CN118401653A

CN118401653A - 用于同种异体细胞疗法的遗传修饰细胞

Info

Publication number: CN118401653A
Application number: CN202280067039.8A
Authority: CN
Inventors: S·施雷弗
Original assignee: Sana'a Biotechnology Co
Current assignee: Sana'a Biotechnology Co
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2024-07-26

Abstract

提供了用于同种异体细胞疗法中的工程化细胞，所述工程化细胞含有一个或多个修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，工程化细胞是低免疫原性细胞。

Description

用于同种异体细胞疗法的遗传修饰细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年8月11日提交的美国临时专利申请号63/232,163和于2022年6月17日提交的美国临时专利申请号63/353,548的优先权和利益，所述美国临时专利中每一篇的内容出于各种目的据此通过引用整体并入本文。

参考电子序列表

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技术领域

在某些方面，本公开涉及用于同种异体细胞疗法中的含有一个或多个修饰(诸如遗传修饰)的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫低下细胞。

发明内容

受体对供体同种抗原的致敏作用是包括细胞疗法在内的临床移植疗法面临的一个问题。例如，移植受体的免疫系统排斥同种异体材料的倾向大大降低了移植疗法的潜在功效，并且减少了围绕此类治疗可能产生的积极影响。仍然需要用于用于治疗多种病症和疾患的改良同种异体细胞，包括用于产生避免被受体免疫系统检测到的基于同种异体细胞的疗法的新途径、组合物和方法。

在某些方面，本文提供了一种包含修饰的工程化细胞，所述修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低一种或多种主要组织相容性复合物I类分子(MHC I类分子)和/或一种或多种MHC II类分子的表达，其中表达的变化是相对于不包含修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

在一些实施方案中，修饰包括以下的表达降低：(i)一种或多种MHC I类分子；(ii)一种或多种MHC II类分子；或(iii)一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子。

在一些实施方案中，修饰包括B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B或NFY-C中的一种或多种的表达降低。

在一些实施方案中，工程化细胞不表达一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子。

在一些实施方案中，工程化细胞不表达B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B或NFY-C中的一种或多种。

在一些实施方案中，修饰通过降低一种或多种MHC I类分子的细胞表面表达来降低一种或多种MHC I类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过降低β-2微球蛋白(B2M)的表达来降低一种或多种MHC I类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过降低B2M基因活性来降低一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达。

在一些实施方案中，修饰通过失活或破坏B2M基因的两个等位基因来降低一种或多种MHC I类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过失活或破坏所有B2M编码序列来降低一种或多种MHCI类分子的表达。

在一些实施方案中，失活或破坏包括B2M基因中的插入缺失(indel)或B2M基因的基因组DNA连续段的缺失。

在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。

在一些实施方案中，B2M基因被敲除。

在一些实施方案中，修饰通过CRISPR相关转座酶、先导编辑(prime editing)或经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)来进行。

在一些实施方案中，修饰通过核酸酶介导的基因编辑来降低一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达。

在一些实施方案中，CRISPR相关转座酶、先导编辑、经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)或核酸酶介导的基因编辑通过选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质来进行：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和CRISPR相关转座酶。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过靶向B2M基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，并且CRISPR-Cas组合包含具有与B2M基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

在一些实施方案中，修饰通过降低一种或多种MHC II类分子的细胞表面表达来降低一种或多种MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过降低CIITA的表达来降低一种或多种MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过降低CIITA基因活性来降低一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达。

在一些实施方案中，修饰通过失活或破坏CIITA基因的两个等位基因来降低一种或多种MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，修饰通过失活或破坏所有CIITA编码序列来降低一种或多种MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，失活或破坏包括CIITA基因中的插入缺失或CIITA基因的基因组DNA连续段的缺失。

在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。

在一些实施方案中，CIITA基因被敲除。

在一些实施方案中，修饰通过核酸酶介导的基因编辑来降低一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或靶向CIITA基因的CRISPR-Cas组合来进行。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，并且CRISPR-Cas组合包含具有与CIITA基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，修饰通过CRISPR相关转座酶、先导编辑或经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)来进行。

在某些方面，本文提供了一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；和(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达，其中表达的变化是相对于不包含所述一个或多个修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

在某些方面，本文提供了一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；和(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达，其中所述一种或多种致耐受性因子增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达，其中表达的变化是相对于不包含所述一个或多个修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

在一些实施方案中，一个或多个修饰：降低一种或多种主要组织相容性复合物I类分子(MHC I类分子)和/或一种或多种MHC II类分子的表达，增加CD47和任选地CD24和/或PD-L1的表达，和/或增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达。

在一些实施方案中，细胞包含一种或多种MHC I类分子(MICA和/或MICB)和TXNIP中的任何一种的敲除、以及PD-L1和HLAE的敲入。

在一些实施方案中，细胞包含A20/TNFAIP3和MANF的敲入。

在一些实施方案中，工程化细胞包含一个或多个修饰以降低MICA的表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含在工程化细胞上降低的MICA表面表达，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在一些实施方案中，降低MICA表达的修饰降低MICA的蛋白质表达。

在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在可检测的MICA细胞表面表达。

在一些实施方案中，降低MICA表达的修饰降低编码MICA的mRNA表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含消除MICA基因活性的一个或多个修饰。

在一些实施方案中，修饰包括MICA基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括所有MICA编码序列的失活或破坏。

在一些实施方案中，失活或破坏包括MICA基因中的插入缺失。

在一些实施方案中，修饰包括MICA基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

在一些实施方案中，修饰包括敲除。

在一些实施方案中，修饰是靶向MICA基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑修饰是锌指核酸酶(ZFN)介导的修饰、TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的修饰或CRISPR-Cas组合介导的。

在一些实施方案中，Cas选自Cas9或Cas12。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有与MICA基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

在一些实施方案中，工程化细胞包含降低MICB表达的修饰。

在一些实施方案中，工程化细胞包含在工程化细胞上降低的MICB表面表达，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在一些实施方案中，降低MICB表达的修饰降低MICB的蛋白质表达。

在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在可检测的MICB细胞表面表达。

在一些实施方案中，降低MICB表达的修饰降低编码MICB的mRNA表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含消除MICB基因活性的修饰。

在一些实施方案中，修饰包括MICB基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括所有MICB编码序列的失活或破坏。

在一些实施方案中，失活或破坏包括MICB基因中的插入缺失。

在一些实施方案中，修饰是MICB基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

在一些实施方案中，修饰是敲除。

在一些实施方案中，其中修饰是靶向MICB基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

在一些实施方案中，Cas选自Cas9或Cas12。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有与MICB基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，修饰降低NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和RHD中的任何一种或多种的表达。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1或Serpinb9。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD24。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括PD-L1。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD46。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD55。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD59。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CR1。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括MANF。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括A20/TNFAIP3。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E和CD47。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47、PDL1、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或A20/TNFAIP以及任选地MANF中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或MANF以及任选地A20/TNFAIP中的一种或多种，包括全部。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8。

在一些实施方案中，工程化细胞包含根据以下的修饰：(i)(a)降低一种或多种MHCI分子和/或一种或多种MHC II分子的表达；和(b)增加CD47的表达；(ii)(a)降低一种或多种MHC I分子和/或一种或多种MHC II分子的表达；(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

(c)增加CD47以及任选地CD24和PD-L1的表达；和(d)增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达；(iii)(a)降低一种或多种MHC I类分子的表达；(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；(c)降低TXNIP的表达；(d)增加PD-L1和HLA-E的表达；和(e)任选地，增加A20/TNFAIP3和MANF的表达；(iv)(a)增加CCL21,PD-L1,FASL,SERPINB9,HLA-G,CD47,CD200和MFGE8的表达；和(b)降低MICA和/或MICB的表达；(v)(a)上述(i)-(iv)中任一项还包括增加或减少靶标表达的另外的编辑。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子是CD47。

