CN118546935B - 一种基于干扰或敲除人pcsk9基因制备增强型car-t细胞的方法及应用 - Google Patents
一种基于干扰或敲除人pcsk9基因制备增强型car-t细胞的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR‑T细胞的方法及应用，涉及CAR‑T细胞制备技术领域，包括利用人工microRNA（miRNA）对PCSK9进行RNA干扰（RNAi）制备增强型CAR‑T和利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术敲除PCSK9制备增强型CAR‑T。本发明采用一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR‑T细胞的方法及应用，通过PCSK9基因敲减元件或者CRISPR/Cas9技术，特异性地敲减或敲除CAR‑T细胞中PCSK9的表达，有效增强CAR‑T细胞对恶性实体肿瘤的治疗作用，并且能增强免疫检查点阻断疗法的肿瘤治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞制备技术领域，尤其是涉及一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法及应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是一种具有靶向功能的免疫细胞治疗方法。CAR-T疗法虽然在血液肿瘤中的治疗作用显著，但是在实体瘤的应用仍然存在着巨大挑战。研究表明实体瘤存在着异质性，并且肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境，CAR-T的功能会受到肿瘤微环境的抑制。目前免疫检查点阻断抗体PD-1和CTLA-4已经用于临床肿瘤患者的治疗，但是仍有很多患者对于此种免疫疗法响应较低。因此寻找一种新的可以提高T细胞的活性并且能增强免疫检查点响应的方法尤为重要。
肿瘤细胞来源的前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9, PCSK9）能增加肿瘤的免疫逃逸，但免疫细胞内源的PCSK9对抗肿瘤免疫的作用不明确。研究发现，PCSK9在肿瘤浸润CD8+T细胞中表达增加，敲除CD8+T细胞的PCSK9可以显著增强其抗肿瘤活性，延长实验动物的生存周期，并且提高免疫检查点疗法的治疗效果。
另外，由于异体来源的CAR-T会出现移植物抗宿主病（GVHD），因此目前大部分的CAR-T是由患者自体T细胞制备。临床上肿瘤病人通常在化疗及放疗后容易出现淋巴减少的情况，因此细胞数量成为CAR-T治疗的一个重要挑战。因此调整CAR-T制备过程，降低对病人原始外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）的需求量也至关重要。
B7H3，又称为CD276，是一种I型跨膜蛋白。该蛋白在多种恶性肿瘤中过度表达，在正常细胞中的表达量极少。该蛋白对T细胞存在抑制作用。目前已有多项以B7H3为靶点的CAR-T产品进入临床试验，证明该靶点的特异性及安全性较高。
miRNA调控基因表达的研究越来越成熟，人工miRNA沉默基因的技术也越来越多用于肿瘤研究，该方法是以哺乳动物内源miRNA前体为基本骨架，将其茎环结构中的miRNA序列替换为与目标靶基因mRNA部分互补的人工miRNA序列，使产生的人工miRNA作用于靶基因，从而抑制靶基因表达。
CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过sgRNA识别目的基因组序列，引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割后形成DNA双链断裂，进而通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等，达到基因编辑目的，并且已经用于CAR-T细胞的构建。在CRISPR-Cas9基因编辑应用中，安全有效的将CRISPR系统的功能组分递送至靶点都是其发挥作用的前提条件。将Cas9和sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）直接转移到细胞中的方法更安全快速，脱靶效应更低，编辑效率更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于干扰或敲除PCSK9制备增强型CAR-T的制备方法及应用，通过干扰或敲除PCSK9表达提高T细胞功能，并改良敲除PCSK9 CAR-T制备过程从而降低对病人原始PBMC数量的需求。
为实现上述目的，本发明提供了一种干扰人PCSK9基因表达的miRNA片段，miRNA片段包括miRNA#603-guide sequence/passenger sequence、miRNA#792-guide sequence/passenger sequence；
miRNA#603-guide sequence的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
miRNA#603-passenger sequence核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
miRNA#792-guide sequence的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，
miRNA#792-passenger sequence核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
以miR-155为骨架，将miR-155茎环结构中的miRNA序列替换为干扰人PCSK9基因表达的miRNA片段制备人工miRNA用于干扰PCSK9制备增强型CAR-T；
人工miRNA包括miRNA#603和miRNA#792，miRNA#603的核苷酸序列为SEQ IDNO.19，miRNA#792的核苷酸序列为SEQ ID NO.20。
一种敲除人PCSK9基因的sgRNA，sgRNA包括sgRNA#1、sgRNA#6，sgRNA#1的spacer序列为SEQ ID NO.22，sgRNA#6的spacer序列为SEQ ID NO.23；
