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CN118440205B - 一种抗itgax抗体及其应用 - Google Patents

一种抗itgax抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗ITGAX抗体及其应用。本发明公开了一种针对ITGAX的单克隆抗体AH64D和/或人源化嵌合抗体hAH64D，本发明所提供的抗体具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述hAH64D抗体通过流式方法检测人外周血淋巴细胞表面ITGAX的方法。本发明解决了目前市场上对人外周血淋巴细胞表面ITGAX检测项目抗体原料相对短缺的问题。本发明所提供的抗体通过对人外周血淋巴细胞表面ITGAX的检测可以作为神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、纳苏‑哈科拉病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆的辅助诊断。

Description

一种抗ITGAX抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗ITGAX抗体及其应用。
背景技术
ITGAX(Integrin alpha-X，整合素α-X)，又称CD11c，是纤维蛋白原的受体。它识别纤维蛋白原中的序列G-P-R。它在炎症反应期间介导细胞间相互作用。它在单核细胞粘附和趋化性中尤为重要。是树突细胞(dendriticcell，DC)表达的特异蛋白，其与β2-整合蛋白(β2-integrin)结合介导DCs的吞噬过程。
ITGAX是一种约150kDa的I型跨膜糖蛋白，是补体受体4(CR4)的一部分。与CR3一起，也被称为Mac-1或者CD11b/CD18，CR4属于黏附分子的β2整合素家族。CR3和CR4构成异质二聚体整合膜蛋白，分别由一条CD18β链(β2)和一条整合素αM链(ITGAM,CD11b)或者一条整合素αX链(ITGAX,CD11c)组成。CR3和CR4具有重叠配体结合特异性，其胞外结构域分享87％的序列同源性。补体受体为细胞功能及可溶性成分、因子和其他相关蛋白质之间建立了一个重要的链接。因此，CR3和CR4能够结合多种配体，如纤维蛋白原或肝素。此外，CR3和CR4都与细胞黏附、迁移及吞噬作用相关。然而，虽然CR3参与了iC3b调理菌的吞噬作用，但CR4主导细胞黏附于人类单核细胞衍生的巨噬细胞和树突状细胞的纤维蛋白原上。研究数据表明应激条件下，ITGAX对造血干细胞和祖细胞(HSPSs)的调节扮演着重要的角色。
在炎症条件下，肝脏经常发现炎症群集。这些群集包括T细胞、CD11b+中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞系细胞和ITGAX+树突状细胞。ITGAX的表达是小神经胶质细胞活化的标志物，并且在阿尔茨海默病(AD)的Aβ斑块周围存在ITGAX阳性小神经胶质细胞，已在多项研究中被证明。
目前行业内并没有对ITGAX特异性较高的诊断试剂原料。由于ITGAX属于一次跨膜蛋白，只存在于细胞膜表面，外周血及体液中含量极低，传统的免疫诊断方法，如化学发光法(CLIA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法等适合外周血等体液中分泌蛋白的检测，而并不适合跨膜蛋白的检测。免疫组化方法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、灵敏度低。而流式检测(Flow)可对天然细胞膜蛋白检测，因此更适合ITGAX分析检测。
目前，亟需开发一种特异性强、灵敏度高的ITGAX抗体用于ITGAX试剂盒的开发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种抗ITGAX抗体及其应用。本发明通过提供一种与ITGAX特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其可以是单克隆抗体或人源嵌合抗体的形式。本发明所提供的抗体具有高亲和力和特异性的特点。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的第一个方面提供了一种特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含分别具有如SEQ ID NO:3-5所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的LCDR1-3，所述重链可变区VH包含分别具有如SEQ ID NO:6-8所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的HCDR1-3。
在本发明的一些实施方式中，其中所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在本发明的一些实施方式中，其中所述VL的氨基酸序列包含具有SEQ ID NO:1所示或与其具有一个或多个保守氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；所述VH的氨基酸序列包含具有SEQ ID NO:2所示或与其具有一个或多个保守氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
在本发明的一些实施方式中，其进一步包含轻链恒定区CL和/或重链恒定区CH，所述轻链恒定区CL包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链恒定区CH包含与SEQ IDNO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗体属于选自IgG的同种型。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗体属于选自IgG1亚型。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗原结合片段选自双链抗体。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗体为鼠源单克隆抗体或人源化嵌合抗体。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗体为单克隆抗体，其中所述抗体为单克隆抗体，克隆号为AH64D，其进一步包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，其中所述抗体为人源化嵌合抗体，其中所述抗体为人源化嵌合抗体，克隆号为hAH64D，其进一步包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的第二个方面提供了一种核酸，其包含编码上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸是DNA，例如cDNA或重组DNA。
本发明的第三个方面提供了一种载体，其包含上述的核酸。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，其包含上述的核酸或上述的载体。
在本发明的一些实施方式中，其中所述宿主细胞为真核细胞。
在本发明的一些实施方式中，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于293F细胞、CHO细胞。
本发明的第五个方面提供了一种杂交瘤细胞，其可以产生上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或抗原结合片段。
本发明的第六个方面提供了一种制备上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在使得所述的抗体、其抗原结合片段表达的条件下，培养上述任一项所述的宿主细胞或上述的杂交瘤细胞。
本发明的第七个方面提供了一种组合物，其包含：
(i)上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或杂交瘤细胞；
(ii)药学上可接受的载体或佐剂。
