷。如上文所述，DNA核苷可以为连续的，或可以任选地散布有一个或多个经修饰的核苷，其条件为间隔区域G能够介导RNA酶H募集。

区F定位成紧邻区G的5′DNA核苷。区F的3′最末端核苷为经糖修饰的核苷，诸如高亲和力经糖修饰的核苷，例如经2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区F′定位成紧邻区G的3′DNA核苷。区F′的5′最末端核苷为经糖修饰的核苷，诸如高亲和力经糖修饰的核苷，例如经2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区域F的长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个、诸如3-4个连续核苷酸。有利地，区F的5′最末端核苷为经糖修饰的核苷。在一些实施例中，区F的两个5′最末端核苷为经糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的5′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区F的两个5′最末端核苷为经2′取代的核苷，诸如两个3′MOE核苷。在一些实施例中，区F的5′最末端核苷为经2′取代的核苷，诸如MOE核苷。

区F′为2至8个连续核苷酸的长度，诸如3至6个、诸如4至5个连续核苷酸的长度。有利地，实施例区F′的3′最末端核苷为经糖修饰的核苷。在一些实施例中，区F′的两个3′最末端核苷为经糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个3′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的3′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区F′的两个3′最末端核苷为经2′取代的核苷，诸如两个3′MOE核苷。在一些实施例中，区F′的3′最末端核苷为经2′取代的核苷，诸如MOE核苷。应当注意，当区域F或F′的长度为一时，优选地，它是LNA核苷。

在一些实施例中，区F和F′独立地由经糖修饰的核苷的连续序列组成或包含经糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施例中，区F的经糖修饰的核苷可独立地选自2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。在一些实施例中，区F和F′独立地包含LNA和经2′取代的经修饰的核苷两者(混合型翼设计)。

在一些实施例中，区F和F′由仅一种类型的经糖修饰的核苷(诸如仅MOE或仅β-D-氧基LNA或仅ScET)组成。这样的设计也称为均匀侧翼或均匀间隔聚体设计。

在一些实施例中，区F或F′的所有核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施例中，区F由1至5个、诸如2至4个、诸如3至4个、诸如1个、2个、3个、4个或5个连续LNA核苷组成。在一些实施例中，区域F和F′的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。

在一些实施例中，区F或F′的所有核苷均为经2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷。在一些实施例中，区F由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个连续OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，侧翼区中的仅一个可由经2′取代的核苷(诸如OMe或MOE核苷)组成。在一些实施例中，5′(F)侧翼区由经2′取代的核苷(诸如OMe或MOE核苷)组成，而3′(F′)侧翼区包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施例中，3′(F′)侧翼区由经2′取代的核苷(诸如OMe或MOE核苷)组成，而5′(F)侧翼区包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。

在一些实施例中，区F和F′的所有经修饰的核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区F或F′可任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。在一些实施例中，区F和F′的所有经修饰的核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区F或F′可任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。在一些实施例中，区域F和F′的5′和3′最末端核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。

在一些实施例中，区域F和区域G之间的核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。在一些实施例中，区域F′和区域G之间的核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。在一些实施例中，区域F或F′，F和F′的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

“LNA间隔聚体”是这样的间隔聚体，其中区F和F′中的一者或两者包含LNA核苷或由该核苷组成。β-D-氧基间隔聚体是这样的间隔聚体，其中区F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由该核苷组成。在一些实施例中，LNA间隔聚体具有下式：[LNA]_1-5-[区域G]-[LNA]_1-5，其中区域G如在间隔聚体区域G定义中的定义。在一个实施例中，LNA缺口聚体为式[LNA]₄-[区域G]_10-12-[LNA]₄者。

“MOE间隔聚体”是这样的间隔聚体，其中区F和F′由MOE核苷组成。在一些实施例中，MOE间隔聚体具有设计[MOE]_1-8-[区G]_5-16-[MOE]_1-8，诸如[MOE]_2-7-[区G]_6-14-[MOE]_2-7、诸如[MOE]_3-6-[区G]_8-12-[MOE]_3-6，其中区G如间隔聚体定义中那样进行定义。具有5-10-5设计的MOE间隔聚体(MOE-DNA-MOE)已经在本领域中广泛使用。

“混合型翼间隔聚体”是这样的LNA间隔聚体，其中区F和F′中的一者或两者包含经2′取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的经2′取代的核苷：2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元，诸如MOE核苷。在一些实施例中，其中区F和F′中的至少一者或区F和F′两者包含至少一个LNA核苷，区F和F′的其余核苷独立地选自由以下项组成的组：MOE和LNA。在一些实施例中，其中区F和F′中的至少一者或区F和F′两者包含至少两个LNA核苷，区F和F′的其余核苷独立地选自由以下项组成的组：MOE和LNA。在一些混合型翼实施例中，区F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。混合型翼间隔聚体设计已公开于WO2008/049085和WO2012/109395，该两者在此以引用方式并入。

侧翼区可包含LNA和DNA核苷两者并且被称为“交替侧翼”，因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序。包含此类交替侧翼的间隔聚体被称为“交替侧翼间隔聚体”。“替代性侧翼间隔聚体”为LNA间隔聚体ASO，其中侧翼(F或F′)中的至少一者除LNA核苷之外还包含DNA。在一些实施例中，区F或F′中的至少一者或区F和F′两者包含LNA核苷和DNA核苷两者。在此类实施例中，侧翼区F或F′或F和F′两者包含至少三个核苷，其中F或F′区的5′和3′最末端核苷为LNA核苷。交替侧翼LNA间隔聚体公开于WO2016/127002。交替侧翼区可包含最多3个连续DNA核苷，诸如1至2个、或1个、或2个、或3个连续DNA核苷。交替侧翼可被标注为一系列整数，表示LNA核苷(L)的数量，之后是DNA核苷(D)的数量，例如：[L]_1-3-[D]_1-4-[L]_1-3或[L]_1-2-[D]_1-2-[L]_1-2-[D]_1-2-[L]_1-2。

在ASO设计中，这些通常会被表示为数字，使得2-2-1表示5′[L]₂-[D]₂-[L]3′，并且1-1-1-1-1表示5′[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3′。带有交替侧翼的ASO中的侧翼(区F和F′)的长度可独立地为3至10个核苷，诸如4至8个、诸如5至6个核苷、诸如4个、5个、6个或7个经修饰的核苷。在一些实施例中，间隔聚体ASO中的侧翼中的仅一个为交替的，而其他侧翼由LNA核苷酸构成。可能有利的是，在3′侧翼(F′)的3′端具有至少两个LNA核苷以赋予额外的核酸外切酶抗性。在一个实施例中，该交替侧翼缺口聚体中的侧翼具有整体长度5至8个核苷中的3至5个为LNA核苷。带有交替侧翼的ASO的一些实例为：[L]_1-5-[D]_1-4-[L]_1-3-[G]_5-16-[L]_2-6；[L]_1-2-[D]_2-3-[L]_3-4-[G]_5-7-[L]_1-2-[D]_2-3-[L]_2-3；[L]_1-2-[D]_1-2-[L]_1-2-[D]_1-2-[L]_1-2-[G]_5-16-[L]_1-2-[D]_1-3-[L]_2-4；[L]_1-5-[G]_5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]₂；和[L]₄-[G]_6-10-[L]-[D]₃-[L]₂；附带条件是间隔聚体的整体长度为至少12个、诸如至少14个核苷酸的长度。

在一些实施例中，本公开的ASO可包含与TMEM106B靶核酸互补的ASO的连续核苷酸序列(诸如间隔聚体F-G-F′)或由该连续核苷酸序列组成，并且可进一步包含5′或3′核苷。5′或3′核苷可与或可不与TMEM106B靶核酸完全互补。此类5′或3′核苷在本文中可被称为区D′和D″。

出于将连续核苷酸序列(诸如间隔聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，区D′或D″可用作可生物裂解的接头。替代性地，区D′或D″可用于提供核酸外切酶保护或使合成或制造变得容易。可以将区域D′和D″分别连接到区域F的5′端或区域F′的3′端，以生成下式：D′-F-G-F′、F-G-F′-D″或D′-F-G-F′-D″。在这种情况下，F-G-F′为ASO的间隔聚体部分，并且区D′或D″构成ASO的独立部分。

区D′或D″可独立地包含可与TMEM106B靶核酸互补或不互补的1个、2个、3个、4个或5个额外的核苷酸或由该额外的核苷酸组成。与F或F′区相邻的核苷酸不是经糖修饰的核苷酸。D′或D′区可用作核酸酶敏感性可生物裂解的接头。在一些实施例中，额外的5′或3′端核苷酸用磷酸二酯键联接，并且为DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适用于用作区D′或D″的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯联接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了聚ASO构建体中的可生物裂解的接头用于在单个ASO内联接多个反义构建体(例如间隔聚体区)的用途。在一些实施例中，本公开的ASO除构成间隔聚体的连续核苷酸序列之外还包含区D′或D″。

在一些实施例中，本公开的ASO可由下式表示：F-G-F′；特别地F_2-8-G_6-16-F′_2-8；D′-F-G-F′，特别地D′_2-3-F_1-8-G_6-16-F′_2-8；F-G-F′-D″，特别地F_2-8-G_6-16-F′_2-8-D″_1-3；或D′-F-G-F′-D″，特别地D′_1-3-F_2-8-G_6-16-F′_2-8-D″_1-3。在一些实施例中，定位在区D′与F之间的核苷间键为磷酸二酯键。在一些实施例中，定位在区F′与D″之间的核苷间键为磷酸二酯键。

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分、区C或第三区)共价联接的ASO。本公开的ASO与一个或多个非核苷酸部分的缀合可改善ASO的药理学，例如，通过影响ASO的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性。缀合物部分可通过改善细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性或细胞摄取来修饰或增强ASO的药代动力学特性。特别地，缀合物可将ASO靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强ASO在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低ASO在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如，脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。ASO缀合物以及它们的合成也已在Manoharan于Antisense Drug Technology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker，Inc.，2001中所作综述和Manoharan，Antisense and NucleicAcid Drug Development，2002，12，103中报导，上述文献各自通过引用整体并入本文。

非核苷酸缀合物部分可选自由以下项组成的组：碳水化合物(例如，GalNAc)、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或它们的组合。例如，缀合物可以为对运铁蛋白受体具有特定亲和力的抗体或抗体片段，例如，如WO 2012/143379中所公开的，该文献通过引用并入本文。在其他实例中，非核苷酸部分可以为抗体或抗体片段，诸如有助于跨血脑屏障的递送的抗体或抗体片段，诸如，例如，靶向运铁蛋白受体的抗体或抗体片段。

如本文所用，“键”或“接头”为两个原子之间的连接，该连接经由一个或多个共价键将一个感兴趣的化学基团或区段与另一个感兴趣的化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如接头或系链)附接至ASO。接头用于将第三区(例如，缀合物部分(区C))共价连接至第一区(诸如，例如，与TMEM106B靶核酸互补的ASO或连续核苷酸序列(区A))。本公开的缀合物可任选地包含接头区(第二区或区B或区Y)，该接头区定位在ASO或其连续核苷酸序列(区A或第一区)与缀合物部分(区C或第三区)之间。区B是指可生物裂解的接头，其包含在条件生理条件下可裂解的生理上不稳定的键或由该键组成。生理上不稳定的接头在其下经历化学裂解的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂以及生理盐浓度。此类生理条件可包括哺乳动物细胞内条件，例如，通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性(诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)的存在。在一些实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。核酸酶敏感接头可包含1至10个核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷，诸如，例如，2至6个核苷，例如，2至4个联接的核苷，并且可进一步包含至少两个连贯磷酸二酯键，诸如至少3个、4个或5个连贯磷酸二酯键。优选地，核苷为天然存在的或经修饰的DNA或RNA。含有磷酸二酯的可生物裂解的接头更详细地描述于WO 2014/076195(据此通过引用并入)中。

区Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分与ASO共价连接的接头。区Y接头可包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团的链结构或寡聚物。本公开的ASO缀合物可由以下区域性元件构成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。接头可以为氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头为C6氨基烷基基团。

如本文所用，术语“处理”是指对现有疾病(例如，本文所述的疾病或疾患)的治疗或对疾病的防止(即，预防)两者。本领域技术人员将认识到“处理”可以为预防性的。可对已被诊断患有神经性疾患的患者执行处理，该神经性疾患诸如选自由神经变性疾病组成的组的神经性疾患，包括与失调的TMEM106B表达或活性相关联的疾病、阿尔茨海默病(AD)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底神经节变性(CBD)、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆症(FTD)、与17号染色体相关的伴有帕金森症的FTD(FTDP-17)以及皮克氏病(PiD)。如本文所用，术语“药用盐”是指保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性、并非在生物学上或其他方面不合需要的那些盐。这些盐是用以下形成的：无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，特别是盐酸；和有机酸，诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸或N-乙酰基半胱氨酸。此外，这些盐可以通过向游离酸添加无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐或镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺、经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如，例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺树脂)。本文所公开的ASO剂也可以两性离子的形式存在。本公开的ASO化合物的一些药用盐可以为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸或甲烷磺酸的盐。

如本文所用，单独或组合的术语“保护基团”表示选择性地封闭多官能化合物中的反应性位点，使得可选择性地在另一个未受保护的反应性位点处进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性的保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。

附图说明

图1示出了CMP ID NO：29_3的结构式。其药用盐包含单价阳离子，诸如，Na⁺、K⁺和Ca²⁺或它们的混合物。附图公开了SEQ ID NO：29。

图2示出了CMP ID NO：29_5的结构式。其药用盐包含单价阳离子，诸如，Na⁺、K⁺和Ca²⁺或它们的混合物。附图公开了SEQ ID NO：25。

图3示出了CMP ID NO：26的结构式。其药用盐包含单价阳离子，诸如，Na⁺、K⁺和Ca²⁺或它们的混合物。附图公开了SEQ ID NO：19。

图1至图3中所示的化合物以质子化形式示出(硫代磷酸酯键上的S原子为经质子化的)，应当理解的是，质子的存在将取决于分子的环境酸性以及替代性阳离子的存在(例如，当反义寡核苷酸(ASO)呈盐形式时)。质子化硫代磷酸酯是以互变异构的形式存在。

图4是散点图，其示出了由以2.5μM的浓度向SK-N-BE(2)胶质母细胞瘤细胞体外施用三天的本公开的613种新ASO化合物诱导的人TMEM106B信使RNA(mRNA)敲低的程度。二十二种已公布的靶向TMEM106B的ASO也进行了测试(包括CMP ID NO：25_1、20和31)并且用作针对本公开的新开发的化合物的性能(即，敲低)基准。水平虚线指示由CMP ID NO 31(先前公布的抗TMEM106B ASO)诱导的人TMEM106B mRNA敲低。新化合物CMP ID NO：15、24_3、12、29_3和26相对于CMP ID NO：31表现出更大的敲低。x轴示出了SEQ ID NO：1的人TMEM106BmRNA内的核苷酸位置。y轴示出了相对于用PBS对照溶液处理的细胞的百分比敲低。

图5是散点图，其示出了由以0.5μM的浓度向SK-N-BE(2)胶质母细胞瘤细胞体外施用三天的本公开的908种新ASO化合物诱导的人TMEM106B mRNA敲低的程度。二十二种已公布的靶向TMEM106B的ASO也进行了测试(包括CMP ID NO：25_1、20和31)并且用作针对本公开的新开发的化合物的性能(即，敲低)基准。水平虚线指示由CMP ID NO：31(先前公布的抗TMEM106B ASO)诱导的人TMEM106B mRNA敲低。新化合物CMP ID NO：8_1、8_3、24_1、6、10_4、29_5、15、24_3、12、29_3、26和8_4连同其他化合物相对于CMP ID NO：31表现出更大的敲低。x轴示出了SEQ ID NO：1的人TMEM106B mRNA内的核苷酸位置。y轴示出了相对于用PBS对照溶液处理的细胞的百分比敲低。

图6是散点图，其示出了由以0.25μM的浓度向SK-N-BE(2)胶质母细胞瘤细胞体外施用三天的本公开的312种新ASO化合物诱导的人TMEM106B mRNA敲低的程度。二十二种已公布的靶向TMEM106B的ASO也进行了测试(包括CMP ID NO：25_1和CMP ID NO：20)并且用作针对本公开的新开发的化合物的性能(即，敲低)基准。新化合物CMP ID NO：8_1、8_3、24_1、6、8_4和29_5连同其他化合物相对于CMP ID NO 25_1表现出更大的敲低。x轴示出了SEQ IDNO：1的人TMEM106BmRNA内的核苷酸位置。y轴示出了相对于用PBS对照溶液处理的细胞的百分比敲低。

图7示出了CMP ID NO：29_5、10_13和14的IC50曲线。在两个复制孔中，用CMP IDNO：29_5、10_13和14的ASO以从10μM到0.001μM的剂量应答曲线处理人iPSC衍生神经元，持续七天。使用Taqman测定来确定TMEM106B mRNA水平相对于PBS对照孔的％KD。针对表中所示的每种ASO确定了IC50曲线(μM)。

图8示出了CMP ID NO：12、29_3和24_3的IC50曲线。在两个复制孔中，用CMP IDNO：12、29_3和24_3的ASO以从10μM到0.001μM的剂量应答曲线处理人iPSC衍生神经元，持续七天。使用Taqman测定来确定TMEM106B mRNA水平相对于PBS对照孔的％KD。针对表中所示的每种ASO确定了IC50曲线(μM)。

图9示出了CMP ID NO：8_2、26和10_6的IC50曲线。在两个复制孔中，用CMP ID NO：8_2、26和10_6的ASO以从10μM到0.001μM的剂量应答曲线处理人iPSC衍生神经元，持续七天。使用Taqman测定来确定TMEM106B mRNA水平相对于PBS对照孔的％KD。针对表中所示的每种ASO确定了IC50曲线(μM)。

图10A至图10C示出了ASO化合物CMP ID NO：29_3、15、26、14和对照ASO 10_13人视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能测定。在三个复制孔中，以10μM至0.00001μM的浓度范围用CMP ID NO：29_3、15、26、14的ASO和对照ASO 10_13处理人RPE细胞，持续五天。图10A中示出了所指示的ASO的IC50曲线。在10μM处，ASO CMP ID NO：29_3、15和26减少了约80％的TMEM106B mRNA。在四个复制孔中，以10μM、5μM和1μM的浓度范围用CMP ID NO：29_3、15、26、14的ASO和对照ASO 10_13处理人RPE细胞，持续五天，并且使用自猝灭牛血清白蛋白(BSA)-BODIPY(其在溶酶体内以蛋白水解方式被溶解时发出荧光)来测定它们对溶酶体功能的影响。将BSA降解活性的平均值归一化为每个孔的细胞数量，并且随后归一化为未经过ASO处理的孔作为对照。CMP ID NO：29_3、15、26和14降低溶酶体活性约50％左右。阴性对照CMPID NO：10_13未减少BSA降解(n＝4，+/-均值标准误差(SEM)＝+/-3；图10B)。四星号表示处于p＜0.0001的水平的统计学显著性，双星号表示处于p＜0.01的水平的统计学显著性，并且单星号表示处于p＜0.05的水平的统计学显著性，如通过Dunnett事后检验所评定的；ns＝不显著。人RPE细胞的荧光图像(图10C)。白点示出了以蛋白水解方式裂解的BSA-BODIPY片段。经CMP ID NO：29_3处理的细胞显示出降低的溶酶体活性。

图11示出了人TMEM106B(hTMEM106B)mRNA的条形图，其是从用本公开的ASO(CMPID NO：14、15、29_3、26)或CMP ID NO：10_13的阴性对照(NC)ASO体内处理的表达hTMEM106B的转基因小鼠的脑组织通过qPCR来测量的。还示出了作为对照的来自未经处理的非转基因(NTG)小鼠的hTMEM106B表达。与之前公布的CMP ID NO：31的ASO相比，新开发的CMP ID NO：29_3和26的ASO剂显示出对体内hTMEM106B表达优异的抑制。星号表示处于p＜0.0001的水平的统计学显著性，如通过Dunnett事后检验所评定的；ns＝不显著。

图12示出了hTMEM106B mRNA的条形图，其是从用本公开的ASO(CMP ID NO：8_1、24_1、6、10_4)或先前公布的CMP ID NO：25_1的抗TMEM106B ASO处理的表达hTMEM106B的转基因小鼠的脑组织通过qPCR来测量的。还示出了作为对照的来自经盐水处理的NTG小鼠的hTMEM106B表达。星号表示处于p＜0.0001的水平的统计学显著性，如通过Dunnett事后检验所评定的；ns＝不显著。

图13示出了hTMEM106B mRNA的条形图，其是从用本公开的ASO(CMP ID NO：29_3(25μg和100μg)和CMP ID NO：26(25μg和100μg))或先前公布的CMP ID NO：31的抗TMEM106BASO或CMP ID NO：10_13(100μg)的阴性对照ASO体内处理的表达hTMEM106B的转基因小鼠的脑组织通过qPCR来测量的。还示出了作为对照的来自用100μg的CMP ID NO：10_13的阴性对照ASO处理的非转基因小鼠的hTMEM106B表达。与之前公布的CMP ID NO：31的ASO相比，新开发的CMP ID NO：29_3和26的ASO剂显示出对体内hTMEM106B表达优异的抑制。星号表示处于p＜0.0001的水平的统计学显著性，如通过Dunnett事后检验所评定的。

图14示出了hTMEM106B mRNA的条形图，其是从用本公开的ASO(CMP ID NO：29_5(25μg和100μg))或CMP ID NO：13(100μg)的阴性对照ASO体内处理的表达hTMEM106B的转基因小鼠通过qPCR来测量的。还示出了作为对照的来自用100μg的CMP ID NO：13的阴性对照ASO处理的非转基因小鼠的hTMEM106B表达。星号表示处于***p＜0.001或****p＜0.0001的水平的统计学显著性，如通过Dunnett事后检验所评定的。

具体实施方式

本文所述的是靶向跨膜蛋白106B(TMEM106B)mRNA、与其结合并促进其降解的反义寡核苷酸(ASO)剂以及含有该ASO剂的药用组合物。此类药剂和组合物对于对神经变性疾患(例如，额颞叶变性(FTD)、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、海马硬化症、髓鞘形成低下性脑白质营养不良(HML)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、皮质基底综合征(CBS)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、进行性核上性麻痹(PSP)和神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL))的治疗可以是特别有用的。例如，可通过任何途径向患有神经变性疾患或有发展神经变性疾患风险的受试者(例如，人)施用一种或多种ASO剂或含有该ASO剂的组合物，以便治疗受试者中的疾患。本公开涵盖对与TMEM106B的增加的水平相关联并且将受益于受试者中的该蛋白质的减少的任何疾病或病症的治疗。

