CN118459836A - 一种流线型外形明胶微载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种流线型外形明胶微载体的制备方法，包括如下步骤：将明胶水溶液加入含乳化剂的油相中搅拌乳化，降温过滤后得到明胶微球，通过有机溶剂洗涤后，将明胶微球用水清洗并分散，加入交联剂反应，将反应溶液快速冷却结冰并保温交联12~48h，解冻后得到明胶微载体溶液，过滤清洗并重新分散到水中，冷冻干燥并经灭菌处理。本发明以明胶微球为原料，通过控制热传导方向和速率形成冰晶造出流线型外形明胶微载体，具有粒径可调，孔隙大小合适的优点，流线型外形可有助于降低流动阻力，适合细胞大规模培养应用。
Description
技术领域
本发明涉及明胶微载体领域，具体涉及一种流线型外形明胶微载体的制备方法。
背景技术
细胞大规模培养在生物技术中占重要地位，并已广泛用于生产各种疫苗、酶、激素、抗体、干扰素和核酸等产品。微载体的成功开发和应用使贴壁依赖型细胞的大规模高产培养成为可能。在微载体培养中，细胞在小球表面以单层形式生长，或在大孔结构的孔中以多层形式生长。微载体通常通过轻轻搅拌悬浮在培养基中。通过在悬浮培养和流化床等系统中使用微载体进行细胞培养，每毫升培养基中的细胞产量可超过一亿个，空间利用率非常高。因此，微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，已经广泛应用于培养各种类型的细胞，如间充质干细胞和Vero细胞等。
传统的细胞微载体为聚苯乙烯微载体和交联葡聚糖微载体。聚苯乙烯微球与细胞的相容性一般，因此细胞在聚苯乙烯微载体表面的粘附较慢；而且聚苯乙烯微球需要较高的转速才能均匀悬浮在培养介质中，高剪切力使得微球之间的碰撞容易损伤细胞。交联葡聚糖载体对细胞有一定的毒性，对于贴壁细胞而言，其生长速度仍不快，且其不可完全酶解，培养细胞的收获难度较大。
明胶是胶原部分水解变性而得到的蛋白质，其化学结构与胶原相似，有利于细胞增殖和黏附，具有良好的生物相容性，降解产物无毒，是理想的生物组织工程材料。采用明胶制备细胞微载体十分合适，与传统微载体相比，明胶基微载体生物相容性更优，且可完全酶解，细胞收获便利，具有更高的产率和可扩展性。为了降低培养基的搅拌速度，减少微球碰撞造成的细胞损伤，具有水滴流线型外形的微载体更具优势。因此，本发明研发一种流线型外形明胶微载体的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔明胶微载体的制备方法，用以解决现有技术中的细胞微载体问题。
本发明提供了一种多孔明胶微载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）配制1~20%浓度的明胶水溶液，配制的过程中将水溶液升温至45~65℃并持续搅拌；
（2）配制油相和乳化剂的混合溶液：将乳化剂按照浓度0.1~5%的比例与油相进行混合，并在搅拌状态下升温至45~65℃；
（3）将步骤（1）配制的明胶水溶液缓慢加入到步骤（2）配制的油相和乳化剂的混合溶液中，加入的过程中持续搅拌并维持体系温度为45~65℃，加入完成后继续搅拌5~60min获得W/O型乳液，所述明胶水溶液与油相和乳化剂的混合溶液的质量比为1:2~1:10；
（4）将步骤（3）获得的W/O型乳液降温到1~15℃并持续搅拌，使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将步骤（4）获得的明胶乳液直接过滤或加入20~200%的有机溶液破乳后过滤，将滤得的明胶微球通过有机溶剂洗涤2~6次，最后过滤收集；
（6）将步骤（5）获得的明胶微球在搅拌的状态下慢慢分散到去离子水中，过滤清洗2~6次，最后过滤收集；
将过滤收集的明胶微球不经干燥直接分散到去离子水中，可大大加快明胶微球在水中的分散速率，且避免了干燥后分散容易出现微球黏连的情况；
明胶微球经有机溶剂洗涤后不交联直接分散到去离子水中过滤，由于明胶微球不交联分散到水中时十分脆弱，一般过滤过程极其容易发生黏连，本发明通过优选滤网孔径采用重力过滤的方式实现了明胶微球不经交联在水中直接过滤，过滤过程中也没有发生任何微球黏连的情况；不交联直接过滤避免了微球在过滤前交联对最后的明胶微载体造孔的不利影响；
（7）将步骤（6）获得的明胶微球分散到去离子水中，并加入交联剂，在1~15℃的温度下反应0~24h，随后将反应溶液倒入扁平容器或圆柱状容器中；
