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CN118401661A - N-末端和/或c-末端切割的可溶性ph20多肽及其用途 - Google Patents

N-末端和/或c-末端切割的可溶性ph20多肽及其用途 Download PDF

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CN118401661A
CN118401661A CN202380015218.1A CN202380015218A CN118401661A CN 118401661 A CN118401661 A CN 118401661A CN 202380015218 A CN202380015218 A CN 202380015218A CN 118401661 A CN118401661 A CN 118401661A
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polypeptide
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acid sequence
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朴淳宰
金奎完
尹相勋
宋炯枏
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Abstract

本发明涉及一种重组PH20多肽，其中在成熟动物野生型PH20的N‑末端缺失了1至7个氨基酸残基，以及其用途。与常规重组PH20多肽相比，本发明中呈现的具有改善的酶活性和生产率的N‑末端和/或C‑末端切割的PH20多肽可表现出优异的表达和酶活性，这可导致工业使用的生产成本降低，并因此降低治疗成本。

Description

N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽及其用途
技术领域
本发明涉及N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽及其用途。
背景技术
人们一直试图通过使用基因工程方法来增加从重组细胞分泌的工业上有用的蛋白质的表达水平。
尝试了若干种常规方法，并且每种方法都有自己的优缺点。例如，在克隆步骤中选择合适的启动子以增加表达水平，然而，当蛋白质折叠是限速步骤时，所表达的蛋白质的量不是从所选择的启动子预期的那么多(Su Xiao等人,Curr Opin Struct Biol.2014,June32-38)。
为了增加从细胞中分泌的蛋白质的表达，在N-末端的靶蛋白质的信号肽已经被来自其他蛋白质的信号肽所置换(Kober,L.,Zehe,C.&Bode,J.,2013.Optimized SignalPeptides for the Development of High Expressing CHO Cell Lines.Biotechnologyand bioengineering,110(4),pp.1164-1173)。在这种情况下，与使用其自身的信号肽的情况相比，蛋白质表达有时会增加，但是当表达的蛋白质在穿过细胞中的内质网膜时被信号肽酶切割的时候，信号肽酶有时在信号肽和成熟蛋白质的N-末端氨基酸之间不能进行精确切割。
为了增加蛋白质表达的其他尝试包括与伴侣蛋白共表达以有助于重组蛋白质折叠，并防止待表达的蛋白质的聚集。然而，由于在重组细胞中同时表达靶蛋白和膜结合伴侣蛋白的技术挑战以及伴侣蛋白表达引起的细胞内生理挑战，该方法在工业上不常使用。
为了增加蛋白质表达的另一种尝试是通过在特定位点使用定点突变来进行重组蛋白质的氨基酸置换。当在细胞中产生时，由多肽组成的蛋白质折叠成三维结构。氨基酸置换可以为蛋白质折叠提供有利的环境，这可以使得蛋白质表达的增加。已有许多成功的案例，但实际问题诸如由于氨基酸修饰导致的免疫原性增加是固有的。
透明质酸(Hyaluronan)(透明质酸(hyaluronic acid)：HA)是一种糖胺聚糖，发现于许多细胞的细胞外基质中，尤其是结缔组织中。透明质酸也主要发现于哺乳动物的皮肤、软骨和滑液中。透明质酸也是眼睛玻璃体液的主要成分。透明质酸在各种生理过程诸如水和血浆蛋白的体内平衡中发挥作用(Laurent TC等人(1992)FASEB J 6:2397-2404)。某些疾病与透明质酸的表达和/或产生有关。透明质酸酶是一种分解透明质酸的酶。透明质酸酶可用于通过催化透明质酸的水解来治疗与透明质酸或其他糖胺聚糖积累相关的疾病或疾患。此外，因为透明质酸是皮下皮肤屏障的主要成分，透明质酸酶可用于增加组织渗透性，因此，当皮下注射时，可增加治疗剂的分散和递送。
基于天然PH20多肽的各种透明质酸酶(例如，HydaseTM、VitraseTM、WydaseTM)已经与其他治疗剂结合使用，通常作为分散剂。许多这些透明质酸酶包含来源于绵羊或牛睾丸的PH20。
人PH20蛋白由509个氨基酸组成，并且已知为存在于精子的质膜中的糖基磷酸肌醇脂质锚定蛋白。虽然血液中存在的透明质酸酶Hyal1、Hyal2、Hyla3或Hyal4仅在酸性pH下有活性，而PH20即使在中性pH下也有活性，所以PH20已被开发成与药物混合用于皮下注射，并已在工业上使用。
最近，使用了HylenexTM，一种447个氨基酸的重组人PH20多肽，其通过切割负责锚定糖基磷酸肌醇的PH20的C-末端处的氨基酸而被修饰具有可溶性。此外，使用人PH20多肽变体的材料也正在开发中。
同时，人PH20，一种在六个位点被N-连接糖基化的糖蛋白，具有非常复杂的三维结构，并且为了生产工业上有用的酶，在动物细胞诸如CHO细胞中表达后需要复杂的纯化过程。因此，对于人PH20的工业实用性，根据其在发酵培养基中的表达水平提高含有人PH20基因的动物细胞的生产率是非常重要的。
在这一技术背景下，本发明的发明人已经确定N-末端或N-和C-末端的切割可以提高可溶性重组PH20多肽的生产率，并完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有改善的生产率的N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽。
