CN118475695A

CN118475695A - Unc13a反义寡核苷酸

Info

Publication number: CN118475695A
Application number: CN202280056776.8A
Authority: CN
Inventors: 张文轩; 贾斯汀·K·伊奇达
Original assignee: Akulastrom Co
Current assignee: Akulastrom Co
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2024-08-09

Abstract

本发明涉及UNC13A隐秘外显子反义寡核苷酸(ASO)、含有其的药物组合物以及用其治疗、抑制、遏制和预防神经系统疾病的方法。

Description

UNC13A反义寡核苷酸

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年7月21日提交的美国临时申请第63/203,409号和2022年5月17日提交的美国临时申请第63/364,830号的权益，所述临时申请各自特此以引用的方式整体并入。

发明领域

本发明涉及UNC13A隐秘外显子反义寡核苷酸(ASO)、含有其的药物组合物以及用其治疗、抑制、遏制和预防神经系统疾病或神经退行性疾病的方法。

发明背景

患者的许多神经退行性病症难以有效治疗，尤其是在特定患者的神经退行性病症的病理学尚未完全了解的情况下。

UNC13A属于最初在秀丽隐杆线虫中发现的一个基因家族，并根据具有这些基因突变的动物由于神经递质释放缺陷而表现出的不协调(unc)运动而命名。UNC13A编码在神经系统中表达的大型多域蛋白，其在神经系统中定位于神经肌肉接头，并在突触小泡融合之前的小泡启动步骤中发挥重要作用。UNC13A基因内的变异会增加肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的风险，这两种相关的神经退行性疾病是由RNA结合蛋白TDP-43的错误定位定义的。Rosa Ma等人，https：//doi.org/10.1101/2021.04.02.438213，bioRxiv，2021年4月4日。

肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)是由多种不同遗传病因引起的复杂疾病。尽管针对特定因果突变(例如C9ORF72反义寡核苷酸(ASO))的治疗策略可能对个别形式的ALS或FTD有效，但这些方法无法解决绝大多数遗传病因未知的病例。此外，考虑到可能导致ALS和FTD的不同基因数量众多，并且每种基因形式都相对罕见，此策略可能难以在所有病例中实施。因此，迫切需要新的治疗策略来挽救多种形式的ALS和FTD，特别是那些遗传病因未知的患者。

最近对Mayo Clinic银行的205名患有TDP-43病理的FTD的患者进行了分析，根据UNC13A基因型对病例进行了分层，并且结果显示携带UNC13A风险等位基因的个体的生存时间呈剂量依赖性缩短(Rosa Ma等人，Nature，603：124-130，2022)。具有两个风险等位基因的患者的中位生存时间比具有正常转录物的患者短3年。同样，UNC13A的变体会增加ALS的风险(Brown等人，Nature，603：131-137，2022)。TDP-43耗竭诱导UNC13A中隐秘外显子的大量包涵，导致UNC13A蛋白无义介导的衰变和丢失(同上)。

国际公开案第WO 2022/122872号描述了特定的反义寡核苷酸，据说其能够通过防止UNC13A隐秘外显子包涵至UNC13A成熟mRNA中来调节剪接。

许多神经退行性病症仍需要有效的治疗，例如肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

发明内容

本发明涉及UNC13A隐秘外显子反义寡核苷酸(ASO或UNC13A ASO)、含有其的药物组合物以及其在治疗神经退行性病症中的用途。特别地，本文所述的ASO针对UNC13A的规范外显子20与21之间的隐秘外显子，并导致UNC13A转录物中隐秘外显子的排除并增加UNC13A蛋白表达。

一个实施方案是遏制UNC13A表达的单链ASO，其中ASO具有包含SEQ ID NO：1-1282的任何核碱基序列的至少12或15个连续核碱基的核碱基序列。ASO还可以是SEQ ID No：1-1282中的任一者。在优选的实施方案中，单链ASO具有包含SEQ ID NO：4-6、9-11、22-25、53、55、359或360的任何核碱基序列的至少12或15个连续核碱基的核碱基序列。在另一优选的实施方案中，单链ASO具有包含SEQ ID NO：4-6、9-11、22-25、53、55、359或360的任何核碱基序列的连续核碱基的核碱基序列。在另一优选的实施方案中，ASO是SEQ ID NO：645-647、650-652、663-666、694、696、1000和1001中的任一者。

另一实施方案是由12至30个键联核苷组成并具有包含SEQ ID NO：1-1282的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列的寡核苷酸。

在某些实施方案中，ASO或寡核苷酸中的至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联，并且修饰的核苷间键联可以是硫代磷酸酯核苷间键联或磷酸二酯核苷间键联。至少一种核苷也可以是修饰的核碱基。

在其它实施方案中，ASO的至少一个核苷可以是修饰的糖部分，其中所述修饰的糖部分可以是双环糖部分，或者所述修饰的糖部分可包含2′-O-甲氧基乙基。在某些方面，双环糖部分包含4′-CH(R)-O-2′桥，其中R基团独立地为H、C_1-12烷基或保护基。

在一个优选的实施方案中，ASO是空间阻断ASO。空间阻断ASO与靶RNA结合，并在空间上拒绝其它分子与RNA进行碱基配对。在一个实施方案中，ASO中的每个核苷具有2′-修饰的糖部分，例如具有2′-O-甲氧基乙基的糖部分，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。

在某些其它实施方案中，寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1-1282中的任一者至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。

在其它实施方案中，寡核苷酸由12至30个键联核苷组成并具有包含SEQ ID NO：1-1282的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列的寡核苷酸。

在一个实施方案中，ASO或寡核苷酸与SEQ ID NO：1207(chr19：17641557-17642844)100％互补。

另一实施方案是包含本发明的UNC13A ASO和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物适合肠胃外施用，例如脑室内注射或鞘内施用。

另一实施方案是一种通过向受试者施用治疗有效量的UNC13A ASO或本文所述的药物组合物来治疗患有神经系统疾病或神经退行性疾病的受试者的方法。一个实施方案是一种通过向有需要的受试者施用治疗有效量的UNC13A ASO或本文所述的药物组合物来治疗有需要的受试者的肌萎缩侧索硬化症(ALS)的方法。另一实施方案是一种通过向有需要的受试者施用治疗有效量的UNC13A ASO或本文所述的药物组合物来治疗有需要的受试者的额颞叶痴呆(FTD)的方法。

另一实施方案是一种通过向受试者施用治疗有效量的UNC13A ASO或本文所述的药物组合物来治疗患有UNC13A疾病或病症的受试者的方法。

另一实施方案是一种通过向有需要的受试者施用有效量的UNC13A ASO或本文所述的药物组合物来增加受试者中的UNC13A蛋白表达的方法。

在本文所述的任何方法的一个实施方案中，受试者具有与rs12973192(C＞G)、rs12608932(A＞C)或两者相关的SNP变体。具有在两个SNP上都具有突变的等位基因的受试者可能对治疗表现出更强的反应。