本发明的第八个方面提供了一种抗体-缀合物，其包含上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第九个方面提供了一种检测试剂，其包含上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些实施方式中，其中所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段通过荧光标记后作为特异性识别ITGAX的流式荧光检测试剂组分。
在本发明的一些实施方式中，用于荧光标记的物质包括但不限于PE、PerCP、FITC、APC。
本发明的第十个方面提供了一种上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、或检测试剂在制备用于检测样品中ITGAX含量的试剂或产品、用于对ITGAX相关疾病进行诊断的试剂或产品、或者用于对ITGAX相关疾病进行预防和/或治疗的药物中的用途。
在本发明的一些实施方式中，其中所述ITGAX相关疾病选自：白血病、肝脏炎症、神经胶质瘤、阿尔茨海默病、纳苏-哈科拉病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经炎症。
本发明的第十一个方面提供了一种上述任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞、杂交瘤细胞、组合物和/或抗体-缀合物在制备如下任一所示的产品中的应用：
(1)检测ITGAX的产品；
(2)刺激或提高免疫应答的产品；
(3)预防和/或治疗ITGAX相关疾病的产品。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
本发明提供了一种抗ITGAX的单克隆抗体，以及通过改造后的人源嵌合抗体hITGAX，避免了天然样本中的HAMA反应。本发明所提供的抗体或其抗原结合片段具有高亲和力和特异性的特点。本发明的产品解决了目前市场上ITGAX检测项目抗体原料特异性差和灵敏度低的问题。本发明所公开的抗体具有较高的灵敏度和特异性，可以作为神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、纳苏-哈科拉病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆的辅助诊断。
在筛选抗体时，本发明选用多种天然细胞抗原，对抗体特异性检测进行比较，经多轮筛选，得到AH64D是对ITGAX特异性较好的抗体。在动物免疫过程中采用皮下多次、多点注射，提高了最终动物血清的效价，提升了阳性克隆率。将HAT筛选试剂从融合当天加入推迟到第2天，使细胞阳性率得到了明显的提升。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为pCDNA3.1-ITGAX质粒构建图谱；
图2为通过SDS-PAGE实验检测ITGAX目的蛋白的纯度；
图3为根据本发明的实施例提供的杂交瘤细胞株AH64D表达的抗体的亚型鉴定及抗体可变区的克隆胶图，泳道顺序如表7所示；
图4为根据本发明的实施例提供的利用抗体AH64D构建的人源化嵌合抗体表达质粒pGmab-K-hAH64D的质粒图；
图5为根据本发明的实施例提供的利用抗体AH64D构建的人源化嵌合抗体表达质粒pGmab-H-hAH64D的质粒图；
图6为根据本发明的实施例提供的利用抗体hAH64D通过流式检测方法在检测人外周淋巴细胞表面ITGAX的应用。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
如本文所用，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
如本文所用，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
如本文所用，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在一个方面，本公开提供了特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含分别具有如SEQ ID NO:3-5所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的LCDR1-3，所述重链可变区VH包含分别具有如SEQ ID NO:6-8所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的HCDR1-3。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，所述VL的氨基酸序列包含具有SEQ ID NO:1所示或与其具有一个或多个保守氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；所述VH的氨基酸序列包含具有SEQ ID NO:2所示或与其具有一个或多个保守氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的成分如C1q(补体激活经典途径中的第一组分)。因此，大多数抗体具有共同形成与抗原结合的抗体部分的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
如本文所用，术语“抗体类似物”是指通过生物或化学方法产生的，在抗体结构的基础上，通过化学基团(如氨基酸)删减，添加，或修饰而得到的衍生物。这些衍生物仍然含有类似于抗体可变区(或抗体可变区中的CDR区)的结构，并能通过这些结构发生类似于抗原-抗体结合的反应。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间例如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方案中，与某种抗原特异性结合的抗体是指以对应于小于约10 5M，例如小于约10 6M、10 7M、10 8M、10 9M或10 10M或更小的KD的亲和力结合抗原的抗体。如本文所用，“KD”是指特定抗体抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。KD越小，抗体与抗原间的结合亲和力越高。
如本文所用，术语“抗体可变区”是指抗体重链和轻链中的一个结构域。包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。在自然界中，抗体可变区由免疫球蛋白(重链和轻链)基因中的V，D(仅重链适用)，和J片段通过基因重组拼接编码。不同的抗体之间可变区的氨基酸序列具有高度的差异性(抗体的其他区域的氨基酸序列相对高度相同)，并负责与特异的抗原决定簇识别和结合。在抗体可变区中，VL结构域和VH结构域从氨基端到羧基端都包含框架区(FR)和CDR区(comlementarity determining region)。一个典型的抗体可变区具有3个骨架区和3个CDR区，它们互相间插排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。骨架区FR主要起到蛋白质结构域框架形成的作用，而CDR区主要起到抗原-抗体特异性识别结合的作用。VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
每个VL结构域和VH结构域的氨基酸排列与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991))、Chothia定义(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901 917,1987；Chothia等人,Nature 342:878 883,1989)；ChothiaKabat CDR的复合，其中CDR H1是Chothia CDR和Kabat CDR的复合；Oxford Molecular的抗体建模软件所使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(万维网bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中的任一项定义的CDR，但是优选的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
如本文所用，术语“抗ITGAX抗体(或抗体类似物)”是以单一的(或单克隆的)形式存在的，单一的抗体(或抗体类似物)含有单一的结构(如单一的氨基酸序列)。
