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CN118515785B - 融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用 - Google Patents

融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用。所述融合蛋白包含E3连接酶及插入在E3连接酶的多肽；其中，所述多肽插入在所述E3连接酶的底物识别域的无规则卷曲结构上且保留所述底物识别域的结构。本发明的融合蛋白及泛素化系统可在小分子筛选及PROTAC化合物开发前针对某底物蛋白检测E3泛素连接酶是否对其有降解效果，从而节约筛选成本，提高开发效率。

Description

融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用。
背景技术
PROTAC（proteolysis-targeting chimeras蛋白降解靶向嵌合体）使用双特异性分子将E3连接酶与靶蛋白连接起来，从而模仿E3连接酶与天然底物的结合，并通过泛素化介导的蛋白酶体降解来降解选定的靶蛋白（如图1所示）。
CRBN和VHL是两种广泛用于PROTAC分子开发的E3连接酶，但它们在有效降解某些靶蛋白方面存在局限性。扩展可开发PROTAC的E3连接酶库对于PROTAC药物的研发至关重要，但人体中E3连接酶有600多种，其中大部分都没有开发出特异性结合的小分子。考虑到小分子开发的长周期和高花费，如果可以在没有特异性小分子或者基于这些小分子的PROTAC分子的情况下提前评估E3连接酶降解所选靶蛋白的能力，就可以优选出有PROTAC开发潜力的E3连接酶进行后续开发。为此，一些新的检测方法被开发了出来。如图2所示，E3连接酶报告系统（ACS Chem Biol. 2017 Oct 20;12（10）：2570）用HaloTag标签蛋白替换E3连接酶的底物识别域，并将靶蛋白与FKBP标签蛋白融合，然后使用带有结合HaloTag和FKBP的PROTAC分子工具化合物库测试E3连接酶对于靶蛋白的降解效率。BioPROTAC测定方法（PNAS2020 Mar 17;117（11）：5791-5800）将E3的底物识别域替换为特异性识别GFP的Nanobody（纳米抗体/VHH，一种在骆驼和羊驼中发现的小抗体的抗原特异性识别片段，相当于于一般抗体的scFv片段），并将靶蛋白与GFP蛋白融合。GFP-Nanobody的相互作用将会模拟E3连接酶与其天然底物的结合，从而诱导蛋白质的泛素化及降解。
然而，这些先前设计的检测方法存在缺陷：它们都需要用Halo标签蛋白/GFPNanobody替换E3连接酶的整个底物识别域，而这会破坏E3连接酶的原始结构。对于某些E3连接酶（例如BTRC）来说这样的替换是可行的，因为其底物识别域的WD40结构域不参与和E3复合物的其余部分的结合。然而，对于另一些E3连接酶如CRL4 E3连接酶（包括CRBN），其稳定的E3复合物形成需要完整的底物识别结构域（如图3所示），而这种整体蛋白结构域的替代会降低E3连接酶与E3复合物的结合，从而抑制靶蛋白降解。事实上，从文献数据来看，CRL4 E3连接酶CRBN在BioPROTAC的检测方法中并没有显示出降解效率，这与CRBN可以通过PROTAC分子广泛的降解非底物蛋白的实际情况并不相符。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中构建E3连接酶库时对E3连接酶底物识别结构域造成破坏的缺陷，提供了一种融合蛋白、包含其的泛素化系统及其应用。
发明人在E3连接酶的底物结合处设计了在针对蛋白结构中的无规则卷曲结构中添加一个小的抗原肽段，并将特异性识别抗原的纳米抗体连接到目标蛋白质。因为抗原序列添加在无规则卷曲结构中，并不改变E3连接酶的整体结构，因此不会影响其与E3复合物的结合，使得CRL4 E3连接酶及其他具有类似特征的E3连接酶的检测成为可能。而纳米抗体-抗原肽段的相互作用可以模拟E3连接酶-底物相互作用，从而评估E3连接酶对特定靶蛋白降解的能力。
理论上，任何特异性的纳米抗体-抗原肽段结合对（或者扩展到蛋白-肽段结合对）都可以应用于这种检测方法。但因为加入的抗原序列在蛋白质的中间位置，而有些纳米抗体与抗原肽段的结合需要抗原肽段进行一定的结构变化（如从无规则卷曲变成α-螺旋或者β-折叠片），这就增加了一些扭力，可能会抑制结合或者引起蛋白质变性。因此，发明人倾向于选择在表达中可以自发折叠成α-螺旋的抗原肽段，因为这样的结构在和纳米抗体结合时不会产生明显的结构变化。另外，某些纳米抗体富含二硫键，无法在胞内稳定存在，也不适用于此种检测方法。通过分析现有的符合上述标准的纳米抗体-抗原肽段对，选择了名为ALFA（SRLEEELRRRLTE，SEQ ID NO: 1）的拥有13个氨基酸的抗原肽段。这是一种可以自行形成α-螺旋结构的肽，并可以特异性的结合名为NbALFA的纳米抗体，且结合常数达到了皮摩尔级别(Nat Commun 2019 10: 4403-4403；WO2020053239A1)。通过分析E3连接酶的结构，发明人将ALFA肽插入了几个E3连接酶的底物结合域中的环区位置。同时，为了防止泛素化发生在纳米抗体上，把NbALFA表面的2个赖氨酸突变为精氨酸，并命名为NbALFAK2R，并将其与想要研究的靶蛋白融合。发明人在靶蛋白中也融合了改造过的HiBit标签（Promega），用于细胞内靶蛋白的定量测定。同时，使用蛋白酶体抑制剂MG132处理转染的细胞，用来判断靶蛋白水平的变化是否通过蛋白酶体降解通路实现。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含E3连接酶及插入在E3连接酶上的多肽；其中，所述多肽插入在所述E3连接酶的底物识别域的无规则卷曲结构上且保留所述底物识别域的结构。
本发明一些实施方案中，所述多肽可自发形成α-螺旋结构，并在与靶向多肽的配体结合后不改变所述底物识别域的结构。