附图简述

当结合附图考虑时，通过参考以下详细描述可更好地理解本发明以及其许多附带优点，因此将容易获得对本发明以及其许多附带优点的更完整的理解，在附图中：

图1是显示在使用TDP-43 siRNA的健康对照系中用ASO处理后UNC13A隐秘外显子(CE)的mRNA水平的图表。为进行筛选，将14天的Ngn2诱导神经元(Ngn2-iN)用TDP-43 siRNA(siTDP-43)处理7天。qRT-PCR以n＝4次生物学重复进行。平均值+/- s.e.m。使用单因素方差分析进行统计分析。p值*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。“NCASO”是指阴性对照ASO。

图2显示ASO相对于隐秘外显子、TDP-43结合位点以及相对于SNP rs12608932和rs12973192的位置。

图3A是显示在一个等位基因上携带风险单倍型(注释为+/-)的散发性ALS患者系中用ASO治疗后UNC13A CE的mRNA水平的图表。qRT-PCR以n＝4次生物学重复进行。平均值+/- s.e.m。使用单因素方差分析进行统计分析。p值*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。

图3B是显示在一个等位基因上携带风险单倍型(注释为+/-)的散发性ALS患者系中用ASO治疗后UNC13A的mRNA水平的图表。qRT-PCR以n＝4次生物学重复进行。平均值+/-s.e.m。使用单因素方差分析进行统计分析。p值*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。

图3C是显示在不携带UNC13A SNP(C9ALS-SNP-/-)的一个C9ALS患者系中用ASO治疗后UNC13A CE的mRNA水平的图表。qRT-PCR以n＝4次生物学重复进行。平均值+/- s.e.m。使用单因素方差分析进行统计分析。p值*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。

图3D是显示在不携带UNC13A SNP(C9ALS-SNP-/-)的一个C9ALS患者系中用ASO治疗后UNC13A的mRNA水平的图表。qRT-PCR以n＝4次生物学重复进行。平均值+/- s.e.m。使用单因素方差分析进行统计分析。p值*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。

图3E是蛋白质印迹，其中与阴性对照siRNA相比，TDP-43 siRNA降低了UNC13A的蛋白质表达，其中所述效果可通过UNC13A ASO来挽救。

图3F是显示与阴性对照siRNA相比，TDP-43蛋白水平被TDP-43 siRNA(siTDP-43)显著降低的图表。进行单因素方差分析以获得统计显著性。

图3G是显示与阴性对照siRNA相比，UNC13A蛋白水平被TDP-43KD显著降低并被ASO处理所挽救的图表。进行单因素方差分析以获得统计显著性。

图4A是显示靶向UNC 13A隐秘外显子的效率高度依赖于序列并且没有表现出一致的模式的图表。在收集RNA之前，用10μM ASO处理Ngn2诱导的皮质兴奋性神经元七天。所有ASO均具有2MOE修饰的碱基和硫代磷酸酯键。倍数变化是相对于TDP-43 siRNA+NCASO处理组而言的，所述处理组在图表中未示出。

图4B是显示靶向UNC13A隐秘外显子的效率高度依赖于序列，并且即使在相同ASO(ASO 55)的变体中也没有表现出一致的模式的另一图表。在收集RNA之前，用10μM ASO处理Ngn2诱导的皮质兴奋性神经元七天。显示的所有ASO均具有2MOE修饰的碱基和硫代膦酸酯键联。

图4C是显示使用邓尼特氏多重比较测试将所有测试组与siTDP43+NCASO组进行比较的单因素方差分析的图表。所有结果的p值均＜0.0001。所述图表显示，靶向UNC13A隐秘外显子的效率高度依赖于序列，并且没有表现出ASO 55变异之间一致的模式。

图4D是显示使用邓尼特氏多重比较测试将所有测试组与siTDP43+NCASO组进行比较的单因素方差分析的图表。仅ASO 55_12-9组显示显著差异(p＜0.0001)。然而，如果除去ASO 55_12-9和55_12-8组，则ASO 37、55、55_12-1、55_12-2、55_12-4和siNC+NCASO相对于参考组显示出显著差异。

图4E是显示使用邓尼特氏多重比较测试将所有测试组与siTDP43+NCASO组进行比较的单因素方差分析的图表，表明靶向UNC13A隐秘外显子的效率是高度序列依赖性的并且没有表现出ASO 55变异之间一致的模式。

图4F是显示靶向UNC13A隐秘外显子的效率高度依赖于序列，并且没有表现出ASO55变异之间一致的模式的图表。如表所示，蓝色序列在6个ASO中是相同的，并且红色序列在3个ASO中进行了测试。对于ASO-55的12聚体型式，序列的组成高度相似，但跳过UNC13A CE的能力有很大不同。在收集RNA之前，用10μM ASO处理Ngn2诱导的皮质兴奋性神经元七天。所有ASO均具有2MOE修饰的碱基和硫代膦酸酯键。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。以下描述优选的方法和材料，尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的而不是旨在限制。本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不旨在限制。

定义

本文使用的术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有”、“可以(may)”和其变化形式旨在表示不排除额外行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或单词。

除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。

本公开还考虑了“包括”本文呈现的实施方案或元件、“由其组成”和“基本上由其组成”的其它实施方案，无论是否明确阐述。

如本文所用，“2′-脱氧核苷”意指包含如在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)和核碱基中所发现的2′-H(H)呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2′-脱氧核苷可包含修饰的核碱基和呋喃糖基糖部分或可包含RNA核碱基(尿嘧啶)呋喃糖基糖部分。

如本文所用，“2′-取代的核苷”意指包含2′-取代的糖部分的核苷。如本文所用，关于糖部分的“2′-取代的”意指包含至少一个除H或OH之外的2′-取代基的糖部分。

如本文所用，“反义分子”意指能够实现至少一种反义活性的寡聚核酸或寡聚双链体。

与数量相关使用的修饰语“约”包括所述值，并且具有上下文所规定的含义(例如，其至少包括与特定数量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”也应被视为公开了由两个端点的绝对值定义的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了范围“2至4”。术语“约”可指指定数字的正负10％。例如，“约10％”可表示9％至11％的范围，并且“约1”可表示0.9-1.1。“约”的其它含义可从上下文中显而易见，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可表示0.5至1.4。

针对本文中数值范围的叙述，明确涵盖具有相同精确度的介于其间的每个数字。例如，针对6-9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且针对6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

如本文所用，“双环糖”或“双环糖部分”意指包含两个环的修饰的糖部分，其中第二环经由连接第一环中的两个原子的桥形成，从而形成双环结构。在某些实施方案中，双环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施方案中，双环糖部分不包含呋喃糖基部分。如本文所用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。

如本文所用，“手性富集群体”意指具有相同分子式的多个分子，其中群体内在特定手性中心处含有特定立体化学构型的分子的数量或百分比大于特定手性中心是立体无规时预期在群体内的相同特定手性中心处含有相同特定立体化学构型的分子的数量或百分比。每个分子内具有多个手性中心的手性富集分子群体可含有一个或多个立体随机手性中心。在某些实施方案中，分子是修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，分子是包含修饰的寡核苷酸的化合物。