将sgRNA化学合成即用型后应用于敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T，即用型sgRNA包括即用型sgRNA#1和即用型sgRNA#6，即用型sgRNA#1核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，即用型sgRNA#6核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
一种基于干扰人PCSK9基因表达制备增强型CAR-T的方法，利用上述的包含干扰人PCSK9基因表达的miRNA片段的人工miRNA片段进行，包括如下步骤：
S1、将含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域的融合基因片段克隆至慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR；
S2、将人工miRNA连接到步骤S1构建的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR中，得到PCSK9敲减的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR；
S3、将pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR和辅助质粒pMD2.G/pSPAX2共转染至293T细胞中包装，得到pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒；
S4、使用步骤S3获得的pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒感染体外活化的T细胞，获得PCSK9敲减的miR-B7H3-CAR-T细胞。
优选地，步骤S1中，CD8ɑ leader核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
CD8ɑ leader氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
B7H3 scFV核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
B7H3 scFV氨基酸序列为SEQ ID NO.4；
CD8铰链区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
CD28跨膜结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
CD28跨膜结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
4-1BB胞内结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；
4-1BB胞内结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；
结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。
优选地，步骤S1中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α--B7H3-CAR的步骤包括：
S1-1、慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α使用BamHI和NotI限制性内切酶进行双酶切，产物经过胶回收；
S1-2、将步骤S1-1回收得到的片段与含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域的融合基因片段按照摩尔比1:1混合，用T4 DNA连接酶进行连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
S1-3、挑取Stbl3感受态细胞的单克隆细胞进行质粒提取，质粒为pCDH-EF1α-B7H3-CAR。
优选地，步骤S2中，连接人工miRNA片段的具体步骤为：
S2-1、将步骤S1中所得质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR用BclI和HpaI双酶切后进行胶回收；
S2-2、将人工miRNA片段用BclI和HpaI双酶切后进行胶回收；
S2-3、将步骤S2-1回收得到的片段与步骤S2-2回收的片段用T4 DNA连接酶进行连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
S2-4、挑取Stbl3感受态细胞的单克隆细胞进行质粒提取，质粒为pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR。
优选地，步骤S4中，对人T细胞进行活化和扩增培养5天后，将获得的T细胞再感染pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒。
一种基于敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T的方法，利用上述的即用型sgRNA进行，包括如下步骤：
（1）将含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域的融合基因片段克隆至慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR；
（2）将步骤（1）中得到的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR和辅助质粒pMD2.G/pSPAX2共转染至293T细胞中进行包装，得到pCDH-EF1α-B7H3-CAR慢病毒；
（3）使用步骤（2）获得的pCDH-EF1α-B7H3-CAR慢病毒感染体外活化并扩增培养5天的T细胞，获得B7H3-CAR-T细胞；