（8）将步骤（7）中装有反应溶液的容器浸没在冷却液中2~600min，冷却液的温度-80~-5℃，使明胶溶液完全结冰后取出，并放置在-25~-5℃环境下继续交联12~48h；
将高导热扁平容器或圆柱状容器浸没在低温冷却液中快速建立降温梯度的方法使容器内明胶溶液结冰，制备的明胶多孔微载体表面孔径大小为10~40μm，孔径大小合适，孔径分布均匀，且该微载体具备流线型的形状，十分适合细胞悬浮培养；
（9）待步骤（8）交联完成后，将容器放置在常温空气或浸没在10~40℃的水溶液中，化冰后过滤回收微载体，并使用去离子水清洗2~6次；
（10）将步骤（9）获得的明胶微载体重新分散到水中，冷冻干燥并经灭菌处理后获得流线型的多孔明胶微载体。
进一步的，所述步骤（1）中明胶水溶液的明胶为A型和/或B型。
进一步的，所述步骤（2）中的油相为植物油、矿物油、石油醚、烃中的一种或几种的组合，所述烃为己烷、庚烷、环己烷、甲苯或二甲苯。
进一步的，所述步骤（2）中的乳化剂为吐温、单硬脂酸甘油酯、司班中的一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（5）中的有机溶剂为乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（6）-步骤（7）中去离子水的温度均为1~15℃。
进一步的，所述步骤（7）中的交联剂为甲醛、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、四甲基乙二胺和京尼平中的一种或几种。
进一步的，所述步骤（7）中的容器材质为玻璃、石英、金属、合金中的一种或几种的组合，容器采用高导热率的材质，避免低导热率的材质如塑料、橡胶等造孔效果差或无法造孔的问题，所述扁平容器的横截面为扁平状，具体为矩形、菱形或椭圆形，横截面内腔的长边为L，短边为D，短边的长度≤20mm，所述圆柱状容器的横截面为圆形，且内腔圆的直径≤20mm，避免了短边长度和圆的直径大于20mm导致孔结构差或无法造孔的问题。
进一步的，所述滤网的孔径为20~300μm。
采用上述本发明技术方案的有益效果是：
本发明以明胶为原料，以乳液法制球，并通过控制热传导方向和速率形成冰晶的方式制备多孔明胶微载体；
所制备的明胶微载体呈流线型多孔结构，符合流体力学特性，具有孔径大小合适、孔隙率高的优点，在搅拌状态下更容易稳定悬浮在培养介质中，更加有利于细胞贴壁生长；
多孔明胶微载体为非刚性结构，搅拌过程中微载体不会损伤细胞，天然多肽结构对细胞完全无毒，与细胞的相容性好，因此细胞在明胶微载体表面贴附速率快，细胞悬浮培养实验证明该微载体大幅提高了细胞的扩增速度；
明胶微载体采用特异性的酶（如胶原酶）可以完全降解，从而更加容易的收获贴壁细胞。
附图说明
图1-3为本发明实施例1获得的明胶微载体扫描电镜图；
图4为本发明实施例2获得的明胶微载体扫描电镜图；
图5为本发明对比例1获得的明胶微载体扫描电镜图；
图6为本发明对比例2获得的明胶微载体扫描电镜图；
图7为本发明三种扁平容器横截面示意图；
实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
(1)称量200g明胶及1.8L去离子水共同加入到5L反应釜中，将反应釜升温到45℃并设定搅拌速度60rpm，持续搅拌直到明胶完全溶解，保温待用；
（2）称量12L液体石蜡及40g乳化剂司班80共同加入到夹套反应釜中，将夹套反应釜升温到45℃并设定搅拌速度300rpm,维持搅拌30min后保温待用；
（3）重新启动夹套反应釜，设定搅拌速度200rpm，温度45℃，同时通过蠕动泵将步骤（1）5L反应釜中的明胶溶液以200ml/min速度打入到夹套反应釜中，明胶溶液加入完毕后关闭夹套反应釜的加料口，维持搅拌50min制备W/O型明胶乳液；
（4）关掉夹套反应釜的45℃热油循环泵并排除夹套中热油，然后开启5℃低温循环泵使夹套反应釜快速降温，降温完成后继续维持搅拌50min使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将夹套反应釜转速提高到400rpm并通过流量泵以10L/min的速率向夹套反应釜中加入14L 5℃的无水乙醇，加入完毕后维持搅拌5min使明胶乳液破乳，破乳后溶液通过流量泵泵入到负压过滤罐中，过滤罐罐底为孔径100μm滤网，设定负压压力0.03MPa，过滤完成后关闭过滤罐底阀门重新加入25L 5℃的无水乙醇清洗过滤，重复清洗过滤5次后在过滤罐底部获得明胶微球粉末；