如本文所用，术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in MolecularBiology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80％一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏ITGAX抗体或者与ITGAX抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
因此，本发明所述的抗体也可以根据本发明提供的抗体可变区氨基酸序列直接合成出来，并且可以通过进一步化学修饰衍生成不同的抗体类似物。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，其进一步包含轻链恒定区CL和/或重链恒定区CH，所述轻链恒定区CL包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链恒定区CH包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
如本文中所用，术语“重链恒定区”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包含下述中的至少一者：CH1结构域、铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，用于本公开的抗原结合多肽可以包含：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或者包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本公开的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，用于本公开的抗体可以缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解的是，可以修饰重链恒定区，使得其在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda(λ)链和kappa(κ)链。本文公开的抗体可以是上述任何类别或亚型。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有选自IgG的同种型。在一些实施方案中，所述抗体具有选自IgG1的亚型。
如本文所用，术语“抗原结合片段”也即“抗体片段”，抗体片段通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dAb、Fab/c、互补决定区、单链抗体、双链抗体、或单域抗体分子等。其中，“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。Fab’片段，其在Fab片段的CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基；F(ab’)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab’片段的二价片段；Fd片段，其具有VH和CH1结构域；Fv片段，其在抗体的单臂中具有VL和VH结构域；dAb片段，其由VH结构域或VL结构域组成；分离的CDR区；和任何上述片段保留了抗原结合活性的修饰形式。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗原结合片段选自双链抗体。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体为鼠源单克隆抗体或人源化嵌合抗体。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体，其进一步包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体中获得的抗体。也就是说，除了可能天然存在的少量突变，构成群体的每个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。本文中的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，也不应被解释为要求通过任何特定的方法产生的抗体。
在本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体为人源化嵌合抗体，其进一步包含轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源于一种来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。“人源化嵌合抗体”是指将单克隆抗体轻链V区核酸序列和重链V区的核酸序列，通过分子克隆方法，分别插入到pGmab-K(含有人抗体kappa链恒定区)和pGmab-H(含有人抗体IgG1链恒定区)表达质粒中构建后的质粒，转染宿主细胞表达得到的抗体。本文中的术语“人源化嵌合抗体”并不限于通过本文中所述的技术产生的抗体，也不应被解释为要求通过任何特定的方法产生的抗体。
在又一方面，本发明提供了核酸，其包含编码本文公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在又一方面，本公开提供了载体，其包含本文公开的核酸。
如本文所用，术语“载体”是指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指可以连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。在一些实施方案中，载体包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)粘粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或来源于P1的人工染色体；(5)噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；(6)动物病毒，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、孢子囊病毒、痘病毒、杆状病毒。
在将本发明公开的核酸连接到载体上时，可以将核酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。
在另一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本发明公开的核酸或本发明公开的载体。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。可以将表达载体导入到宿主细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如CHO细胞，如CHOS细胞和CHO K1细胞，或HEK293细胞，如HEK293A、HEK293T和HEK293F。
在本文公开的宿主细胞的一些实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。
在本文公开的宿主细胞的一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于293F细胞、CHO细胞。
在另一方面，本公开提供了杂交瘤细胞，其可以产生本发明公开的特异性结合ITGAX的抗体或抗原结合片段。
如本文所用，术语“杂交瘤细胞”是指在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。在经典的单克隆抗体制备方法里，首先需要具备合适的抗原，并用其免疫动物。为了制备抗ITGAX的抗体(或抗体类似物)，合适的抗原必须含有ITGAX。这个抗原可以通过天然人组织或血液中分离纯化，或通过人工重组蛋白表达的方式利用原核或真核细胞表达并通过纯化获得。抗原用于动物免疫和抗体筛选检测使用。
在经典的单克隆抗体制备方法中，首先用ITGAX抗原免疫动物，并通过间隔时间采血，验证动物是否对ITGAX抗原产生了抗体反应。然后将从有抗体反应的动物的脾脏中分离出来B细胞，在体外与永生的骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。然后将这些杂交瘤细胞在培养板中极限稀释并重新生长起来(单克隆杂交瘤细胞株)，并采取这些杂交瘤细胞株的培养液上清，检测其是否含有针对抗原的特异性抗体。根据抗体产量，质量和细胞株生长特性，可以选出最佳的单克隆抗体生产细胞株，进行后续的单克隆抗体生产。