（4）通过CRISPR-Cas9技术，将即用型sgRNA和Cas9蛋白形成的核糖核蛋白RNP转入步骤（3）获得的B7H3-CAR-T细胞，特异性靶向敲除人PCSK9基因，获得sgPsck9-B7H3-CAR-T细胞。
优选地，步骤（4）中，基因敲除过程包括：通过电转染将RNP复合物递送到B7H3-CAR-T细胞内进行基因编辑，制备sgPsck9-B7H3-CAR-T细胞。
因此，本发明采用上述一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法及应用，具有以下技术效果：
（1）本发明使用人工miRNA可以克服先前RNA干扰技术易脱靶的弱点，可以高效特异地沉默目标基因，并且本发明将miRNA整合到CAR表达载体，可以同时进行目标基因的干扰和CAR的表达；
（2）本发明利用RNP形式，将纯化的Cas9蛋白和向导RNA在体外形成RNP（RNA-蛋白复合体），然后以化学转染或电转等手段导入宿主细胞进行基因编辑。直接递送Cas9/sgRNARNP无需转录和翻译，可以实现快速基因编辑，同时半衰期较短，有较低的脱靶率，更为安全有效；
（3）通过PCSK9基因敲减元件或者CRISPR/Cas9技术，特异性地敲减或敲除CAR-T细胞中PCSK9的表达，有效的增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用及免疫检查点疗法的肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为干扰或敲除人PCSK9基因的示意图，其中，A为含有基因敲减miRNA和CAR的载体元件示意图，B为表达CAR的载体元件及在CAR-T细胞通过电转进行基因敲除的示意图；
图2为PBMC细胞、miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-603-B7H3-CAR-T细胞、miR-792-B7H3-CAR-T细胞、sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sg#1-B7H3-CAR-T细胞和sg#6-B7H3-CAR-T细胞的CAR阳性率统计图；
图3为PCSK9干扰效率的检测结果，其中，A为miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞的PCSK9的表达；B为sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sg#1-B7H3-CAR-T细胞和sg#6-B7H3-CAR-T细胞的PCSK9的表达；
图4为CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性检测结果，其中，A为miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞对胰腺癌细胞的杀伤统计；B为sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sg#1-B7H3-CAR-T细胞和sg#6-B7H3-CAR-T细胞对胰腺癌细胞的杀伤统计；
图5为CAR-T细胞动物体内抗肿瘤活性检测中第10天，第15天及第20天荷瘤小鼠小动物活体成像；
图6为CAR-T细胞动物体内抗肿瘤活性检测中各组荷瘤小鼠肿瘤大小；
图7为CAR-T细胞动物体内抗肿瘤活性检测中各组荷瘤小鼠肿瘤重量统计图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例一
一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T的方法，包括如下步骤：
S1、慢病毒表达载体的构建
表达载体一：pCDH-EF1α-B7H3-CAR慢病毒表达载体，序列包括CD8ɑ leader、B7H3scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域。
表达载体二：pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒表达载体，序列包括插入到EF1α内含子区域的miRNA序列、CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域。
CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成整个表达框，如图1所示。
CD8ɑ leader核苷酸序列为atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg，如SEQ ID NO.1所示；
CD8ɑ leader氨基酸序列为MALPVTALLLPLALLLHAARP，如SEQ ID NO.2所示；
B7H3 scFV核苷酸序列为：ctgcatgtaggctgtgctggaggattcgtctacagtcaatgtgaccttgtccttgaactcttgattgtagttagtataaatataagaaggataaatatttccgatccactcaaggccttgtccaggcctctgcttcacccagtttatccagtagttggtgaaggtgtagccagaagccttgcaggacagcttcacagccccaggcctcaccagttcagccccctgctgcagcttgacctgctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagatccccttatggttacgacgagtatggtctggactactggggccaaggcaccacggtcaccgtctcctcaggtggTggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcgagctcactcagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcactatgaactgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtagaaatcaaaagaactacttgacctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatatactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatgtttatccgctcacgttcggtgctGggaccaagctggaaataaaacgg，如SEQ ID NO.3所示；