在一些实施方案中，CD47具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一部分具有至少约85％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子的表达的增加包括所述一种或多种致耐受性因子的细胞表面表达的增加。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子之一是外源多肽。

在一些实施方案中，修饰包括编码所述一种或多种致耐受性因子的一种或多种外源多核苷酸。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的每一种与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。

在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1a启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和UBC启动子。

在一些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸被整合到一个或多个基因组基因座中。

在一些实施方案中，整合是非靶向插入。

在一些实施方案中，非靶向插入通过使用慢病毒载体将外源多核苷酸引入细胞中来进行。

在一些实施方案中，整合是靶向插入。

在一些实施方案中，一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组：MICA基因座、MICB基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRBC基因座、CD142基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、ROSA26基因座、LRP1基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

在一些实施方案中，该一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组B2M基因座、TAP1基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、MIC-A基因座、MIC-B基因座和安全港基因座。

在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子表达的增加包括经由启动子增加内源基因的基因活性的修饰。

在一些实施方案中，增加基因活性的修饰通过修饰内源启动子或引入异源启动子来进行。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于人类细胞或动物细胞，任选地猪细胞、牛细胞或羊细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于人类细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于从多能干细胞或其后代衍生的分化细胞。

在一些实施方案中，多能干细胞是或来源于诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于从供体受试者分离的原代细胞。

在一些实施方案中，供体受试者在从供体受试者获得原代时是健康的或没有被怀疑患有疾病或疾患。

在一些实施方案中，工程化细胞选自β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌肉细胞、心脏细胞、血细胞、胰岛细胞、平滑肌细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心肌细胞、视觉细胞(optic cell)、干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(PSC)。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于内皮细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于上皮细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于多能干细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于胚胎干细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是或来源于间充质谱系的细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是ABO血型O型、恒河猴因子阴性(Rh-)(包含功能性ABO A等位基因和/或功能性ABO B等位基因)或恒河猴因子阳性(Rh+)中的一种或多种。

在一些实施方案中，工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。

在某些方面，本文提供了一种细胞群，其包含本文所述的任何细胞群。

在一些实施方案中，群体中至少约30％的细胞包含本文所述的工程化细胞。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含修饰。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在一些实施方案中，群体中至少约50％的细胞不具有MICA多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，工程化细胞上降低的MICB多肽表面表达被降低至相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞的MICB多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％的细胞不具有MICB多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码所述一种或多种致耐受性因子的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和CIITA表达。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使B2M基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

在一些实施方案中，相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使CIITA基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

在某些方面，本文提供了一种组合物，其包含本文所述的任何细胞群。

在某些方面，本文提供了一种包含本文所述的任何细胞群的组合物，其中：(a)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽细胞表面表达，并且其中工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；(b)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)其中相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在某些方面，本文提供了一种包含本文所述的任何细胞群的组合物，其中：(a)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)其中相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在某些方面，本文提供了一种包含本文所述的任何细胞群的组合物，其中：(a)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽细胞表面表达，并且其中工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；(b)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中在工程化细胞上降低的MICB多肽表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；(c)相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(d)其中相对于不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代β胰岛细胞群的组合物，其中所述工程化原代β胰岛细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代T细胞群的组合物，其中所述工程化原代T细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(ii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代甲状腺细胞群的组合物，其中所述工程化原代甲状腺细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代皮肤细胞群的组合物，其中所述工程化原代皮肤细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代内皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代内皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在某些方面，本文提供了一种包含工程化原代视网膜色素上皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代视网膜色素上皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞在B2M基因的所有等位基因中包含插入缺失。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞还包含CIITA基因的所有等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞在CIITA基因的所有等位基因中包含插入缺失。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；B2M^indel ^/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICB^indel/indel；B2M^indel ^/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

在一些实施方案中，工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；MICB^indel ^/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

在一些实施方案中，使用基于核酸酶的基因编辑对工程化细胞进行工程化。

在一些实施方案中，组合物是药物组合物。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载剂。

在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂。

在一些实施方案中，冷冻保护剂包含浓度为约5％至约10％DMSO(v/v)的DMSO。

在某些方面，本文提供了一种容器，其包含本文所述的任何组合物的组合物。

在一些实施方案中，容器是无菌袋。

在一些实施方案中，无菌袋是冷冻保存相容的。

在某些方面，本文提供了一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)降低或消除源细胞中一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低或消除源细胞中MICA和/或MICB的表达。

在某些方面，本文提供了一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，其中所述受试者被怀疑患有或患有自身免疫性疾病，所述方法包括：(a)降低或消除源细胞中MHC I类分子和/或MHC II类分子的表达；(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低或消除所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

在某些方面，本文提供了一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，其中所述受试者被确定具有抗MICA抗体和/或抗MICB抗体，所述方法包括：(a)降低或消除源细胞中MHCI类分子和/或MHC II类分子的表达；(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低或消除源细胞中MICA和/或MICB的表达。

在一些实施方案中，方法包括如果受试者具有抗MICA抗体，则降低或消除MICA的表达，任选地进一步降低或消除MICB的表达。

在一些实施方案中，方法包括如果受试者具有抗MICB抗体，则降低或消除MICB，任选地进一步降低或消除MICA的表达。

在一些实施方案中，方法包括如果受试者具有抗MICA抗体和抗MICB抗体，则降低或消除MICA和MICB的表达。

在某些方面，本文提供了一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)降低或消除源细胞中一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)当个体被确定具有特异性地识别多肽的抗体时，降低或消除源细胞中多肽的表面表达。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDOl、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8和SERPINB9、及其任何组合。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8、及其任何组合。

在一些实施方案中，方法包括降低或消除一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子的表达。

在某些方面，本文提供了一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)增加源细胞中CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达；和(b)降低源细胞中MICA和/或MICB的表达。

在某些方面，本文提供了一种制造工程化细胞的方法，所述方法包括以下组合中的任一种：(i)(a)降低一种或多种MHC I分子和/或一种或多种MHC II分子的表达；(b)降低MICA和/或MICB的表达；(c)增加CD47、任选地CD24和PD-L1的表达；和(d)增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达；(ii)(a)降低一种或多种MHC I类分子的表达；(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；(c)降低TXNIP的表达；(d)增加PD-L1和HLA-E的表达；和(e)任选地，增加A20/TNFAIP3和MANF的表达；(iii)(a)增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达；和(b)降低MICA和/或MICB的表达；(iv)(a)降低一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；和(b)增加CD47的表达；(v)(i)-(iv)中任一项还包括增加或减少基因表达的另外的编辑。

在某些方面，本文提供了一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)敲除一种或多种MHC I分子；(b)敲除MICA和/或MICB；(c)敲除TXNIP；和(d)敲入PD-L1和HLAE。