其他的方法也可以用来获取单克隆抗体。譬如，上述动物的脾脏细胞可以被分离出来，然后用标记的抗原(如荧光素标记ITGAX)与之孵育。由于产生抗体的B细胞通常会有抗体分子呈现在细胞膜表面，这些细胞会被标记的抗原结合(染色)，从而可以被荧光流式细胞分选仪分选出来。这些分选出来的B细胞的mRNA可以被分离出来，通过体外反转录和特异性PCR反应得到抗体的可变区cDNA的文库。这个cDNA文库可以被插入到表达质粒中(如适合在哺乳动物细胞表达的抗体表达质粒，或适合在细菌细胞表达的噬菌体表达质粒)，并在适合这个表达质粒的宿主细胞中进行表达。这些宿主细胞(或噬菌体)可以通过不同的方法(如前面所述的细胞极限稀释培养方法，或噬菌体斑铺板方法)被分离纯化(克隆)出来。这些细胞株或噬菌体克隆可以被用来生产抗体，并对抗体进行分析鉴定。
在又一方面，本公开提供了制备本发明所公开的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在使得所述的抗体、其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明所公开的宿主细胞或杂交瘤细胞。
在又一方面，本公开提供了组合物，其包含：(i)本发明所公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或杂交瘤细胞；和(ii)药学上可接受的载体或佐剂。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体或佐剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或此类载体或佐剂被批准或可用于包含在对人肠胃外施用的药物组合物中。
在一些实施方案中，与本文公开的组合物一起使用的载体或佐剂包括但不限于无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，当药物组合物静脉内给药时，载体可以是水。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗体片段，连同合适的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在又一方面，本公开提供了抗体-缀合物，其包含本发明所公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段。
在又一方面，本发明提供了检测试剂，其包含本发明所公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段。
在本文公开的检测试剂的一些实施方案中，其中所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段通过荧光标记后作为特异性识别ITGAX的流式荧光检测试剂组分。
在本发明的公开中，合适的用于荧光标记的物质包括但不限于PE(藻红蛋白)、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物)、FITC(异硫氰酸荧光素)、APC(别藻蓝蛋白)。
在另一方面，本公开提供了本发明所公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、或检测试剂在制备用于检测样品中ITGAX含量的试剂或产品、用于对ITGAX相关疾病进行诊断的试剂或产品、或者用于对ITGAX相关疾病进行预防和/或治疗的药物中的用途。
在本文公开的用途的一些实施方案中，所述ITGAX相关疾病选自：白血病、肝脏炎症、神经胶质瘤、阿尔茨海默病、纳苏-哈科拉病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经炎症。
在又一方面，本公开提供了本发明所公开的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞、杂交瘤细胞、组合物和/或抗体-缀合物在制备如下任一所示的产品中的应用：
(1)检测ITGAX的产品；
(2)刺激或提高免疫应答的产品；
(3)预防和/或治疗ITGAX相关疾病的产品。
本发明的抗ITGAX的抗体可以用于检测人外周血淋巴细胞表面的ITGAX，或含有ITGAX的物质，以及能与ITGAX特异结合的物质(如抗ITGAX的抗体)，检测的原理主要是基于本发明的ITGAX的抗体与ITGAX的特异性识别和结合，并利用化学标记技术(如标记抗体，或标记的特异性二抗)或物理检测技术(如光散射技术，等离子体共振技术等)进行检测。
本发明提供了抗ITGAX的单克隆抗体AH64D和/或人源化嵌合抗体hAH64D，此抗体具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述抗体的流式检测方法。本发明解决了目前市场上ITGAX检测项目抗体原料的相对短缺的问题，可作为相关神经类疾病的辅助诊断，填补国内相关市场空白。
编码本发明的抗体的重链和/或轻链的核酸在本发明的范围内，根据重链和/或轻链的氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列，如表1所示。需要说明的是，下表1列出的CDR序列是根据IMGT数据库获得的。本领域技术人员应知的是，不同数据库分析出来的CDR序列可能不一样，但是这些变化均应包含在本发明的保护范围之内。
表1不同编号对应的序列信息
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：ITGAX重组蛋白表达质粒的构建
ITGAX的核酸序列是根据NCBI Gene ID:NM_000887.5((ITGAX)序列，在合成DNA序列时,ITGAX的胞外区序列在3ˊ端被连接上一段蛋白纯化用标签序列(6×His)，DNA序列上下游分别设计EcoRI和XbaI位点。以上设计好的DNA序列交由第三方基因合成公司合成，并构建入pUC57质粒中，构建后质粒命名为pUC57-ITGAX，经NEB Cutsmart核酸内切酶体系，分别取2μg pUC57-ITGAX和pCDNA3.1质粒加入2UEcoRI和2U XbaI内切酶，37℃酶切2小时后，经1％琼脂糖凝胶分离并回收阳性条带并使用A260检测回收后的DNA片段浓度，分别取pUC57-ITGAX和pCDNA3.1质粒双酶切片段各2nmol、加入1U T4连接酶用T4连接酶缓冲液和超纯水定容至20μL，16℃过夜连接后转化入DH5α感受态细胞，并涂布于LB平板上，挑取单菌落经FCMV和SV40通用引物测序，经测序基因序列正确无误。构建的质粒被命名为pCDNA3.1-ITGAX，其结构如图1所示。
实施例2：ITGAX重组蛋白的表达与鉴定
首先，表达质粒pCDNA3.1-ITGAX被转染到CHO-S细胞。转染悬浮培养的CHO-S细胞中，使用的转染试剂是Free Style MAX(Invitrogen,16447100)，转染操作步骤如厂商产品说明书进行。
随后，转染后的CHO-S细胞被转移到一个125mL三角摇瓶中，在30mL FreeStyleCHO培养基中，细胞密度为1×106个细胞/mL。细胞在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养，摇床转速为130rpm。培养液上清在细胞培养7天后被收集，上清中的ITGAX重组蛋白浓度(CHO-S细胞表达分泌的)被检测，检测方法是夹心法ELISA。
具体而言，在夹心法ELISA中，纯化的抗体(abcam，#ab254183，#ab195534，)被分别用作夹心ELISA方法的包被抗体和检测抗体。为了确定ITGAX的活性浓度，已知浓度(以A280法检测)的ITGAX对照抗原(义翘神州，#CT017-H2508H)被用来做浓度标准曲线。用pH9.6的碳酸缓冲溶液稀释的鼠抗ITGAX抗体(abcam，#ab254183)1μg/mL，100μL/孔包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤2次；每孔加入200μL的1％BSA的PBS，室温封闭2小时后置于三折纸上拍干；加样：PTB分别不同比例或不同浓度稀释ITGAX转染上清和对照抗原，稀释后样品0.1mL于反应孔中，置37℃温育1小时，然后洗涤，同时做空白孔(不加样品)，阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1mL，置37℃温育1小时，然后洗涤3次。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1mL。37℃温育1小时，洗涤3次。加底物液显色：各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H2SO4 0.1mL。测OD值判断结果，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)，结果见表2。