如本文所用，关于寡核苷酸的“互补”意指所述寡核苷酸或其一个或多个区域的至少70％的核碱基以及另一种核酸或其一个或多个区域的核碱基能够在寡核苷酸和其它核酸的核碱基序列以相反方向排列时彼此形成氢键结。互补核碱基意指能够彼此形成氢键的核碱基。互补核碱基对包括腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)；腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)；胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)；以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)。互补寡核苷酸和/或核酸不需要在每个核苷处具有核碱基互补性。相反，容忍一些错配。如本文所用，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意指寡核苷酸在寡核苷酸的每个核苷处与另一寡核苷酸或核酸互补。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种类型的修饰的糖和/或未修饰的糖部分，其沿着寡核苷酸或其区域以限定的模式或糖基序排列。在某些情况下，此类糖基序包括但不限于本文讨论的任何糖修饰。

在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成。在此类实施方案中，修饰的寡核苷酸的完全修饰区域的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，整个修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中完全修饰的区域内的每个核苷包含相同的修饰的糖部分，在本文中称为均匀修饰的糖基序。在某些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸是均匀修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，均匀修饰的寡核苷酸的每个核苷包含相同的2′-修饰。

如本文所用，“抑制”是指基本上拮抗、阻止、防止、遏制、约束、减缓、破坏、改变、消除、停止或逆转特定因子(例如感染因子)或疾病的活性的进展或严重性的能力。

如本文所用，术语“核苷间键联”是寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。如本文所用，“修饰的核苷间键联”意指除了磷酸二酯核苷间键联之外的任何核苷间键联。“硫代磷酸酯键联”是修饰的核苷间键联，其中磷酸二酯核苷间键联的非桥接氧原子之一被硫原子取代。

在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核苷可使用任何核苷间键联连接在一起。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类核苷间键联基团。代表性的含磷核苷间键联包括但不限于含有磷酸二酯键(也称为未修饰的或天然存在的键联)的磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯或其它烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。代表性的不合磷的核苷间键联基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-)、硫代二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH₂-O-)；和N，N′-二甲基肼(-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-)。与天然存在的磷酸酯键联相比，修饰的核苷间键联可用于改变、典型地增加寡核苷酸的核酸酶抗性。制备含磷和不含磷核苷间键联的方法是本领域技术人员熟知的。

具有手性中心的代表性核苷间键联包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。包含具有手性中心的核苷间键联的修饰的寡核苷酸可制备为包含立体随机核苷间键联的修饰的寡核苷酸群体，或包含特定立体化学构型的硫代磷酸酯键联的修饰的寡核苷酸群体。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体包含硫代磷酸酯核苷间键联，其中所有硫代磷酸酯核苷间键联都是立体随机的。这种修饰的寡核苷酸可使用合成方法产生，所述方法导致每个硫代磷酸酯键联的立体化学构型的随机选择。尽管如此，如本领域技术人员所熟知，每个单独的寡核苷酸分子的每个单独的硫代磷酸酯具有确定的立体构型。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸包含处于特定的、独立选择的立体化学构型的一个或多个特定硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少65％的分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少70％的分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少80％的分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少90％的分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少99％的分子中。这种手性富集的修饰的寡核苷酸群体可使用本领域已知的合成方法产生，例如以下各者中所述的方法：Oka等人，JACS 125，8307(2003)；Wan等人，Nuc.Acid.Res.42，13456(2014)；Locked Nucleic Acid Aptamers第10章，Nucleic Acid and Peptide Aptamers：Methods and Protocols v 535，2009，Barciszewski等人，Gunter Mayerand编；以及WO 2017/015555。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集具有至少一种(Sp)构型的指定硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。在另一实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集具有至少一种(Rp)构型的指定硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。

如本文所用，“MOE”是指甲氧基乙基。“2′-MOE”是指呋喃糖基环2′位的-OCH₂CH₂OCH₃基团。

“神经系统疾病”是指导致大脑、脊柱或神经元中的电、生化或结构异常的任何疾病。例如，神经系统疾病可以是神经退行性疾病。例如，神经退行性疾病可能导致运动神经元变性。例如，神经系统疾病可以是肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)或额颞叶痴呆。神经系统疾病的进一步实例包括但不限于例如帕金森氏病(Parkinson’s disease)、慢性创伤性脑病、多发性硬化症、外周肌病、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen’s encephalitis)、注意力缺陷多动障碍、自闭症、中枢性疼痛综合征、焦虑症和/或抑郁症。在一个实施方案中，患者患有其中发生TDP-43耗竭的神经系统疾病。

神经系统疾病可能与异常的内体运输有关。例如，内体途径和内体是膜结合蛋白的再循环或分解、高尔基体相关蛋白的运输以及外泌体中蛋白质的细胞外释放的必要组成部分。例如，这些过程有助于神经传递并推动突触小泡或神经递质受体的再循环与降解之间的平衡。

神经系统疾病可能与异常的溶酶体降解有关。溶酶体降解的改变可能存在于神经系统疾病，例如神经退行性疾病中。衰老和与年龄相关的疾病期间的组织蛋白酶失衡可能会对中枢神经系统(CNS)神经元产生有害影响，并且溶酶体可能是膜蛋白或其前体的展开和部分降解的位点，所述膜蛋白或其前体随后从细胞中排出，或从死亡细胞中释放并积累为病理实体。

医疗保健专业人员可通过评估运动神经元变性的一种或多种症状来诊断受试者患有与运动神经元变性相关的疾病。为了诊断神经系统疾病，体检后可能会进行彻底的神经系统检查。神经系统检查可评估运动和感觉技能、神经功能、听力和言语、视力、协调和平衡、精神状态以及情绪或行为的变化。与神经系统疾病相关的疾病的非限制性症状可能是手臂、腿、脚或脚踝无力；言语含糊不清；抬起脚前部和脚趾有困难；手无力或笨拙；肌肉麻痹；肌肉僵硬；不自觉的抽搐或书写动作(舞蹈症)；肌肉不自主、持续性挛缩(肌张力障碍)；运动迟缓；失去自动动作；姿势和平衡受损；缺乏灵活性；身体部位有刺痛感；头部运动时产生的电击感；手臂、肩膀和舌头抽搐；吞咽困难；呼吸困难；咀嚼困难；视力部分或完全丧失；复视；眼球运动缓慢或异常；震颤；不稳定步态；疲劳；记忆丧失；头晕；难以思考或集中注意力；阅读或写作困难；对空间关系的误解；迷失方向；沮丧；焦虑；难以做出决定和判断；失去冲动控制；难以计划和执行熟悉的任务；攻击性；易怒；社交退缩；情绪波动；失智；睡眠习惯的改变；神志恍惚；和食欲改变。

可进行测试来判断可能具有与神经系统疾病相似症状的疾病和病症、测量肌肉受累情况、评估神经元变性。测试的非限制性实例是肌电图(EMG)；神经传导速度研究；血液、尿液或其它物质的实验室测试；磁共振成像(MRI)；磁共振波谱；肌肉或神经活检；经颅磁刺激；基因筛检；X射线；透视；血管造影；计算机断层扫描(CT)；正电子发射断层扫描；脑脊液分析；鞘内增强CT扫描；脑电图；眼震电图描记；诱发反应；多导睡眠图；热成像；和超声波。医疗保健专业人员还可评估患者的运动神经元变性相关疾病家族史，并部分根据神经系统疾病家族史做出诊断。医疗保健专业人员可在受试者出现一种或多种症状后诊断与神经系统疾病相关的疾病。