本发明一些实施方案中，所述E3连接酶所述E3连接酶选自SCF、CRL4、APC/C和CRL3家族的E3泛素连接酶。
本发明一些实施方案中，所述E3连接酶选自BTRC、FBXW2、FBXW4、FBXW5、FBXW7、FBXW8、FBXW9、FBXW10、FBXW11、FBXW12 (SCF家族); CRBN、COP1、DCAF1、DCAF2、DCAF3、DCAF4、DCAF5、DCAF6、DCAF7、DCAF8、DCAF9、DCAF10、DCAF11、DCAF12、DCAF13、DCAF14（CRL4家族）；CDC20（APC/C家族）和KEAP1（CRL3家族）。
本发明一些实施方案中，所述多肽的长度为5-15 aa，例如为10-15 aa。
本发明一些实施方案中，所述多肽包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
本发明一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明一些实施方案中，所述多肽为经修饰的多肽。
本发明一些实施方案中，所述修饰为在多肽的N端和C端分别添加单个脯氨酸。
本发明一些实施方案中，所述多肽的N端与C端分别通过连接子插入所述E3连接酶。
本发明一些实施方案中，所述连接子为GS连接子。
本发明一些实施方案中，所述连接子包如SEQ ID NO: 9-12任一所示的氨基酸序列。
本发明一些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO: 13-40任一所示或与SEQ ID NO: 13-40任一具有至少80%、至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.8%、或99.9%序列同一性的氨基酸序列。
本发明的第二方面提供一种如第一方面所述的融合蛋白在构建泛素连接酶筛选平台、构建PROTAC筛选平台、调控蛋白胞内表达水平中的应用。
本发明一些实施方案中，所述融合蛋白中的多肽与靶向所述多肽的配体结合，所述配体与靶蛋白相连，缩小E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离，从而使所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以进行泛素化降解，所述配体为免于泛素化的配体。
本发明一些实施方案中，所述配体为蛋白质配体。
本发明一些实施方案中，所述配体为抗体或抗原结合片段。
本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合结构域的非抗原识别域的表面无自由赖氨酸。
本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合结构域的非抗原识别域的表面的赖氨酸替换为精氨酸。
本发明一些实施方案中，所述抗体为单域抗体。
本发明一些实施方案中，所述抗体为重链抗体。
本发明一些实施方案中，所述配体为重链抗体，所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示的CDR3。
本发明一些实施方案中，所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示或与SEQ ID NO: 6具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.8%、或99.9%同一性的氨基酸序列的可变区。
本发明一些实施方案中，所述靶蛋白还连接标签蛋白；所述标签蛋白优选为免于泛素化的标签蛋白，且可用于靶蛋白的定量检测。
本发明一些实施方案中，所述标签蛋白为HiBit；所述HiBit优选为K2R变体，包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
本发明的第三方面提供一种泛素化系统，所述泛素化系统包含如第一方面所述的融合蛋白、靶向所述融合蛋白中的多肽的配体，以及靶蛋白；
其中，所述配体为免于泛素化的配体；所述靶蛋白与靶向多肽的配体连接，E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离缩小，从而使所述靶蛋白被E3连接酶的底物识别域识别进而与E3连接酶结合，所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以实现泛素化降解。
本发明一些实施方案中，所述配体为特异性结合多肽的蛋白质配体。
本发明一些实施方案中，所述配体为抗体或其抗原结合结构域。
本发明一些实施方案中，所述抗体为重链抗体或scFv。
本发明一些实施方案中，所述抗体为单域抗体。
本发明一些实施方案中，所述抗体为重链抗体。
本发明一些实施方案中，所述配体为重链抗体，所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示的CDR3。
本发明一些实施方案中，所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示或与SEQ ID NO: 6具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.8%、或99.9%同一性的氨基酸序列的可变区。
本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合结构域的非抗原识别域的表面无自由赖氨酸。
本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合结构域的非抗原识别域的表面的赖氨酸替换为精氨酸。
本发明一些实施方案中，所述靶蛋白还与标签蛋白连接；所述标签蛋白为免于泛素化的标签蛋白。
本发明一些具体实施方案中，所述标签蛋白为HiBit；所述HiBit优选为K2R变体，包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面所述的融合蛋白或者如第三方面所述的泛素化系统。