跨膜蛋白106B

跨膜蛋白106B(TMEM106B)是一种主要位于内体和溶酶体的膜中的单程2型整合膜糖蛋白。它在神经元以及神经胶质细胞和内皮细胞中表达。据信它主要参与溶酶体功能。细胞系中的TMEM106B的过度表达和敲低可引起溶酶体大小、数量和酸化中的增加。已将TMEM106B与若干常见神经变性疾患(包括额颞叶变性(FTLD))相关联(Nicholson和Rademakers，Acta Neuropathol.132：639-651(2016))。

神经变性疾患(包括例如额颞叶变性(FTLD)、帕金森氏病(或帕金森症)、髓鞘形成低下性脑白质营养不良、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、海马硬化症、衰老、阿尔茨海默病(AD)、皮质基底综合征、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、进行性核上性麻痹(PSP)和神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL))代表主要的未满足的医疗需求，并且存在指示神经变性疾患中的特定的TMEM106B等位基因变体和经改变的TMEM106B表达的明确的遗传和实验证据。因此，需要用于研究和治疗应用的抑制TMEM106B的表达的药剂。

神经变性疾患

神经变性疾患可能与失调的TMEM106B表达或活性相关联。与TMEM106B的失调表达相关联的示例性疾患可包括神经变性疾患，诸如，例如，额颞叶变性(FTLD)、帕金森氏病(或帕金森症；PD)、与17号染色体相关的伴有帕金森症的FTD(FTDP-17)、髓鞘形成低下性脑白质营养不良(HML)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、海马硬化症、皮质基底神经节变性(CBD)、皮质基底综合征(CBS)、慢性创伤性脑病(CTE)、皮克氏病(PiD)、边缘主导型年龄相关性的TDP-43脑病(LATE)、进行性核上性麻痹(PSP)和神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。鉴于这些疾患中的若干种与额叶皮层功能障碍相关联，本公开的化合物可用于治疗额叶皮层中与年龄相关联或与疾病相关联的变化。

因此，本文所述的ASO可适用于治疗FTLD。特别地，本公开的ASO或药物组合物可有利于治疗以泛素化蛋白的核内或细胞质积聚为特征的FTLD(FTLD-U)，诸如，例如，FTLD-TDP(其特征在于沉积在额叶和颞叶脑区中的泛素化TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的存在)，以及其他TDP-43蛋白质构象病(例如，ALS、阿尔茨海默病、伴有硬化症的大脑年龄相关性TDP-43(CARTS)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和海马硬化症)。

额颞叶变性

FTLD是一种以大脑皮层的额叶和颞叶中的进行性神经变性为特征的临床综合征。FTLD的表现是复杂且异质性的，并且可能表现为三种临床上有区别的变体中的一种，包括：1)行为变异型额颞叶痴呆症(BVFTD)，其特征在于行为和性格中的改变、冷漠、社交退缩、持续行为、注意力缺陷、去抑制和明显的额叶变性；2)语义性痴呆症(SD)，其特征在于流畅性、命名性失语症、单词、物体和概念的语义知识的进行性丧失以及明显的前颞叶变性；或3)进行性非流畅性失语症(PNA)；其特征在于言语产生中的运动缺陷、减少的语言表达以及明显的外侧裂周区皮层变性。FTLD患者的脑中的神经元缺失与三种有区别的神经病理学中的一种相关联：1)tau阳性神经元和神经胶质包涵体的存在；2)泛素(ub)阳性和TAR DNA结合蛋白43(TDP43)阳性但tau阴性包涵体；或3)ub且肉瘤中融合(FUS)阳性但tau和TDP-43阴性包涵体中。这些神经病理学被认为在FTLD的病因学中是很重要的。

近一半的FTLD患者有患有痴呆症、ALS或帕金森氏病的一级家庭成员，表明与该疾病的病因有很强的遗传联系。已将染色体17q21中的许多突变与FTLD表现相联系。

阿尔茨海默病

阿尔茨海默病是一种神经变性疾患，其特征在于大脑皮层的额叶、颞叶和顶叶以及皮层下结构(如基底前脑胆碱能系统和脑干内的蓝斑)中的进行性神经元缺失。阿尔茨海默病的临床表现是许多认知功能中的进行性衰退，包括短期和长期记忆、空间导航、语言流畅性、冲动控制、快感缺乏和社交退缩。阿尔茨海默病患者的脑中的神经元萎缩与细胞外和细胞内蛋白质包涵体的积聚有联系。不溶性淀粉样β(Aβ)蛋白的聚集体通常存在于细胞外空间中，而过度磷酸化的tau蛋白的神经元纤维缠结(NFT)通常存在于受影响的神经元的细胞内区室中。这些神经病理学被认为在阿尔茨海默病的病因学中是很重要的。

对阿尔茨海默病的临床管理已采用药理学和行为干预来减轻该疾患的症状。例如，作为用于改善阿尔茨海默病的认知缺陷的一种手段，已将乙酰胆碱酯酶抑制剂用于提高脑中的乙酰胆碱水平，因为发现这种神经递质在阿尔茨海默病患者中被耗尽。此外，通常将非典型抗精神病药物开给阿尔茨海默病患者以进行行为管理。然而，该策略的目标是改善该疾病的症状而不是解决其发展和进展。与这些治疗不同，本文所述的组合物和方法提供了对可能导致阿尔茨海默病发展的不同生物化学现象进行处理的益处。因此，本文所述的组合物和方法的目标是疾病的生理原因，代表着一种潜在的治愈性疗法。

髓鞘形成低下性脑白质营养不良

髓鞘形成低下性脑白质营养不良是指以脑中的白质的变性为特征的一组显性遗传性疾患。髓鞘形成低下性脑白质营养不良的特征可在于白质变性的存在、轴突和髓磷脂的缺失、轴突球状体的存在、以及在一些情况下远端肢体中的囊性骨病变(例如，Nasu-Hakola病)。脑白质营养不良通常出现在婴儿期和幼儿期左右，并且其特征可在于应激性亢进、对环境过敏、肌肉强直、头部后仰、听力和视力下降或丧失以及癫痫症。脑白质营养不良的非限制性实例包括Nasu-Hakola病(PLOSL)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、X连锁肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病和亚历山大病。

肌萎缩性侧索硬化症

ALS(也被称为卢·格里格氏病)是一种最致命的神经变性疾患，其特征是初级运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元的丧失。运动神经元的丧失引起基本运动控制(包括呼吸)中的深度受损并且在诊断之后2至5年内引起死亡。ALS患者通常在该疾病的晚期需要呼吸支持。这些患者还表现出横纹肌以及平滑肌(例如，吞咽肌)中的肌肉无力。一些患者还可能同时发展额颞叶痴呆症。

已描述了ALS的两种一般形式，即散发性ALS(sALS)(其是美国最常见的ALS形式并且占所有诊断病例的90％至95％)以及家族性ALS(fALS)(其表现出显性遗传并且占美国所有病例的约5％至10％)。这两种ALS形式在临床上是无法区分的。

在分子水平处，ALS与疾病发作之后出现的受妨碍的细胞过程(包括例如ER应激、反应性氧化物的产生、线粒体功能障碍、蛋白质聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸兴奋性毒性(特别是在运动神经元中))相关联。尽管有这些发现，但ALS的病因是复杂且异源性的。一般来讲，ALS被认为是一种复杂的遗传性疾患，其中多种基因与环境因素相互作用以增加对该疾病的易感性。已将超过十二种基因与ALS病理学相关联，包括Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶(SOD-1)、TARDBP、TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)、肉瘤中融合/肉瘤中易位(FUS)、血管生成素(ANG)、Ataxin-2(ATXN2)、含有缬酪肽的蛋白(VCP)、视神经蛋白(OPTN)以及9号染色体开放阅读框72(C9ORF72)中的非编码GGGGCC六核苷酸重复的扩展。然而，运动神经元变性的确切机制仍然是未知的。

目前尚无可用的针对ALS的治愈性处理。唯一获得FDA批准的药物是利鲁唑，它是TTX敏感性钠通道、红藻氨酸和NMDA受体的拮抗剂，并且是GABAa受体的增效剂。然而，已报告了针对早期ALS患者的仅约三个月寿命延长，并且尚未观察到针对晚期ALS患者的治疗益处。

多系统萎缩症

MSA是一种神经变性疾患，其通常表现为失调的自主神经功能、震颤、运动功能减退、肌肉强直、帕金森症和共济失调。患有MSA的患者通常在诊断之后存活6至10年。在细胞水平处，MSA对应于基底神经节、下橄榄核和小脑内的神经元的潜在缺失。α-突触核蛋白的经修饰的形式的存在已被认为是针对MSA的潜在原因。在来自MSA患者的脑组织中也已发现了路易体。MSA的另一个常见特征是神经胶质增生、星形胶质细胞增殖、神经胶质瘢痕、由α-突触核蛋白和tau蛋白构成的Papp-Lantos体。

MSA的发作通常与运动不能-强直综合征(62％的病例)以及平衡紊乱、泌尿生殖症状和跌倒的表现相关联。疾病进展的特征在于进行性帕金森症、尿失禁或潴留、阳痿、便秘、声带麻痹、口干和皮肤干燥、热调节异常、呼吸问题、视力问题和认知受损。

MSA一般分为两种亚型，即以帕金森症为主的MSA(MSA-P)和伴有小脑特征的MSA(MSA-C)。MSA-P的特征是锥体外系运动受损并且可包括纹状体黑质系统中的变性。MSA-C的特征是小脑共济失调并且可能与散发性橄榄脑桥小脑萎缩症相关联。

对MSA的处理在很大程度上一直是姑息性的，并且尚未开发出处理这种破坏性疾患的治愈性疗法。

运动神经元疾病

MND属于归因于CNS的运动神经元的破坏和运动神经元回路中的变性变化的一组神经系统疾患。MND通常是进行性变性疾患，其影响上运动神经元和下运动神经元，导致连续的全身肌肉去神经支配。MND通常在中年出现，尽管已观察到从18岁到85岁的广泛年龄范围的有症状性疾病发作。MND症状通常包括吞咽困难、肢体无力、言语不清、步态受损、面部肌肉无力和肌肉痉挛。在疾病的晚期，呼吸肌肉组织失去其运动神经支配，这通常是ALS患者死亡的最终原因。大多数MND的病因学是未知的，但已将环境、毒性、病毒和遗传因素归因于疾病病理学。

运动神经元(包括上运动神经元和下运动神经元)影响随意肌，刺激它们进行收缩。上运动神经元在大脑皮层中起源，并且通过脑干和脊髓发送轴突纤维来控制下运动神经元。下运动神经元位于脑干和脊髓中，并且对肌肉骨骼系统进行神经支配。下运动神经元疾病是涉及下运动神经元变性的疾病。下运动神经元变性与神经元和肌肉的断开相关联，导致肌肉无力和减弱的反射。上运动神经元或下运动神经元的缺失引起无力，肌肉萎缩症(消瘦)和无痛性无力是MND的临床特点。

皮质基底综合征

皮质基底节综合征是一种与tau蛋白病和FTLD相关联的进行性非典型帕金森综合征。皮质基底综合征可表现为三种形式中的一种，即额叶行为执行障碍性空间综合征(FBS)、原发性进行性失语症的不流畅/语法障碍变体以及进行性核上性麻痹综合征(PSPS)。常见症状通常包括失用症、异肢现象、额叶缺陷和锥体外系运动症状，包括肌阵挛或强直。皮质基底综合征通常在诊断之后6.5年内引起死亡。目前尚无可用的针对这种病症的治愈性处理。