神经退行性疾病会导致神经元进行性破坏，从而影响神经元信号传导。例如，神经退行性变可以是肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich’s ataxia)、路易体氏病(Friedreich’s ataxia)、帕金森氏病、脊髓肌萎缩、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、进行性延髓麻痹和假性延髓麻痹。

与运动神经元变性相关的疾病可能是导致运动神经元进行性破坏，从而干扰向肌肉发出的神经元信号传导，导致肌肉无力和消瘦的病况。在健康个体中，上运动神经元将信号从大脑传递至脑干和脊髓中的下运动神经元，然后下运动神经元将信号传递至肌肉，从而产生随意肌肉活动。上运动神经元和下运动神经元的破坏会影响诸如呼吸、说话、吞咽和行走等活动，并且随着时间的推移，这些功能可能会丧失。运动神经元疾病的实例包括但不限于肌萎缩侧索硬化症、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、进行性延髓麻痹和假性延髓麻痹。

当兴奋性神经递质谷氨酸的受体(谷氨酸受体)，例如NMDA受体和AMPA受体被过量的谷氨酸或作用于谷氨酸受体的其它化合物或神经递质过度激活时，可能会发生神经元过度兴奋。兴奋性毒性可能由神经元过度兴奋引起。兴奋性毒性是神经细胞因过度刺激而受损或死亡的病理过程。过度刺激会使高水平的钙离子(Ca²⁺)进入细胞。Ca²⁺流入细胞会激活多种酶，包括磷脂酶、核酸内切酶和蛋白酶，例如钙蛋白酶。这些酶会损害细胞结构，例如细胞骨架、细胞膜和DNA的组分。

神经元过度兴奋可能与以下各者有关：脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤、听力损失(由于噪音过度暴露或耳毒性)、癫痫、疼痛性神经病、注意力缺陷多动障碍、自闭症、中枢性疼痛综合征、神经退行性疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、额颞叶痴呆、精神分裂症、拉斯穆森氏脑炎、亨廷顿氏病、酗酒或酒精戒断，特别是苯二氮卓类药物戒断过快，以及亨廷顿氏病。导致神经元周围谷氨酸浓度过高的其它常见病况是低血糖。血糖是从NMDA和AMPA受体位点的突触间间隙中去除谷氨酸的主要方法。

如本文所用，“非双环修饰的糖部分”意指如下的修饰的糖部分：包含不在糖的两个原子之间形成桥以形成第二环的修饰，例如取代基。

如本文所用，“核碱基”意指未修饰的核碱基或修饰的核碱基。如本文所用，“未修饰的核碱基”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或鸟嘌呤(G)。如本文所用，“修饰的核碱基”是除未修饰的A、T、C、U或G之外的能够与至少一个未修饰的核碱基或修饰的核碱基配对的一组原子。“5-甲基胞嘧啶”或“mC”是修饰的核碱基。通用碱基是一种修饰的核碱基，其可与五个未修饰的核碱基中的任一者配对。如本文所用，“核碱基序列”意指独立于任何糖或核苷间键联修饰的核酸或寡核苷酸中的连续核碱基的顺序。

在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一种或多种包含未修饰的核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一种或多种包含修饰的核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一种或多种不包含核碱基的核苷，称为脱碱基核苷。

在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基、8-氮杂和其它8-取代的嘌呤、5-卤基(特别是5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、2-N-异丁酰鸟嘌呤、4-N-苯甲酰胞嘧啶、4-N-苯甲酰尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰尿嘧啶、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸扩展碱基和氟化碱基。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1，3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-clamp)。修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的核碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括公开于美国专利第3,687,808号中的那些；公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley&Sons，1990，858-859；Englisch等人.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613；Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993，273-288中的那些；以及公开于第6和15章，Antisense Drug Technology，Crooke S.T.编，CRC Press，2008，163-166和442-443中的那些。

如本文所用，“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地是未修饰的或修饰的。如本文所用，“修饰的核苷”意指包含修饰的核碱基和/或修饰的糖部分的核苷。修饰的核苷包括无碱基核苷，其缺乏核碱基。“键联核苷”是以连续序列连接的核苷(即，键联的核苷之间不存在额外的核苷)。

如本文所用，“寡聚化合物”意指寡核苷酸和任选的一个或多个额外特征，例如缀合物基团或末端基团。寡聚化合物可与与第一寡聚化合物互补的第二寡聚化合物配对，或可不配对。“单链寡聚化合物”是不配对的寡聚化合物。术语“寡聚双链体”意指由具有互补核碱基序列的两种寡聚化合物形成的双链体。寡聚双链体的每种寡聚化合物可被称为“双链寡聚化合物”。

如本文所用，“寡核苷酸”意指通过核苷间键联连接的键联核苷链，其中每个核苷和核苷间键联可以是修饰的或未修饰的。核苷间键联可以是本文所述的任何键联。除非另有说明，否则寡核苷酸由8-50个键联核苷组成。如本文所用，“修饰的寡核苷酸”意指其中至少一个核苷或核苷间键联被修饰的寡核苷酸。如本文所用，“未修饰的寡核苷酸”意指不包含任何核苷修饰或核苷间修饰的寡核苷酸。

“UNC13A”属于最初在秀丽隐杆线虫中发现的一个基因家族，并根据具有这些基因突变的动物由于神经递质释放缺陷而表现出的不协调(unc)运动而命名。UNC13A编码在神经系统中表达的大型多域蛋白，其在神经系统中定位于神经肌肉接头，并在突触小泡融合之前的小泡启动步骤中发挥重要作用。已知UNC13A基因内的变异会增加肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的风险，这两种相关的神经退行性疾病是由RNA结合蛋白TDP-43的错误定位定义的。

如本文所用，“糖部分”意指未修饰的糖部分或修饰的糖部分。上标撇号(′)用于描述核苷或核苷酸中糖的编号(核碱基位置编号时不带撇号)。仅描述糖时，不使用撇号。如本文所用，“未修饰的糖部分”意指如在RNA中发现的2-OH(H)呋喃糖基部分(“未修饰的RNA糖部分”)，或如在DNA中发现的2-H(H)部分(“未修饰的DNA糖部分”)。未修饰的糖部分在1、3和4位各有一个氢，在3位有一个氧，并且在5位有两个氢。如本文所用，“修饰的糖部分”或“修饰的糖”意指修饰的呋喃糖基糖部分或糖替代物。如本文所用，修饰的呋喃糖基糖部分意指包含非氢取代基代替未修饰的糖部分的至少一个氢的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，修饰的呋喃糖基糖部分是2-取代的糖部分。此类修饰的呋喃糖基糖部分包括双环糖和非双环糖。