本发明的第五方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第四方面所述的多核苷酸。
本发明一些实施方案中，所述重组表达载体为质粒骨架，例如为pcDNA3.1。
本发明的第六方面提供一种转化体，所述转化体包含如第四方面所述的多核苷酸或者如第五方面所述的重组表达载体。
本发明的第七方面提供一种制备融合蛋白的方法，所述方法包括培养如第六方面所述的转化体以获得所述融合蛋白。
本发明的第八方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的泛素化系统、如第四方面所述的多核苷酸、如第五方面所述的重组表达载体或者如第六方面所述的转化体。
本发明的第九方面提供一种评价E3连接酶的方法，所述方法包括通过如第三方面所述的泛素化系统评价E3连接酶对靶蛋白的降解效率；
其中，所述泛素化系统中，所述多肽通过与靶向多肽的配体结合缩小E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离，从而使所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以进行泛素化降解。
本发明的第十方面提供一种E3连接酶的评估系统，所述评估系统包括输入模块、反应分析模块和判断输出模块；其中，所述输入模块向所述反应分析模块输入如第三方面所述的泛素化系统，所述泛素化系统在所述反应分析模块中对靶蛋白进行泛素化，并分析所述靶蛋白在泛素化前后的含量数据传递给判断输出模块；所述判断输出模块根据所述靶蛋白在泛素化前后的含量数据，判断使用的E3连接酶对所述靶蛋白的降解作用；
其中，当所述靶蛋白在泛素化后的含量达到泛素化前的含量的80%时，且靶蛋白含量的降低能够被蛋白酶抑制剂抑制时，判断E3连接酶对所述靶蛋白有降解作用，否则E3连接酶对所述靶蛋白没有降解作用。
本发明的第十一方面提供一种如第一方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的泛素化系统、如第四方面所述的多核苷酸、如第五方面所述的重组表达载体、如第六方面所述的转化体、如第八方面所述的试剂盒或者如第十方面所述的评估系统在构建泛素连接酶筛选平台、构建PROTAC筛选平台、调控蛋白胞内表达水平中的应用。
本发明的第十二方面提供一种如SEQ ID NO: 1所示的多肽在构建泛素连接酶筛选平台、构建PROTAC筛选平台、调控蛋白胞内表达水平中的应用。
本发明的第十三方面提供一种抗体或其抗原结合结构域在构建泛素连接酶筛选平台、构建PROTAC筛选平台、调控蛋白胞内表达水平中的应用；
所述抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQID NO: 4所示的CDR3。
本发明一些实施方案中，所述可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示或与SEQ ID NO: 6具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.8%、或99.9%序列同一性的氨基酸序列。
本发明一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合结构域为免于泛素化的抗体或其抗原结合结构域。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的融合蛋白及泛素化系统提供了一种通用的E3泛素连接酶针对非自然底物蛋白的降解谱的检测方法，可在小分子筛选及PROTAC化合物开发前针对某靶蛋白检测E3泛素连接酶是否对其有降解效果，从而节约筛选成本，提高开发效率。
附图说明
图1为E3连接酶降解自然底物蛋白和PROTAC介导的E3连接酶降解非自然底物蛋白的原理示意图。
图2为文献中使用HaloTag标签的E3连接酶报告系统和BioPROTAC检测方法示意图。
图3为DCAF1的底物识别WD40结构域与DDB1的交互作用的蛋白质三维结构示意图。
图4为本发明以BTRC为示例的基于纳米抗体-抗原肽段对的检测E3连接酶对于靶蛋白的降解选择性的方法设计示意图。
图5为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶BTRC（SEQID NO: 13）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图6为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW2（SEQID NO: 14）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图7为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW4（SEQID NO: 15）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图8为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW5（SEQID NO: 16）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图9为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW7（SEQID NO: 17）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图10为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW8（SEQID NO: 18）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图11为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW9（SEQID