进行性核上性麻痹

PSP是一种进行性神经变性疾病，其特征在于跌倒、垂直性眼肌麻痹、运动不能-强直特征、明显的延髓功能障碍和额叶皮质下痴呆症。独立步态的丧失(无法在没有帮助的情况下站立)在疾病发作之后不到5年出现。PSP与黑质、苍白球、丘脑底核、中脑和桥脑网状结构中的深度神经元缺失以及由tau丝构成的神经元纤维缠结的存在相关联。除存在广泛和多灶性神经病理学变化之外，还存在多种神经递质异常，包括多巴胺、乙酰胆碱、GABA和去甲肾上腺素系统的功能障碍。

“进行性核上性麻痹”这一名称描述了该疾病的主要特征：进行性任意眼球运动障碍。该疾病的发作通常在50至70岁之间。许多患者最初报告有持续的眩晕和平衡问题或持续的跌倒，通常是向后跌倒。任意眼球运动的减少降低了阅读、爬楼梯和驾驶机动车辆的能力。其他早期症状可包括性格改变，诸如，例如，易怒或丧失冲动控制。一些患者对日常活动和爱好失去兴趣。即使在疾病的早期阶段，情绪变化和抑郁也是非常常见的。

控制眼球运动的大脑区位于控制舌头和用于吞咽的肌肉的区附近。患者的言语通常变慢且加深。随着疾病进展，对液体和食物的吞咽也受损，这导致危及生命的肺炎。这是晚期PSP死亡的主要原因。迄今为止，尚无针对该疾病的治愈性处理。

神经元蜡样质脂褐质沉积症

NCL是一种涵盖性术语，其涉及至少八种临床上公认的溶酶体贮积症的集合，这些溶酶体贮积症是由体内细胞(诸如神经元、肝脏、脾脏、心肌和肾脏细胞)内的脂褐质的积聚引起的。NCL在临床上表现为深度神经变性以及进行性和不可逆的运动和认知能力丧失，尽管疾病严重程度和临床表现可能取决于特定的NCL变体。

已知的NCL变体包括：婴儿变体(也被称为Santovuori-Haltia病(SHD))、晚期婴儿变体(被称为Jansky-Bielschowsky病(JBD))、芬兰晚期婴儿变体(FLI)、晚期婴儿变体(VLI)、CLN7变体(CLN7)、CLN8变体(CLN8)、土耳其晚期婴儿变体(TLI)、9型变体(T9)、CLN10变体(CLN10)、青少年变体(也被称为Batten病(BD))和成人变体(也被称为Kuf氏病(KD))。SHD与早期视力丧失相关联，其在2岁时逐渐转变为完全视网膜失明，之后在3岁时进入植物人状态，并且在4岁时脑死亡。该变体也与癫痫发作的自发性发生相关联。JBD变体出现在2至4岁之间，并且与共济失调、癫痫发作、进行性认知下降和异常言语发育相关联，并且通常导致在8岁时死亡。BD通常出现在4至10岁之间，并且包括诸如视力丧失、癫痫发作、认知功能障碍和过早死亡等症状。患有KD变体的NCL患者通常表现出比SHD和BD变体更轻微的症状，并且具有40年左右的预期寿命。

反义寡核苷酸

本公开涉及能够调节TMEM106B的表达(诸如抑制TMEM106B)的ASO化合物。通过以下来实现调节：使编码TMEM106B的靶核酸(例如，前体mRNA或mRNA)与能够与TMEM106B靶核酸杂交的ASO接触，并且通过促进对RNA酶H的募集并通过抑制翻译(例如，通过空间位阻)来促进其降解。TMEM106B靶核酸可以为哺乳动物TMEM106BmRNA序列，诸如选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：1至4。

本公开的ASO化合物包含与TMEM106B mRNA的序列(例如，SEQ ID NO：1至4中的任一个)或其变体的区至少基本上互补或完全互补的核苷序列，所述互补性足以在细胞内条件下产生特异性结合。例如，本公开设想了具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的至少7个(例如，至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个)连贯核苷酸互补的反义序列的ASO。在特定实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的7个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的8个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的9个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的10个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的11个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106BmRNA的一个或多个区的12个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的13个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的14个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的15个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的16个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的17个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的18个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106BmRNA的一个或多个区的19个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的20个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的21个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的22个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的23个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的24个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的25个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106BmRNA的一个或多个区的26个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的27个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的28个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的29个连贯核苷酸互补的反义序列。在另一个实例中，ASO具有与TMEM106B mRNA的一个或多个区的30个连贯核苷酸互补的反义序列。在又另一个实例中，ASO具有与TMEM106BmRNA的一个或多个区的核苷酸100％互补的反义序列。

本公开设想了这样的ASO化合物，其在与TMEM106B mRNA的一个或多个区(例如，SEQ ID NO：1至4中所述的TMEM106B mRNA的区中的任何一个)结合时与7个至22个(例如，7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个)核苷酸的长度的TMEM106B mRNA形成双链体结构。例如，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为7个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为8个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为9个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为10个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为11个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为12个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106B mRNA之间的双链体结构可以为13个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为14个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为15个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为16个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为17个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为18个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为19个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为20个核苷酸的长度。在另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为21个核苷酸的长度。在又另一个实例中，ASO化合物与TMEM106BmRNA之间的双链体结构可以为10个核苷酸的长度。

根据所公开的方法和组合物，由ASO(例如，与SEQ ID NO：5至50中的任一个的核酸序列具有至少90％(至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性的药剂)与TMEM107B mRNA的一个或多个区形成的双链体结构可包含至少一个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)错配，其中错配可以为TMEM107BmRNA中不存在的核碱基的插入、存在于TMEM106B mRNA中的核碱基的缺失或不与TMEM106B mRNA互补的核碱基。例如，双链体结构可含有1个错配。在另一个实例中，双链体结构含有2个错配。在另一个实例中，双链体结构含有3个错配。在另一个实例中，双链体结构含有4个错配。在另一个实例中，双链体结构含有5个错配。在另一个实例中，双链体结构含有6个错配。在另一个实例中，双链体结构含有7个错配。在另一个实例中，双链体结构含有8个错配。在另一个实例中，双链体结构含有9个错配。在另一个实例中，双链体结构含有10个错配。在另一个实例中，双链体结构含有11个错配。在另一个实例中，双链体结构含有12个错配。在另一个实例中，双链体结构含有13个错配。在另一个实例中，双链体结构含有14个错配。在又另一个实例中，双链体结构含有15个错配。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为具有SEQ ID NO：1的核酸序列的多核苷酸。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为具有SEQ ID NO：2的核酸序列的多核苷酸。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为具有SEQ ID NO：3的核酸序列的多核苷酸。

在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为具有SEQ ID NO：4的核酸序列的多核苷酸。

在一些实施例中，本公开的ASO能够通过抑制或下调细胞中的TMEM106B靶核酸(TMEM106B前体mRNA或mRNA)的表达来调节TMEM106B靶核酸的表达。此类调节产生与在没有用ASO处理的情况下细胞中的靶标的表达水平相比对TMEM106B靶核酸表达的至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的抑制。对TMEM106B表达的调节可出现在体外(例如，在原代细胞培养物、细胞系或组织类器官中)或体内(例如，在向动物(例如，哺乳动物，例如，人)施用时)。在一些实施例中，本公开的ASO可以能够在向原代神经元细胞施加5μM ASO之后在体外抑制原代神经元细胞中的TMEM106BmRNA的表达水平至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，本公开的ASO可以能够在向原代神经元细胞施加0.5μM ASO之后在体外抑制原代神经元细胞中的TMEM106B蛋白的表达水平至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。合适地，实例提供了可用于测量TMEM106B RNA或蛋白质抑制的测定(例如，实例1、实例2和实例5)。

对TMEM106B靶核酸的调节可通过ASO的连续核苷酸序列与TMEM106B靶核酸之间的杂交来触发。在一些实施例中，本公开的ASO包含ASO与TMEM106B靶核酸之间的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)错配。甚至在不存在该一个或多个错配的情况下，与TMEM106B靶核酸的杂交仍可足以显示出对TMEM106B表达的期望调节。由错配引起的降低的结合亲和力可有利地通过以下来补偿：增加ASO中的核苷酸的数量，或者增加能够增加与靶标的结合亲和力的经修饰的核苷(诸如，例如，存在于ASO序列内的经2′糖修饰的核苷(例如，LNA))的数量。

在一些实施例中，ASO包含10至30个核苷酸的长度的连续序列，其与TMEM106B靶核酸的区为至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)互补。本公开的ASO或其连续核苷酸序列可与TMEM106B靶核酸的区完全互补(即，100％互补)。

本公开的ASO可在长度上包含10至35个核苷酸或由其组成(例如，10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个核苷酸的长度)。在一些实施例中，ASO在长度上包含16至22个(例如，16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个)核苷酸或由其组成。在一些实施例中，ASO在长度上包含16至20个(例如，16个、17个、18个、19个、20个)核苷酸或由其组成。在一些实施例中，ASO或其连续核苷酸序列包含22个核苷酸或更少核苷酸(例如，22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个核苷酸或更少核苷酸)或由其组成。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。例如，如果ASO被称为包含10至30个核苷酸，则10个和30个核苷酸两者均包括在内。在一些实施例中，连续核苷酸序列包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续核苷酸或由其组成。在一些实施例中，ASO包含16个、17个、18个、19个或20个核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，ASO或连续核苷酸序列在长度上包含与选自由SEQ ID NO：5至50(参见材料和方法部分的表5中列出的基序序列)组成的组的序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的10至30个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，ASO或连续核苷酸序列在长度上包含与选自由SEQ ID NO：5至50(参见表5中列出的基序序列)组成的组的序列具有至少90％同一性、优选地100％同一性的10至30个(例如，10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸或由其组成。在一些实施例中，ASO或连续核苷酸序列在长度上包含与SEQ ID NO：5至50的序列(参见表5中列出的靶序列)具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)互补性的10至30个核苷酸或由其组成。

应当理解的是，连续核碱基序列可经修饰以例如增加核酸酶抗性或与TMEM106B靶核酸的结合亲和力。其中将经修饰的核苷(诸如高亲和力经修饰的核苷)掺入到ASO序列中的模式通常被称为ASO设计。本公开的ASO被设计为带有经修饰的核苷和DNA核苷。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。

在一些实施例中，ASO包含至少1个经修饰的核苷，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个经修饰的核苷。在一些实施例中，ASO包含1至10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)经修饰的核苷。在“定义”部分中在“经修饰的核苷”、“高亲和力经修饰的核苷”、“糖修饰”、“2′糖修饰”、“锁核酸(LNA)”、“逆向核苷酸”等下描述了合适的修饰。

在一些实施例中，ASO包含一个或多个经糖修饰的核苷，诸如经2′糖修饰的核苷。优选地，本公开的ASO包含独立地选自由以下项组成的组的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)经2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA(例如，2′-O-甲基-RNA)、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。有利的情况是，经修饰的核苷中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)为锁核酸(LNA)。

在一些实施例中，本公开的ASO包含至少一个LNA核苷，诸如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个LNA核苷，诸如2至6个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)LNA核苷，诸如3至7个(例如，3个、4个、5个、6个或7个)LNA核苷、4至8个(例如，4个、5个、6个、7个或8个)LNA核苷或3个、4个、5个、6个、7个或8个LNA核苷。在一些实施例中，ASO中的经修饰的核苷的至少75％(例如，至少76％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)为LNA核苷，诸如，例如，β-D-氧基LNA或ScET。在一些实施例中，ASO中的所有经修饰的核苷均为LNA核苷。在一些实施例中，ASO可包含β-D-氧基-LNA以及以下LNA核苷中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、ScET或ENA(呈β-D或α-L构型或它们的组合)。在一些实施例中，所有LNA胞嘧啶核苷均为5-甲基胞嘧啶核苷。ASO或连续核苷酸序列可具有在该核苷酸序列的5′端处的至少1个LNA核苷以及在该核苷酸序列的3′端处的至少2个LNA核苷，以赋予ASO核酸酶抗性。在一些实施例中，本公开的ASO能够募集RNA酶H。