在某些实施方案中，修饰的糖部分是包含具有一个或多个取代基的呋喃糖基环的非双环修饰的糖部分，其中没有一个取代基桥接呋喃糖基环的两个原子以形成双环结构。此类非桥接取代基可位于呋喃糖基的任何位置，包括但不限于2、4和/或5位处的取代基。在某些实施方案中，非双环修饰的糖部分的一个或多个非桥接取代基是支链的。适合于非双环修饰的糖部分的2-取代基的实例包括但不限于：2-F、2-OCH₃(“OMe”或“O-甲基”)和2-O(CH₂)₂OCH₃(“MOE”)。在某些实施方案中，2-取代基选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF₃、OCF₃、OC_1-10烷氧基、O-C_1-10取代的烷氧基、O-C_1-10烷基、O-C_1-10取代的烷基、S-烷基、N(R_m)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(R_m)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂ON(R_m)(R_n)或OCH₂C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中每个R_m和R_n独立地为H、氨基保护基团、或取代或未取代的C_1-10烷基，并且所述2-取代基可进一步被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO₂)、硫醇、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。适合于非双环修饰的糖部分的4′-取代基的实例包括但不限于烷氧基(例如甲氧基)和烷基。适合于非双环修饰的糖部分的5-取代基的实例包括但不限于：5-甲基(R或S)、5-乙烯基和5-甲氧基。在某些实施方案中，非双环修饰的糖部分包含多于一个非桥接糖取代基，例如2-F-5-甲基糖部分等。

在某些实施方案中，2′-取代的非双环修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的非桥接2′-取代基：F、NH₂、N₃、OCF₃、OCH₃、O(CH₂)₃NH₂、CH₂CH＝CH₂、OCH₂CH＝CH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂ON(R_m)(R_n)、O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂和N-取代的乙酰胺(OCH₂C(＝O)-N(R_m)(R_n))，其中每个R_m和R_n独立地为H、氨基保护基、或取代或未取代的C_1-10烷基。

在某些实施方案中，2′-取代的核苷非双环修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的非桥接2′-取代基：F、OCF₃、OCH₃、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂ON(CH₃)₂、O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂和OCH₂C(＝O)-N(H)CH₃(“NMA”)。

在某些实施方案中，2′-取代的非双环修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的非桥接2′-取代基：F、OCH₃和OCH₂CH₂OCH₃。

某些修饰的糖部分包含桥接呋喃糖基环的两个原子以形成第二环，从而产生双环糖部分的取代基。在某些此类实施方案中，双环糖部分在4呋喃糖环原子与2呋喃糖环原子之间包含桥。此类4至2桥接糖取代基的实例包括但不限于：4-CH₂-2、4-(CH₂)₂-2、4-(CH₂)₃-2、4-CH₂-O-2(“LNA”)、4-CH₂-S-2、4-(CH₂)2-O-2(“ENA”)、4-CH(CH₃)-O-2(称为“受限乙基”或“cEt”)、4-CH₂-O-CH₂-2、4-CH₂-N(R)-2、4-CH(CH₂OCH₃)-O-2(“受限MOE”或“cMOE”)和其类似物、4-C(CH₃)(CH₃)-O-2和其类似物、4-CH₂-N(OCH₃)-2和其类似物、4-CH₂-O-N(CH₃)-2、4-CH₂-C(H)(CH₃)-2、4-CH2-C(＝CH₂)-2和其类似物、4-C(R_aR_b)-N(R)-O-2、4-C(R_aR_b)-O-N(R)-2、4-CH₂-O-N(R)-2和4-CH₂-N(R)-O-2，其中R、R_a和R_b各自独立地为H、保护基团或C_1-12烷基。

在某些实施方案中，此类4至2桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(R_a)(R_b)]_n-、-[C(R_a)(R_b)]_n-O-、-C(R_a)＝C(R_b)-、-C(R_a)＝N-、-C(＝NR_a)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R_a)₂-、-S(＝O)_x-和-N(R_a)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每个R_a和R_b独立地为H、保护基、羟基、C_1-12烷基、取代的C_1-12烷基、C_1-12烯基、取代的C_2-12烯基、C_2-12炔基、取代的C_2-12炔基、C_5-20芳基、取代的C_5-20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-7脂环基、取代的_C5-7脂环基、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)₂-J₁)或亚硫酰基(S(＝O)-J₁)；并且J₁和J₂各自独立地为H、C_1-12烷基、取代的C_1-12烷基、C_2-12烯基、取代的C_2-12烯基、C_2-12炔基、取代的C_2-12炔基、C_5-20芳基、取代的C_5-20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C_1-12氨基烷基、取代的C_1-12氨基烷基，或保护基团。

额外的双环糖部分是本领域已知的，参见例如：Freier等人，Nucleic AcidsResearch，1997，25(22)，4429-4443；Albaek等人，J.Org.Chem.，2006，71，7731-7740；Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455456；Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.，20017，129，8362-8379；Wengel等人，美国专利第7,053,207号；Imanishi等人，美国专利第6,268,490号；Imanishi等人，美国专利第6,770,748号；Imanishi等人，U.S.RE44,779号；Wengel等人，美国专利第6,794,499号；Wengel等人，美国专利第6,670,461号；Wengel等人，美国专利第7,034,133号；Wengel等人，美国专利第8,080,644号；Wengel等人，美国专利第8,034,909号；Wengel等人，美国专利第8,153,365号；Wengel等人，美国专利第7,572,582号；以及Ramasamy等人，美国专利第6,525,191号；Torsten等人，WO 2004/106356号；Wengel等人，WO 1999/014226号；Seth等人，WO 2007/134181号；Seth等人，美国专利第7,547,684号；Seth等人，美国专利第7,666,854号；Seth等人，美国专利第8,088,746号；Seth等人，美国专利第7,750,131号；Seth等人，美国专利第8,030,467号；Seth等人，美国专利第8,268,980号；Seth等人，美国专利第8,546,556号；Seth等人，美国专利第8,530,640号；Migawa等人，美国专利第9,012,421号；Seth等人，美国专利第8,501,805号；以及Allerson等人，美国专利公开案第US2008/0039618号和Migawa等人，第US2015/0191727号。

本文中可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人类灵长类动物(例如猴子，如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在一些实施方案中，受试者可以是人类或非人类。在优选的实施方案中，受试者或患者是人类。受试者或患者可能正在接受其它形式的治疗。

除非另有定义，否则本文中可互换使用的“治疗有效量”或“有效剂量”或“有效量”意指在必要的时间段内有效实现所需治疗结果的药物剂量。有效剂量可由本领域技术人员确定，并且可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引起所需反应的能力等因素而变化。本文所用的此术语还可指在动物、哺乳动物或人类中有效产生期望的体内效果的量。治疗有效量可在一次或多次施用(例如，药剂可在疾病进展的任何阶段、在症状之前或之后等作为预防性治疗或治疗性地给予)、应用或给药中施用，并且不旨在限于特定的配制物、组合或施用途径。在本公开的范围内，药物可在受试者治疗过程中的不同时间施用。施用的时间和使用的剂量将取决于多种因素，例如治疗目标(例如治疗与预防)、受试者的状况等，并且可由本领域技术人员容易地确定。