最后，利用ELISA CALC计算对照蛋白4参数逻辑曲线作为标准曲线，其中，R2＝0.997。通过计算得到待测细胞上清中ITGAX蛋白表达浓度约为35.6ng/mL，结果显示pCDNA3.1-ITGAX转染的CHO-S细胞上清中有明显的目的蛋白表达。
表2不同蛋白浓度对应的吸光值
实施例3：ITGAX的CHO-S稳定细胞株的筛选与鉴定
被表达质粒为了筛选获取稳定表达ITGAX的细胞株，pCDNA3.1-ITGAX转染的CHO-S细胞被稀释到100个细胞/孔的密度，加入到96孔板的微孔中，200μL CD-CHO培养基/孔，培养基中含12.5μM MSX试剂(谷氨酰胺合成酶GS抑制剂，用于筛选GS抗性基因)。微孔培养板在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养约20天，使抗性细胞生长。有抗性细胞生长的微孔中的细胞被转移到24孔细胞培养板中进行扩大培养(同时定量测定不同细胞株ITGAX蛋白的表达水平)，转移时大约1000个细胞/孔。培养7天后，板中的细胞上清被取出做ITGAX蛋白浓度检测。
ITGAX蛋白浓度检测具体操作为：用pH9.6的碳酸缓冲溶液稀释的鼠抗ITGAX抗体(abcam，#ab254183)1μg/mL，100μL/孔包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤2次；每孔加入200μL的1％BSA的PBS，室温封闭2小时后置于三折纸上拍干；加样：PTB分别不同比例或不同浓度稀释不同ITGAX转染CHO-S稳定细胞株的培养上清和对照抗原(义翘神州，#CT017-H2508H)，稀释后样品0.1mL于反应孔中，置37℃温育1小时，然后洗涤，同时做空白孔(不加样品)，阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1mL，置37℃温育1小时，然后洗涤3次。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1mL。37℃温育1小时，洗涤3次。加底物液显色：各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H2SO4 0.1mL。测OD值判断结果，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)，结果见表3。
利用ELISA CALC计算对照蛋白4参数逻辑曲线作为标准曲线，其中，R2＝0.998。通过计算得到待测细胞上清中ITGAX蛋白表达浓度，结果显示pCDNA3.1-ITGAX转染的CHO-S的3A4号细胞株上清中有明显的目的蛋白表达442.1ng/mL。结合ITGAX表达水平和细胞生长特性，最终选取3A4号细胞株被用于后期的ITGAX蛋白生产。
表3不同蛋白浓度对应的吸光值
实施例4：ITGAX重组蛋白的生产和纯化
细胞培养阶段：将ITGAX稳定细胞株3A4以2×105个细胞/ml浓度培养于装有400mLCD-CHO培养基的1L摇瓶中，培养基中含有12.5μM MSX试剂。将摇瓶放入CO2培养箱(37℃，5％CO2)内的摇床(130rpm)中培养10天。将培养10天后的细胞培养液取出，200g离心5分钟(分离细胞和粗的细胞碎片)后移取上清至新的瓶中，继续3000g离心15分钟(分离细的细胞碎片)。将分离后的上清液用0.22μM的滤杯过滤除菌后4℃保存。
蛋白纯化阶段：将除菌后的细胞上清液平衡至室温后用Ni柱进行纯化。Ni柱填料(介质)，公司GE Healthcare，货号:#17-3712-02。取30mL层析柱装柱，装柱介质最终体积为10mL。细胞上清上样量400mL，流速为1.0mL/分钟，然后用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱(20mMTris-HCl,pH 8.5，50-1000mM咪唑浓度梯度)。ITGAX重组蛋白在100mM咪唑洗脱液中洗脱下来。取纯化实验各洗脱步骤样品，用SDS-PAGE实验检测ITGAX目的蛋白的纯度，结果见图2，其中，泳道(Lane)1-9加样分别为：上清液、流传液、Marker、洗涤液、10mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、100mM咪唑洗脱液、200mM咪唑洗脱液、500mM咪唑洗脱液；其中ITGAX纯化蛋白主要存在Lane7中(即100mM咪唑洗脱液中)。如图2的结果显示，纯化后的ITGAX重组蛋白主要存在于泳道7(Lane7)中，蛋白分子量为127.8KDa，与理论值一致；目测纯度为95％。
用10KDa超滤管(Millipore，UFC900396)对含有ITGAX重组蛋白的洗脱液(Lane7)进行浓缩，并用10KDa的透析袋过夜透析，透析液为10mM pH7.4 PBS缓冲液。透析后的重组蛋白用A280法检测蛋白浓度。典型的总蛋白浓度为1.12mg/mL。纯化后的ITGAX在4℃保存。
实施例5：用ITGAX重组蛋白免疫BALB/c小鼠
选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行如下免疫程序：初次免疫时，用25μg ITGAX蛋白与等量弗式完全佐剂混合，经乳化后皮下多点注射；首次免疫后14天，用12.5μgITGAX蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。二次免疫后14天，用12.5μgITGAX蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。三次免疫后14天采血并分离血清，用ITGAX蛋白包被ELISA板，进行间接ELISA试验，测定血清效价。结果显示制备的鼠抗血清效价为1：72900，典型的免疫小鼠血清检测结果参见表4。
表4鼠抗血清效价检测
血清稀释倍数 OD450
100 2.875
300 2.425
900 2.104
2700 1.865
8100 1.245
24300 0.952
72900 0.568
本底 0.042
实施例6：细胞融合
在实施例5中经第三次免疫后，对小鼠进行加强免疫，具体步骤如下，注射12.5μgITGAX蛋白与PBS混合至体积200μL进行腹腔注射。加强免疫小鼠3天后进行细胞融合。摘出小鼠眼球取血后，脱臼处死小鼠，放入70％酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤找到脾脏，用镊子取下，放入200目不锈钢滤膜中轻轻研碎，用DMEM培养基(Thermo，11965092)轻轻冲洗下细胞，之后室温下的离心机中200g离心10分钟，弃上清后备用。
制备饲养细胞时，脱臼处死小鼠，放入70％酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤，用注射器吸取PBS轻轻注入腹膜下，从另一边再将含有饲养细胞的液体洗出，之后室温下的离心机中200g离心10分钟，弃上清后备用。将2.0×107个FO骨髓瘤细胞与2.0×108个脾细胞混匀，离心机中200g离心10分钟，弃上清，轻微振荡混匀，于37℃水浴中，在90秒内滴加1mL体积浓度为50％的PEG-1450(Merk，P1458)水溶液，然后滴加20mL DMEM培养基，离心机中200g离心10分钟，弃上清，重复洗一次，离心机中200g离心10分钟，弃上清，得到杂交瘤细胞，将细胞铺到10块96孔培养板中，每孔150μL。将饲养层细胞10000个细胞/孔加入上述10块96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板标记好后，放入37℃的含5％ CO2的细胞培养箱中培养，第二日加入HAT筛选培养基(Merk，H0262)，再用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT筛选培养液维持7～10天后应换用HT培养液(Merk，H0137)，再维持2周，改用20％ FBS(ExCell,FSP500)的DMEM培养基继续培养。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