在一些实施方案中，如本文所述的任何方法还包括敲入A20/TNFAIP3和MANF。

在一些实施方案中，如本文所述的任何方法还包括降低或消除MICA的表达，并且其中降低或消除表达包括降低或消除MICA蛋白的表达。

在一些实施方案中，如本文所述的任何方法还包括降低或消除MICB的表达，并且其中降低或消除表达包括降低或消除MICB蛋白的表达。

在一些实施方案中，降低或消除MICA和MICB的表达，并且其中降低或消除表达包括降低或消除MICA和MICB蛋白的表达。

在一些实施方案中，降低或消除表达包括降低或消除细胞表面表达。

在一些实施方案中，降低或消除表达包括引入降低或消除相关基因活性的修饰。

在一些实施方案中，修饰是基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，失活或破坏包括插入缺失。

在一些实施方案中，插入缺失是基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

在一些实施方案中，方法包括敲除相关基因活性。

在一些实施方案中，降低或消除一种或多种MHC I类分子表达的修饰是B2M的修饰。

在一些实施方案中，降低或消除一种或多种MHC I类分子表达的修饰是CIITA的修饰。

在一些实施方案中，修饰通过核酸酶介导的基因编辑来进行。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合包含选自由以下组成的组的Cas：Cas9或Cas12。

在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，其中所述CRISPR-Cas组合包含指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰包括引入编码一种或多种致耐受性因子的至少一种外源多核苷酸。

在一些实施方案中，至少一种多核苷酸是编码两种或更多种致耐受性因子的多顺反子载体。

在一些实施方案中，至少一种多核苷酸被整合到细胞的基因组中。

在一些实施方案中，整合通过非靶向插入来进行。

在一些实施方案中，整合通过慢病毒载体来进行。

在一些实施方案中，整合通过靶向插入靶基因组基因座中来进行。

在一些实施方案中，整合通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

在一些实施方案中，其中所述靶基因组基因座选自由以下组成的组：MICA基因座、MICB基因座、B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、ROSA26基因座、LRP1基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

在一些实施方案中，如本文所述的任何方法还包括实施细胞分化技术，使得所述工程化细胞分化成期望的细胞类型。

在一些实施方案中，源细胞从供体受试者中分离。

在一些实施方案中，供体受试者是健康的，或者在分离的时候没有被怀疑患有疾病或疾患。

在某些方面，本文提供了一种使用本文所述的方法产生的工程化细胞。

在某些方面，本文提供了一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用本文所述的工程化细胞、本文所述的工程化细胞群或本文所述的组合物。

在一些实施方案中，疾患是疾病或细胞缺陷。

在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、乳糜泻、格雷夫斯病、银屑病、结肠炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、阿狄森氏病、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎和恶性贫血。

在一些实施方案中，细胞缺陷与造血疾病或病症相关，或者所述疾病或疾患是造血疾病或病症。

在一些实施方案中，造血疾病或病症是脊髓发育不良、再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞病、戴-布二氏贫血、沙赫曼戴蒙氏病、科斯特曼综合征、慢性肉芽肿病、肾上腺脑白质营养不良、白细胞粘附缺陷、血友病、地中海贫血、β-地中海贫血、白血病诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性(髓系)白血病(AML)、成人淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性髓系白血病(CML)、幼年型慢性髓性白血病(CML)和幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、严重联合免疫缺陷病(SCID)、X连锁严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽肿病、Chediak-Higashi综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或AIDS。

在一些实施方案中，细胞缺陷与白血病或骨髓瘤相关，或者其中所述疾病或疾患是白血病或骨髓瘤。

在一些实施方案中，细胞缺陷与自身免疫性疾病或疾患相关，或者所述疾病或疾患是自身免疫性疾病或疾患。

在一些实施方案中，自身免疫性疾病或疾患是急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增殖综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病(Balo disease)、巴洛同心硬化症、贝赫切特综合征(Bechetssyndrome)、伯杰氏病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、科干综合征(Cogan syndrome)、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈病、德库姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、附着点炎相关性关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化纤维发育不良、纤维化肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线性IgA病(LAD)、卢伽雷氏病、狼疮性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、米勒-费雪综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆哈-哈伯曼病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、视神经鞘炎、神经性肌强直、眼部瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、甲状腺炎、回文性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、拉斯穆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳氏病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、斯威特综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，细胞群是包含造血干细胞(HSC)和/或其衍生物的群体。

在一些实施方案中，细胞缺陷与帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、神经精神障碍性中风或肌萎缩侧索硬化症(ALS)相关，或者其中所述疾病或疾患是帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、神经精神障碍性中风或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

在一些实施方案中，细胞群是包含神经细胞和/或神经胶质细胞的群体。

在一些实施方案中，个体在循环中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体。

在一些实施方案中，个体表现出抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的持续存在。

在一些实施方案中，个体患有导致抗MICA抗体和/或抗MICB抗体存在的自身免疫相关疾患。

在一些实施方案中，自身免疫相关疾患是桥本氏病。

在一些实施方案中，自身免疫相关疾患是狼疮。

在一些实施方案中，自身免疫相关疾患是多发性硬化症。

在一些实施方案中，基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。

在一些实施方案中，选择个体还包括测量个体中抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在。

在某些方面，本文提供了一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括：(a)确定个体中的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，其中阳性抗MICA抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICA抗体，并且其中阳性抗MICB抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICB抗体；和(b)基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，向所述个体施用包含本文所述的工程化细胞群的组合物或本文所述的组合物，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA表达，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICB表达，并且其中如果抗MICA抗体状态和抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA和MICB表达。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括基于个体的抗MICA抗体状态和/或抗MICB抗体状态选择个体进行治疗。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括测量个体的抗MICA抗体状态和/或抗MICB抗体状态。

在某些方面，本文提供了一种鉴定适用于有需要的个体的同种异体疗法的方法，其中所述同种异体疗法包含含有本文所述的工程化细胞群的组合物或本文所述的组合物，所述方法包括确定个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态以鉴定适用于在所述个体中使用的同种异体疗法，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA表达的群体的工程化细胞，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICB表达的群体的工程化细胞，并且其中如果抗MICA抗体状态和抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA和MICB表达的群体的工程化细胞。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括向个体施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，个体已经被施用一种或多种免疫抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂是小分子或抗体。在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂选自由以下组成的组：环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、霉酚酸酯、皮质类固醇、泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素(deoxyspergualine)、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(胸腺肽-α)和免疫抑制抗体。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括环孢菌素。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括霉酚酸酯。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括皮质类固醇。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括环磷酰胺。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括雷帕霉素。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506)。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包括抗胸腺细胞球蛋白。

在一些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂是一种或多种免疫调节剂。

在一些实施方案中，一种或多种免疫调节剂是小分子或抗体。

在一些实施方案中，抗体结合一种或多种受体或配体，所述一种或多种受体或配体选自由以下组成的组：IL-2受体的p75、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD58、以及与其任何配体结合的抗体。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向个体施用或已经向个体施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向个体施用或已经向个体施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在第一次施用工程化细胞的同一天，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞之后，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向个体施用或已经向个体施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向个体施用或已经向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向个体施用或已经向个体施用一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，与为了减少不包含工程化细胞的修饰的免疫原性细胞的免疫排斥而施用的一种或多种免疫抑制剂的剂量相比，以更低的剂量施用所述一种或多种免疫抑制剂。

在一些实施方案中，工程化细胞能够受控杀伤工程化细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞包含自杀基因或自杀开关。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关在药物或前药的存在下或在被选择性外源化合物活化时诱导受控细胞死亡。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关是能够诱导工程化细胞凋亡的诱导蛋白。

在一些实施方案中，能够诱导工程化细胞凋亡的诱导蛋白是胱天蛋白酶蛋白质。

在一些实施方案中，胱天蛋白酶蛋白质是胱天蛋白酶9。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

在一些实施方案中，在向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之后，自杀基因或自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

在一些实施方案中，在向个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之前，自杀基因或自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

在一些实施方案中，在向个体施用工程化细胞之后，自杀基因或自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

在一些实施方案中，在对个体产生细胞毒性或其他负面后果的情况下，自杀基因或自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