（6）关掉负压过滤罐中负压，向过滤罐中重新加入50L 5℃的水并开启搅拌以100rpm的速度使明胶微球分散到水中，分散完成后关闭搅拌，开启过滤罐底部阀门使明胶微球溶液依靠重力进行过滤，过滤完成后重复水清洗操作3次，在过滤罐底部获得明胶微球；
（7）重新将过滤罐中加入10L 5℃水使明胶微球重新分散，加入100ml戊二醛溶液（25%水溶液），随后将上述溶液泵入10L扁平不锈钢容器中，扁平不锈钢容器横截面内腔短边长度为D=40mm；
（8）将容器浸没在-20℃冷却液中1h，容器内明胶分散液完全结冰，将扁平容器从冷却液中取出并放置在-20℃中继续交联48h；
（9）交联完成后将扁平容器浸没在37℃温水中15min使内部冰块完全化冰得到明胶微载体溶液，随后打开容器盖子将内部明胶微载体溶液倒入20L滤罐中负压抽滤，滤罐的滤网孔径为50μm，负压压力0.2MPa，完成后加入20L水重复清洗2次，然后将滤网收集的明胶微载体加入0.1M/L甘氨酸溶液浸泡2h，滤网过滤后，再使用水清洗3次得到明胶微载体；
（10）将明胶微载体重新分散到水中，然后冷冻干燥获得流线型多孔明胶微载体，如图1所示，明胶微载体呈流线型结构，且微载体表面孔结构均匀，如图2-3所示，孔径大小分布在10~40μm。
实施例2
(1)称量500g明胶及1.5L去离子水共同加入到5L反应釜中，将反应釜升温到45℃并设定搅拌速度60rpm，持续搅拌直到明胶完全溶解，保温待用；
（2）称量12L液体石蜡及40g乳化剂司班80共同加入到夹套反应釜中，将夹套反应釜升温到45℃并设定搅拌速度300rpm,维持搅拌30min后保温待用；
（3）重新启动夹套反应釜，设定搅拌速度200rpm，温度45℃，同时通过蠕动泵将步骤（1）5L反应釜中的明胶溶液以200ml/min速度打入到夹套反应釜中，明胶溶液加入完毕后关闭夹套反应釜的加料口，维持搅拌50min制备W/O型明胶乳液；
（4）关掉夹套反应釜的45℃热油循环泵并排除夹套中热油，然后开启5℃低温循环泵使夹套反应釜快速降温，降温完成后继续维持搅拌50min使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将夹套反应釜转速提高到400rpm并通过流量泵以10L/min的速率向夹套反应釜中加入14L 5℃的无水乙醇，加入完毕后维持搅拌5min使明胶乳液破乳，破乳后溶液通过流量泵泵入到负压过滤罐中，过滤罐罐底为孔径100μm滤网，设定负压压力0.03MPa，过滤完成后关闭过滤罐底阀门重新加入25L 5℃的无水乙醇清洗过滤，重复清洗过滤5次后在过滤罐底部获得明胶微球；
（6）关掉负压过滤罐中负压，向过滤罐中重新加入50L 5℃的水并开启搅拌以100rpm的速度使明胶微球分散到水中，分散完成后关闭搅拌，开启过滤罐底部阀门使明胶微球溶液依靠重力进行过滤，过滤完成后重复水清洗操作3次，在过滤罐底部获得明胶微球；
（7）重新将过滤罐中加入10L 5℃水使明胶微球重新分散，加入100ml戊二醛溶液（25%水溶液），随后将上述溶液泵入10L扁平不锈钢容器中，不锈钢容器内腔厚度40mm；
（8）盖上容器的盖子后将容器浸没在-20℃冷却液中1h，容器内明胶分散液完全结冰，将扁平容器从冷却液中取出并放置在-20℃中继续交联48h；
（9）交联完成后将扁平容器浸没在37℃温水中15min使内部冰块完全化冰得到明胶微载体溶液，随后打开容器盖子将内部明胶微载体溶液倒入20L滤罐中负压抽滤，滤罐的滤网孔径为50μm,负压压力0.2MPa，完成后加入20L水重复清洗2次，然后将滤网收集的明胶微载体加入0.1M/L甘氨酸溶液浸泡2h，滤网过滤后，再使用水清洗3次得到明胶微载体；
（10）将明胶微载体重新分散到水中，然后冷冻干燥获得明胶微载体，如图4所示，明胶微载体的孔径大小和形状呈不规则结构。
对比例1
(1)称量200g明胶及1.8L去离子水共同加入到5L反应釜中，将反应釜升温到45℃并设定搅拌速度60rpm，持续搅拌直到明胶完全溶解，保温待用；
（2）称量12L液体石蜡及40g乳化剂司班80共同加入到夹套反应釜中，将夹套反应釜升温到45℃并设定搅拌速度300rpm,维持搅拌30min后保温待用；