在一些实施例中，ASO可包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)逆向核苷(参见材料和方法)。在一些实施例中，ASO可包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)DNA 7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤吡唑并[3，4-d]嘧啶(PPG)核苷。

在本公开的上下文中，可以有利的是采用作为如在“定义”部分中在例如“间隔聚体”、“LNA间隔聚体”、“MOE间隔聚体”、“混合型翼间隔聚体”和“交替侧翼间隔聚体”下所述的间隔聚体设计的ASO结构设计。间隔聚体设计包括带有均一侧翼、混合型翼侧翼、交替侧翼和间隔破坏者设计的间隔聚体。可以有利的情况是，本公开的ASO为带有F-G-F′设计的间隔聚体，特别是式5′-F-G-F′-3′的间隔聚体，其中区F和F′独立地包含1至8个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)核苷，其中的2至5个(例如，2个、3个、4个或5个)为经2′糖修饰的并限定F和F′区的5′和3′端，并且G为能够募集RNA酶H的6至16个(例如，6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个)核苷的区，诸如包含6至16个(例如，6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个)DNA核苷的区。在一些实施例中，间隔聚体为LNA间隔聚体。在一些实施例中，LNA间隔聚体选自以下均一侧翼设计：4-10-4、3-11-4、4-11-4、4-12-4或4-14-2，其中通式为5′侧翼-中心块-3′侧翼。在一些实施例中，LNA间隔聚体选自以下交替侧翼设计：3-1-3-10-2、1-3-4-6-1-3-2、1-2-1-2-2-8-4或3-3-1-8-2-1-2。表5列出了每个基序序列的示例性设计。

在所有情况下，F-G-F′设计都可进一步包括区D′或D″，如在“定义”部分中在“ASO中的区D′或D″”下所述。在一些实施例中，本公开的ASO具有在间隔聚体区的5′或3′端处的1个、2个或3个磷酸二酯联接的核苷单体，诸如DNA单体。

ASO还可包含至少一个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)经修饰的核苷间键。合适的核苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键合”下。在一些实施例中，连续核苷酸序列内的核苷间键的至少75％(例如，至少76％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)为硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，ASO或其连续序列中的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。

对于本公开的一些实施例，ASO选自带有以下项的ASO化合物的组：CMP-ID-NO：6；8_1；8_3；8_4；10_4；12；14；15；24_1；24_3；26；29_3；和29_5。

在本公开的上下文中，特别有利的ASO为选自由以下项组成的组的ASO化合物：

其中非斜体大写字母为β-D-氧基LNA核苷，斜体大写字母为2′-O-甲基核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

制造方法

本公开进一步提供了用于制造本文所述的ASO的方法，其包括：使核苷酸单元在适用于形成包含在ASO中的共价地联接的连续核苷酸聚合物的条件下发生反应，并且持续适用于形成该连续核苷酸聚合物的时间。该制造方法可使用亚磷酰胺化学(参见例如Caruthers等人，Methods in Enzymology 154：287-313(1987))。该方法可进一步包括：使连续核苷酸序列与缀合部分在适于将缀合物部分共价地附接至ASO的条件下发生反应，并且持续适于将缀合物部分共价地附接至ASO的时间。因此，本公开提供了用于制造本公开的ASO化合物或含有该化合物的组合物的方法，其包括：将本公开的ASO或缀合的ASO与药用稀释剂、溶剂、载体、盐或辅助剂混合。

药用盐

根据本公开的化合物可呈药用盐的形式。术语“药用盐”是指保留本公开化合物的生物学有效性和特性并由合适的无毒有机或无机酸或者有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐包括例如衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的那些，以及衍生自有机酸诸如p-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的那些。碱加成盐包括衍生自氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化季铵(诸如，例如，氢氧化四甲基铵)的那些。为了获得化合物的改善的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性而将药物化合物化学修饰成盐是药物化学家众所周知的技术。此类方法描述于例如Bastin，Organic Process Research&Development 4：427-35(2000)中或Ansel，In：《药物剂型和药物递送系统(第六版)》(Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，6th ed.(1995))第196和1456-7页。例如，本文提供的化合物的药用盐可以是钠盐。

因此，本公开提供了ASO或其缀合物的药用盐。在一些实施例中，药用盐为钠盐或钾盐。本公开进一步提供了包含ASO或其盐或缀合物的药物组合物。

药物组合物

本公开进一步提供了药物组合物，其包含前述ASO或其盐或缀合物中的任一者以及药用稀释剂、载体、盐或辅助剂。药用稀释剂可包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)，诸如，例如，无菌PBS。药用盐可包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，ASO以1μM至10mM溶液的浓度(例如，1μM至8mM、1μM至6mM、1μM至4mM、1μM至2mM、1μM至500μM、1μM至300μM、300μM至10mM、500μM至10mM、2mM至10mM、4mM至10mM、6mM至10mM、以及8mM至10mM的浓度)用于药用稀释剂中。

用于本公开中的合适的配制物可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，费城，宾夕法尼亚州，第17版，1985中。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer，Science 249：1527-1533，(1990)。WO 2007/031091提供了药用稀释剂、载体和辅助剂的另外的合适的实例(据此通过引用并入本文)。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、配制物、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合以及前体药物配制物，其通过引用并入本文。

本公开的ASO可与药用活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制物。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌或者可以进行无菌过滤。可将所得水性溶液按原样包装以供使用或可将该水性溶液冻干。可在施用之前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常将在3与11之间(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或11)，例如，在5与9之间(例如，5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9)，例如，在6与8之间(例如，6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8)，例如在7与8之间(例如，7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8)，例如，7至7.5(例如，7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)。可将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中(每一个单剂量单元含有固定量的上述药剂)，诸如，例如，在片剂或胶囊的密封包装中。

在一些实施例中，本公开的ASO或其缀合物为前体药物。

药物用途

本公开的ASO可作为用于例如诊断、治疗和预防的研究试剂进行利用。在研究试剂的上下文中，此类ASO可用于特异性地调节细胞(例如，体外细胞培养物或组织类器官)和实验动物中的TMEM106B蛋白的合成，从而有助于对靶基因的功能分析或有助于对其作为针对治疗干预的靶标的有用性的临床前评估。如果在研究或诊断中采用本公开的ASO或其缀合物，则TMEM106B靶核酸可以为cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

本公开提供了用于在表达TMEM106B的靶细胞中调节TMEM106B表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的本公开的寡核苷酸。在一些实施例中，靶细胞为神经元细胞。在一些实施例中，靶细胞为神经胶质细胞(例如，小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞或雪旺细胞)。在一些实施例中，靶细胞为哺乳动物细胞，例如，人细胞。靶细胞可以为形成哺乳动物中的组织的一部分的体外细胞培养物或组织类器官或体内细胞。靶细胞可存在于CNS(诸如脑或脊髓)中。在一些实施例中，该细胞为脑细胞。在一些实施例中，该细胞为额叶皮层细胞或额颞叶细胞。在一些实施例中，靶细胞为丘脑、海马、纹状体、视网膜或脊髓的细胞。

应当理解的是，对于体外用途(诸如，例如，为了评估靶细胞中的TMEM106B表达或其抑制)，该细胞可从组织被分离或可衍生自组织(例如，已建立的或永生化的细胞系)，诸如CNS组织、脑组织、额叶皮层、额颞叶组织、丘脑组织、海马组织、纹状体组织、视网膜组织或脊髓组织。从靶组织分离的细胞被称为原代细胞。

在其用于诊断目的的用途的上下文中，本公开的ASO可用于通过northern印迹、原位杂交、实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、RNA测序或适用于量化mRNA表达的其他技术来检测和量化细胞和组织中的TMEM106B表达。

在治疗应用的上下文中，可向疑似患有疾病或疾患的动物(例如，人)施用本公开的ASO，可通过调节TMEM106B的表达来对其进行治疗。本文描述了可受益于用本公开的靶向TMEM106B的化合物进行治疗的示例性病症。因此，本公开提供了用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括：向罹患或易患如本文所提及的疾病的受试者施用治疗上或预防上有效量的本公开的ASO或含有其的药物组合物。此外，本公开涉及用作药物的本公开的ASO或含有其的药物组合物。本公开的ASO或药物组合物可以有效量进行施用。仍进一步地，本公开提供了本公开的ASO用于制造用于治疗如本文所提及的疾患的药物或用于治疗本文所提及的疾患的方法的用途。

该疾病或疾患可与失调的TMEM106B表达或活性相关联。在一些实施例中，该疾病或疾患可与TMEM106B基因或以下基因中的突变相关联：该基因的蛋白质产物与TMEM106B相关联或相互作用(例如，为其结合伴侣)。因此，TMEM106B靶核酸可以为TMEM106B序列的突变形式。在一些实施例中，TMEM106B靶核酸为TMEM106B的活性或表达的调节剂。因此，本公开进一步提供了ASO或其药物组合物用于制造用于治疗TMEM106B的异常(例如，增加的)水平或活性的药物的用途。与失调的TMEM106B表达或活性相关联的示例性疾患可包括神经变性疾患，诸如，例如，额颞叶变性(FTLD)、帕金森氏病(或帕金森症；PD)、髓鞘形成低下性脑白质营养不良(HML)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、海马硬化症、皮质基底综合征(CBS)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、进行性核上性麻痹(PSP)和神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。鉴于这些疾患中的若干种与额叶皮层功能障碍相关联，本公开的化合物可用于治疗额叶皮层中与年龄相关联或与疾病相关联的变化。

因此，本文所述的ASO或含有其的药物组合物可适用于治疗FTLD。特别地，本公开的ASO或药物组合物可有利于治疗以泛素化蛋白的核内或细胞质积聚为特征的FTLD(FTLD-U)，诸如，例如，FTLD-TDP(其特征在于沉积在额叶和颞叶脑区中的泛素化TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的存在)，以及其他TDP-43蛋白质构象病(例如，ALS、阿尔茨海默病、伴有硬化症的大脑年龄相关性TDP-43(CARTS)、边缘主导型年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病(CTE)和海马硬化症)。在一些实施例中，本文所述的药物组合物可用于治疗或预防冠状病毒(例如，COVID-19)感染。

用于体内施用的反义寡核苷酸

可使用标准方法向受试者(例如，被鉴定为患有本文所述的疾病或疾患的受试者)施用本文所公开的化合物和组合物。例如，可通过许多不同途径(包括例如全身施用)中的任一种来施用本文所公开的化合物和组合物。全身施用的非限制性实例包括肠内(例如，口服)或肠胃外(例如，静脉内、动脉内、经粘膜、腹膜内、表皮、粘膜内(例如，鼻内或舌下)、肌肉内或经皮)施用。另外的施用途径可包括皮内、皮下和经皮注射。也可使用适用于局部递送ASO或含有其的组合物的方法来施用本文所公开的组合物。局部施用的非限制性实例包括表皮(例如，局部)、关节内和吸入途径。特别地，可向受试者的脑组织(例如，神经细胞，诸如例如，神经元或神经胶质)局部地施用所公开的组合物。