B7H3 scFV氨基酸序列为LHVGCAGGFVYSQCDLVLELLIVVSINIRRINISDPLKALSRPLLHPVYPVVGEGVARSLAGQLHSPRPHQFSPLLQLDLLSSPTSEDSAVYYCTRSPYGYDEYGLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMNCKSSQSLLNSRNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYVYPLTFGAGTKLEIKR，如SEQ ID NO.4所示；
CD8铰链区的核苷酸序列为accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat，如SEQ ID NO.5所示；
CD8铰链区的氨基酸序列为TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD，如SEQ ID NO.6所示；
CD28跨膜结构域的核苷酸序列为ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc，如SEQ ID NO.7所示；
CD28跨膜结构域的氨基酸序列为FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS，如SEQ ID NO.8所示；
4-1BB胞内结构域的核苷酸序列为aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg，如SEQ ID NO.9所示；
4-1BB胞内结构域的氨基酸序列为KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，如SEQ ID NO.10所示；
结构域的核苷酸序列为agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc，如SEQ IDNO.11所示；
结构域的氨基酸序列为RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，如SEQID NO.12所示。
将CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域的融合基因片段克隆至慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α中，得到重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR。
进一步将miRNA片段连接到pCDH-EF1α-B7H3-CAR质粒的EF1α内含子区域，得到PCSK9敲减的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR。
具体步骤包括：
S1-1、将慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α使用BamHI和NotI限制性内切酶进行双酶切，产物经过胶回收。
S1-2、将步骤S1回收得到的片段与委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成的整个表达框CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及结构域序列，按照摩尔比1∶1混合，用T4酶进行连接，然后转化Stbl3感受态。
S1-3、挑取单克隆进行质粒提取，酶切鉴定后送测序确认，该质粒为pCDH-EF1α-B7H3-CAR。
S1-4、将合成好的以miR-155为骨架的miRNA#603用BclI和HpaI双酶切后进行胶回收。
其中miR-155为骨架将茎环结构中的miRNA序列替换为miRNA#603-guidesequence/miRNA#603-passenger sequence序列，5′端加入Bcl1和Srf1酶切位点，3′端加入Hpa1和Sph1酶切位点进行化学合成。
miRNA#603对应的全长序列如SEQ ID NO.19所示，为：tggaggcttgctttgggctgtatgctgacattctcgaagtcggtgaccgttttggccactgactgacggtcacgactcgagaatgtcaggacacaaggccctttatcagcactcacatggaacaaatggcccgttaacgta。
miRNA#603-guide sequence核苷酸序列为acattctcgaagtcggtgacc，如SEQ IDNO.13所示；
miRNA#603-passenger sequence核苷酸序列为ggtcacgactcgagaatgt，如SEQ IDNO.14所示。
S1-5、将步骤S1-3所得的产物与步骤S1-4所得产物用T4酶进行连接，然后转化为Stbl3感受态。
S1-6、挑取单克隆进行质粒提取，酶切鉴定后送测序确认，该质粒为pCDH-EF1α-miRNA-#603-B7H3-CAR。
S2、慢病毒的包装制备
S2-1、Day1：取5×106个293T细胞，离心后弃上清，用10 mL 37 °C预热的完全培养基（D-MEM+10% FBS+2 mM L-谷氨酰胺+0.1 mM非必需氨基酸+1 mM丙酮酸钠+1% P/S）重悬，接种于10 cm培养皿中，37 °C，5% CO2培养箱中孵育过夜。
S2-2、弃去培养皿中的培养液，加入5 mL含10%FBS的Opti-MEM® I培养液。
S2-3、DNA-Lipofectamine® 3000复合物的制备：
S2-3-1、将1.5 mL无血清的Opti-MEM® I培养液加入5 mL离心管中，加入9 μgpMD2.G和pSPAX2包装质粒混合物和3 μg pCDH-EF1α-B7H3-CAR或pCDH-EF1α-miRNA#603-B7H3-CAR，轻柔混合。
S2-3-2、将1.5mL无血清的Opti-MEM® I培养液加入另一个5mL离心管中，加入36 μL Lipofectamine® 3000，轻柔混合后在室温下孵育5 min。