本发明的目的在于提供一种编码该N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽的核酸。
本发明的目的在于提供一种包含该核酸的重组表达载体。
本发明的目的在于提供用该重组表达载体转化的宿主细胞。
本发明涉及一种生产该N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽的方法，包括培养宿主细胞的步骤。
本发明提供了一种重组PH20多肽，其中从成熟动物野生型PH20的N-末端缺失1至7个氨基酸残基。
具体地，根据本发明的其中一个或多个氨基酸残基从成熟动物野生型PH20的N-末端缺失的重组PH20多肽可被表征为选自但不限于由以下组成的组：
(a)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的人野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(b)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.2至8中任一个的氨基酸序列的灵长类野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(c)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的牛野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；以及
(d)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.10的氨基酸序列的绵羊野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基。
本发明提供了编码重组PH20多肽的核酸和包含该核酸的重组表达载体。
本发明还提供了用该重组表达载体转化的宿主细胞，以及生产N-末端和/或C-末端切割的可溶性PH20多肽的方法，包括培养宿主细胞的步骤。
附图说明
图1是示出根据本发明的实施方式的PH20多肽的培养物中的酶活性的图表，其中SEQ ID No.1的C-末端是Y482或F468，并且N-末端起始于L36、N37、F38、R39或A40。各自活性都表示为基于具有最长氨基酸长度的L36-Y482的相对活性百分比。
图2是示出根据本发明的实施方式的经纯化的PH20多肽在pH 5.3下的酶活性(表示为比活性)的图表，其中SEQ ID No.1的C-末端是Y482或F468，并且N-末端起始于L36、N37、F38、R39或A40。各自活性都表示为基于具有最长氨基酸长度的L36-Y482的相对活性百分比。
图3是示出根据本发明的实施方式的经纯化的PH20多肽在pH 7.0下的酶活性(表示为比活性)的图表，其中SEQ ID No.1的C-末端是Y482或F468，并且N-末端起始于L36、N37、F38、R39或A40。各自活性都表示为基于具有最长氨基酸长度的L36-Y482的相对活性百分比。
图4示出了使用SEQ ID No.1、2、9和10的氨基酸序列的Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行多重序列比对的结果。
图5是示出根据本发明的实施方式的PH20多肽的培养基的酶活性的图表，对于SEQID No.2(其中C-末端是Y483)、SEQ ID No.9(其中C-末端是H478)或SEQ ID No.10(其中C-末端是H477)，所述PH20多肽的N-末端分别以L36、N37或D37、F38、R39、A40或P41开始。各自活性都表示为测量值。
图6是示出根据本发明的实施方式的经纯化的PH20多肽在pH 5.3下的酶活性(表示为比活性)的图表，对于SEQ ID No.2(其中C-末端是Y483)、SEQ ID No.9(其中C-末端是H478)或SEQ ID No.10(其中C-末端是H477)，所述PH20多肽的N-末端分别以L36、N37、F38、R39、A40或P41开始。各自活性都表示为测量值。
图7示出了根据本发明的实施方式，在培养物中和在纯化状态下测量PH20多肽在pH 5.3下的酶活性的结果，所述PH20多肽具有SEQ ID No.1的L36-Y482、N37-482和F38-Y482的不同信号肽。图7中表示出使用来自人血清白蛋白的信号肽的培养物和纯化蛋白的酶活性，使用来自人PH20的信号肽的培养物和纯化蛋白的酶活性，以及使用来自人免疫球蛋白κ的信号肽的培养物和纯化蛋白的酶活性。培养物的酶活性标度在主y轴上表示为条形图，纯化蛋白的活性标度在辅助y轴上表示为折线图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所落入领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文所用的术语是本领域公知的且常用的。
为了扩大在PH20的C-末端处切割并转化为可溶性形式的重组PH20多肽的工业实用性，本发明通过进一步切割PH20的N-末端，提供了生产率显著提高的N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽。本文使用的术语“可溶性”是指具有在水溶液中具有活性而不会聚集的三维结构的形式。
因此，本发明涉及重组PH20多肽，其中从成熟动物野生型PH20的N-末端缺失1至7个氨基酸残基、优选1至6个氨基酸残基、优选1至5个氨基酸残基、优选1至4个氨基酸残基、优选1至3个氨基酸残基、优选1至2个氨基酸残基、优选1个氨基酸残基。
本发明中的成熟动物野生型PH20可以指表现出所需功能形式的重组PH20多肽。根据本发明的成熟动物野生型PH20可以指，例如，其中促进成熟动物野生型PH20分泌到细胞外的信号肽在分泌过程中被切割的状态。
动物可以是，例如但不限于哺乳动物、啮齿动物等，诸如人、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、羊、猴等。
根据本发明的动物野生型PH20可以包括，例如，但不限于：