实施例7：阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆培养
首先，通过方正实验确定ITGAX蛋白作为抗原最佳包被量。将0.5、1.0、2.0、4.0μg的ITGAX蛋白包被96孔板，每个浓度6个孔分别设置为3个阳性和3个阴性。用不同稀释倍数的ITGAX蛋白免疫鼠阳性血清进行方正滴定，同时以未免疫鼠阴性血清作为阴性对照。用每孔0.5μg纯化的ITGAX蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤2次；每孔加入200μL的1％BSA的PBS，室温封闭2小时后置于三折纸上拍干；加样：加待检样品0.1mL于反应孔中，置37℃温育1小时，然后洗涤，同时做空白孔(不加样品)，阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1mL，置37℃温育1小时，然后洗涤3次。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体(索莱宝，#SE131)0.1mL。37℃温育1小时，洗涤3次。加底物液显色：各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H2SO4 0.1mL。测OD值判断结果，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出抗ITGAX的杂交瘤细胞单克隆。
按照上述方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，通过有限稀释法将原有的孔用HAT选择培养基稀释后重新分到96孔培养板中，之后观察细胞的形态和数量。调整细胞为3～10个细胞/mL。取前一日准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL。于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。通过间接法ELISA检测比较不同细胞株培养上清中抗体与ITGAX蛋白的结合活性，选择OD值最高(OD450＝2.324)的细胞株AH64D用于后期实验。细胞应尽快冻存，最终选定克隆号AH64D的杂交瘤细胞株用于抗体生产。
实施例8：单克隆抗体的大量制备及抗体效价测定
(1)单克隆抗体的大量制备
通过腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于8周龄BALB/C鼠，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获5～10mL腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。将获得的腹水于3000g离心10分钟，弃去上层油脂和底部沉淀，收集上清分装于-20℃，腹水上清解冻并平衡至室温后，加入1/10体积的1M Tris–HCl pH8.0，使样品pH值至8.0。用20个柱体积100mM pH8.0的Tris–HCl平衡protein G亲和柱中，将调节pH至8.0后的腹水上清上柱，之后用20个柱体积100mM pH 8.0的Tris–HCl洗涤，最后用100mM Glycine–HCL pH 2.5洗脱抗体。将抗体洗脱液加入到浓缩管(Millipore，UFC801008，10K)中离心机(湘仪，L550)室温3000×g离心20分钟。分批离心至溶液体积至1mL/浓缩管(2管)，加入10mM PBS pH 7.4缓冲液4mL，继续室温3000×g离心20分钟。重复离心3次，使抗体的缓冲液为10mM PBS pH 7.4，加入10mM PBS pH 7.4至总体积10mL。最后将浓缩后的抗体溶液2mL/管分装于离心管中，-80℃中保存。利用BCA试剂盒(索莱宝，PC0020)测定抗体浓度，经测定纯化后的单克隆抗体AH64D浓度为1.8mg/mL。
(2)抗体效价测定
利用ELISA间接法检测抗ITGAX抗体AH64D的效价。将ITGAX蛋白用PBS稀释，以0.2μg/mL、100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃过夜后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔，清洗后拍干。用1％BSA的PBS溶液，200μL/孔封闭酶标板，室温2小时，封闭后拍干；加入PTB稀释至20ng/mL的抗ITGAX抗体AH64D，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入TMB底物溶液，100μL/孔室温反应10分钟，加入100μL/孔的1M H2SO4终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果参见表5，可见纯化后的抗体效价为1:729000。
表5抗体效价测定
抗体稀释倍数 OD450
1000 2.452
3000 2.124
9000 1.869
27000 1.539
81000 1.104
243000 0.875
729000 0.362
本底 0.048
实施例9：单克隆抗体的序列分析
(1)单克隆抗体亚型鉴定
将杂交瘤细胞株AH64D用加有10％血清的DMEM培养基(GIBCO，#C11995500BT)培养在10cm直径的细胞培养皿中(37℃、5％ CO2)。培养7天后将细胞转移至15mL离心管中，血球计数板计数后取出4×106个细胞，以200g离心5分钟后，弃上清，并将离心管倒置，将管内液体控干。管内细胞利用QIAGEN公司的反转录试剂盒(Qiagen,74134)合成cDNA。
抗体亚型是通过用抗体亚型特异的引物做PCR确定的。上述合成的cDNA被用来作为PCR反应模板。PCR所用引物序列信息见表6。
表6PCR引物序列信息
注：表中S＝C or G,M＝A or C,R＝A or G,and W＝A or T。
PCR反应溶液体系：TAKARA Ex Taq(5U/μL，TAKARA，RR001B)，0.25μL；10×Ex TaqBuffer，5μL；dNTP混合物(各2.5mM)，4μL；模板cDNA，1μL；上游引物(100μM)，1μL；下游引物(100μM)，1μL；加入双蒸水至总体积50μL。
PCR反应温度程序：94℃5分钟预变性，温度循环30次(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟)，72℃10分钟延伸。
反应结束后，PCR产物各取10μL上样于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳图如图3所示，各泳道所加样品顺序如表7所示。如图3所示，通过电泳图分析，泳道2(Lane2)和泳道6(Lane6)分别扩增到IgG1重链和kappa轻链650bp的阳性条带，由此确定本发明获得的单克隆抗体AH64D重链为IgG1亚型，轻链为kappa亚型。根据PCR产物结果可以推断出抗体的亚型，结果如表7所示。由表7可知，本发明获得的单克隆抗体AH64D为重链为IgG1，轻链为kappa。
表7对应泳道的样品信息
(2)杂交瘤细胞株AH64D抗体可变区(V区)测序
细胞株AH64D的抗体的V区在PCR扩增后得到的片段(见上条)被从琼脂糖凝胶上切割下来，并用DNA抽提试剂盒(Qiagen，74134)提取出来。提取得到的DNA片段被与pEASY-T1克隆载体链接，并被转化到Trans1-T1感受态细胞中(Transgen,CT101-1)。转化的细菌菌落被挑取到LB培养基中，经过过夜培养后进行DNA测序。本发明提供的抗ITGAX抗体(AH64D)的轻链V区核酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链V区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
基于以上，获得的单克隆抗体AH64D的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列如表8所示。根据IMGT数据库的抗体的CDR序列显示于表9中。抗体的轻链恒定区和重链恒定区序列显示于表10中。抗体的完整重链和轻链序列显示于表11中。
表8单克隆抗体AH64D的VL和VH序列
表9单克隆抗体AH64D的CDR序列
LCDR1 Q S L V H S N G N S Y SEQ ID NO:3
LCDR2 E V S SEQ ID NO:4
LCDR3 F Q G T H L P G S T SEQ ID NO:5