在一些实施方案中，方法还包括施用允许工程化细胞群的工程化细胞耗尽的剂。

在一些实施方案中，允许工程化细胞耗尽的剂是识别工程化细胞表面上表达的蛋白质的抗体。

在一些实施方案中，抗体选自由以下组成的组：识别CCR4、CD16、CD19、CD20、CD30、EGFR、GD2、HER1、HER2、MUC1、PSMA和RQR8的抗体。

在一些实施方案中，抗体选自由以下组成的组：莫格利珠单抗(mogamulizumab)、AFM13、MOR208、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、乌利妥昔单抗(ublituximab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、利妥昔单抗、利妥昔单抗-Rllb、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)、RO5083945(GA201)、西妥昔单抗、Hul4.18K322A、Hul4.18-IL2、Hu3F8、达妥昔单抗(dinituximab)、c.60C3-Rllc及其生物类似药。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法包括施用识别工程化细胞表面上的一种或多种致耐受性因子的剂。

在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以表达一种或多种致耐受性因子。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子是CD47。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法还包括向个体施用一种或多种另外的治疗剂。

在一些实施方案中，已经向个体施用一种或多种另外的治疗剂。

在一些实施方案中，包括监测所述方法的治疗功效。

在一些实施方案中，包括监测所述方法的预防功效。

在一些实施方案中，重复所述方法直到出现期望的对一种或多种疾病症状的抑制。

在一些实施方案中，如本文所述的任何工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关以及与自杀基因或安全开关相关的基因由整合到工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关以及一种或多种致耐受性因子由整合到工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过非靶向插入到工程化细胞的基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将外源多核苷酸引入细胞中来整合。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过靶向插入到细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子是CD47。

在一些实施方案中，如本文所述的任何方法包括如本文所述的任何工程化细胞，其中所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，自杀基因选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过非靶向插入到工程化细胞的基因组中来整合。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过靶向插入到工程化细胞的靶基因组基因座中来整合。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子是CD47。

在一些实施方案中，如本文所述的任何组合物包含工程化细胞群的工程化细胞，所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，自杀基因以及与自杀基因或安全开关相关的基因由整合到工程化细胞群的工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

在一些实施方案中，自杀基因或自杀开关和外源CD47由整合到工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过非靶向插入到基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将外源多核苷酸引入工程化细胞群的工程化细胞中来整合。

在一些实施方案中，双顺反子盒通过靶向插入到工程化细胞群的工程化细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中所述靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

在一些实施方案中，如本文所述的任何工程化细胞，其中如本文所述的任何细胞群、或如本文所述的任何方法，其中所述工程化细胞包含一个或多个修饰以增加一种或多种致耐受性因子的表达，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1或Serpinb9。

在一些实施方案中，工程化细胞是自体细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是同种异体细胞。

附图说明

图1A-1C展示了施用本文所述的工程化细胞后可能遇到的场景。图1A示出了场景I；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中不存在针对一种或多种细胞表面抗原的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下表达一种或多种细胞表面抗原(例如，MICA和/或MICB)。图1B示出了场景II；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中存在针对一种或多种细胞表面抗原的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下表达一种或多种细胞表面抗原(例如，MICA和/或MICB)。图1C示出了场景III；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中存在针对MICA和/或MICB的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下具有降低的MICA和/或MICB表达。

图2显示了示出未工程化的人诱导多能干细胞(iPSC)以及B2M^indel/indel；CIITA^indel ^/indel；CD47tg人iPSC在非刺激和刺激条件下的MICA和MICB表达的流式细胞术图。

图3A-3C显示了示出人原代CD3+T细胞(图3A)、原代β胰岛(图3B)和iPSC衍生的β胰岛(图3C)上的MICA和MICB表达的流式细胞术图。

图4A提供了示出在未工程化的以及B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg iPSC来源的间充质干细胞(MSC)上的MICA和MICB表达的流式细胞术图。图4B显示了示出在MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC上的MICA和MICB表达的流式细胞术图。

图5显示了评价来自患有桥本氏病的个体志愿者和健康志愿者的血清样品中抗MICA抗体(A)和抗MICB抗体(B)的存在的蛋白质印迹。(M)指示分子量标记。

图6A-6E显示了在使用工程化MSC或iPSC细胞的供体特异性抗体(DSA)结合测定中来自患有桥本氏病的个体志愿者和健康志愿者的血清的平均荧光强度(MFI)图。图6A显示了来自患有桥本氏病的个体志愿者的B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果；图6B显示了来自患有桥本氏病的个体志愿者的MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果；图6C显示了来自患有桥本氏病的个体志愿者的iPSC(无MICA或MICB表达)和血清的DSA结果；图6D显示了来自健康志愿者的B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果；以及图6E显示了来自健康志愿者的MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果。

图7A和7B显示了来自患有桥本氏病的个体志愿者(图7A)和健康志愿者(图7B)的血清的细胞裂解(如通过归一化细胞指数报告的)随时间变化的图。

图8显示了评价来自患有多发性硬化症的个体志愿者的血清样品中抗MICA抗体(A)和抗MICB抗体(B)的存在的蛋白质印迹。(M)指示分子量标记。

图9A-9C显示了在使用工程化MSC或iPSC细胞的供体特异性抗体(DSA)结合测定中来自患有多发性硬化症的个体志愿者的血清的平均荧光强度(MFI)图。图9A显示了来自患有多发性硬化症的个体志愿者的B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果；图9B显示了来自患有多发性硬化症的个体志愿者的MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC和血清的DSA结果；以及图9C显示了来自患有桥本氏病的个体志愿者的iPSC(不表达MICA或MICB)和血清的DSA结果。

图10A-10C显示了来自患有多发性硬化症的个体志愿者(图10A、10B、部分10C)和健康志愿者(部分10C)的血清的细胞裂解(如通过归一化细胞指数报告的)随时间变化的图。

图11显示了评价来自患有系统性红斑狼疮的个体的血清样品中抗MICA抗体(A)和/或抗MICB抗体(B)的存在的蛋白质印迹。(M)指示分子量标记。

具体实施方式

在一些方面，本文提供了方法和组合物，所述方法和组合物用于减轻和/或逃避响应于同种异体移植物(诸如同种异体细胞疗法)的免疫系统反应的影响。为了克服细胞疗法的免疫排斥问题，本文公开了具有逃避免疫系统的能力的工程化细胞(本文也称为工程化免疫逃避细胞或工程化低免疫原性细胞)、其群体或其药物组合物，它们代表了任何可移植细胞类型的可行来源。在本文提供的工程化细胞的方面，受体受试者免疫系统对细胞的排斥被减少并且工程化细胞在它们施用之后能够在宿主中植入并发挥功能，而不管受试者的基因组成、或受试者体内对一种或多种先前同种异体移植物的任何现有反应、先前的自体嵌合抗原受体(CAR)T排斥和/或其中表达转基因的其他自体或同种异体疗法。本文所述的工程化细胞可以源自任何细胞，包括但不限于β胰岛细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、视网膜色素上皮细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞和血细胞(例如，浆细胞或血小板)。在一些实施方案中，所提供的工程化原代细胞是工程化细胞(例如，直接取自活组织(诸如患者活检)的细胞)。