NO: 19）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图12为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW10（SEQ ID NO: 20）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图13为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW11（SEQ ID NO: 21）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图14为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶FBXW12（SEQ ID NO: 22）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图15为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶CRBN（SEQID NO: 23）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图16为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶COP1（SEQID NO: 24）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图17为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF1（SEQID NO: 25）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图18为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF2（SEQID NO: 26）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图19为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF3（SEQID NO: 27）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图.
图20为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF4（SEQID NO: 28）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图21为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF5（SEQID NO: 29）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图22为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF6（SEQID NO: 30）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图23为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF7（SEQID NO: 31）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图24为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF8（SEQID NO: 32）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图25为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF9（SEQID NO: 33）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图26为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF10（SEQ ID NO: 34）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图27为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF11（SEQ ID NO: 35）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图28为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF12（SEQ ID NO: 36）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱，及相对蛋白质丰度在有/无蛋白酶体抑制剂共孵育下的变化的结果示意图。
图29为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF13（SEQ ID NO: 37）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图30为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶DCAF14（SEQ ID NO: 38）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图31为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶CDC20（SEQID NO: 39）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
图32为在与对照肽段（不与纳米抗体结合）或ALFA肽段融合的E3连接酶KEAP1（SEQID NO: 40）存在下不同靶蛋白与NbALFAK2R融合蛋白的降解谱结果示意图。
具体实施方式
定义
术语“泛素连接酶”是指促进泛素向特异性底物蛋白质转移、靶向底物蛋白质用于降解的蛋白质家族。例如，小脑蛋白是单独或与E2泛素结合酶组合导致泛素连接到标靶蛋白质上的赖氨酸并且随后靶向特异性蛋白质底物用于通过蛋白酶体降解的E3泛素连接酶蛋白质。因此，E3泛素连接酶单独或与E2泛素结合酶复合是泛素向标靶蛋白质转移的原因。一般来说，泛素连接酶参与聚泛素化，以便第二泛素连接到第一泛素；第三泛素连接到第二泛素，等等。聚泛素化标记蛋白质用于通过蛋白酶体降解。然而，存在一些限于单泛素化的泛素化事件，其中仅单一泛素通过泛素连接酶添加到底物分子。单泛素化蛋白质不被靶向到蛋白酶体用于降解，但可能反而在其细胞位置或功能方面改变，例如经由结合具有能够结合泛素的结构域的其它蛋白质。
本发明中，泛素依赖性蛋白水解是真核细胞用来降解细胞内蛋白质的一种主要的分解代谢途径。有3类酶协同催化蛋白泛素化：E1泛素活化酶、E2泛素偶合酶，以及E3泛素连接酶（见Hochstrasser(1996)Annu Rev.Genet30:40539）。E1和E2主要涉及泛素的活化和转移，泛素途径的底物特异性由E3泛素连接酶完成。
如本发明所用，“免泛素化”是指靶蛋白上由于缺少泛素连接酶的可识别元件而无法被泛素连接酶识别，进而避免被泛素化降解。
本发明使用的“抗体”是指至少由两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的二肽链结构。所述的“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”，指具有抗原结合活性的最小抗体片段。
本发明中，“单域抗体”、“单区抗体”与“纳米抗体”互换使用。所述单域抗体可以包括其互补决定区是单域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单域抗体可以是现有技术的任何抗体，或将来的任何单域抗体。单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、山羊、兔和牛。在一些实例中，单域抗体是天然存在的单域抗体，称作缺少轻链的重链抗体。出于清楚目的，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或单区抗体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼科 （Camelidae）物种（例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼）中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体，这类VHH也涵盖在本发明的范围内。类似VH区和VL区，VHH区可以再划分为超变区，称作"互补性决定区"(CDR)，其间插有更保守的区域，称作"框架区"(FR)。框架区和CDR的范围己有多种方法定义。
如在本文中所用，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60%同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。
如在本文中所用，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞的载体，主要用于DNA或RNA的复制的载体，以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是当被引入合适的宿主细胞时可被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意味着合适的宿主细胞，其包含能够产生期望的表达产量的表达载体。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
NbALFAK2R纳米抗体为将NbALFA纳米抗体框架区的两个赖氨酸突变为精氨酸后的抗体，其抗体序列如下表1所示。
实施例中使用的HiBitK2R标签的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，其原始HiBit标签的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
实施例1
本实施例使用的HEK293T细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，USA），并使用DMEM（Gibco 11995-073）和10%浓度的胎牛血清（FBS，Gibco 10099-141C）培养。主要使用的试剂包括：Lipofectamine 3000转染试剂（Invitrogen L3000008），Opti-MEM 培养基（Gibco 31985062），Typsin细胞消化液（Gibco 25200114），HiBit试剂（Nano-Glo® HiBiT裂解检测系统，Promega N3040），MG132化合物（Selleck S2619），DMSO（Sigma D2650-5X10ML）。