HCDR1 G Y S F T G Y Y SEQ ID NO:6
HCDR2 V N P Y N G G T SEQ ID NO:7
HCDR3 A P D V R A N D F A R W Y F D V SEQ ID NO:8
表10单克隆抗体AH64D的轻链恒定区和重链恒定区
表11单克隆抗体AH64D的轻链和重链
实施例10：抗体AH64D人源嵌合抗体改造和表达、纯化
(1)pGmab-K-hAH64D/pGmab-H-hAH64D质粒的构建
通过将前期得到的抗体AH64D轻链V区核酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链V区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示，以上设计好的DNA序列交由第三方基因合成公司合成，并构建入pUC57质粒中，构建后质粒命名为pUC57-AH64D-VL和pUC57-AH64D-VH，经NEB Cutsmart核酸内切酶体系，分别取2μg pUC57-AH64D-VL或pUC57-AH64D-VH和pGmab-K(含有人抗体kappa链恒定区)或pGmab-H(含有人抗体IgG1链恒定区)质粒加入2U XbaI和2U BamHI内切酶，37℃酶切2小时后，经1％琼脂糖凝胶分离并回收阳性条带并使用A260检测回收后的DNA片段浓度，分别取插入片段(AH64D-VL或AH64D-VH)和表达质粒双酶切片段(pGmab-K或pGmab-H)各2nmol、加入1U T4连接酶用T4连接酶缓冲液和超纯水定容至20μL，16℃过夜连接后转化入DH5α感受态细胞，并涂布于LB平板上，挑取单菌落经FCMV和SV40通用引物测序，经测序基因序列正确无误。构建后表达质粒分别命名为pGmab-K-hAH64D/pGmab-H-hAH64D，质粒图参见图4和图5。
hAH64D抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列显示于表12中。根据Kabat系统的抗体的CDR序列显示于表13中。抗体的重链和轻链序列显示于表14中。
表12hAH64D抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列
表13hAH64D抗体的CDR序列
LCDR1 Q S L V H S N G N S Y SEQ ID NO:3
LCDR2 E V S SEQ ID NO:4
LCDR3 F Q G T H L P G S T SEQ ID NO:5
HCDR1 G Y S F T G Y Y SEQ ID NO:6
HCDR2 V N P Y N G G T SEQ ID NO:7
HCDR3 A P D V R A N D F A R W Y F D V SEQ ID NO:8
表14hAH64D抗体的轻链和重链
(2)人源嵌合抗体hAH64D的表达和纯化
首先，将上述过程中构建的两种质粒pGmab-K-hAH64D/pGmab-H-hAH64D按照1：1混合后被转染到CHO-S细胞。转染悬浮培养的CHO-S细胞中，使用的转染试剂是Free StyleMAX(Invitrogen,16447100)，转染操作步骤如厂商产品说明书进行。随后，转染后的CHO-S细胞被转移到一个125mL三角摇瓶中，在30mL FreeStyle CHO培养基中，细胞密度为1×106个细胞/mL。细胞在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养，摇床转速为130rpm。最后，培养液上清在细胞培养7天后被收集，上清中的抗ITGAX人源化抗体(命名为hAH64D)活性浓度(CHO-S细胞表达分泌的)被检测，检测方法是间接法ELISA。在这个实验里，ITGAX蛋白作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入用PTB不同比例稀释的表达有hAH64D的细胞上清，加入到上述封闭后酶标板中，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗人抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H2SO4，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)，结果参见表15。如表15所示，细胞上清中抗ITGAX人源化抗体hAH64D的活性效价检测，经检测细胞上清中hAH64D的效价为24300。
表15细胞上清中抗ITGAX人源化抗体hAH64D的效价检测
细胞上清稀释倍数 hAH64D
10 2.435
30 2.124
90 1.862
2700 1.425
8100 0.582
24300 0.325
72900 0.118
本底 0.087
随后，将细胞上清于3000×g离心10分钟，加入1/10体积的1M Tris–HCl pH8.0，使样品pH值至8.0。用20个柱体积100mM pH8.0的Tris–HCl平衡protein G亲和柱中，将调节pH至8.0后的腹水上清上柱，之后用20个柱体积100mM pH 8.0的Tris–HCl洗涤，最后用100mMGlycine–HCL pH 2.5洗脱抗体。将抗体洗脱液加入到浓缩管(Millipore，UFC801008，10K)中离心机(湘仪，L550)室温3000×g离心20分钟。分批离心至溶液体积至1mL/浓缩管(2管)，加入10mM PBS pH 7.4缓冲液4mL，继续室温3000×g离心20分钟。重复离心3次，使抗体的缓冲液为10mM PBS pH 7.4，加入10mM PBS pH 7.4至总体积10mL。最后将浓缩后的抗体溶液2mL/管分装于离心管中，-80℃中保存。利用BCA试剂盒(索莱宝，PC0020)测定抗体浓度，测定纯化后的人源嵌合抗体hAH64D浓度为4.1mg/mL。
纯化后的抗ITGAX人源化抗体hAH64D的活性效价检测，在这个实验里，ITGAX蛋白作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入用PTB稀释的不同浓度的抗体hAH64D，加入到上述封闭后酶标板中，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗人抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H2SO4，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)，结果参见表16。如表16所示，经检测细胞上清中hAH64D的效价为2430000。
表16亲和纯化后的人源化抗体hAH64D的效价检测
抗体稀释倍数 hAH64D
10000 1.985
30000 1.235
90000 0.895
270000 0.652
810000 0.324
2430000 0.154
7290000 0.102
本底 0.068
实施例11：抗体hAH64D在检测ITGAX的灵敏度及特异性的鉴定
(1)抗体hAH64D和AH64D在检测ITGAX的灵敏度的鉴定
抗体hAH64D检测ITGAX的灵敏度的能力用间接法ELISA进行了评估。并比较其与抗体AH64D和对照抗体(鼠抗ITGAX单克隆抗体，abcam，#ab11029)灵敏度的差异。在这个实验里，ITGAX蛋白作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入用PTB稀释的不同浓度的抗体AH64D、hAH64D、对照抗体，加入到上述封闭后酶标板中，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗人抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1MH2SO4，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。
实验结果如表17所示，抗体AH64D抗体和hAH64D检测ITGAX蛋白的灵敏度优于对照抗体，并且hAH64D与ITGAX蛋白相比AH64D抗体背景数值更低(0.063)，结果分析，ITGAX蛋白标准曲线R2＝0.9981，IC50＝25ng/mL。本方法标准曲线范围为0-3000ng/mL，最低检出限对照抗体为50ng/mL；AH64D抗体为25ng/mL；hAH64D抗体为12.5ng/mL，结果参见表17。
表17抗体AH64D以及hAH64D测定ITGAX蛋白灵敏度的鉴定