(a)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的人野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(b)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.2至8中任一个的氨基酸序列的灵长类野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(c)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的牛野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；以及
(d)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.10的氨基酸序列的绵羊野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基。
表1.动物PH20的氨基酸序列的信息
表2.动物PH20的氨基酸序列
人体的透明质酸酶存在于血浆或其他器官中，并且包括在酸性pH下有活性的Hyal1、Hyal2、Hyal3和Hyal4，以及在精子顶体中表达并在受精中起作用的PH20。
具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的人PH20多肽由M1至T35的信号序列、L36至S490的透明质酸酶活性位点、以及A491至L509的C-末端GPI(糖基-磷脂酰肌醇)锚定序列组成，并且转化为缺乏所有C-末端GPI锚定序列的可溶性形式的重组PH20多肽用作体内治疗剂或分散剂。特别是，据报道，即使当C-末端氨基酸序列的某一部分(即I465至L509之间的任何部分)被切割时，酶活性得以保留，同时保持溶解性。对于商业产品，C-末端终止于第482位。然而，这种情况保持了除信号序列之外的从N-末端的L36开始的序列(WO 2010/077297A等)。
最近，提出了具有从N37、F38、R39、A40、P41或P42以及L36开始的经切割的N-末端的透明质酸酶变体具有酶活性，并且在此基础上，已经开发了具有良好热稳定性和酶活性的透明质酸酶变体(WO 2020/022791A等人)。
猴(长鼻猴)的PH20多肽与人PH20多肽具有93.1％的序列同一性。因此，基于图4中多重序列分析的结果，可以预期具有终止于Y483的C-末端的猴(长鼻猴)的PH20多肽是具有活性和可溶性的PH20。
牛(家牛)的PH20多肽和绵羊(绵羊(Ovis aries))的PH20多肽彼此之间有90.6％的序列同一性，分别与人PH20多肽有63.6％和63.5％的序列同一性。对于牛(家牛)的PH20多肽，Meyer等人(1997)报道了一种可溶性多肽具有终止于H478的C-末端。基于图4中多重序列分析的结果，可以预期具有终止于H477的C-末端的绵羊(绵羊(Ovis aries))的PH20多肽是具有活性和可溶性的PH20。
本发明通过进一步切割N-末端，即进一步从成熟的天然PH20多肽缺失氨基酸残基，提供了生产率提高的N-末端和/或C-末端切割的重组PH20多肽。本文使用的术语“N-末端和/或C-末端切割的重组PH20多肽”实质上是指PH20变体。
在具有SEQ ID No:1的氨基酸序列的野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前切割根据本发明的重组PH20多肽，导致一个或多个N-末端氨基酸残基的缺失。
具体地，根据本发明的重组PH20多肽可以包括在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前被切割的序列，并且起始于SEQ ID No:1的氨基酸序列的N37、F38、R39、A40、P41或P42。更具体地，根据本发明的重组PH20多肽可以包含起始于SEQ ID No:1的氨基酸序列的N37或F38的序列。
在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前的切割表示在N-末端处紧接在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前的所有的一个或多个氨基酸残基都被切割和缺失。
例如，切割发生在氨基酸残基N37、F38、R39、A40、P41或P42之前的说法是指，在SEQID No.1的氨基酸序列中，紧接在N37之前的残基1至36、紧接在F38之前的残基1至37、紧接在R39之前的残基1至38、紧接在A40之前的残基1至39、紧接在P41之前的残基1至40以及紧接在P42之前的残基1至41分别被切割和除去。
根据本发明的重组PH20多肽可以进一步包括在C-末端处一些氨基酸残基的缺失。具体地，根据本发明的重组PH20多肽可以在选自由SEQ ID No:1的氨基酸序列的F468至Y482组成的组的氨基酸残基之后被切割，导致C-末端处氨基酸残基的缺失。更具体地，根据本发明的重组PH20多肽可以包含终止于SEQ ID No:1的氨基酸序列的F468或Y482的序列。
在选自由SEQ ID No.1的氨基酸序列的F468至Y482组成的组的氨基酸残基之后的切割，以及C-末端处氨基酸残基的缺失意味着紧接在选自由F468至Y482组成的组至C-末端的氨基酸残基之后的所有氨基酸残基都被切割和缺失。例如，残基F468或Y482之后的切割意味着SEQ ID No.1的氨基酸序列的F468或Y482之后的所有残基都被切割和缺失。
在具体实施方式中，根据本发明的重组PH20多肽可以选自由以下组成的组：
(1)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于N37并且终止于Y482(N37-Y482)的氨基酸序列；
(2)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于N37并且终止于F468(N37-F468)的氨基酸序列；
(3)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于F38并且终止于Y482(F38-Y482)的氨基酸序列；或