如本文所教导，在某些方面，同种异体细胞疗法可能受益于低免疫原性多能(HIP)修饰，包括对MICA和/或MICB的修饰。基于可用于本文所述细胞工程化的细胞的表征，已经鉴定了MICA和/或MICB表达，并且此类细胞将受益于MICA和/或MICB修饰，诸如降低MICA和/或MICB的表达。例如，患有(或怀疑患有)自身免疫性病症的个体将受益于本文教导的细胞疗法。本文提供的工程化细胞含有修饰(例如，基因修饰)，其导致MICA和/或MICB的表达改变(例如，表达降低或消除)、一种或多种致耐受性因子(例如，CD47)的表达改变(例如，过表达或表达增加)、以及一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达改变(例如，表达降低或消除)。在一些实施方案中，工程化细胞中存在的修饰提供了改变的(例如，降低的或消除的)MICA和/或MICB细胞表面表达、改变的(例如，增加的或过表达的)一种或多种致耐受性因子细胞表面表达、以及改变的(例如，降低的或消除的)一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子细胞表面表达，诸如MICA和/或MICB在细胞表面上的降低的或在一些情况下消除的表达、一种或多种致耐受性因子在细胞表面上的增加或过表达、以及一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子在细胞表面上的减低的表达或在一些情况下消除的表达。在所提供的方面，改变的表达是相对于不含有修饰的类似细胞而言的，所述类似细胞诸如同一细胞类型的野生型或未修饰细胞、或在其他方面相同但缺乏本文中改变一种或多种致耐受性因子以及一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达的修饰的细胞。本文描述了向细胞引入修饰以改变表达的示例性方法。例如，可以使用多种用于过表达基因或蛋白质或增加基因或蛋白质的表达的方法中的任何一种，诸如通过引入或递送编码蛋白质的外源多核苷酸(即转基因)或引入或递送DNA靶向结构域和靶向基因的转录激活因子的融合蛋白。还可以使用多种用于降低或消除基因或蛋白质表达的方法中的任何一种，包括非基因编辑方法，诸如通过引入或递送抑制性核酸(例如，RNAi)或涉及引入或递送靶向核酸酶系统(例如，CRISPR/Cas)的基因编辑方法。在一些实施方案中，用于降低或消除表达的方法通过基于核酸酶的基因编辑技术来进行。

在一些实施方案中，利用稀切核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术用于降低或消除人类细胞中免疫基因的表达(例如，通过缺失关键免疫基因的基因组DNA)。在一些实施方案中，基因组编辑技术包括使用切口酶、碱基编辑、先导编辑和基因写入。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人类细胞中插入耐受性诱导(致耐受性)因子(例如，CD47)，从而产生在植入受体受试者中后能够逃避免疫识别的工程化细胞。因此，本文提供的工程化细胞表现出影响MICA和/或MICB的一种或多种基因和因子的调节表达(例如，降低或消除表达)，影响一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的一种或多种基因和因子的调节表达(例如，降低或消除表达)，以及致耐受性因子(诸如CD47)的调节表达(例如，增加表达或过表达)。在一些实施方案中，工程化细胞逃避受体受试者的免疫系统。

在一些方面，本文提供的工程化细胞不遭受先天免疫细胞排斥或适应性免疫细胞排斥(例如，低免疫原性细胞)。例如，在一些实施方案中，工程化细胞对NK细胞介导的裂解和巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，工程化细胞可用作移植到受体受试者体内的通用相容细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，几乎不需要或不需要免疫抑制剂。此类低免疫原性细胞在移植后保留细胞特异性特性和特征。

本公开至少部分基于本发明人的发现和独特观点，即关于对以下细胞进行工程化，所述细胞可用于施用至具有针对工程化细胞上的一种或多种细胞表面抗原的预先存在抗体(和/或在已施用工程化细胞的个体中工程化细胞的循环寿命期间产生的抗体)的个体。具体地，本文公开了MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达(诸如细胞表面表达)降低(包括消除)的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的(诸如消除的)MICA表达。在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的(诸如消除的)MICB表达。在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的(诸如消除的)MICA和MICB表达。这种工程化有助于避免在个体中触发针对工程化细胞的免疫反应。此外，这些发现支持本文提供的另外公开，诸如患者和/或治疗选择。

本文提供的工程化细胞可以进一步利用致耐受性因子的过表达并调节(例如，降低或消除)一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类(MHC I类)分子或其组分或一种或多种MHC II类分子(MHC II类)分子的表达(例如，表面表达)。在一些实施方案中，利用稀切核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术用于降低或消除人类细胞中免疫基因的表达(例如，通过缺失关键免疫基因的基因组DNA)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人类细胞中插入耐受性诱导(致耐受性)因子(例如，CD47)，从而产生在植入受体受试者中后能够逃避免疫识别的工程化细胞。因此，除了上文所述的MICA和/或MICB调节之外，本文提供的工程化细胞表现出影响一种或多种MHC I类分子、一种或多种MHC II类分子并逃避受体受试者免疫系统的一种或多种基因和因子的调节表达。在一些情况下，细胞是T细胞，并且细胞还被工程化以调节(例如，降低或消除)内源性TCR表达。

在一些实施方案中，工程化细胞表现出允许它们逃避免疫识别的特征。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞是低免疫原性的。在一些方面，本文提供的工程化细胞不会遭受先天免疫细胞排斥。例如，在一些实施方案中，工程化细胞对NK细胞介导的裂解和巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，工程化原代细胞可用作移植到受体受试者体内的通用相容细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，几乎不需要或不需要免疫抑制剂。此类低免疫原性细胞在移植后保留细胞特异性特性和特征。

因此，在一些方面，本文提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含以下中的任何一种或两种：(a)降低的MHC I类链相关蛋白A(MICA)多肽细胞表面表达；和(b)降低的MHCI类链相关蛋白B(MICB)多肽细胞表面表达，并且其中所述工程化细胞还包含：(c)增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47)表达(相关时，包括细胞表面表达)。在一些实施方案中，工程化细胞还包含：降低的一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类(MHC I类)分子或其组分(诸如B2M)细胞表面表达和/或降低的一种或多种MHC II类分子细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞还包含增加的致耐受性因子表达，所述致耐受性因子诸如CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8中的一种或多种。在一些实施方案中，降低的表达被降低至比经工程化以降低表达之前的表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，降低的表达被降低至比参考细胞或参考细胞群(诸如同一细胞类型的细胞或群体或免疫原性反应降低或消除的细胞)的表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，降低的表达被降低至比测量的表达水平(诸如已知表现出免疫原性反应降低或消除的水平)低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，增加的表达被增加至比经工程化以增加表达之前的表达水平高约40％或更高的水平。在一些实施方案中，增加的表达被增加至比参考细胞或参考细胞群(诸如同一细胞类型的细胞或群体或免疫原性反应降低或消除的细胞)的表达水平高约40％或更高的水平。在一些实施方案中，增加的表达被增加至比测量的表达水平(诸如已知表现出免疫原性反应降低或消除的水平)低约40％或更低的水平。

在其他方面，本文提供了一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或其组分和/或一种或多种MHC II类分子的表达，其中表达的变化是相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

在其他方面，本文提供了一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；和(b)增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达，其中表达的变化是相对于不包含所述一个或多个修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

在其他方面，本文提供了本文所述的任何工程化细胞的群体。在一些实施方案中，群体的特征在于群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有修饰。

在其他方面，本文提供了包含本文所述的任何工程化细胞群的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂。

在其他方面，本文提供了制备工程化细胞的方法，所述方法包括向源细胞中引入修饰以：(a)降低或消除一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低或消除MICA的表达和/或降低或消除MICB的表达。

在其他方面，本文提供了使用同种异体疗法治疗个体(本文中也可互换地称为受试者)的疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用本文所述的任何工程化细胞群或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，个体在循环中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体。在一些实施方案中，基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。在一些实施方案中，方法还包括基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。