（3）重新启动夹套反应釜，设定搅拌速度200rpm，温度45℃，同时通过蠕动泵将步骤（1）5L反应釜中的明胶溶液以200ml/min速度打入到夹套反应釜中，明胶溶液加入完毕后关闭夹套反应釜的加料口，维持搅拌50min制备W/O型明胶乳液；
（4）关掉夹套反应釜的45℃热油循环泵并排除夹套中热油，然后开启5℃低温循环泵使夹套反应釜快速降温，降温完成后继续维持搅拌50min使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将夹套反应釜转速提高到400rpm并通过流量泵以10L/min的速率向夹套反应釜中加入14L 5℃的无水乙醇，加入完毕后维持搅拌5min使明胶乳液破乳，破乳后溶液通过流量泵泵入到负压过滤罐中，过滤罐罐底为孔径100μm滤网，设定负压压力0.03MPa，过滤完成后关闭过滤罐底阀门重新加入25L 5℃的无水乙醇清洗过滤，重复清洗过滤5次后在过滤罐底部获得明胶微球；
（6）关掉负压过滤罐中负压，向过滤罐中重新加入50L 5℃的水并开启搅拌以100rpm的速度使明胶微球分散到水中，分散完成后关闭搅拌，开启过滤罐底部阀门使明胶微球溶液依靠重力进行过滤，过滤完成后重复水清洗操作3次，在过滤罐底部获得明胶微球；
（7）重新将过滤罐中加入10L 5℃水使明胶微球重新分散，加入100ml戊二醛溶液（25%水溶液），随后将上述溶液倒入5个2L的不锈钢平底盘中，盘中溶液高度约50mm；
（8）将平底盘放置在-80℃低温冰箱中6-10h，容器内明胶分散液完全结冰，将平底盘从冰箱中取出并放置在-20℃中继续交联48h；
（9）交联完成后将平底盘放置在常温下并施加流动空气使平底盘内冰块完全化冰得到明胶微载体溶液，将明胶微载体溶液倒入20L滤罐中负压抽滤，滤罐的滤网孔径为50μm,负压压力0.2MPa，完成后加入20L水重复清洗2次，然后将滤网收集的明胶微载体加入0.1M/L甘氨酸溶液浸泡2h，滤网过滤后，再使用水清洗3次得到明胶微载体；
（10）将明胶微载体重新分散到水中，然后冷冻干燥获得明胶微载体，如图5所示，明胶微载体大小部分不均，且孔径大小和形状分布不均。
对比例2
(1)称量200g明胶及1.8L去离子水共同加入到5L反应釜中，将反应釜升温到45℃并设定搅拌速度60rpm，持续搅拌直到明胶完全溶解，保温待用；
（2）称量12L液体石蜡及40g乳化剂司班80共同加入到夹套反应釜中，将夹套反应釜升温到45℃并设定搅拌速度300rpm，维持搅拌30min后保温待用；
（3）重新启动夹套反应釜，设定搅拌速度200rpm，温度45℃，同时通过蠕动泵将步骤（1）5L反应釜中的明胶溶液以200ml/min速度打入到夹套反应釜中，明胶溶液加入完毕后关闭夹套反应釜的加料口，维持搅拌50min制备W/O型明胶乳液；
（4）关掉夹套反应釜的45℃热油循环泵并排除夹套中热油，然后开启5℃低温循环泵使夹套反应釜快速降温，降温完成后继续维持搅拌50min使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将夹套反应釜转速提高到400rpm并通过流量泵以10L/min的速率向夹套反应釜中加入14L 5℃的无水乙醇，加入完毕后维持搅拌5min使明胶乳液破乳，破乳后溶液通过流量泵泵入到负压过滤罐中，过滤罐罐底为孔径100μm滤网，设定负压压力0.03MPa，过滤完成后关闭过滤罐底阀门重新加入25L 5℃的无水乙醇清洗过滤，重复清洗过滤5次后在过滤罐底部获得明胶微球；
（6）关掉负压过滤罐中负压，向过滤罐中重新加入50L 5℃的水并开启搅拌以100rpm的速度使明胶微球分散到水中，分散完成后关闭搅拌，开启过滤罐底部阀门使明胶微球溶液依靠重力进行过滤，过滤完成后重复水清洗操作3次，在过滤罐底部获得明胶微球；
（7）重新将过滤罐中加入10L 5℃水使明胶微球重新分散，加入100ml戊二醛溶液（25%水溶液），随后将上述溶液泵入10个1L的圆柱形塑料（聚丙烯）容器中，塑料容器内腔直径40mm；
（8）盖上容器的盖子后将容器浸没在-20℃冷却液中6h，容器内明胶分散液完全结冰，将扁平容器从冷却液中取出并放置在-20℃中继续交联48h；
（9）交联完成后将扁平容器浸没在37℃温水中15min使内部冰块完全化冰得到明胶微载体溶液，随后打开容器盖子将内部明胶微载体溶液倒入20L滤罐中负压抽滤，滤罐的滤网孔径为50μm,负压压力0.2MPa，完成后加入20L水重复清洗2次，然后将滤网收集的明胶微载体加入0.1M/L甘氨酸溶液浸泡2h，滤网过滤后，再使用水清洗3次得到明胶微载体；