如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”受试者是指向受试者施用本文所述的组合物或药剂，使得疾病或病症的至少一种症状被治愈、缓解、减轻、改变、补救、减少、改善或改进。治疗包括施用有效量以缓解、减轻、改变、补救、减少、改善和/或改进与疾病或病症相关的一种或多种症状。治疗可抑制与疾病或病症相关的症状的恶化或变坏。

肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的一个标志性病理特征是RNA结合蛋白TDP-43从大脑和脊髓神经元细胞核至细胞质的消耗，在细胞质中，TDP-43在超过95％的ALS病例和约45％的FTD病例中死后聚集为不溶性包涵体(Brown，同上)。TDP-43的一种主要功能是在RNA剪接过程中作为隐秘外显子(规范外显子20与21之间)包涵的阻遏物。UNC13A中的单核苷酸多态性(SNP)是与人类FTD/ALS相关的最强全基因组关联研究(GWAS)命中之一(Diekstra等人，Ann.Neurol.76，120-133，2014)。证据表明，TDP-43抑制UNC13A中的隐秘外显子剪接事件。(与正常的保守外显子不同，这些隐秘外显子潜伏在内含子中，并且通常被排除在成熟的mRNA之外)。人脑、神经元细胞系和iPSC衍生的运动神经元的细胞核中TDP-43的丢失导致UNC13A mRNA中包涵隐秘外显子并减少UNC13A蛋白表达。Rosa Ma等人，“TDP-43 represses cryptic exon inclusion in FTD/ALS gene UNC13A.”，https：//doi.org/10.1101/2021.04.02.438213，bioRxiv(2021年4月4日发布)。与人类FTD/ALS风险相关的主要变体位于隐藏内含子本身的隐秘外显子中，并且表明其在面对TDP-43功能障碍时会增加UNC13A隐秘外显子剪接。数据显示，FTD/ALS(UNC13A遗传变体)最强的遗传风险因素之一与TDP-43功能丧失之间存在直接的功能联系。

根据Rosa Ma的说法，与FTD/ALS疾病风险相关的最显著遗传变体位于隐藏隐秘外显子本身的内含子内。携带这些SNP的额颞叶变性(FTLD)伴TDP-43包涵(FTLD-TDP)患者的脑样品显示出比缺乏风险等位基因的FTLD-TDP患者更多的UNC13A隐秘外显子包含。根据Rosa Ma的说法，这些风险等位基因不足以引起隐秘外显子包涵，因为健康对照样品(GTEx)的RNA序列数据中未检测到隐秘外显子，并且功能研究表明UNC13A隐秘外显子包涵需要TDP-43功能障碍。相反，UNC13A风险等位基因发挥TDP-43功能丧失依赖性疾病调节作用。不受任何特定理论束缚，本发明人推测UNC13A蛋白表达的增加是神经退行性疾病(例如ALS和FTD)的有效治疗。

TDP-43敲除后，隐秘外显子在外显子20与21之间以两种可根据其大小区分的形式出现。一个风险SNP，rs12973192位于隐秘外显子内的16个碱基对处，另一个风险SNP位于同一内含子内隐秘外显子的供体剪接位点下游534个碱基对处。风险SNP以独立且相加的方式增加了ALS和FTD病例的皮质中隐秘外显子包涵的量。最近对377名个体(包括ALS、FTD和对照)的大脑和脊髓组织的批量RNA-seq数据中UNC13A CE包涵的分析表明，在患有TDP的ALS或FTD患者的死后组织中检测到UNC13A CE-43病理学(Brown等人，Nature 603：131-137，2022)，而不是UNC13A风险SNP携带者。隐秘外显子表达反映了TDP-43聚集和清除的已知组织分布：其对ALS脊髓和运动皮层以及FTD额叶和颞叶皮层具有特异性，但在疾病和对照的小脑中均不存在。

本文所述的治疗方法包括向有需要的受试者施用包含有效量的一种或多种反义寡核苷酸的组合物，所述组合物通过遏制、预防或抑制UNC13A的隐秘外显子的转录来治疗神经系统疾病。一种或多种反义寡核苷酸可减少或抑制神经退行性变。

在具有TDP-43病理学的ALS患者中恢复UNC13A水平可能会导致患有神经系统和神经退行性疾病(例如ALS或FTD)的患者的生存期延长数年。目前要求保护的反义寡核苷酸(ASO)可直接注射至脊髓中，并在整个中枢神经系统中实现持续的靶标接合，同时外周毒性最小。

本公开提供了可用于调节UNC13A表达的寡核苷酸(修饰的或未修饰的)。表1提供了本公开的人UNC13A反义寡核苷酸或抑制性核酸的碱基的通用序列(5′至3′)。

当TDP-43功能失调时，与ALS/FTD易感性相关的UNC13A风险单倍型会增强隐秘外显子包涵。UNC13A中与ALS/FTD相关的SNP包括rs12608932和rs12973192。rs12608932(A＞C)和rs12973192(C＞G)均位于被发现含有隐秘外显子的同一内含子中。图2显示ASO相对于隐秘外显子、TDP-43结合位点以及相对于SNP rs12608932和rs12973192的位置。

表1

如图4A-4F中所示，上文列出的ASO 55(SEQ ID.NO.55)变体替代标记如下，以便更清楚地鉴定为ASO 55的变体：

在一个实施方案中，本公开提供由12-30个键联核苷组成并具有包含表1中的SEQID NO：1-641的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核苷酸碱基的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸与包含SEQID NO：1-641或由其组成的任何序列至少80％至100％(即，80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或100％；或任何前述值之间的任何数值范围或值)同一。表1中提供的序列可用于设计用于抑制UNC13A隐秘外显子表达的反义分子。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单链的。在一些实施方案中，寡核苷酸包含中和寡核苷酸上的电荷的部分或与所述部分复合，以促进跨细胞膜的摄取和转移。

在另一实施方案中，表1中的每个ASO具有基序，其中每个核碱基具有2′-OCH₂CH₂-OCH₃基团(即，2′-MOE)并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。这将是所述基序：2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE*2MOE，其中(i)2MOE是具有2’-OCH₂CH₂-OCH₃基团的核碱基(即2′-MOE)，并且(ii)星号(*)是指硫代磷酸酯键联。下面的表2显示了此基序。

表2：UNC13A反义寡核苷酸(ASO)中的碱基序列。大写字母是2′-甲氧基乙基核糖核苷；小写字母是DNA核苷；星号(*)是硫代磷酸酯键联；没有星号的键联是磷酸二酯键联)

表2

ASO 55(SEQ ID.NO.55)变体具有以下基序：其中每个核碱基具有2′-OCH₂CH₂-OCH₃基团(即2′-MOE)并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，所述变体替代标记如下，以便更清楚地鉴定为具有前述基序和核苷间键联的ASO 55的变体：

本公开的UNC13A反义或抑制性核酸可抑制UNC13A的规范外显子20与21之间的隐秘外显子的表达并增加UNC13A蛋白表达。UNC13A反义或抑制性核酸可包括表2中列出的寡核苷酸和与其98％-99％同一的序列的任何组合。