在其他方面，本文提供了使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括：(a)确定个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，其中阳性抗MICA抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICA抗体，并且其中阳性抗MICB抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICB抗体；和(b)基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，向个体施用包含本文所述的任何工程化细胞群的组合物或本文所述的任何组合物，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA表达，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICB表达，并且其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA和MICB表达。

在另一方面，本文提供了一种鉴定适用于有需要的个体的同种异体疗法的方法，其中所述同种异体疗法包含含有本文所述的任何工程化细胞群的组合物或本文所述的任何组合物，所述方法包括确定个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态以鉴定适用于在所述个体中使用的同种异体疗法，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA表达的群体的工程化细胞，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICB表达的群体的工程化细胞，并且其中如果抗MICA抗体状态和抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA和MICB表达的群体的工程化细胞。

本文还提供了治疗病症的方法，所述方法包括施用在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥的工程化细胞(例如，工程化原代细胞)。在一些实施方案中，当重复施用(例如，移植或植入)至MHC错配的同种异体受体时，由本文所述方法中的任何一种产生的工程化细胞会逃避免疫排斥。

除非特别指出相反的情况，否则特定实施方案的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，其中许多方法出于说明的目的在下文中描述。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月更新)；Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:APractical Approach,第I卷和第II卷(IRL Press,Oxford,1985)；以及Techniques forthe Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcriptionand Translation(B.Hames和S.Higgins,编辑,1984)；Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；Current Protocols inImmunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,编辑,1991)；免疫学年度评论；以及诸如Advances in Immunology等期刊上的专著。

本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的据此通过引用整体并入本文，其程度如同每篇单独的出版物单独地通过引用并入本文一样。如果本文阐述的定义与据此通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。本领域技术人员将认识到，在本公开的范围和精神内，若干实施方案是可能的。以下描述说明了本公开，并且当然，不应以任何方式解释为限制本文所述的本发明的范围。

I.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语学旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考的目的，本文定义了具有通常所理解的含义的术语，并且将此类定义并入本文不应必然理解为表示与本领域通常所理解的含义相比具有实质性的区别。

如本文所用，术语“约”当指可测量的值(诸如量或浓度等)时，意味着涵盖特定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。如本文所用，包括在所附权利要求中，单数形式“一个(a或an)”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指示。例如，“一个(a或an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。应当理解，本文所述的方面和变化包括“由”和/或“基本上由”此类方面和变化“组成”的实施方案。

如本文使用，术语“和/或”包括一个或多个相关联列出项目的任何和所有组合。

如本文所用，关于多肽或多核苷酸的术语“外源”旨在表示所提及的分子被引入感兴趣的细胞。外源分子(诸如外源多核苷酸)可以通过例如将外源编码核酸引入细胞的遗传物质中(诸如通过整合到染色体中)或作为非染色体遗传物质(诸如质粒或表达载体)来引入。因此，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指将编码核酸以可表达的形式引入到细胞中。在一些情况下，“外源”分子是细胞中不正常存在的分子、构建体、因子等，但可以通过一种或多种遗传、生物化学或其他方法引入细胞中。

术语“内源”是指存在于天然或未修饰细胞中的参考分子，诸如多核苷酸(例如，基因)或多肽。例如，当关于内源基因的表达使用时，该术语是指由包含在细胞内且非外源引入的内源核酸编码的基因的表达。

“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列，诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点及/或基因座控制区。基因序列通常存在于细胞染色体上的固定染色体位置或基因座处。

术语“基因座”是指特定基因或遗传标记位于染色体上的固定位置。提及“靶基因座”是指其中期望靶向遗传修饰(诸如基因编辑或外源多核苷酸的整合)的期望基因的特定基因座。

关于基因的术语“表达”或“基因表达”是指将基因中所含的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)，或者可以是由mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化修饰的蛋白质。因此，提及表达或基因表达包括蛋白质(或多肽)表达或基因(诸如mRNA)的可转录产物的表达。蛋白质表达可以包括蛋白质的细胞内表达或表面表达。通常，基因产物(诸如mRNA或蛋白质)的表达处于细胞中可检测的水平。

如本文所用，“可检测”表达水平意指可通过技术人员已知的标准技术检测到的水平，所述标准技术包括例如差异显示、RT(逆转录酶)偶联聚合酶链式反应(PCR)、RNA印迹和/或RNA酶保护分析以及基于免疫亲和的蛋白质检测方法(诸如流式细胞术、ELISA或蛋白质印迹)。表达水平的程度只需大到足以通过标准表征技术进行可视化或测量。

如本文所用，术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”意指除了不含有用于调节特定基因表达的修饰的原始细胞或源细胞中的表达(例如野生型表达水平(其也可以是不表达或不可测量的表达))之外的任何形式的表达。本文提及的“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”用于意指基因表达的增加和/或就涉及多肽而言，相对于不含有修饰的细胞(诸如工程化以引入修饰之前的原始源细胞，诸如未修饰细胞或野生型细胞)中的水平，增加的多肽水平和/或增加的多肽活性。表达、多肽水平或多肽活性的增加可以是至少5％、10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或100％或甚至更多。在一些情况下，表达、多肽水平或多肽活性的增加可以是至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更多。

术语“低免疫原性”是指不太倾向于在移植此类细胞的受试者中发生免疫排斥的细胞。例如，相对于同一细胞类型但不含有修饰的类似细胞(诸如未改变或未修饰的野生型细胞)，这样的低免疫原性细胞在移植此类细胞的受试者中发生免疫排斥的倾向可能低约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更多。典型地，低免疫原性细胞对受试者是同种异体的，并且低免疫原性细胞在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥。在一些实施方案中，保护低免疫原性细胞免受T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。

细胞的低免疫原性可以通过评价细胞的免疫原性(诸如细胞引发适应性和先天免疫反应的能力)来确定。这种免疫反应可以使用本领域技术人员公知的测定来测量。

如本文所用的术语“致耐受性因子”包括免疫抑制因子或免疫调节因子，它们在施用、移植或植入后调节或影响细胞被宿主或受体受试者的免疫系统识别的能力。通常，致耐受性因子是诱导对工程化原代细胞的免疫耐受性，使得工程化原代细胞不被受体的宿主免疫系统靶向(诸如排斥)的因子。因此，致耐受性因子可能是免疫力低下的因子。致耐受性因子的实例包括免疫细胞抑制性受体(例如，CD47)、接合免疫细胞抑制性受体的蛋白质、检查点抑制剂和其他降低先天或适应性免疫识别的分子。

术语“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”和“减少(decrease)”在本文中均一般用于意指减少统计上显著的量。然而，为了避免疑问，“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少(decrease)”意指如与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至多并包括100％降低(即如与参考样品相比不存在的水平)，或如与参考样品相比10％-100％之间的任何降低。

术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中全部用于一般表示静态显著量的增加；为了避免任何疑问，术语“增加”、“增加”或“增强”或“活化”意指如与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％的增加或如与参考水平相比10％-100％之间的任何增加，或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或在2倍与10倍之间的任何增加或更大增加。

如本文所用，术语“修饰”是指细胞中影响细胞中的基因表达的任何变化或改变。在一些实施方案中，修饰是直接改变细胞中编码蛋白质产物的基因或其调控元件的遗传修饰，诸如通过基因编辑、诱变或通过外源多核苷酸或转基因的基因工程化。

如本文所用，“插入缺失”是指由基因组中核苷酸碱基的插入、缺失或其组合导致的突变。因此，插入缺失通常从序列中插入或缺失核苷酸。如本领域技术人员将理解的，除非插入缺失的长度是三的倍数，否则基因组序列的编码区中的插入缺失将导致移码突变。本公开的CRISPR/Cas系统可以用于在靶多核苷酸序列中诱导任何长度的插入缺失。