(4)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于F38并且终止于F468(F38-Y468)的氨基酸序列。
(5)PH20多肽，包含SEQ ID No.2至8中任一个的起始于N37并且终止于L490(N37-L490)的氨基酸序列；
(6)PH20多肽，包含SEQ ID No.2至8中任一个的起始于F38并且终止于L490(F38-L490)的氨基酸序列；
(7)PH20多肽，包含SEQ ID No.9的起始于D37并且终止于H478(D37-H478)的氨基酸序列；
(8)PH20多肽，包含SEQ ID No.9的起始于F38并且终止于H478(F38-H478)的氨基酸序列；
(9)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于D37并且终止于H477(D37-H477)的氨基酸序列；
(10)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于F38并且终止于H477(F38-H477)的氨基酸序列；
(11)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于R39并且终止于H477(R39-H477)的氨基酸序列；以及
(12)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于A40并且终止于H477(A40-H477)的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种包含重组PH20多肽的用于治疗癌症的组合物，以及使用该组合物治疗癌症的方法。
对癌症没有特别的限制，包括实体癌和血液癌两者。这种癌症的实例可以选自但不限于由以下组成的组：皮肤癌(包括黑色素瘤)、肝癌、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食管癌、胆道癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、颈椎癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤和胶质瘤。优选地，可以用本发明的组合物治疗的癌症可以选自但不限于由以下组成的组：结肠癌、乳腺癌、肺癌和肾癌。
该组合物可以是药物组合物。所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，其中，所述载体通常用于药物的配制中，并且可以是选自但不限于由以下组成的组的至少一种：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、褐藻胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。所述药物组合物可以进一步包含选自由以下组成的组的至少一种：稀释剂、赋形剂、润滑剂、保湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂，它们都通常用于药物组合物的制备中。
药物组合物可以口服或肠胃外给药。如果肠胃外给药，它可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔内注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药或直肠给药。当口服给药时，蛋白质或肽是可消化的，因此口服组合物可以经配制来包覆活性剂或保护其在胃中不被降解。此外，组合物可以通过任何允许活性剂被转运到靶细胞的装置来给药。
该药物组合物可以呈在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液的形式，或者可以配制呈提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且可以进一步包含分散剂或稳定剂用于配制。
特别地，根据本发明的用于治疗癌症的组合物的特征在于用于与其他抗癌剂的联合疗法。
用于联合疗法的优选抗癌剂包括但不限于化疗剂、抗体型抗癌剂、RNAi或细胞疗法。
可用于联合疗法的抗癌剂是但不限于免疫抗癌剂，更优选免疫检查点抑制剂。
在另一方面，本发明涉及一种编码根据本发明的重组PH20多肽的核酸，所述重组PH20多肽在成熟动物野生型PH20的N-末端和/或C-末端处具有氨基酸残基的缺失。
本文使用的核酸可以存在于细胞或细胞裂解物中，或者可以以部分纯化或基本上纯净的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术，从其他细胞成分或其他污染物诸如来自其他细胞的核酸或蛋白质中纯化核酸时，核酸是“分离的”或“基本上纯净的”。本发明的核酸可以是，例如，DNA或RNA。
在另一方面，本发明涉及一种包含核酸的载体，特别是重组表达载体。对于根据本发明的重组PH20重组多肽的表达，编码PH20重组多肽的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达PH20重组多肽的杂交瘤的cDNA克隆)获得，并且该DNA可以“可操作地连接”到转录和翻译控制序列并插入到表达载体中。
本文使用的术语“可操作地连接”可意味着编码PH20重组多肽的基因被连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列具有调控编码PH20重组多肽的基因的转录和翻译的预期功能。将表达载体和表达控制序列选择为与宿主细胞相容用于待使用的表达。通过标准方法将编码PH20重组多肽的基因插入表达载体中(例如，将编码PH20重组多肽的基因片段与载体上的互补限制性酶位点连接，或者如果不存在限制性酶位点，则进行平端连接)。
此外，重组表达载体具有控制编码PH20重组多肽的基因在宿主细胞中表达的调控序列。“调控序列”可包括启动子、增强子或其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)，其控制编码PH20重组多肽的基因的转录或翻译。本领域技术人员可以认识到，表达载体的设计可以通过选择不同的控制序列而变化，这取决于诸如待转化的宿主细胞的类型或蛋白质的表达水平等因素。