特别地，可向受试者的脑组织(诸如被确定为导致受试者中的潜在病理学的脑组织)局部地施用本公开的化合物和组合物。向脑的局部施用通常包括适用于将ASO或含有其的组合物递送至脑细胞(例如，神经细胞)，使得所选择的以突触方式连接的细胞群体中的至少一部分细胞与该组合物接触的任何方法。ASO可被递送至CNS的任何细胞，包括神经元、神经胶质或两者。一般而言，ASO被递送至CNS的细胞，包括例如脊髓、脑干(髓质、脑桥和中脑)、小脑、间脑(例如，丘脑和下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮层(例如，枕叶、颞叶、顶叶或额叶中的皮层区))的细胞、或它们的组合、或其中的细胞的任何合适的亚群。其他递送部位包括红核、杏仁核、内嗅皮层以及丘脑的腹外侧核或前核中的神经元。

可通过直接立体定向注射或显微注射到CNS的实质或心室中来递送本公开的ASO或组合物。在特别的实例中，可将本公开的ASO直接递送至受试者脑中的一个或多个癫痫病灶。例如，可借助于直接立体定向注射到旧皮层(allocortex)(例如，海马体)或新皮层(例如，额叶)的一个或两个半球中来向受试者施用本公开的ASO或含有其的药物组合物。在特别的实例中，借助于直接立体定向注射到脑(例如，额叶皮层)的一个或两个半球中来向受试者施用本公开的ASO。替代性地，可通过静脉内注射来施用本公开的ASO。在另一个实例中，向受试者鞘内施用本公开的ASO，并且可将ASO直接施用至小脑延髓池。

为了将本公开的ASO或含有其的药物组合物特异性地递送至特定区以及至特定CNS细胞群体，可通过立体定位显微注射来施用ASO。例如，受试者可具有以手术方式固定在适当位置(拧入颅骨中)的立体定向框架基座。使用高分辨率MRI对带有立体定向框架基座(例如，带有基准标记的MRI相容立体定向框架基座)的脑进行成像。然后将MRI图像传递至运行立体定向软件的计算机。使用一系列冠状、矢状和轴向图像来确定用于将本公开的组合物注射到脑中的插管或注射针的靶注射部位和轨迹。该软件直接将轨迹转换成对于立体定向框架而言适当的三维坐标。在进入部位之上钻孔，并且将立体定向装置定位，其中注射针植入在给定深度处。可将组合物(诸如本文所公开的组合物)注射在靶部位处。

另外的给药途径还可包括在直接可视化下的ASO局部施加(例如，表面皮层施加)或其他非立体定向施加。可以鞘内方式(例如，直接进入小脑延髓池)、在心室中(例如，使用脑室内(ICV)注射)或通过静脉内注射来递送ASO。

在一个实例中，本公开的方法包括通过立体定位注射来进行脑内或脑室内施用。然而，也可根据本公开采用其他已知的递送方法。例如，为了实现组合物跨CNS的更广泛分布，可将其注射到脑脊液中，例如，通过腰椎穿刺。为了将组合物引导至外周神经系统(PNS)，可将其注射到脊髓、一个或多个外周神经节中或感兴趣的身体部分的皮肤之下(皮下或肌肉内)。在某些情况下，可经由血管内方法来施用组合物。例如，在其中血脑屏障受干扰或未受干扰的情况下，可动脉内(颈动脉)施用组合物。此外，为了实现更全局性的递送，可在通过输注包含甘露醇的高渗溶液实现的血脑屏障的“打开”期间施用组合物。

在任何给定情况下最合适的施用途径将取决于所施用的特定组合物、受试者、正在治疗的特定癫痫症、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、受试者的年龄、体重、性别、正在治疗的疾病的严重程度、受试者的饮食以及受试者的排泄率。

实例

以下实例被提出以便向本领域普通技术人员提供对可如何使用、制备和评估本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹示例性地说明本发明而不旨在限制本发明人视为其发明的范围。

材料和方法

ASO基序序列和ASO化合物

表5示出了由本发明人针对靶向和降解TMEM106B mRNA所设计的ASO核苷酸序列(由SEQ ID NO指示)、特定ASO化合物(由CMP ID NO指示)和HELM注释的列表。这些ASO的化学结构在图1至图3中示出。

表5：本公开的靶向TMEM106B的反义化合物的HELM注释

Helm注释索引：

[LR](G)为β-D-氧基-LNA鸟嘌呤核苷，

[LR](T)为β-D-氧基-LNA胸腺嘧啶核苷，

[LR](A)为β-D-氧基-LNA腺嘌呤核苷，

[LR]([5meC])为β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷，

[dR](G)为DNA鸟嘌呤核苷，

[dR](T)为DNA胸腺嘧啶核苷，

[dR](A)为DNA腺嘌呤核苷，

[dR]([C]为DNA胞嘧啶核苷，

[dR]([PPG])为DNA 7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤核苷，

[idR](G)为逆向DNA鸟嘌呤核苷，

[idR](T)为逆向DNA胸腺嘧啶核苷，

[idR](A)为逆向DNA腺嘌呤核苷，

[idR](C)为逆向DNA胞嘧啶核苷

[mR](G)是2′-O-甲基RNA鸟嘌呤核苷，

[mR](U)为2′-O-甲基RNA尿嘧啶核苷，

[mR](A)为2′-O-甲基RNA腺嘌呤核苷，

[mR](C)为2′-O-甲基RNA DNA胞嘧啶核苷，

[sP]是硫代磷酸酯核苷间键，

P是磷酸二酯核苷间键。

反义寡核苷酸序列表示存在于ASO中的核碱基的连续序列。设计是指间隔聚体设计，例如，F-G-F′。在经典间隔聚体设计(例如，3-10-3(5′侧翼核苷酸-中心块核苷酸-3′侧翼核苷酸))中，侧翼(F和F′)中的所有核苷酸均由相同的经2′糖修饰的核苷(例如，LNA、cET或MOE)以及形成间隔(G)的中心块中的一段DNA构成。在带有交替侧翼设计的间隔聚体中，ASO的侧翼被标注为一系列整数，表示经2′糖修饰的核苷(M)的数量，之后是DNA核苷(D)的数量。例如，带有2-2-1基序的侧翼表示5′[M]₂-[D]₂-[M]3′，并且1-1-1-1-1基序表示5′[M]-[D]-[M]-[D]-[M]3′。两个侧翼在5′和3′末端处均具有经2′糖修饰的核苷。包含DNA核苷(通常为6至16个)的间隔区(G)位于侧翼之间。

反义寡核苷酸合成

ASO合成在本领域中是公知的。下面描述的是可用于产生具有期望的序列和修饰的ASO的示例性方案。使用亚磷酰胺方法在Oligomaker 48上以1μmol规模在尿苷通用支持物上合成ASO。在合成结束时，通过在60℃用氨水处理ASO达5至16小时来将ASO从固体支持物裂解。将ASO通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取进行纯化并通过超高效液相色谱(UPLC)进行表征，并且通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)来进一步确认分子质量。

反义寡核苷酸的伸长

通过使用乙腈中的0.1M的受5′-O-DMT保护的亚磷酰胺和乙腈中的DCI(4，5-二氰基咪唑)(0.25M)的溶液作为活化剂来执行β-氰乙基-亚磷酰胺(例如，DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)的偶联。对于最终的循环，使用带有期望修饰的亚磷酰胺(例如用于附接缀合基团或这样的缀合基团的C6接头)。使用氢化黄原素(0.01M，在处于9：1比率的乙腈/吡啶中)来进行用于引入硫代磷酸酯键的硫醇化。使用处于7：2：1摩尔比率的THF/吡啶/水中的0.02M碘来引入磷酸二酯键。

对于固相合成后缀合，在固相合成的最后一个循环中使用可商购获得的C6氨基接头亚磷酰胺。在脱保护并从固体支持物裂解之后，分离出氨基联接的经脱保护的ASO。使用标准合成方法经由官能团的活化来引入缀合物部分。

通过反相高效液相色谱进行纯化

在Phenomenex Jupiter 10μm C18 150x10mm柱上通过制备型RP-HPLC来纯化粗制化合物。将0.1M乙酸铵(pH 8)和乙腈以5mL/min的流速用作缓冲液。将收集的级分冻干以产生经纯化的化合物，其通常表现为白色固体。

缩写：

DCI：4,5-二氰基咪唑

DCM：二氯甲烷

DMF：二甲基甲酰胺

DMT：4,4'-二甲氧基三苯甲基

THF：四氢呋喃

Bz：苯甲酰基

Ibu：异丁酰基

逆向寡核苷酸的合成

术语“逆向核苷”或“反向核苷”(DNA X^INV)是指包含与典型取向相反的二甲氧基三苯甲基(DMT)和亚磷酰胺基团的核苷；DMT基团附接至核糖部分的3′-OH，并且亚磷酰胺附接至核糖部分的5′-OH。

DNA X^INV(X＝A、T、C或G)在亚磷酰胺寡核苷酸合成期间作为亚磷酰胺掺入到寡核苷酸中(参见下面的方案1)。该反向构型允许在5′到3′方向上的寡核苷酸合成(而不是标准的3′到5′方向)，并且提供5′-5′或3′-3′核酸酶抗性键而不是天然的3′-5′键(参见下面的方案2)。另参见Ortigao等人，Antisense Res.Dev.，2：129-146(1992)。示例性逆向核苷酸在方案2中示出。

为了改善所设计的ASO化合物的安全性特征，用逆向磷酸二酯键对硫代磷酸酯骨架进行了修饰，以降低硫代磷酸酯含量，并且因而降低ASO的手性复杂性，同时还保留对核酸外切酶的抗性。

例如，为了合成含有在3′端处的3′-3′磷酸二酯键的CMP ID NO：10_4的ASO，首先在亚磷酰胺寡核苷酸合成的第一个循环期间将适当的Bz-dA-5′-CE亚磷酰胺附接至通用支持物，之后在亚磷酰胺寡核苷酸合成的第二个循环期间在标准的3′-5′方向上添加第二单体(即Bz-LNA A-3′-CE亚磷酰胺)，以形成对应的末端3′-3′键。具有在3′端处带有3′-3′键的单个逆向碱基为寡核苷酸赋予核酸外切酶抗性并且防止通过聚合酶延伸，因为没有游离3′羟基基团来启动合成。

方案1：用于合成反向3′-3′或5′-5′核苷间键的DNA 5′亚磷酰胺

方案2：硫代磷酸酯核苷间键和逆向磷酸二酯核苷间键的设计

实例1：反义寡核苷酸减少人SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞中的TMEM106B mRNA表达

作为初始筛选，对超过1000种所设计的靶向TMEM106B的ASO针对它们减少人SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞(ECACC；目录号95011815)中的TMEM106B mRNA表达的能力进行了测试。使SK-N-BE(2)细胞在最低必需培养基(MEM)(Sigma，目录号M2279)与营养混合物F-12Ham(Sigma，目录号N4888)以1：1(v/v)比率混合的细胞培养基中生长，在所有随后周用1mM谷氨酰胺(Sigma，目录号G7513)和0.025mg/mL庆大霉素(Sigma，目录号G1397)、15％胎牛血清(FBS)(Sigma，目录号F7524)和10％FBS对该细胞培养基进行补充。每五天通过以下来对细胞进行胰蛋白酶消化：用PBS(Sigma，目录号14190-094)洗涤，之后添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma，目录号T3924)，并且在37℃孵育2至3分钟。然后在细胞接种之前对细胞进行研磨。将细胞保持培养最多15代。

作为下一步，将每孔20,000个细胞接种在96孔板(Nunc，目录号167008)中的190μL生长培养基中。在将细胞接种至达到最终浓度之后约24小时添加溶于PBS中的ASO。将细胞在没有任何培养基变化的情况下孵育三天。在孵育之后，通过去除培养基，之后添加125μLRLT裂解缓冲液(Qiagen，目录号79216)和125μL的70％乙醇来收获细胞。根据制造商的说明(Qiagen RNA酶96试剂盒)对RNA进行纯化，并洗脱到50μL的最终体积的水中，之后在qPCR之前进一步用水稀释10倍。