在一些实施方案中，改变是点突变。如本文所用，“点突变”是指替换一个核苷酸的取代。本公开的CRISPR/Cas系统可以用于诱导靶多核苷酸序列中任何长度的插入缺失或点突变。

如本文所用，“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列功能的方式缺失全部或部分靶多核苷酸序列。例如，可以通过在靶多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中的靶多核苷酸序列中诱导插入缺失来改变靶多核苷酸序列，从而实现敲除。本领域技术人员将容易理解如何基于本文所述的细节使用本公开的CRISPR/Cas系统敲除靶多核苷酸序列或其部分。

在一些实施方案中，改变导致敲除靶多核苷酸序列或其部分。使用本公开的CRISPR/Cas系统敲除靶多核苷酸序列或其部分可以用于多种应用。例如，出于研究目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以在体外执行。对于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可以用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变等位基因并将那些包含敲除突变等位基因的细胞引入受试者体内)。

本文中的“敲入”意指向宿主细胞增加遗传功能的过程。这导致敲入的基因产物(例如，RNA或编码的蛋白质)的水平增加。如本领域技术人员将理解的，这可以通过多种方式实现，包括将基因的一个或多个另外拷贝添加到宿主细胞中或改变内源基因的调控组分以增加蛋白质的表达。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。

在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达降低。

在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达增加。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达增加。

基因表达的“调节”是指基因表达水平的变化。表达的调节可以包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可以是完全的，例如，其中基因表达完全失活或被活化至野生型水平或更高水平；或者它可以是部分的，其中基因表达部分降低或部分活化至野生型水平的某一分数。

术语“有效地连接(operatively linked)”或“可操作地连接(operably linked)”关于两个或更多个组件(诸如序列元件)的并置可互换使用，其中组件被排列成使得两个组件都正常运行并且允许至少一个组件可以介导施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列(诸如启动子)响应于一种或多种转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则所述转录调控序列有效地连接至编码序列。转录调控序列通常以顺式方式与编码序列有效地连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是有效地连接至编码序列的转录调控序列，即使它们不连续。

如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，是指通过肽键连接的一系列氨基酸残基(即氨基酸残基的聚合物)，并且不限于最小长度。此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基或其组合，包括但不限于氨基酸残基的肽、多肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。因此，蛋白质或多肽包括具有修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物的那些蛋白质或多肽。该定义涵盖全长多肽或蛋白质及其片段。该术语还包括其修饰种类，例如一个或多个残基的翻译后修饰，例如甲基化、磷酸化、糖基化、唾液酸化或乙酰化。

贯穿本公开，所要求保护的主题的各个方面以范围的形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限与该陈述范围内的任何其他陈述或中间值之间的每一个中间值，直到下限单位的十分之一，都涵盖在本公开中，受到陈述范围内的任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个限值时，排除这些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。在一些实施方案中，为一个特征提供了两个相反的和开放的范围，并且在这样的描述中，可以预见本文中提供了那两个范围的组合。例如，在一些实施方案中，描述了特征大于约10个单位，并且描述了(诸如在另一句中)特征小于约20个单位，因此，本文所述了约10个单位至约20个单位的范围。

如本文所用，互换使用的术语“受试者”或“个体”是哺乳动物。在一些实施方案中，“哺乳动物”包括人，非人类灵长类动物，家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫、猴等。在一些实施方案中，受试者或个体是人类。在一些实施方案中，受试者是已知或怀疑患有疾病、病症或疾患的患者。

如本文所用，术语“治疗(treating和treatment)”包括向受试者施用有效量的本文所述的细胞，使得受试者的至少一种疾病症状减轻或疾病改善，例如有益或期望的临床结果。出于该技术的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减少、疾病状态的稳定(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。在一些实施方案中，疾病或病症的一种或多种症状在疾病治疗后减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。

出于该技术的目的，疾病治疗的有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减少、疾病状态的稳定(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。

“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导感兴趣基因的表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。将载体或构建体引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导的转移(例如，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。

II.工程化细胞和将细胞进行工程化的方法

本文提供了包含调节MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)表达的一个或多个修饰(诸如遗传修饰)的工程化细胞。在一些实施方案中，修饰降低(诸如消除)MICA多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，修饰降低(诸如消除)MICB多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，一个或多个修饰降低(诸如消除)MICA多肽和MICB多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞包含一个或多个如本文所述的另外的修饰。

处于说明的目的，并且不解释为限制本文描述的范围，图1A-1C中提供了使用本文所述的工程化细胞可能遇到的场景。图1A示出了场景I；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中不存在针对一种或多种细胞表面抗原的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下表达一种或多种细胞表面抗原(例如，MICA和/或MICB)。B2M^indel/indel和CIITA^indel/indel降低(诸如阻断)细胞表面上一种或多种功能性MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子的表达，以分别阻止MHC I类分子和MHC II类分子介导的免疫反应。CD47表达增加(诸如过表达)会降低NK和巨噬细胞介导的免疫反应。在一些实施方案中，并且如场景1中所示，移植表达MICA和/或MICB并包含B2M^indel/indel；CIITA^indel ^/indel；CD47tg修饰的工程化细胞适合用于缺乏针对MICA和/或MICB的预先存在抗体的患者。图1B示出了场景II；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中存在针对一种或多种细胞表面抗原的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下表达一种或多种细胞表面抗原(例如，MICA和/或MICB)。在一些实施方案中，针对MICA和/或MICB的预先存在抗体可以触发针对由B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞表达的MICA和/或MICB抗原的免疫反应。这种情况限制了同种异体疗法的实用性。图1C示出了场景III；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg细胞在宿主(受体)中存在针对MICA和/或MICB的预先存在抗体(例如，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的情况下具有降低的MICA和/或MICB表达。在一些实施方案中，如果患者具有或怀疑具有针对MICA和/或MICB的抗体，则修饰用于移植物的细胞以降低或消除除了B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg之外的MICA和/或MICB的表达，使得细胞避免经由抗MICA抗体和/或抗MICB抗体触发免疫反应。在一些实施方案中，基于细胞是否表达MICA和/或MICB(例如，不表达MICA的细胞不需要修饰来降低MICA的表达)，修饰用于移植物的细胞以降低或消除除了B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg之外的MICA和/或MICB的表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含以下中的任何一种或两种：(a)降低的MICA多肽细胞表面表达；和(b)降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中所述工程化细胞还包含：(c)增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47)表达(相关时，包括细胞表面表达)。在一些实施方案中，工程化细胞还包含：降低的一种或多种MHC I类分子或其组分(诸如B2M)细胞表面表达和/或降低的一种或多种MHC II类分子细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞包含以下中的任何一种或两种：(a)降低的MICA多肽细胞表面表达；和(b)降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中所述工程化细胞还包含：(c)增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47)表达(相关时，包括细胞表面表达)；(d)降低的一种或多种MHC I类分子细胞表面表达；和(e)降低的一种或多种MHC II类分子细胞表面表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含以下中的任何一种或两种：(a)降低的MICA多肽细胞表面表达；和(b)降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中所述工程化细胞还包含(c)CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8中的一种或多种的增加的表达。

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞包括增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰。在一些实施方案中，致耐受性因子是DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)中的一种或多种。在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)中的一种或多种。在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰是或包括增加的CD47表达。在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰是或包括增加的PD-L1表达。在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰是或包括增加的HLA-E表达。在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰是或包括增加的HLA-G表达。在一些实施方案中，增加一种或多种致耐受性因子表达的修饰是或包括增加的CCL21、PD-L1、FasL、Serpinb9、H2-M3(HLA-G)、CD47、CD200和Mfge8表达。