（10）将明胶微载体重新分散到水中，然后冷冻干燥获得不规则明胶微载体，如图6所示。
在本发明的优选实施例中，步骤（7）中扁平容器为矩形、椭圆形或菱形，其横截面内腔的长边为L，短边为D，短边的长度≤20mm，如图7所示。
综上，本发明实施例1制备的明胶微载体具有流线型结构，微载体大小分布均匀，且孔径大小和形状均匀分布，实施例2制备的明胶微载体不具备流线型结构，且孔径形状和大小分布不均，对比例1-2采用不锈钢平盘和塑料容器的制备方法造孔效果差，且通过空气冷冻导致微载体表面孔径很大，而且出现大量片状结构。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种流线型外形明胶微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制1~20%浓度的明胶水溶液，配制的过程中将水溶液升温至45~65℃并持续搅拌至明胶完全溶解；
（2）配制油相和乳化剂的混合溶液：将乳化剂按照浓度0.1~5%的比例与油相进行混合，并在搅拌状态下升温至45~65℃；
（3）将步骤（1）配制的明胶水溶液缓慢加入到步骤（2）配制的油相和乳化剂的混合溶液中，加入的过程中持续搅拌并维持体系温度为45~65℃，加入完成后继续搅拌5~60min获得W/O型乳液，所述明胶水溶液与油相和乳化剂的混合溶液的质量比为1:2~1:10；
（4）将步骤（3）获得的W/O型乳液降温到1~15℃并持续搅拌，使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
（5）将步骤（4）获得的明胶乳液直接过滤或加入20~200%的有机溶液破乳后过滤，将滤得的明胶微球通过有机溶剂洗涤2~6次，最后过滤收集；
（6）将步骤（5）获得的明胶微球在搅拌的状态下慢慢分散到去离子水中，过滤清洗2~6次，最后过滤收集；
（7）将步骤（6）获得的明胶微球分散到去离子水中，并加入交联剂，在1~15℃的温度下反应0~24h，随后将反应溶液倒入扁平容器或圆柱状容器中；
（8）将步骤（7）中装有反应溶液的容器浸没在冷却液中2~600min，冷却液的温度-80~-5℃，使明胶溶液完全结冰后取出，并放置在-25~-5℃环境下继续交联12~48h；
（9）待步骤（8）交联完成后，将容器放置在常温空气或浸没在10~40℃的水溶液中，化冰后过滤回收微载体，并使用去离子水清洗2~6次；
（10）将步骤（9）获得的明胶微载体重新分散到水中，冷冻干燥并经灭菌处理后获得流线型的多孔明胶微载体。
2.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中明胶水溶液的明胶为A型和/或B型。
3.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的油相为植物油、矿物油、石油醚、烃中的一种或几种的组合，所述烃为己烷、庚烷、环己烷、甲苯或二甲苯。
4.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的乳化剂为吐温、单硬脂酸甘油酯、司班中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的有机溶剂为乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）-步骤（7）中去离子水的温度均为1~15℃。
7.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的交联剂为甲醛、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、四甲基乙二胺和京尼平中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的容器材质为玻璃、石英、金属、合金中的一种或几种的组合，所述扁平容器的横截面为扁平状，具体为矩形、菱形或椭圆形，横截面内腔的长边为L，短边为D，短边的长度≤20mm，所述圆柱状容器的横截面内腔为圆形，且圆的直径≤20mm。
9.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述滤网的孔径为20~300μm。
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