将RNA在90℃热激达40秒以使RNA：LNA双链体变性并直接移至冰中，并且在使用之前进行离心。对于一步qPCR反应，将qPCR混合物(qScript^TMXLE 1步RT-qPCRROX(QauntaBio，目录号95134-500))与具有1X的浓度的两种IDT探针混合以生成主混合物。Taqman探针获自IDT：TMEM：Hs.PT.58.3604573(引物-探针比率2，FAM)；POLR2A：Hs.PT.39.a19639531(引物-探针比率2，HEX/VIC)。接着，然后将6μL的主混合物与浓度为1至2ng/μL的4μL RNA在qPCR板(光学384孔，目录号4309849)中混合。在密封之后，将板在室温以1000g旋转达1分钟，并转移至ViiaTM 7系统(AppliedBiosystems，赛默飞世尔)。使用以下PCR条件：50℃达15分钟，95℃达3分钟，40个循环：95℃达5秒，之后进行1.6℃/秒的温度降低，之后60℃达45秒。使用QuantStudioTM Real_timePCR软件分析数据。

使用Quantstudio 7软件捕获qPCR数据并对原始数据执行质量控制。然后将数据导入到E-Workbook中，其中使用BioBook模板来捕获和分析数据。使用以下步骤分析数据：

1.通过ΔCt方法来计算RNA量(量＝2^(-Ct)*1,000,000,000)。

2.将RNA量归一化为针对在相同孔中运行的管家基因测定的计算的量。相对靶标量＝量_靶标/量_管家。

3.对于每个孔，通过除以相同板上的所有经PBS处理的孔的均值来计算RNA敲低的程度。经归一化的靶标量＝(相对靶标量/[均值]相对靶标量]_PBS_孔)*100

4.最终数据显示为RNA相对于未处理的(PBS)孔的百分比。

5.对于浓度应答实验，根据针对使用8种或10种浓度(具体取决于稀释模型)的每种化合物的RNA敲低值(步骤3至4)拟合了一条曲线。使用Biobook中的4参数S形剂量反应模型拟合曲线。

在一组实验中，对613种新型靶向人TMEM106B的ASO化合物以2.5μM浓度进行了三天测试。该实验还包括22种已公布的靶向人TMEM106B的化合物，包括CMP ID NO：25_1和CMPID NO：20，这些化合物先前已在美国专利申请公开号US 2021/0054383中进行了描述，该美国专利申请通过引用以其整体并入本文。对由所设计的化合物诱导的人TMEM106B的敲低进行测量、量化，并且将特定的ASO序列映射到它们在SEQ ID NO：1的人TMEM106B转录物内的杂交区上(图4)。

在另一组实验中，对908种新型人TMEM106B ASO化合物以0.5μM浓度进行了三天测试。该实验还包括22种已公布的靶向人TMEM106B的化合物，包括CMP ID NO：25_1和CMP IDNO：20，这些化合物先前已在美国专利申请公开号US 2021/0054383中进行了描述，该美国专利申请通过引用以其整体并入本文。对由新型化合物诱导的人TMEM106B的敲低进行量化，并且将特定的ASO序列映射到它们在SEQ ID NO：1的人TMEM106B转录物内的杂交区上(图5)。化合物CMP ID NO：8_1、8_3、24_1、6、10_4、29_5、15、24_3、12、29_3、26和8_4连同其他化合物相对于CMP ID NO：31表现出更大的敲低，连同其他ASO相对于CMP ID NO：31显出对TMEM106B表达优异的抑制。

在又另一项实验中，对311种新型靶向人TMEM106B的化合物以0.25μM浓度进行了测试。该实验还包括两种已公布的靶向人TMEM106B的化合物，包括CMP ID NO：25_1和CMPID NO：46，这些化合物先前在美国专利申请公开号US 2021/0054383中进行了描述，该美国专利申请通过引用以其整体并入本文。对由新型化合物诱导的人TMEM106B的敲低进行量化，并且将特定的ASO序列映射到它们在SEQ ID NO：1的人TMEM106B转录物内的杂交区上(图6)。化合物CMP ID NO：8_1、CMP ID NO：8_3、CMP ID NO：6、CMP ID NO：8_4和CMP ID NO：29_5连同其他ASO相对于CMP ID NO：25_1显示出对TMEM106B表达优异的抑制。上面三项实验的结果在下表6中详细示出。

表6：用本公开的反义寡核苷酸化合物处理的SK-N-BE(2)胶质母细胞瘤细胞中的TMEM106B敲低

实例2：靶向人TMEM106B的反义寡核苷酸的体外功效

针对靶向TMEM106B的反义寡核苷酸的IC50值确定

最初在人神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE(2)中筛选靶向人TMEM106B的ASO化合物，如实例1中所述。为了更好地转化到人类患者，在衍生自诱导型多能干细胞(iPSC)并与人原代星形胶质细胞共培养的人神经元中测试了候选ASO化合物针对人TMEM106B的功效。

用RLT缓冲液收获了人iPSC衍生神经元。用Qiagen RNeasy 96试剂盒完成了RNA提取。对RNA样品品质进行了测量，并且随后对样品进行了RNA测序。从样品制备了DNA文库，并以每次最多至48个样品的批次进行了测序。从中间96孔板中的母液用基于培养物的培养基缓冲液以连续稀释对ASO进行了稀释。连续稀释被设计为获得最终指定浓度的10X的浓度，以减少在添加到神经元之后的培养基稀释。在第7天，根据制造商的说明用Cells to Ct试剂(赛默飞世尔)收获了细胞以进行Taqman测定。将使用Taqman测定获得的相对表达水平归一化为对照孔，并且将数据导入到Graph Pad Prism软件中进行IC50分析，其是用软件曲线拟合功能来完成的。

在所有所测试的化合物中，在七天的处理之后选择了27种ASO来用IC50曲线进行表征。两种先前公布的ASO(即CMP ID NO：31和25_1)被包括在内作为针对本公开的新设计的ASO化合物的性能基准。发现了新设计的ASO具有在4.6nM至175nM的范围内的IC50浓度(表7和图7至图9)，其指示所测试的化合物的高效能。此外，观察到了人神经元TMEM106BmRNA几乎完全抑制，这表明有前景的治疗潜力。根据该筛选，鉴定出如与CMP ID NO：25_1相比具有改善的效能的ASO，包括CMP ID NO：8_3、8_4、8_1、29_3和12还有其他ASO。与CMP IDNO：31相比，所有27种ASO化合物均具有改善的IC50。

脱靶分析

在来自IC50实验的所选择的一组18种ASO中评估了候选ASO化合物的潜在脱靶活性。这些研究的结果汇总在下表7中。用处于5μM、0.5μM和0.05μM的ASO对细胞进行了处理，并且执行了批量RNA测序。将ASO浓度选择为处于IC50的1至5X、10X以及约100至1000X，以针对脱靶效应对ASO化合物进行应激测试，这些化合物仅具有ASO与脱靶基因之间错配、插入或缺失的1至2个碱基对，并且因此可能具有弱活性，并且可能需要显著量的ASO浓度才能被观察到。在5μM处，检测到了潜在的ASO脱靶效应。该浓度为所测试的ASO的IC50的100X至1000X；此类浓度通常不会在体内出现。将经ASO处理的样品与非靶向对照ASO(CMP ID NO：13)进行了比较，以便鉴定除预期的TMEM106B靶标以外的转录物的表达中的变化。制作并分析了火山图，以基于对1个或2个碱基对错配的生物信息学预测来确定潜在的脱靶效应。该组中的ASO被预测为具有经由生物信息学搜索所鉴定的潜在的56至1069种编码蛋白质的脱靶基因。然而，发现了所测试的ASO(CMP ID NO：10_4、29_3、24_3和29_5，还有其他ASO)中的一些具有少于5种在该非生理学浓度处显示出超过50％mRNA减少的脱靶基因。在0.5μM或0.05μM ASO浓度处未鉴定出脱靶基因，这两种浓度更接近向受试者施用的ASO的生理浓度。这些发现表明，一些这些ASO可具有治疗上有利的安全性特征。所测试的ASO中的一些在5μM处显示出与6至15种所观察的基因的脱靶结合。当ASO浓度降低至0.5μM和0.5μM时，这些脱靶效应显著减少。显著地，甚至在5μM的非生理ASO浓度处，CMP ID NO：24_3在人神经元中也没有可检测到的脱靶效应。相比之下，发现了其他ASO(包括CMP ID NO：8_1)与超过27种脱靶基因结合。当ASO浓度降低时，这些ASO靶向的脱靶基因的数量减少。综合起来，当ASO处于0.05μM浓度(其接近IC50浓度)时，几乎所有所鉴定的脱靶基因都未被检测到或减少。表7中汇总了针对不同ASO化合物的上述发现。这些发现表明，精心选择的ASO浓度可赋予对TMEM106B表达的选择性抑制并减少脱靶效应。

表7.抗TMEM106B ASO化合物的功能表征

表7说明：

表7是根据筛选所选择以进行进一步表征的ASO的汇总表。先前鉴定的CMP ID NO：25_1和31的ASO也被包括在内以进行比较。列出了IC50值。Mm1基因：1个碱基对错配基因。Mm2基因：2个碱基对错配基因。编码蛋白质的Mm1：编码蛋白质的1个碱基对错配基因。编码蛋白质的Mm2：编码蛋白质的2个碱基对错配基因。在5μM处观察到的脱靶：在5μM ASO浓度处，人iPSC神经元中mRNA减少超过50％的脱靶基因。在5μM处的脱靶基因：前10种脱靶基因的名称。在0.5μM处观察到的脱靶：在0.5μM ASO浓度处，人iPSC神经元中发现的mRNA减少超过50％的脱靶基因。在0.05μM处观察到的脱靶：在0.05μM ASO浓度处，人iPSC神经元中发现的mRNA减少超过50％的脱靶基因。

实例3：人视网膜色素上皮细胞中的溶酶体蛋白水解的功能测定

为了确定本公开的靶向TMEM106B的ASO是否影响溶酶体功能，在体外在人视网膜色素上皮(RPE)细胞中执行了功能测定。人(RPE)细胞因其扁平的细胞形态而被选为针对该实验的模型，这有助于使用已知的成像技术对溶酶体进行可视化。人RPE细胞购自ATCC，并且根据制造商的说明进行了培养。

用可容易地被内化并运输至溶酶体的经自淬灭的BSA对细胞进行了处理。这是通过将人RPE细胞以1000个细胞/孔平板接种在1％经Geltrex包被的384孔板中来执行的。将细胞在0.5％血清培养基中用ASO处理五天以防止过度生长。将200nM巴弗洛霉素用作阳性对照。BSA的经自猝灭的BODIPY-FL缀合物购自BioVision(7932-10)，并且根据制造商建议的方案执行了实验。添加终浓度为20μg/mL的SA并且孵育过夜。使用Bravo自动化将细胞用4％PFA和4％蔗糖在室温固定达20分钟。然后使用Biotek 406微孔板洗涤机(贝克曼库尔特)用PBS将经固定的细胞洗涤两次，之后通过与含有1X PBS、0.1％Triton X-100、2％驴血清和1％BSA的溶液在室温孵育达30分钟来进行透化和封闭。去除封闭液，并且将细胞与封闭液中的一抗在4℃孵育过夜。将细胞封闭，并且随后针对Hoechst(西格玛1：10,000)和LAMP1(BD 1：500)进行染色。在Biotek 406细胞板洗涤机(贝克曼库尔特)上用PBS洗涤六次之后，将细胞与经荧光团缀合的二抗(杰克逊免疫研究实验室公司)在室温在黑暗中孵育达一小时以避免光漂白。然后在成像之前用PBS将细胞再洗涤六次。使用InCell6000共焦显微镜(通用电气医疗生命科学)捕获了荧光图像。具体地，以40×放大率每孔成像16个视野。每种处理条件通过四个孔来表示。对BSA信号进行分段，并且从所有16个视野加总得到总强度作为每孔的总计算值。用InCell 6000分析软件执行了对BSA信号的图像分析。对四份重复进行平均，并且用表示标准平均误差(SEM)的误差条进行绘图。