转染前一天，铺板HEK293T细胞于48孔细胞培养板中，使其在转染时密度为70%-80%。转染当天，取0.06 µg表达E3连接酶-ALFA肽段融合蛋白（SEQ ID NO: 13-40）或E3连接酶-阴性对照随机肽段（control peptide，AVERYLKDQQLLGIW（SEQ ID NO: 41），不与纳米抗体NbALFAK2R结合）融合蛋白和0.06 µg表达HiBitK2R-靶蛋白-纳米抗体融合蛋白的质粒（制备方法参照https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fpcdna3_1_man.pdf，质粒骨架为pcDNA3.1，通过3’ HindIII和5’ EcoRI位点插入需表达的蛋白序列）于25 µL Opti-MEM培养基中混匀后，加入0.24 µL P3000混匀，再加入稀释了1.25 µL Lipofectamine 3000试剂的25 µL Opti-MEM培养基，室温孵育15分钟后加入48孔细胞培养板中。转染6小时后，用Typsin消化细胞，培养基重悬至1 mL，取35 µL至深孔384孔细胞培养板中。转染后24小时，每孔加入20 µL HiBit试剂，摇匀后，室温孵育20 min读取发光强度。
对于阳性组（表达HiBitK2R-靶蛋白-纳米抗体融合蛋白，靶蛋白HiBit信号降低20%），会进一步进行蛋白酶体抑制实验来验证靶蛋白水平的变化是否通过蛋白酶体降解通路实现。质粒转染实验步骤与之前一致，转染6小时后，用Typsin消化细胞，培养基重悬至1mL，并加入70 nL 2.5mM MG132（蛋白酶体抑制剂）或DMSO（阴性对照），取35 µL至深孔384孔细胞培养板中。转染后24小时，每孔加入20 µL HiBit试剂，摇匀后，室温孵育20 min读取发光强度。
检测结果
使用与NbALFAK2R融合的多种蛋白底物（包含β-catenin、KRASG12C、RAF1、FGFR1、FGFR3、SHP2、WDR5、GATA2、MCL1、Myc、SMARCA2）来评估BTRC、CRBN、FBXW7和COP1等属于SCF家族，CRL4家族，APC/C家族，CRL3家族的28个E3连接酶的蛋白降解谱。如图4所示，ALFA抗原及阴性对照随机肽段（control peptide）融合在三个E3连接酶的底物识别区，从而模拟自然底物与之的结合。其中β-catenin是BTRC的自然底物，而CRBN可以通过纳米抗体-抗原的结合有效降解RAF1，以上E3连接酶-底物蛋白的组合在assay中用被用做阳性对照。实验结果表明，融合了ALFA的BTRC、CRBN和FBXW7可以有效地降解多种靶蛋白。BTRC除了显示出对自然底物β-catenin的降解，还表现出对KRASG12C、RAF1、FGFR3、SHP2、WDR5、GATA2和SMARCA2的降解，且降解依赖蛋白酶体通路（如图5所示）。FBXW7表现出对KRASG12C、RAF1、FGFR1、FGFR3、SHP2、GATA2、SMARCA4的降解，且降解依赖蛋白酶体通路（如图9所示）。FBXW11作为BTRC的同源蛋白，表现出与BTRC类似的降解谱（如图13所示）。CRBN对所有测试的靶蛋白都有降解效果，且降解依赖蛋白酶体通路（KRASG12C存疑，如图15所示）。CRBN在所有测试的E3连接酶中表现出最为广泛的降解谱，符合针对CRBN开发的PROTAC降解谱较为广泛的性质。其他测试的E3连接酶对测试的靶蛋白没有显示出任何降解效果，或仅对个别靶蛋白有降解效果（如图6-8、10-12、14、16-32所示），表明这些E3连接酶的降解谱较窄，可能不适合用于开发针对其的PROTAC分子。

Claims (24)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含E3连接酶及插入在E3连接酶的多肽；其中，所述多肽插入在所述E3连接酶的底物识别域的无规则卷曲结构上且保留所述底物识别域的结构；
所述多肽包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
所述E3连接酶为BTRC、CRBN、FBXW7或FBXW11；
所述多肽的N端与C端分别通过连接子插入所述E3连接酶；
所述多肽在N端和C端分别添加单个脯氨酸；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、17、21或23所示；
所述插入的位置对应于如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列的第303-333位；或者
所述插入的位置对应于如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的第692-720位；或者
所述插入的位置对应于如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列的第240-268位；或者
所述插入的位置对应于如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列的第130-158位。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子为GS连接子。
3. 如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子具有如SEQ ID NO: 9-12任一所示的氨基酸序列。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白在构建泛素连接酶筛选平台或构建PROTAC筛选平台中的应用；
所述融合蛋白中的多肽与靶向所述多肽的配体结合，所述配体与靶蛋白相连，缩小E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离，从而使所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以进行泛素化降解；
所述配体为免于泛素化的配体；
所述配体为抗体，所述抗体为重链抗体；