S2-3-3、将S2-3-1、S2-3-2两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
S2-3-4、室温下孵育20 min，得到DNA-Lipofectamine® 3000复合物。
S2-4、将得到的DNA-Lipofectamine® 3000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37 °C，5% CO2培养箱中孵育过夜。
S2-5、Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10 mL DMEM完全培养基。37 ℃，5% CO2培养箱中孵育72 h。
S2-6、Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15 mL离心管中，在4 °C条件下2000 g离心15 min。
S2-7、0.45 μm滤头过滤到50 mL 100 kDa超滤管中，12 mL每支，4 °C条件下5000g离心30 min。
S2-9、获得病毒浓缩液，分装至灭菌EP管中保存于-80 °C。
S3、B7H3-CAR-T细胞、PCSK9敲减或敲除的B7H3-CAR-T细胞的制备
S3-1、培养基配置：配置50 mL完全培养基。1.5 mL CTS Immune Cell SR+0.5 mLGluta Max+1.3 mL CTS OpTmizer T-Cell Expansion Basal Medium Supplement + 0.5mL P/S + 25 μL IL-2 (100 IU) + CTS OpTmizer T-Cell Expansion Basal Medium补齐至50 mL。
S3-2、PBMC分离
S3-2-1、提前30 min将人外周血单个核细胞分离液恢复至室温。
S3-2-2、将新鲜的肝素抗凝的患者外周血与FACS (PBS+2% FBS)按照1∶1的比例轻柔混合均匀。
S3-2-3、取新的无菌离心管，底部置细胞分离液，轻柔的将稀释好的外周血与分离液等体积沿管壁平铺在淋巴细胞分离液上层。
S3-2-4、800 g室温离心25 min（缓升缓降）。离心管中由上至下分为四层。第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色淋巴细胞，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
S3-2-5、小心吸取中间白膜层细胞加入到新的50 mL离心管，补加RPMI 1640至50mL，600 g离心10 min，弃上清；再次用50 mL RPMI 1640重悬细胞，500 g离心10 min，弃上清。
S3-3、T细胞培养、病毒感染及电转
Day 0：吸取步骤S3-1配置的完全培养基，将步骤2-5得到的PBMC细胞按照1.5×106个/mL重悬。按照1∶1比例加入CD3/28磁珠。置于恒温培养箱（37 ℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
Day 1：不处理。
Day 2：不做处理。
Day 3：轻柔吹起孔板中的细胞并收集至50 mL离心管，1000 rpm/5 min，弃上清。用5 mL培养基重悬以后转移至无菌流式管，置于磁铁（Stemcell）上，静置2 min，收集上清（此步骤的目的在于去磁珠）。细胞计数，调整细胞密度为1.5×106/mL，转移至培养瓶或者培养皿中继续培养。
Day 4：静置不做处理。
Day 5：经过活化扩增后，得到T细胞。收集细胞（取5×106细胞），重悬在500 μL新鲜培养基中，转入新的48孔板，每孔加入100 μL浓缩的慢病毒（均匀滴入孔板中），盖上孔板的盖子，混匀，放入孵箱培养4小时后加入4.5 mL培养基，培养过夜。
Day 6：按照Day 5的操作步骤进行二次感染。
Day 7：将两次感染过的T细胞进行换液，调整T细胞密度为1.5×106/mL。离心速度不要超过1000rpm。此步骤获得B7H3-CAR-T细胞及miR-603-B7H3-CAR-T细胞，结构图如图1所示。
Day 8：静置，不做处理。
Day 9：进行电转。
1）收集需要电转的B7H3-CAR-T细胞，轻轻吹打，使得培养板底部的细胞充分收集。300 g/5min，离心弃上清。细胞计数后备用。
2）基因编辑准备：取无菌的EP管，加入20 μL的R buffer，加入Cas9蛋白3 μg/106细胞（或18 pmol/106细胞），加入sgRNA#6 45 pmol/106细胞。混匀，室温孵育15 min。Cas9蛋白和sgRNA可根据实际情况调整（根据效率优化）。
sgRNA#6 spacer序列为cuuggcaguugagcacgcgc，如SEQ ID NO.23所示；化学合成即用型sgRNA，即用型sgRNA#6核苷酸序列为cuuggcaguugagcacgcgcguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，如SEQ ID NO.25所示。
3）Cas9蛋白和sgRNA#6孵育期间，取1.5×106的B7H3-CAR-T细胞，300 g离心5min，完全去除上清（可用不含钙镁的DPBS再清洗一遍），用80 μL的R buffer重悬1.5×106细胞。
4）Cas9和sgRNA#6孵育期间，组装好Neon电转仪，在电击槽中加入3 mL的Ebuffer。
5）Cas9和sgRNA#6孵育期间，取T细胞完全培养基（添加10%的FBS）2.5 mL与6孔板中，将培养基置于培养箱复温。
6）将R buffer重悬的细胞转移至Cas9和sgRNA#6孵育管中，混匀细胞，总体积准备至约110 μL，不足可添加R buffer。
7）用电转枪吸取枪头后，吸取100 μL的细胞混匀液（注意电转枪中不可有气泡，否则点击过程中容易产生火花），将电转枪插入点击槽中，卡好位置。
8）在Neon电转仪器上选择电转程序1700/20/1。
9）进行电击，电击完成后，将电转枪的细胞转移至已预温的培养基中（培养密度2×106/mL），放入培养箱中进行培养。
10）基因编辑24小时后，如果培养基变黄，可用T细胞完全培养基调整细胞培养密度1×106/mL进行培养。此步骤获得PCSK9敲除的sgPcsk#6-B7H3-CAR-T细胞。