在一个实施方案中，ASO或寡核苷酸与SEQ ID NO：1283(chr19：17641557-17642844)100％互补。

治疗方法可包括施用所公开的组合物的任何数量的方式。施用方式可包括水性、脂质、油性或其它溶液、模拟脑脊液中的溶液、乳液例如水包油乳液、脂质体、水性或油性悬浮液等。典型地，本公开的ASO将直接施用于受试者的CNS。因此，配制物或组合物将是无菌的并且更优选地适合于注射。以下配制物和方法仅是示例性的并且绝不是限制性的。

适用于肠胃外施用的配制物包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使配制物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。配制物可存在于单位剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小瓶中，并且可作为液体或在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需要在使用前即时添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。所述配制物可在预填充注射器中提供。

额外治疗剂可与所公开的一种或多种反义或抑制性核酸和组合物同时或依序施用。依序施用包括在公开的一种或多种反义或抑制性核酸或组合物之前或之后施用。在一些实施方案中，一种或多种额外治疗剂可在与所公开的一种或多种反义或抑制性核酸相同的组合物中施用。在其它实施方案中，在施用额外治疗剂与所公开的一种或多种反义或抑制性核酸之间可存在时间间隔。在一些实施方案中，将额外治疗剂与所公开的一种或多种反义或抑制性核酸一起施用可允许较低剂量的其它治疗剂和/或以较低频率的时间间隔施用。当与一种或多种其它活性成分组合使用时，本公开的一种或多种反义或抑制性核酸和其它活性成分可以比各自单独使用时更低的剂量使用。因此，本公开的药物组合物包括除了本公开的一种或多种反义或抑制性核酸之外还含有一种或多种其它活性成分的那些。上述组合包括本公开的一种或多种反义或抑制性核酸不仅与一种其它活性化合物的组合，而且还包括与两种或更多种其它活性化合物的组合。例如，本公开的化合物可与多种药物组合来治疗神经系统疾病。反义寡核苷酸可共价连接至另一种寡核苷酸，例如具有除PIKFYVE之外的靶标的寡核苷酸。反义寡核苷酸可与抗体共价键联。

所公开的一种或多种反义或抑制性核酸可与以下各者组合，但不限于此：抗胆碱能药物、抗惊厥药、抗抑郁药、苯二氮卓类、减充血剂、肌肉松弛剂、止痛剂和/或兴奋剂。其它类型的疗法和治疗包括但不限于数字通信设备、饲管、机械通气、营养支持、深部脑刺激、职业疗法、物理疗法和/或言语疗法。

所公开的组合物可掺入适合施用于受试者(例如患者，其可以是人类或非人类)的药物组合物中。药物组合物可包含载体(例如药学上可接受的载体)。在本公开的上下文中可使用任何合适的载体，并且此类载体是本领域众所周知的。载体的选择将部分地由组合物的具体用途(例如向动物施用)和用于施用组合物的具体方法来确定。因此，本发明的组合物有多种合适的配制物。

药物组合物可包含治疗有效量或预防有效量的反义寡核苷酸。组合物的治疗有效量可由本领域技术人员确定，并且可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中本公开的一种或多种反义或抑制性核酸的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所抵消的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。典型地，由于预防剂量在疾病之前或疾病早期阶段用于受试者，因此预防有效量将低于治疗有效量。

药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。根据配制者的判断，可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，例如但不限于乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如但不限于玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如但不限于羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如但不限于可可脂和栓剂蜡；油，例如但不限于花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如但不限于油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如但不限于氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer′s solution)；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒相容润滑剂，例如但不限于月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，并且脱模剂、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

所公开的一种或多种反义或抑制性核酸的施用途径以及组合物的形式将决定所使用的载体的类型。

本公开的药物组合物可以多种方式施用，其取决于需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是肠胃外的，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内施用，例如鞘内、脑室内或心室内施用。在一个实施方案中，反义或抑制性核酸通过静脉内、腹膜内、或作为推注施用或直接施用至靶器官中。在另一实施方案中，反义或抑制性核酸作为推注在鞘内或脑室内施用。

用于全身施用的载体典型地包括以下中的至少一者：溶剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、助流剂、溶剂、悬浮剂、润湿剂、表面活性剂、其组合等。组合物中的所有载体都是任选的。

合适的稀释剂包括糖，例如葡萄糖、乳糖、右旋糖和蔗糖；二醇，例如丙二醇；碳酸钙；碳酸钠；糖醇，例如甘油；甘露糖醇；和山梨糖醇。

合适的润滑剂包括二氧化硅、滑石、硬脂酸以及其镁盐和钙盐、硫酸钙；以及液体润滑剂如聚乙二醇和植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油。全身或局部组合物中润滑剂的量典型地为约5％至约10％。

合适的粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮；硅酸镁铝；淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉；明胶；黄芪胶；以及纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠。全身组合物中粘合剂的量典型地为约5％至约50％。

合适的崩解剂包括琼脂、藻酸和其钠盐、泡腾混合物、交联羧甲基纤维素、交聚维酮、羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、粘土和离子交换树脂。全身组合物中崩解剂的量典型地为约0.1％至约10％。

合适的着色剂包括例如FD&C染料的着色剂。当使用时，全身或局部组合物中着色剂的量典型地为约0.005％至约0.1％。

合适的调味剂包括薄荷醇、薄荷和水果调味剂。当使用时，全身或局部组合物中调味剂的量典型地为约0.1％至约1.0％。

合适的抗氧化剂包括丁基化羟基苯甲醚(“BHA”)、丁基化羟基甲苯(“BHT”)和维生素E。全身或局部组合物中抗氧化剂的量典型地为约0.1％至约5％。

合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。全身或局部组合物中防腐剂的量典型地为约0.01％至约5％。

合适的助流剂包括二氧化硅。全身或局部组合物中助流剂的量典型地为约1％至约5％。

合适的溶剂包括水、等渗盐水、油酸乙酯、甘油、羟基化蓖麻油、醇例如乙醇和磷酸盐缓冲溶液。全身或局部组合物中溶剂的量典型地为约0至约100％。

合适的悬浮剂包括AVICEL RC-591(来自Philadelphia，PA的FMC Corporation)和藻酸钠。全身或局部组合物中悬浮剂的量典型地为约1％至约8％。

合适的表面活性剂包括卵磷脂、聚山梨醇酯80和月桂基硫酸钠，以及来自Wilmington，Delaware的Atlas Powder Company的TWEENS。合适的表面活性剂包括公开于以下各者中的那些：C.T.F.A.Cosmetic Ingredient Handbook，1992，第587-592页；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版1975，第335-337页；和McCutcheon′sVolume 1，Emulsifiers&Detergents，1994，北美版，第236-239页。全身或局部组合物中表面活性剂的量典型地为约0.1％至约5％。

用于肠胃外、鞘内、脑室内或心室内施用的组合物和配制物可包括无菌水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。例如，鞘内脑脊液(CSF)导管可用于递送本公开的反义配制物。导管可插入L3或L4椎骨。导管的远端在鞘内空间内延伸至大约L1椎骨。将反义寡核苷酸溶解于盐水中，通过过滤灭菌，并以0.33ml/min以1.0ml体积施用，随后用0.5ml无菌水冲洗。总输注时间为4.5分钟。