所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的CDR3。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体的非抗原识别域的表面无自由赖氨酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体的非抗原识别域的表面的赖氨酸替换为精氨酸。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重链抗体包含如SEQ ID NO: 6所示或与SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的可变区。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白还连接标签蛋白；所述标签蛋白用于靶蛋白的定量检测，并免于泛素化。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述标签蛋白为HiBit；所述HiBit包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
10.一种泛素化系统，其特征在于，所述泛素化系统由如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白、靶向所述融合蛋白中的多肽的配体，以及靶蛋白组成；
其中，所述配体为免于泛素化的配体；所述靶蛋白与靶向多肽的配体连接，E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离缩小，从而使所述靶蛋白被E3连接酶的底物识别域识别进而与E3连接酶结合，所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以实现泛素化降解；
所述配体为重链抗体，所述重链抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的CDR3。
11.如权利要求10所述的泛素化系统，其特征在于，所述抗体的非抗原识别域的表面无自由赖氨酸。
12.如权利要求11所述的泛素化系统，其特征在于，所述抗体的非抗原识别域的表面的赖氨酸替换为精氨酸。
13. 如权利要求10所述的泛素化系统，其特征在于，所述重链抗体包含如SEQ ID NO:6所示或与SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的可变区。
14.如权利要求10所述的泛素化系统，其特征在于，所述靶蛋白还与标签蛋白连接；所述标签蛋白为免于泛素化的标签蛋白。
15. 如权利要求14所述的泛素化系统，其特征在于，所述标签蛋白为HiBit；所述HiBit包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
16.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或者如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统。
17.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求16所述的多核苷酸。
18.如权利要求17所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒骨架。
19.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求16所述的多核苷酸，或者如权利要求17或18所述的重组表达载体。
20.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白、如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统、如权利要求16所述的多核苷酸、如权利要求17或18所述的重组表达载体，或者如权利要求19所述的转化体。
21.一种评价E3连接酶的方法，其特征在于，所述方法包括通过如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或者如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统评价E3连接酶对靶蛋白的降解效率；
其中，所述泛素化系统中，所述多肽通过与靶向多肽的配体结合缩小E3连接酶与所述靶蛋白的空间距离，从而使所述靶蛋白携带所述E3连接酶的泛素化标记以进行泛素化降解。
22.一种E3连接酶的评估系统，其特征在于，所述评估系统包括输入模块、反应分析模块和判断输出模块；其中，所述输入模块向所述反应分析模块输入如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统，所述泛素化系统在所述反应分析模块中对靶蛋白进行泛素化，并分析所述靶蛋白在泛素化前后的含量数据传递给判断输出模块；所述判断输出模块根据所述靶蛋白在泛素化前后的含量数据，判断使用的E3连接酶对所述靶蛋白的降解作用；
其中，当所述靶蛋白在泛素化后的含量低于泛素化前的含量的80%，且靶蛋白含量的降低能够被蛋白酶抑制剂抑制时，判断E3连接酶对所述靶蛋白有降解作用，否则E3连接酶对所述靶蛋白没有降解作用。
23.一种如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统、如权利要求16所述的多核苷酸、如权利要求17或18所述的重组表达载体、如权利要求19所述的转化体、如权利要求20所述的试剂盒或者如权利要求22所述的评估系统在构建泛素连接酶筛选平台或构建PROTAC筛选平台中的应用。
24.一种如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白、如权利要求10-15任一项所述的泛素化系统、如权利要求16所述的多核苷酸、如权利要求17或18所述的重组表达载体、如权利要求19所述的转化体、如权利要求20所述的试剂盒或者如权利要求22所述的评估系统在制备调控蛋白胞内表达水平的试剂中的应用。
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