11）基因编辑72小时后，可取样检测细胞表型和基因编辑效率等。
实施例二
一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T的方法，采用与实施例一相同的办法，不同之处在于：
连接到pCDH-EF1α-B7H3-CAR上的miRNA片段为miRNA#792，制备pCDH-EF1α-miRNA#792-B7H3-CAR；
PCSK9敲减的细胞为miR-#792-B7H3-CAR-T；
电转时的sgRNA为sgRNA#1，制备的PCSK9敲除的细胞为sgPcsk#1-B7H3-CAR-T。
以miR-155为骨架将茎环结构中的miRNA序列替换为miRNA#792-guide sequence/passenger sequence序列，5′端加入Bcl1和Srf1酶切位点，3′端加入Hpa13和Sph1酶切位点进行化学合成。
miRNA#792-guide sequence: ataaactccaggcctatgagg，如SEQ ID NO.15所示。
miRNA#792-passenger sequence: cctcatggctggagtttat，如SEQ ID NO.16所示。
miRNA#792对应的全长序列为：tggaggcttgctttgggctgtatgctgataaactccaggcctatgagggttttggccactgactgaccctcatggctggagtttatcaggacacaaggccctttatcagcactcacatggaacaaatggcccgttaacgtagcatgcatgta，如SEQ ID NO.20所示。
sgRNA#1 spacer核苷酸序列为uacaggcagcaccagcgaag，如SEQ ID NO.22所示；化学合成即用型sgRNA，即用型sgRNA#1核苷酸序列为uacaggcagcaccagcgaagguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，如SEQ IDNO.24所示。
实施例三
一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T的方法，采用与实施例一相同的办法，不同之处在于：
连接到pCDH-EF1α-B7H3-CAR上的miRNA片段为miR-scramble，制备pCDH-EF1α-miRNA-scramble-B7H3-CAR；pCDH-EF1α-miRNA-scramble-B7H3-CAR慢病毒感染PBMC细胞获得miR-scr-B7H3-CAR-T；
电转时的sgRNA为sg-scramble，制备的细胞为sg-scr-B7H3-CAR-T。
以miR-155为骨架将茎环结构中的miRNA序列替换为miR-scramble-guidesequence/passenger sequence序列，5′端加入Bcl1和Srf1酶切位点，3′端加入Hpa13和Sph1酶切位点进行化学合成。
miR-scramble-guide sequence: ttctaatactacgttccgcat，如SEQ ID NO.17所示。
miR-scramble-passenger sequence: atgcggacgagtattagaa，如SEQ ID NO.18所示。
miR-scramble对应的全长序列为：tggaggcttgctttgggctgtatgctgttctaatactacgttccgcatggttttggccactgactgacatgcggacgagtattagaacaggacacaaggccctttatcagcactcacatggaacaaatggcccgttaacgta，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
sg-scramble的核苷酸序列为：ggccgaaaccugauccuuuaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，如SEQ ID NO.26所示。
实验测试
（一）CAR表达效率的检测。
流式检测PBMC细胞、miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞、sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sgPcsk#1-B7H3-CAR-T细胞和sgPcsk#6-B7H3-CAR-T细胞阳性率。用B7H3抗原蛋白与CAR-T细胞共孵育，室温孵育60 min后清洗，随后用anti-B7H3抗体进行孵育，4 ℃孵育30 min后清洗，应用流式细胞仪分析。
结果如图2所示，其中，PBMC细胞为阴性对照组。结果显示，miR-B7H3-CAR-T细胞和sg-B7H3-CAR-T细胞组均可以成功表达识别B7H3的CAR（图中数据以%表示）。
（二）PCSK9干扰效率的检测
流式检测miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞、sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sgPcsk#1-B7H3-CAR-T细胞和sgPcsk#6-B7H3-CAR-T细胞的PCSK9的表达。
细胞破膜后清洗，用anti-PCSK9抗体进行孵育，4 ℃孵育30 min后清洗，应用流式细胞仪分析。
结果如图3所示，miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞、sgPcsk#1-B7H3-CAR-T细胞和sgPcsk#6-B7H3-CAR-T细胞中PCSK9的表达显著降低。
（三）CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性检测。
（1）分别以miR-B7H3-CAR-T、sg-B7H3-CAR-T为效应细胞，Panc01-luc胰腺癌细胞为靶细胞。于96孔板中按照1∶1，5∶1，10∶1的效靶比混合效应细胞及靶细胞，轻轻混匀；同时设置无细胞的培养液孔以及只有靶细胞的样品对照孔置于5% CO2，37 ℃培养箱中孵育。
（2）共孵育后的第18 h，加入裂解液以及荧光素酶底物后使用酶标仪检测荧光强度。