在另一方面，本发明涉及一种包含核酸或载体的宿主细胞。根据本发明的宿主细胞优选选自但不限于由以下组成的组：动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌和昆虫细胞。
具体地，根据本发明的宿主细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌属、假单胞菌属、奇异变形杆菌或葡萄球菌属。它也可以是真菌，诸如曲霉属、酵母诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母菌、裂殖酵母菌属或粗糙链孢霉、其他低等真核细胞、或真核细胞诸如高等真核生物诸如昆虫的细胞。
此外，根据本发明的宿主细胞可以来源于植物或哺乳动物。可以优选使用猴肾细胞7(COS7)、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT 78细胞或HEK293细胞，但不限于此。特别优选地，可以使用CHO细胞。
将核酸或载体转染到宿主细胞中。对于“转染”，可以使用通常用于将外源核酸(DNA或RNA)引入原核或真核宿主细胞的许多不同技术，诸如电泳、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染或脂质体转染。各种表达宿主/载体组合可以用于表达根据本发明的PH20重组多肽。用于真核宿主的合适表达载体包括但不限于来源于SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列。可在细菌宿主中使用的表达载体包括从大肠杆菌获得的细菌质粒，诸如pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322、pMB9或其衍生物；宿主范围更广的质粒，诸如RP4；噬菌体DNA，其可以由多种多样的噬菌体λ衍生物作为示例，诸如λgt10和λgt11或NM989；和其他DNA噬菌体，诸如M13或丝状单链DNA噬菌体。对酵母细胞有用的表达载体是2℃质粒及其衍生物。对昆虫细胞有用的载体是pVL941。
在另一方面，本发明涉及一种生产根据本发明的重组PH20重组多肽的方法，包括培养宿主细胞以表达根据本发明的重组PH20重组多肽的步骤。
当将能够表达PH20重组多肽的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，可通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选足以允许PH20重组多肽分泌到培养宿主细胞的培养基中的一段时间，来产生PH20重组多肽。
在某些情况下，所表达的PH20重组多肽可以从宿主细胞中分离并纯化至均质。PH20重组多肽的分离或纯化可以通过任何常用于蛋白质的分离或纯化方法(诸如层析)来进行。层析可以是例如但不限于选自亲和层析、离子交换层析或疏水层析的一种或多种组合。除了层析之外，过滤、超滤、盐析或透析可以结合使用。
在下文中，给出实施例以进一步描述本发明。提供以下实施例仅是为了说明本发明，对于本领域技术人员来说，显然本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1.N-末端和/或C-末端切割的重组PH20透明质酸酶的克隆
对于PH20多肽的表达，通过Genscript(韩国)来合成编码野生型人PH20多肽的氨基酸L36至S509的序列、编码来自猴(长鼻猴)的PH20多肽(UniprotID:H2DJA7)的氨基酸M1至L510的DNA序列、编码来自牛(家牛)的PH20多肽(Uniprot ID:F1MTV1)的氨基酸L36至H478的DNA序列、以及编码来自绵羊(绵羊(Ovis aries))的PH20多肽(Uniprot ID:W5NSU1)的氨基酸L36至H477的DNA序列。
通过聚合酶链式反应(下文称为“PCR”)扩增每个合成的PH20多肽基因，并将其插入pcDNA3.4-TOPO载体的XhoI或NotI限制性酶位点。为了在ExpiCHO细胞中表达，使用了人血清白蛋白信号肽。对于使用HisTrap柱的蛋白质纯化，将His标签的DNA序列放置于PH20cDNA的3'末端处。对N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽进行PCR，并通过DNA测序证实氨基酸置换。
为了产生N-末端切割的人PH20多肽的变体，制备了含有L36-Y482的质粒，并将其用作模板以产生四种变体，其中氨基酸从N-末端依次一个接一个地被除去，并且对于每种变体，四种变体的C-末端终止于F468。
为了产生N-末端切割的猴(长鼻猴)PH20多肽的变体，制备了含有L36至Y483的质粒，并将其用作模板以产生五种变体，其中氨基酸从N-末端依次一个接一个地被除去。
为了产生N-末端切割的牛(家牛)PH20多肽的变体，制备了含有L36至H478的质粒，并将其用作模板以产生五种变体，其中氨基酸从N-末端依次一个接一个地被除去。
为了产生N-末端切割的绵羊(绵羊(Ovis aries))PH20多肽的变体，制备了含有L36至H477的质粒，并将其用作模板以产生五种变体，其中氨基酸从N-末端依次一个接一个地被除去。
实施例2.N-末端和/或C-末端切割的重组PH20透明质酸酶的表达和纯化
通过使用ExpiCHO表达系统进行N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽的表达。当ExpiCHO细胞的细胞密度达到6×106个细胞/mL时，使用ExpiFectamine CHO试剂将含有插入pcDNA3.4-TOPO载体的N-末端和C-末端切割的PH20多肽的cDNA的质粒转染到ExpiCHO细胞中。作为细胞培养基，使用ExpiCHO表达培养基(100至500mL)。转染后，将ExpiCHO细胞以130rpm振荡并培养总共6天，在此期间，将细胞在37℃下温育1天，并进一步在32℃的较低温度下温育5天。温育完成后，通过以10,000rpm离心30分钟收集细胞上清液。