ITGAX浓度(ng/mL) 对照抗体 AH64D hAH64D
3000 1.865 2.561 2.865
1000 1.354 2.235 2.674
300 0.985 2.124 2.145
100 0.625 1.825 1.824
50 0.325 0.825 0.985
25 0.21 0.535 0.548
12.5 0.145 0.325 0.268
0 0.105 0.321 0.098
本底 0.102 0.224 0.063
(2)抗体hAH64D和AH64D在检测ITGAX的特异性的鉴定
抗体hAH64D和AH64D检测ITGAX的特异性的能力用间接法Cell based ELISA进行了评估。在这个实验里，分别培养细胞(MCF7)和相应的MCF7 ITGAX敲除细胞系(abcam，#ab287574，这株细胞由于对ITGAX基因敲除，因此膜表面不表达ITGAX蛋白)，使用10％血清的DMEM培养基培养3代后，细胞转移至96孔细胞培养板中，细胞密度10万细胞/孔，培养过夜，弃掉上清，加入4％多聚甲醛，体积100μL/孔，固定细胞30分钟。PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，96孔板板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入用PTB稀释的不同浓度的抗体hAH64D和AH64D，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H2SO4，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。实验结果如表18所示，表明抗体hAH64D相比于抗体AH64D和对照抗体，检测天然细胞膜表面ITGAX蛋白拥有更好的特异性。
表18抗体AH64D以及hAH64D在检测ITGAX的特异性的鉴定
实施例12：比较抗体hAH64D和AH64D通过流式检测方法在检测人外周淋巴细胞表面ITGAX的应用
(1)抗体hAH64D和AH64D的异硫氰酸荧光素(FITC)标记及标记产物的鉴定
分别取抗体hAH64D和AH64D(20nmol，3mg)定容至0.5mL加入到透析袋(10KDa，宽度1cm)中，在2L 10mM PBS溶液(pH 7.4)中4℃过夜透析。次日将含有抗体溶液的透析袋放入1L 10mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中室温搅拌透析2小时，准备与活化好的FITC进行偶联。
与此同时，使用分析天平精确称取0.1mg FITC，加入上述透析后的抗体溶液中，边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12～18小时。结合完毕后，先将结合物以3000×g离心20分钟，除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于10mMPBS溶液(pH 7.4)烧杯中透析过夜。取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25柱，分离游离的FITC，收集标记的荧光抗体于4℃保存。
(2)利用FTTC标记抗体hAH64D和AH64D通过流式检测方法在检测人外周淋巴细胞表面ITGAX蛋白
在本实验中，人全血的处理采用基于Chow et al,2005(PMID:16080188)的改进方案。简而言之，人全血在22℃4％多聚甲醛中固定10分钟。然后通过在37℃下添加Triton X-100(最终浓度为0.1％)使红细胞溶解15分钟。在实验中，用100倍稀释的抗FTTC标记抗体hAH64D和AH64D，在4℃染色30分钟。同型对照抗体为相同条件下使用的FITC标记小鼠单克隆IgG1(abcam，#ab170190)。使用CytoFLEX仪器，采集>30,000总事件，使用50mW氩蓝激光器(488nm)和530/30带通滤波器收集。通过活细胞的前向和侧向光散射特性收集门控策略事件，通过比较FITC数值确定抗体hAH64D识别外周淋巴细胞表面ITGAX蛋白，结果见图6。
如图6所示，阴性抗体488nm荧光值峰值(10×104)，抗体(hAH64D)488nm荧光值检测峰值(140×104)，抗体(AH64D)488nm荧光值检测峰值(100×104和140×104)，结果显示抗体(hAH64D和AH64D)都可特异性识别人外周淋巴细胞表面ITGAX蛋白，但hAH64D抗体在流式检测中显示更好的单峰而AH64D流式检测背景峰较多，特异性要低于hAH64D抗体。由此判断hAH64D抗体流式检测中，特异性识别人外周淋巴细胞表面ITGAX蛋白具有很好的优势。
本发明提供了抗ITGAX的单克隆抗体AH64D和/或hAH64D，此抗体具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述hAH64D抗体通过流式方法检测人外周血淋巴细胞表面ITGAX的方法。本发明解决了目前市场上ITGAX检测项目抗体原料相对短缺的问题。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (14)

1.特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3、4和5所示，且所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 6、7和8所示。
2.根据权利要求1所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含与SEQ IDNO: 1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其轻链恒定区CL包含与 SEQ ID NO: 13具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，并且重链恒定区CH包含与SEQ ID NO: 14具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自双链抗体；所述抗体为鼠源单克隆抗体或人源化嵌合抗体。
5.根据权利要求4所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体，其轻链包含与SEQ IDNO: 15具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，并且重链包含与SEQ IDNO: 16具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化嵌合抗体，其轻链包含与SEQ IDNO: 17具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，并且重链包含与SEQ IDNO: 18具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
7.核酸，其包含编码根据权利要求1-6中任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
8.载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括但不限于293F细胞、CHO细胞。
11.制备权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在使得所述的抗体、其抗原结合片段表达的条件下，培养根据权利要求9或10所述的宿主细胞。
12.检测试剂，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段，其中所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段通过荧光标记后作为特异性识别ITGAX的流式荧光检测试剂组分。
13.权利要求1-6中任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、或权利要求12所述的检测试剂在制备用于检测样品中ITGAX含量的产品中的用途。
14.权利要求1-6中任一项所述的特异性结合ITGAX的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的载体、权利要求9或10所述的宿主细胞在制备检测ITGAX的产品中的应用。
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