细胞毒性/死亡率=（处理样品吸光度-样品对照孔吸光度）/样品对照孔吸光度×100%。
实验结果如图4所示，图4中（A）为miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞对胰腺癌细胞的杀伤统计，图4中（B）为sg-scr-B7H3-CAR-T细胞、sgPcsk#1-B7H3-CAR-T细胞和sgPcsk#6-B7H3-CAR-T细胞对胰腺癌细胞的杀伤统计。
结果显示，miR-#603-B7H3-CAR-T细胞、miR-#792-B7H3-CAR-T细胞、sgPcsk#1-B7H3-CAR-T细胞和sgPcsk#6-B7H3-CAR-T对Pan01-luc胰腺癌细胞的杀伤率明显强于普通miR-scr-B7H3-CAR-T细胞、sg-scr-B7H3-CAR-T细胞。说明本发明制备的PCSK9敲减或敲除的CAR-T细胞对胰腺癌细胞具有高效的杀伤作用。
（四）CAR-T细胞动物体内抗肿瘤活性检测
取对数生长期的Panc01-luc人胰腺癌细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×106个癌细胞的悬液0.1 mL原位接种于NCG小鼠的胰腺组织。
实验分组及治疗情况如表1所示，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量小鼠体重，观察体重变化情况。在荷瘤后的第10天，第15天及第20天用小动物活体成像系统监测肿瘤的生长情况，实验分组及治疗情况。第10天，第15天及第20天荷瘤小鼠小动物活体成像如图5所示，各组荷瘤小鼠肿瘤大小如图6所示，各组荷瘤小鼠肿瘤重量如图7所示。
表1
；
实验发现，经过PCSK9敲除或者敲减的B7H3-CAR-T治疗的小鼠肿瘤的生长得到了一定程度上的抑制，且显著提高了PD-1的治疗效果，说明构建的干扰PCSK9的CAR-T可以明显抑制体内肿瘤的生长，提高免疫治疗的效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于：利用人工miRNA对人PCSK9基因进行RNA干扰制备增强型CAR-T或通过CRISPR-Cas9基因编辑技术利用sgRNA敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T；
人工miRNA是以miR-155为骨架，将miR-155茎环结构中的miRNA序列替换为干扰人PCSK9基因表达的miRNA片段制备得到，
干扰人PCSK9基因表达的miRNA片段为：miRNA#603-guide sequence/passengersequence、miRNA#792-guide sequence/passenger sequence；
miRNA#603-guide sequence的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
miRNA#603-passenger sequence核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
miRNA#792-guide sequence的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，
miRNA#792-passenger sequence核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
人工miRNA包括miRNA#603和miRNA#792，miRNA#603的核苷酸序列为SEQ ID NO.19，miRNA#792的核苷酸序列为SEQ ID NO.20；
sgRNA包括sgRNA#1、sgRNA#6，sgRNA#1的spacer序列为SEQ ID NO.22，sgRNA#6的spacer序列为SEQ ID NO.23；
将sgRNA化学合成即用型后应用于CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T，即用型sgRNA包括即用型sgRNA#1和即用型sgRNA#6，即用型sgRNA#1核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，即用型sgRNA#6核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于，基于干扰人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法包括如下步骤：
S1、将含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及CD3结构域的融合基因片段克隆至慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR；
S2、将人工miRNA连接到步骤S1构建的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR中，得到PCSK9敲减的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR；
S3、将pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR和辅助质粒pMD2.G/pSPAX2共转染至293T细胞中包装，得到pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒；
S4、使用步骤S3获得的pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒感染体外活化的T细胞，获得PCSK9敲减的miR-B7H3-CAR-T细胞；
CD8ɑ leader核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
CD8ɑ leader氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
B7H3 scFV核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