使用AKTA prime设备或类似设备(GE Healthcare)通过两步柱层析纯化从ExpiCHO细胞产生的在C末端处具有His标签的PH20多肽。对于人PH20和猴PH20，使用Q琼脂糖凝胶(其是阴离子交换层析)，因为pI接近6。对于牛或绵羊PH20多肽，pI大于8，因此使用Capto S柱(其是阳离子交换层析)进行第一次纯化，使用HisTrap HP柱(其是His标签亲和层析)进行每种蛋白质的第二次纯化。
为了通过使用Q琼脂糖凝胶柱纯化蛋白质，制备了缓冲液A(20mM磷酸钠，pH 7.5)和缓冲液B(20mM磷酸钠，pH 7.5，0.5M NaCl)。将培养基的pH和电导率调节至与缓冲液A相同，并将培养基通过孔径为0.22μm的膜过滤。将蛋白质结合到Q琼脂糖凝胶柱上，使5CV的缓冲液A流动以除去非特异性结合的蛋白质，并使5CV的缓冲液B以0至100％的浓度梯度流动，以便洗脱蛋白质。
为了使用Capto S柱纯化蛋白质，制备了缓冲液A(20mM磷酸钠，15mM NaCl，pH6.0)和缓冲液B(20mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 6.0)。将培养基的pH和电导率调节至与缓冲液A相同，并将培养基通过孔径为0.22μm的膜过滤。然后将蛋白质结合到Capto S柱上，使3倍柱体积(CV)的缓冲液A流过以除去非特异性结合的蛋白质。使4CV的缓冲液B顺序流动以洗脱靶蛋白质。
为了使用HisTrap HP柱纯化蛋白质，制备了缓冲液A(20mM磷酸钠，500mM NaCl，pH7.5)和缓冲液B(20mM磷酸钠，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.5)。在蛋白质样品与HisTrapHP柱结合后，7CV的7％缓冲液B流动以除去非特异性结合的蛋白质，并且使3CV的40％缓冲液B流动以洗脱靶蛋白质。使用透析缓冲液(20mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 7.0)透析柱洗脱液。
实施例3.N-末端和/或C-末端切割的重组PH20透明质酸酶的N-末端测序
纯化的N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽以每7.5％ SDS-PAGE凝胶的泳道10μg的量上样，并进行电泳(150V，1小时)。然后将含有经电泳展开的蛋白质的凝胶引入具有PVDF膜的印迹试剂盒中，并在100V下转移90分钟，通过丽春红S染色确认转移。最后，使用PPSQ-53A蛋白质测序仪(Shimadzu，日本)对通过切取每个蛋白质条带获得的样品从N-末端开始的5个氨基酸进行测序。
作为N-末端测序的结果，证实了其他PH20多肽具有预期的序列，但是在一些具有N37-Y482或N37-F468的人PH20多肽中，发现N-末端处的氨基酸是天冬氨酸而不是天冬酰胺，导致了去酰胺化。基于这一结果和图4的多重序列分析，表明天冬氨酸被发现作为牛和绵羊中相应的氨基酸，可以推断天冬氨酸作为该位置处的氨基酸在稳定蛋白质结构中起作用。
实施例4.重组N-末端和/或C-末端切割的PH20透明质酸酶活性的测量
透明质酸酶的活性通过浊度测定法来测量，浊度是由透明质酸与白蛋白(BSA)混合时产生的沉淀引起的，其是通过吸光度来测量的。当透明质酸被PH20多肽水解时，通过混合透明质酸和白蛋白产生的沉淀的浊度/吸光度降低。该测定通常在pH 5.3下进行，如下所述。将具有已知活性(单位)的透明质酸酶标准品稀释至6、8、10、12、15和20单位/mL，并在每个试管中制备。通过调节稀释因数使其符合标准曲线的范围，在缓冲液(20mM磷酸钠，pH5.3，77mM氯化钠和0.01％(w/v)牛血清白蛋白)中稀释经纯化的蛋白质样品。将50μl的经稀释的样品分配到96孔板的每个孔中，并在37℃下经受加热反应10min。将50μl的0.06％透明质酸另外分配到每个孔中。0.06％透明质酸处于溶解在300mM的pH为5.3的磷酸钠缓冲液中的状态。将样品和0.06％透明质酸在37℃下反应45分钟。反应后，将40μl的酶-底物反应溶液分配到200μl的酸性白蛋白溶液中，并在室温下静置19min。然后使用分光光度计在600nm处测量吸光度。酸性白蛋白溶液由溶解在pH为3.75的缓冲液中的0.1％白蛋白(BSA)组成，该缓冲液包含24mM的乙酸钠和79mM的乙酸。使用活性标准品，通过标准曲线将经测量样品的吸光度值转化为活性。
当在pH 7.0下进行上述步骤时，蛋白质样品缓冲液是pH为7.0的20mM的磷酸钠、77mM的氯化钠和0.01％(w/v)牛血清白蛋白，并且对于0.06％透明质酸水溶液是将透明质酸溶解于pH为7.0的20mM磷酸钠缓冲液和70mM的氯化钠中。
这些活性测量也可以在培养基中进行。在这种情况下，由于低于300单位/mL的值是不可靠的，所以将定量限(LOQ)设置为300单位/mL，低于该值的值被标记为无效，即0。此外，在使用经纯化的蛋白质样品进行活性测量的情况下，将定量限(LOQ)设定为15单位/μg。
除了SEQ ID No.1的野生型PH20多肽的M1至T35的信号序列之外，将N-末端调整为L36、N37、F38、R39或A40，并选择C-末端为F468或Y482，通过实施例1的方法产生总共10种N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽。在通过动物细胞的瞬时转染培养获得的培养基中纯化这些克隆中的每一个，并通过实施例2的方法比较pH 5.3和pH 7.0下的酶活性。
如图1所示，从比较每个培养基中人PH20活性的结果来看，令人惊讶的是，培养基中N37-Y482的活性比具有野生型N-末端的成熟L36-Y482的培养基中的活性高3倍以上，并且培养基中其中N-末端另外缺失两个氨基酸残基的F38-Y482的人PH20活性也比具有野生型N-末端的成熟L36-Y482的培养物中的活性高2倍以上。
然而，缺少三个N-末端氨基酸残基的R39-Y482导致酶的几乎不表达，并且缺少四个N-末端氨基酸残基的A40-Y382也导致培养物中酶的几乎不表达。
总之，对于人透明质酸酶PH20，发现在成熟人透明质酸酶PH20中缺少一个或两个N-末端氨基酸残基的变体在培养基中表现出显著增加的表达。特别地，考虑到用于注射的人透明质酸酶PH20的工业可用性，表明通过生产其中一个或两个N-末端氨基酸被切割的变体酶，可以获得工业上和经济上优异的变体。