在降解后，经降解和分离的BSA片段发出荧光，并且允许对溶酶体蛋白水解活性的可视化和量化(图10C，白点)。使用该测定，观察到CMP ID NO：29_3、15、26和14的ASO有效地将BSA降解活性降低约50％。这些发现表明，溶酶体功能随着ASO介导的TMEM106B降解而降低(图10B和10C)。

所选择的一组靶向TMEM106B的ASO被证实在RPE细胞中具有稳健的TMEM106B敲低活性。多种ASO(即CMP ID NO：29_3、15和26)在10μM的浓度处使TMEM106B mRNA减少约80％(图10A)。ASO CMP ID NO：14在10μM的浓度处使TMEM06b mRNA减少约50％。ASO CMP ID NO：10_13显示出几乎没有TMEM106B减少，并且因此被用作ASO阴性对照(图10A)。相对于人iPSC衍生的神经元，在人RPE细胞中观察到了引发相同水平敲低所需的ASO浓度中的增加。这可能是由于在五天的ASO处理期间RPE细胞的持续增殖，从而需要更高的ASO浓度才能引发TMEM106B敲低。

实例4：用于确定靶向TMEM106B的反义寡核苷酸的安全性的半胱天冬酶测定

为了测量本文所述的ASO的体外毒性特征，执行了半胱天冬酶测定以测量经处理的细胞中的细胞凋亡。使用Lipofectamine2000(赛默飞世尔11668-019)用100nM的ASO对NIH 3T3-L1细胞(ATCC目录CL-173)进行转染。在24小时之后遵循下述方案测量了半胱天冬酶3和半胱天冬酶7活化作为针对细胞凋亡的代表，该方案改编自Dieckmann等人，Mol.Ther.Nucl.Acids 10：45-54(2018)。该实验重复执行三次，其中每次重复均在96孔板中进行。在转染之前24小时，将细胞用胰蛋白酶消化并以4000个细胞/孔接种在96孔板(ViewPlate-96，珀金埃尔默，目录号6005181)中处于37℃含5％CO₂的100μL的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)生长培养基(西格玛，目录号D0819)、10％胎牛血清(西格玛，目录号F7524)、1mM丙酮酸钠(西格玛，目录号S8636)和0.025mg/mL庆大霉素(西格玛，目录号G1397)中。

用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(赛默飞世尔科技，目录号14190250)将ASO稀释至5μM的最终浓度。还用0μM浓度的寡核苷酸制备了阴性对照。将9.6μL的经稀释的ASO与110.4μL的Opti-MEM(赛默飞世尔科技，目录号31985047)轻轻地混合。将30μL的LOM溶液(其包含以1：99(v/v)的比率与Opti-MEM(赛默飞世尔科技，目录号31985047)混合的Lipofectamine TM 2000(赛默飞世尔科技，目录号11668019))在制备之后立即进行使用，添加到空的96孔板的每个孔。将30μL的经Opti-MEM稀释的寡核苷酸添加到LOM混合物，并且之后进行20分钟的孵育。从NIH 3T3-L1细胞培养物去除培养基，并且添加50％的培养基(其包含DMEM、20％胎牛血清和1mM丙酮酸钠)和50μL的LNA寡核苷酸的LOM溶液。

接下来，在将ASO添加到细胞24小时之后，将如根据制造商的方案所制备的100μL的3/7试剂(普洛麦格，目录号G8093)添加到细胞。将板以500rpm摇动达30秒并在室温孵育达一小时，并且之后用BackSeal(珀金埃尔默，目录号6005199)封闭板的背面。然后使用EnSight多模式板阅读器(珀金埃尔默，目录号HH34000000)测量发光。

计算针对被标记为“中性”(无寡核苷酸)的孔的原始测量结果的中值。随后，该板内的每个测量结果均通过该中值归一化。在相同板内单独计算所有“中性”和“阳性”孔(阳性＝已知细胞毒性寡核苷酸)的中值。每个孔如下进行缩放：((值-中值(中性))/(中值(阳性)-中值(中性))*100。使用在前一步处计算的值，针对每个孔计算并报告跨3个重复(3个板)的中值。半胱天冬酶测定的结果汇总在表8中。

表8.半胱天冬酶测定结果的汇总

实例5：靶向人TMEM106B mRNA的反义寡核苷酸的体内功效

对实例1中所述的所选择的一组ASO剂针对它们在体内降低小鼠脑中的TMEM106B表达的能力进行了测试。表达人TMEM106B基因的转基因小鼠是经由细菌人工染色体(BAC)技术生成的。雄性和雌性小鼠(23至32g)被给予5μL的在0.9％盐水中配制的ASO化合物，通过徒手注射递送到带有-0.5AP、1.0ML、2.5DV的立体定位坐标的右侧脑室中。在异氟烷麻醉下，在颅骨中心正上方的皮肤中切开切口。直接通过骨骼使小鼠接受脑室内注射，并且用手术胶闭合切口。使动物在加热垫上恢复并受到监测直至完全清醒。

进行了四项体内研究。研究1测试了CMP ID NO：14、15、29_3和26的四种ASO、CMPID NO：10_13的阴性对照ASO或盐水的单个100μg剂量(图11)。研究2测试了CMP ID NO：25_1、8_1、24_1、6和10_4的五种ASO和盐水的单个100μg剂量(图12)。研究3测试了针对CMP IDNO：31、29_3和26、CMP ID NO：10_13的阴性对照ASO或盐水中的每一者的两个剂量水平(图13)。研究4测试了针对CMP NO：29_5的两个剂量水平。在所有四项研究中均应用了相同的方法。在注射之后十四天，用过量异氟烷处死小鼠，之后快速断头，并且将脑放置在冰冷的小鼠脑切片器基质(斯托尔廷)中，并切成重约30至40mg的两个(2mm)冠状切片(在距前囟0.26mm处开始)。将组织浸入RNALater溶液(赛默飞世尔科技，目录AM7021)中并于4℃储存。使用Rneasy迷你试剂盒(凯杰，目录74116)使用QIAcube机器人工作站(凯杰)分离RNA。简而言之，将脑片段从RNALater溶液转移至含有3mm碳化钨珠(凯杰，目录69997)的1.5mLEppendorf管中的1mL RLT缓冲液。使用TissueLyser II(凯杰；以30Hz进行3分钟)裂解组织并以20,000g离心达3分钟。将550μL的裂解液(无泡沫、无沉淀物)转移至2mL Eppendorf管，并且置于预先装有所有所需试剂的QIAcube中。根据“RNeasy迷你-动物组织和细胞-大样品(第2版)”程序纯化RNA，其中用50μL的H₂O洗脱。使用NanoDrop 8000(赛默飞世尔科技)分光光度计测量RNA浓度，并且用H₂O将浓度调整至2ng/μL。

如实例1中所述，使用TMEM106B Hs00998849_ml(赛默飞世尔科技，目录4351370)作为探针和GAPDH探针(目录4351309，应用生物系统)测量了来自右半球的切片上的TMEM106B mRNA的表达水平以进行归一化。使用QuantStudioTM Real_time PCR软件来分析数据，并且对重复的读数求平均值。使用Graphpad Prism 5.0中的单向ANOVA来分析对TMEM106B mRNA减少的统计分析。

所有所测试的靶向TMEM106B的寡核苷酸在单次注射之后两周均降低了TMEM106BmRNA水平(图11至图14以及下表9中)。数据显示为平均对照样品(经盐水处理的小鼠；值越低抑制越大)的百分比。在研究1中，与经盐水处理的小鼠相比，所测试的所有四种ASO(即CMP ID NO：14(剩余60％、15(剩余44％)、293(剩余25％)和26(剩余27％))均产生了显著的TMEM106B减少((F(6，32)＝104.0，p＜0.00001，之后进行Dunnett事后检验)。阴性对照ASO(CMP ID NO：10_13)对TMEM106B水平没有影响(剩余95％)。在研究2中，与经盐水处理的小鼠相比，所有五种ASO均显著地减少了TMEM106B转录物(图12；(F(6，33)＝30.19，p＜0.0001，之后进行Dunnett事后检验)。化合物25_1为剩余29％，8_1为剩余34％，24_1为剩余33％，6为剩余56％，10_4为剩余47％。在研究3中，所有ASO均产生TMEM106B mRNA的显著减少(F(8，45)＝64.57，p＜0.0001，之后进行Dunnett事后检验)。与处于相同剂量水平的CMPID NO：31相比，CMP ID NO：29_3和26的ASO在25μg和100μg剂量处产生更大的敲低(图13)，表明CMP ID NO：29_3和26的体内效能更高，倍数为4倍。(针对研究3的％KD：阴性对照ASO(100ug)与经盐水处理的小鼠(剩余93％)没有显著差异，CMP ID NO：31(25ug)为剩余94％且(100ug)为剩余50％，CMP ID NO：29_3(25ug)为剩余53％且(100ug)为剩余22％，CMP IDNO：26(25ug)为剩余65％且(100ug)为剩余28％。在用本文所述的ASO处理的小鼠中观察到了最低程度的副作用(图14)。在研究4中，阴性对照ASO CMPD ID NO：13对TMEM106B mRNA没有影响，而CMPD ID NO：29_5显著地减少了mRNA，其中在25ug处剩余68％(p＜.001)，并且在100ug处剩余32％(p＜.0001)(F(3，20)＝41.4，p＜.0001，之后进行Dunnett事后)。正如预期的那样。非转基因对照未表达人TMEM106b mRNA。

表9：使用本公开的反义寡核苷酸对TMEM106B的体内敲低

其他实施例

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所述本发明的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已结合特定实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类特定实施例。实际上，对于本领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在本发明的范围内。

其他实施例在权利要求中。

Claims (24)

1.一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为选自由以下项组成的组的化合物：

其中非斜体大写字母为β-D-氧基LNA核苷，斜体大写字母为2′-O-甲基核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：26。

3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：8_3。

4.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：8_4。

5.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：12。

6.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：24_3。

7.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：24_1。

8.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：29_5。

9.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：8_1。

10.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：10_4。

11.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：6。

12.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：29_3。

13.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：14。

14.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为CMP ID NO：15。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中TMEM106B靶核酸为哺乳动物TMEM106B靶核酸。

16.根据权利要求15所述的反义寡核苷酸，其中所述哺乳动物TMEM106B靶核酸为人TMEM106B靶核酸。

17.一种缀合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸以及共价附接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。

18.一种根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸的药用盐。

19.一种根据权利要求18所述的缀合物的药用盐。

20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸，以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐或辅助剂。

21.一种药物组合物，其包含根据权利要求17所述的缀合物，以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐或辅助剂。

22.一种用于在表达TMEM106B的靶细胞中调节TMEM106B表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求20或21所述的药物组合物。

23.一种用于治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向罹患或易患所述疾病的受试者施用治疗上或预防上有效量的根据权利要求20或21所述的药物组合物。

24.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其用于治疗或预防疾病。