虽然全身组合物中的组分的量可根据所制备的全身组合物的类型而变化，但一般来说，全身组合物包含0.01％至50％的活性化合物和50％至99.99％的一种或多种载体。用于肠胃外施用的组合物典型地包含0.1％至10％的活性物质和90％至99.9％的载体(包括稀释剂和溶剂)。

与公开的化合物结合使用的载体的量足以提供用于每单位剂量药物施用的组合物的实际量。用于制备可用于本发明方法的剂型的技术和组合物描述于以下参考文献中：Modern Pharmaceutics，第9和10章，Banker和Rhodes编(1979)；Lieberman等人，Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(1981)；以及Ansel，Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第2版，(1976)。

候选反义或抑制性核酸的体内测试可通过本领域普通技术人员已知的方式进行。例如，候选的一种或多种反义或抑制性核酸可施用于哺乳动物，例如小鼠或兔子。可通过任何被认为合适的途径向哺乳动物施用一定剂量的候选反义或抑制性核酸。接着可使用常规方法和标准来分别监测动物运动神经元活性和/或UNC13A基因或蛋白质的表达或活性减少或提高的迹象。如果需要，可将在候选反义或抑制性核酸存在下获得的结果与未用候选反义或抑制性核酸治疗的对照动物中的结果进行比较。剂量研究可在本文所述的用于鉴定能够治疗神经系统疾病的一种或多种反义或抑制性核酸的方法和/或在体内对候选反义或抑制性核酸的任何后续测试中进行或与其结合进行。医学领域的技术人员可确定一种或多种反义或抑制性核酸的适当剂量。可通过监测受试者的疾病抑制或改善迹象来确定剂量。可增加或减少剂量以获得所需的治疗频率。一种或多种反义或抑制性核酸的毒性和功效可通过细胞培养物或实验动物(例如动物)中的标准药学程序来确定，例如确定50％群体致死剂量(LD50)和50％群体治疗有效剂量(ED50)。LD50/ED50的剂量比是治疗指数，并且表示毒性作用与治疗作用之间的比值。递送系统可被设计成通过将一种或多种反义或抑制性核酸递送至特定靶标(例如，特异性递送至运动或中枢神经系统神经元)来帮助预防毒性副作用。例如，可基于临床电生理学或肌电图的结果来确定一种或多种反义或抑制性核酸的最佳剂量，以分析周围神经的兴奋性。

用于人类的剂量可通过评估从动物研究和细胞培养测定中获得的数据来确定。优选剂量具有极小的毒性或没有毒性并且包括ED50。剂量可根据剂型和施用途径而变化。对于本文所述的方法中使用的任何反义或抑制性核酸，可最初在细胞培养物中估计剂量。可在动物模型中配制剂量，其包括实现如在细胞培养物中测定的症状的半数最大抑制(LD50)的测试化合物的浓度。从细胞培养物和动物模型获得的此类信息可用于更准确地确定人类的有用剂量。

本公开提供了遏制人类细胞中UNC13A的规范外显子20与21之间的隐秘外显子的表达的ASO。随附数据表明这些ASO可能能够预防神经退行性变。

实施例

实施例1

为了评估患者神经元是否可重现隐秘外显子包涵表型，对大约80个ALS/FTD患者系的基因测序数据进行了审查，并鉴定了一名对UNC13A风险等位基因呈杂合的ALS患者。使用多西环素诱导型Ngn2方法从患者的iPSC中产生诱导的兴奋性皮质神经元(iN)。Ngn2-iN以高水平表达端脑标记Brn-2、Cux1和FoxG1，其为2/3层兴奋性皮质神经元的特征。其形成成熟的突触前和突触后特化，并在移植至小鼠大脑中时整合至现有的突触网络中。从该UNC13A风险SNP载体生成iN后，进行定量RT-PCR并确认隐秘外显子的存在。由于已知隐秘外显子包涵仅发生在死后TDP-43耗尽的细胞核中，因此对源自三个患者系的iNS进行了定量RT-PCR，其中使用siRNA降低了TDP-43表达。发现TDP-43的耗尽使隐秘外显子水平增加＞1,000倍，并且UNC13A常规转录物和蛋白质的水平显著降低(图3E-3G)。因此，在ALS和FTD疾病的背景下TDP-43水平的降低导致UNC13A mRNA中包涵隐秘外显子，从而导致UNC13A蛋白水平降低。

实施例2：ASO介导的隐秘外显子包涵遏制可挽救患者源性神经元中的UNC13A水平

ASO序列是根据外显子20与21之间的基因鉴定的，以平铺在隐秘外显子和TDP-43结合位点周围，并针对对照(NCASO)筛选隐秘外显子包涵的减少和正常转录物表达的增加(图1中的数据)。鉴定出若干有效阻断隐秘外显子包涵的ASO序列(图3A-3G)，同时还鉴定出一些不能阻断隐秘外显子包含的ASO序列。

图1和4A-4F是UNC13A外显子20-21中的ASO阻断对照(NCASO)的隐秘外显子表达的图表。

前述描述和附图应被视为仅仅是对本发明原理的说明。本发明并不旨在受限于优选实施方案，并且可以本领域普通技术人员清楚的多种方式来实现。本领域技术人员将容易想到本发明的多种应用。因此，不期望将本发明限制于所公开的具体实例或所示和所描述的精确构造和操作。相反，可采取落入本发明的范围内的所有合适的修改和等同物。本文引用的所有参考文献均以引用的方式并入。

Claims

1.一种遏制UNC13A中隐秘外显子的表达的单链反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：1-641的任何核碱基序列中的至少12个连续核碱基的核碱基序列。

2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：1-1282的任何核碱基序列的至少15个连续核碱基的核碱基序列。

3.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：4-6、9-11、22-25、53、55、359或360的任何核碱基序列的至少15个连续核碱基的核碱基序列。

4.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：1-1282中的任一者的核碱基序列。

5.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：4-6、9-11、22-25、53、55、359或360中的任一者的核碱基序列。

6.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：645-647、650-652、663-666、694、696、1000和1001中的任一者的核碱基序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有18至20个键联的核苷。

8.如前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其中至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。

9.如权利要求8所述的反义寡核苷酸，其中至少一个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

10.如权利要求8所述的反义寡核苷酸，其中每个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

11.如前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。

12.如前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖部分。

13.如权利要求12所述的反义寡核苷酸，其中所述修饰的糖部分包含2′-O-甲氧基乙基。

14.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的每个核苷包含具有2′-O-甲氧基乙基的修饰的糖部分，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

15.如前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含15至50个核苷。

16.一种药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于肠胃外递送。

18.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于脑室内或鞘内施用。

19.一种治疗患有需要治疗的神经系统疾病或神经退行性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求16-18中任一项所述的药物组合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述神经系统疾病选自由家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及家族性和散发性额颞叶痴呆(FTD)组成的组。

21.一种增加有需要的受试者中的UNC13A蛋白表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求16-18中任一项所述的药物组合物。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是通过脑室内或鞘内施用来施用。

23.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述受试者具有与rs12973192(C＞G)、rs12608932(A＞C)或两者相关的SNP变体。