此外，如图2和图3所示，L36-Y482、N37-Y482和F38-Y482的比活性之间几乎没有差异，证实了图1中人透明质酸酶PH20活性的差异是因为生产率的差异。此外，在具有比其C-末端终止于Y482的蛋白质短14个C-末端氨基酸的PH20变体中，只有缺失一个N-末端氨基酸的N37-F468在培养基中有活性。
特别地，图2示出了每种经纯化的多肽在pH 5.3下的比活性，证实了当C-末端是Y482时L36-Y482、N37-Y482和F38-Y482之间几乎没有差异，但当C-末端为F468时，N37-F468和F38-F468具有比L36-F468高1.5至2倍的比活性。在pH 7.0下的比活性显示出相同的模式。
也就是说，基于图2和图3中所示的结果，商业上使用的PH20的较短变体(L36-F468，其中C-末端氨基酸被进一步切割至第468位的末端)在动物细胞中几乎不表达。作为纯化其中表达的非常少量的L36-F468变体并测量其比活性的结果，酶的比活性与L36-Y482相比大约为60％。基于这些发现，当从成熟的人透明质酸酶PH20缺失一个或两个额外的N-末端氨基酸残基时，PH20多肽的透明质酸蛋白酶活性或生产率显著增加。
总之，尽管由L36-F468组成的人透明质酸酶PH20变体酶的比活性与L36-Y482PH20变体相比没有显著降低，但其在重组细胞中的表达极低，使其不适合工业使用。
另一方面，对于N37-F468变体，在细胞中的表达显著增加，这与L36-Y482变体的表达类似，但是N37-F468(其进一步缺失一个N-末端氨基酸)在细胞中的表达，与L36-F468相比，显著增加了至少100倍。
鉴于PH20的分子模型和本发明的实验结果，在重组PH20蛋白在细胞中表达时的转录和易位期间PH20的N-末端处的氨基酸和C-末端处的氨基酸之间的相互作用影响稳定性、折叠速率等，此外，极大地影响从细胞分泌的重组蛋白的表达。这显著影响了PH20及其变体的生产率。这些结果不仅可以应用于人PH20，还可以应用于哺乳动物来源的PH20，诸如牛或绵羊，并且进一步，预期可以应用于具有与人PH20相似的结构或物理化学特性的其他PH20。
此外，发现在哺乳动物PH20中保持了这些特性，所述哺乳动物PH20具有与人PH20多肽相似的序列结构和相同的生物功能，特别是表1中列出的猴(长鼻猴)、牛(家牛)和绵羊(绵羊(Ovis aries))PH20，如图5和图6所示。特别是，当N-末端起始于A40时，发现绵羊PH20多肽会高度地表达。
总之，本发明的结果表明，对于成熟的PH20蛋白，特别是动物PH20诸如人PH20，除去N-末端处额外的一至四个，优选一或两个氨基酸残基可以显著增加重组细胞中的表达率，从而增加蛋白生产率。
对于人PH20，当C-末端终止于Y482时，从成熟PH20中除去了一些额外的N-末端氨基酸残基的PH20显示出显著增加的表达，而透明质酸酶的内在活性没有显著变化，当C-末端终止于F468时，与具有完整N-末端的成熟蛋白质相比，从成熟PH20中除去了一个或两个额外的N-末端氨基酸残基的变体反而显示出增加的酶的比活性。虽然已经尝试通过在人PH20的氨基酸序列的特定位点置换不同的氨基酸来增加蛋白质的比活性，但是还没有报道通过除去N-末端的氨基酸同时保持或增加其活性来显著增加其在细胞中的表达的情况。据预测，经缺失N-末端的变体在免疫原性方面优于其中一个或多个氨基酸在一个或多个特定位点被替换的PH20，甚至在人体内长期给药后也是如此。
已经有报道表明了当成熟蛋白的N-末端被切割时表达增加，诸如关于人α1-抗胰蛋白酶(H.Johansen等人,Mol.Biol.Med.1987,4:291-305)和人乳头瘤病毒L1蛋白(M.Wei等人,Emerging Microbes&Infections,2018,7:160)的研究，但是很难在N-末端位点的氨基酸位置、截短数量等方面找到彼此的相似性。例如，在人α1-抗胰蛋白酶中，5至10个N-末端氨基酸的缺失增加了细胞中的表达，但没有改变酶的活性，而在人乳头瘤病毒L1蛋白中，10或15个N-末端氨基酸的切割没有改变蛋白的整体表达，但在某些情况下增加了蛋白的溶解性。特别是，对于透明质酸酶诸如PH20，还没有进行过这样的尝试，也没有发现像本发明中那样切割一个或两个N-末端氨基酸显着增加表达和活性的情况。
对人PH20的三维晶体结构尚不清楚。然而，根据使用程序对PH20的三维结构的预测，预测尽管氨基酸F38、R39和Y434位于PH20的N-末端处第37位的天冬酰胺侧链附近，并且在它们之间具有适当的电荷相互作用，但是成熟蛋白质中的氨基酸Leu36不与周围的氨基酸形成任何特定的键，并且疏水性氨基酸暴露于水溶液，从而不利地影响结合速度或稳定性，进而影响蛋白质的表达。
在成熟的野生型动物PH20蛋白质中，具有不会显著改变蛋白质三维结构的氨基酸置换的变体可以显示与本发明相同的结果。由于在分别与人PH20具有63.6％和63.5％同一性的牛和绵羊PH20中，以及与人PH20具有超过93.1％同一性的灵长类PH20中也证实了其效果，对于与人PH20具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的PH20，在蛋白质的三维结构没有被显著修饰的范围内，可以预测相同的结果。
实施例5.具有不同信号肽的N-末端和/或C-末端切割的重组PH20透明质酸酶的制备以及活性的测量
制备了九种用人PH20、人血清激素或Igκ的单一肽替换的变体，以鉴定信号肽的变化。信号肽的序列列于下表2。
在前面的实施例中，信号肽来自人血清白蛋白(HSA)，并且测试了表2中列出的其他信号肽是否也获得了相同的结果。
除了应用表2中的信号肽之外，如实施例1和2中那样制备重组人PH20的L36-Y482、N37-Y482和F38-Y482，并如实施例4中那样进行活性测定，结果示于图7中。
如图7所示，即使当使用人PH20或Igκ的信号肽时，依赖于成熟PH20的N末端缺失的生产率变化倾向于与使用人血清激素的信号肽的情况相似。在这点上，证实了具有在N-末端氨基酸进一步的缺失的成熟PH20中表达和生产率的增加与信号肽的类型关系不大。
工业实用性
与常规重组PH20多肽相比，本文所述的具有改善的酶活性和生产率的N-末端和/或C-末端切割的PH20多肽表现出优异的表达和更高的酶活性，这可使得治疗成本的降低，因为工业使用的生产成本更低。