B7H3 scFV氨基酸序列为SEQ ID NO.4；
CD8铰链区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
CD28跨膜结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
CD28跨膜结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
4-1BB胞内结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；
4-1BB胞内结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
CD3结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；
CD3结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。
3.根据权利要求1所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于，基于敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法包括如下步骤：
（1）将含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及CD3结构域的融合基因片段克隆至慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR；
（2）将步骤（1）中得到的重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR和辅助质粒pMD2.G/pSPAX2共转染至293T细胞中进行包装，得到pCDH-EF1α-B7H3-CAR慢病毒；
（3）使用步骤（2）获得的pCDH-EF1α-B7H3-CAR慢病毒感染体外活化并扩增培养5天的T细胞，获得B7H3-CAR-T细胞；
（4）通过CRISPR-Cas9技术，将即用型sgRNA和Cas9蛋白形成的核糖核蛋白RNP转入步骤（3）获得的B7H3-CAR-T细胞，特异性靶向敲除人PCSK9基因，获得sgPcsk9-B7H3-CAR-T细胞；
CD8ɑ leader核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
CD8ɑ leader氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
B7H3 scFV核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
B7H3 scFV氨基酸序列为SEQ ID NO.4；
CD8铰链区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
CD28跨膜结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
CD28跨膜结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
4-1BB胞内结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；
4-1BB胞内结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.10；
CD3结构域的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；
CD3结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。
4.根据权利要求2所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于：
步骤S1中，构建重组慢病毒质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR的步骤包括：
S1-1、慢病毒骨架质粒pCDH-EF1α使用BamHI和NotI限制性内切酶进行双酶切，产物经过胶回收；
S1-2、将步骤S1-1回收得到的片段与含有CD8ɑ leader、B7H3 scFV、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域及CD3结构域的融合基因片段按照摩尔比1:1混合，用T4 DNA连接酶进行连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
S1-3、挑取Stbl3感受态细胞的单克隆细胞进行质粒提取，质粒为pCDH-EF1α-B7H3-CAR。
5.根据权利要求2所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于，步骤S2中，连接人工miRNA片段的具体步骤为：
S2-1、将步骤S1中所得质粒pCDH-EF1α-B7H3-CAR用BclI和HpaI双酶切后进行胶回收；
S2-2、将人工miRNA片段用BclI和HpaI双酶切后进行胶回收；
S2-3、将步骤S2-1回收得到的片段与步骤S2-2回收的片段用T4 DNA连接酶进行连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
S2-4、挑取Stbl3感受态细胞的单克隆细胞进行质粒提取，质粒为pCDH-EF1αmiRNA-B7H3-CAR。
6.根据权利要求2所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于：步骤S4中，对人T细胞进行活化和扩增培养5天后，将获得的T细胞再感染pCDH-EF1α-miRNA-B7H3-CAR慢病毒。
7.根据权利要求3所述的一种基于干扰或敲除人PCSK9基因制备增强型CAR-T细胞的方法，其特征在于，步骤（4）中，基因敲除过程包括：
通过电转染将RNP递送到B7H3-CAR-T细胞内进行基因编辑，制备sgPcsk9-B7H3-CAR-T细胞。
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