前面已经详细描述了本发明的某些方面。对于本领域技术人员来说，显然这些特定的实施例仅仅是优选的实施方式，并不意图限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。
参考文献
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4.M.F.Meyer,G.Kreil,and H.Aschauer,"The soluble hyaluronidase frombull testes is a fragment of the membrane-bound PH-20enzyme",FEBS letter(1997)413:385-388。
序列表自由文本
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Claims (13)

1.一种重组PH20多肽，其中，成熟动物野生型PH20的N-末端处缺失1至7个氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的重组PH20多肽，其特征在于，其选自由以下组成的组：
(a)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的人野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(b)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.2至8中任一个的氨基酸序列的灵长类野生型PH20中，在选自由N37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；
(c)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.9的氨基酸序列的牛野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基；以及
(d)重组PH20多肽，其中在具有SEQ ID No.10的氨基酸序列的绵羊野生型PH20中，在选自由D37至P42组成的组的氨基酸残基之前，通过切割缺失一个或多个N-末端氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的重组PH20多肽，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中起始于N37、F38、R39、A40、P41或P42的序列。
4.根据权利要求1所述的重组PH20多肽，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中起始于N37或F38的序列。
5.根据权利要求1所述的重组PH20多肽，其中，C-末端处的一些氨基酸残基进一步缺失。
6.根据权利要求5所述的重组PH20多肽，其特征在于，在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中选自由F468至Y482组成的组的氨基酸残基之后通过切割缺失一个或多个C-末端氨基酸残基。
7.根据权利要求6所述的重组PH20多肽，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中终止于F468或Y482的序列。
8.根据权利要求1所述的重组PH20多肽，其特征在于，其选自由以下组成的组：
(1)PH20多肽，其包含SEQ ID No.1的起始于N37并且终止于Y482(N37-Y482)的氨基酸序列；
(2)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于N37并且终止于F468(N37-F468)的氨基酸序列；
(3)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于F38并且终止于Y482(F38-Y482)的氨基酸序列；或
(4)PH20多肽，包含SEQ ID No.1的起始于F38并且终止于F468(F38-Y468)的氨基酸序列；
(5)PH20多肽，包含SEQ ID No.2至8中任一个的起始于N37并且终止于L490(N37-L490)的氨基酸序列；
(6)PH20多肽，包含SEQ ID No.2至8中任一个的起始于F38并且终止于L490(F38-L490)的氨基酸序列；
(7)PH20多肽，包含SEQ ID No.9的起始于D37并且终止于H478(D37-H478)的氨基酸序列；
(8)PH20多肽，包含SEQ ID No.9的起始于F38并且终止于H478(F38-H478)的氨基酸序列；
(9)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于D37并且终止于H477(D37-H477)的氨基酸序列；
(10)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于F38并且终止于H477(F38-H477)的氨基酸序列；
(11)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于R39并且终止于H477(R39-H477)的氨基酸序列；以及
(12)PH20多肽，包含SEQ ID No.10的起始于A40并且终止于H477(A40-H477)的氨基酸序列。
9.一种编码根据权利要求1至8中任一项所述的重组PH20多肽的核酸。
10.一种包含根据权利要求9所述的核酸的重组表达载体。
11.一种用根据权利要求10所述的重组表达载体转染的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，其选自由以下组成的组：动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌和昆虫细胞。
13.一种生产重组PH20多肽的方法，其包括培养根据权利要求12所述的宿主细胞的步骤。
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