在一些实施方案中，细胞包括降低一种或多种MHC I类分子的表达的一个或多个修饰，诸如基因组修饰，以及增加CD47表达的修饰。换句话说，工程化细胞包含外源CD47蛋白，并且表现出一种或多种MHC I类分子的表面表达的降低或沉默。在一些实施方案中，细胞包括降低一种或多种MHC II类分子表达的一个或多个基因组修饰、以及增加CD47表达的修饰。在一些情况下，工程化细胞包含外源CD47核酸和蛋白质，并且表现出一种或多种MHCI类分子的表面表达降低或沉默。在一些实施方案中，细胞包括降低或消除一种或多种MHCII类分子表达的一个或多个基因组修饰、降低或消除一种或多种MHC II类分子表达的一个或多个基因组修饰、以及增加CD47表达的修饰。在一些实施方案中，工程化细胞包含外源CD47蛋白，表现出一种或多种MHC I类分子的表面表达降低或沉默，并且表现出一种或多种MHC II类分子的表面表达降低或缺乏。在许多实施方案中，细胞是B2M ^indel/indel、CIITA^indel ^/indel、CD47tg细胞。

在一些实施方案中，任何基因编辑技术都可以用于降低所描述的一种或多种靶多核苷酸或靶蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括涉及核酸酶、整合酶、转座酶、重组酶的系统。在一些实施方案中，基因编辑技术可用于基因的敲除或敲低。在一些实施方案中，基因编辑技术可用于将DNA敲入或整合到基因组的区域中。在一些实施方案中，基因编辑技术介导单链断裂(SSB)。在一些实施方案中，基因编辑技术介导双链断裂(DSB)，包括结合非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括基于DNA的编辑或引物编辑。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)。

在一些实施方案中，基因编辑技术与碱基编辑相关。碱基编辑器(BE)通常是Cas(“CRISPR相关”)结构域和核碱基修饰结构域(例如，天然或进化的脱氨酶，诸如胞苷脱氨酶，包括APOBEC1(“载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽1”)、CDA(“胞苷脱氨酶”)和AID(“活化诱导的胞苷脱氨酶”))结构域的融合物。在一些情况下，碱基编辑器还可以包括改变细胞DNA修复过程以提高所产生的单核苷酸变化的效率和/或稳定性的蛋白质或结构域。

在一些方面，目前可用的碱基编辑器包括转化靶标C的胞苷碱基编辑器(例如，BE4)。·G至T·A和转化靶标A的腺嘌呤碱基编辑器(例如，ABE7.10)·T至G·C.在一些方面，首次结合被设计为在不引入双链DNA断裂的情况下诱导碱基变化的碱基编辑器(BE)系统证明了Cas9靶向脱氨作用。另外，与失活的Cas9(dCas9)融合的大鼠脱氨酶APOBEC1(rAPOBEC1)用于成功地将sgRNA的PAM上游的胞苷转化为胸苷。在一些方面，通过将dCas9改变为“切口酶”Cas9D10A来优化该第一BE系统，该切口酶在脱氨基胞苷相对的链上切口。在不受理论束缚的情况下，预期这引发长补丁碱基切除修复(BER)，其中脱氨基链优先用于模板修复以产生U:A碱基对，然后在DNA复制期间将其转化为T:A。

在一些实施方案中，碱基编辑器是核碱基编辑器，其含有无催化活性的第一DNA结合蛋白结构域、具有碱基编辑活性的结构域和具有切口酶活性的第二DNA结合蛋白结构域，其中所述DNA结合蛋白结构域在单一融合蛋白上表达或单独表达(例如，在单独的表达载体上)。在一些实施方案中，碱基编辑器是融合蛋白，其包含具有碱基编辑活性的结构域(例如，胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)和两个核酸可编程DNA结合蛋白结构域(napDNAbp)，第一napDNAbp包含切口酶活性并且第二napDNAbp是催化失活的，其中至少两个napDNAbp通过接头连接。在一些实施方案中，碱基编辑器是融合蛋白，其包含具有切口酶活性(nCas；nCas9)的CRISPR-Cas(例如，Cas9)的DNA结构域、具有核酸可编程DNA结合活性(dCas；例如，dCas9)的CRISPR-Cas蛋白(例如，Cas9)的催化失活结构域以及脱氨酶结构域，其中dCas通过接头连接至nCas，并且dCas紧邻脱氨酶结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器是腺嘌呤至胸腺嘧啶或“ATBE”(或胸腺嘧啶至腺嘌呤或“TABE”)颠换碱基编辑器。示例性碱基编辑器和碱基编辑器系统包括专利公开号US20220127622、US20210079366、US20200248169、US20210093667、US20210071163、WO2020181202、WO2021158921、WO2019126709、WO2020181178、WO2020181195、WO2020214842、WO2020181193中描述的任一种，这些专利据此整体并入。

在一些实施方案中，基因编辑技术是靶向启动逆转录(TPRT)或“先导编辑”。在一些实施方案中，先导编辑介导人细胞中的靶向插入、缺失、所有12种可能的碱基到碱基转化及其组合，而不需要DSB或供体DNA模板。

先导编辑是一种基因组编辑方法，其使用与聚合酶联合工作的核酸可编程DNA结合蛋白(“napDNAbp”)(即，以融合蛋白的形式或以其他方式与napDNAbp反式提供)将新的遗传信息直接写入指定的DNA位点，其中先导编辑系统用先导编辑(PE)指导RNA(“PEgRNA”)编程，该先导编辑指导RNA既指定靶位点，又通过工程化到指导RNA上(例如，在指导RNA的5'或3'端处，或在指导RNA的内部部分处)的延伸(DNA或RNA)以替代DNA链的形式模板化所需编辑的合成。含有所需编辑(例如，单个核碱基取代)的替换链与待编辑的靶位点的内源链共享相同的序列(除了它包括所需编辑)。通过DNA修复和/或复制机制，靶位点的内源链被含有所需编辑的新合成的替换链替换。在一些情况下，先导编辑可被认为是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，因为先导编辑器搜索并定位待编辑的期望靶位点，并编码含有期望编辑的替换链，该替换链被同时安装以替代相应的靶位点内源DNA链。例如，先导编辑可适用于进行基于CRISPR/Cas的精确基因组编辑以绕过双链断裂。在一些实施方案中，同源蛋白是或编码Cas蛋白-逆转录酶融合物或相关系统，以用指导RNA靶向特定DNA序列，在靶位点产生单链切口，并且将带切口的DNA用作与指导RNA一起整合的工程化逆转录酶模板逆转录的引物。在一些实施方案中，先导编辑器蛋白与作为基因组DNA相反链上互补DNA瓣的合成的模板的两个先导编辑指导RNA(pegRNA)配对，导致PE诱导的缺口位点之间的内源DNA序列被pegRNA编码的序列替换。

在一些实施方案中，基因编辑技术与作为逆转录酶或本领域已知的任何DNA聚合酶的先导编辑器相关。因此，在一个方面，先导编辑器可以包含Cas9(或等同的napDNAbp)，其被编程为通过将其与含有与靶DNA中的互补原间隔区退火的间隔区序列的特异性指导RNA(即PEgRNA)缔合来靶向DNA序列。此类方法包括在Anzalone等人(doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4)中或在PCT公开号WO2020191248、WO2021226558或WO2022067130中公开的任何方法，这些文献据此全文并入。

在一些实施方案中，基因编辑技术是经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)。在一些方面，PASTE是其中通过与逆转录酶和丝氨酸整合酶两者融合的CRISPR-Cas9切口酶指导基因组插入的平台。如在Ioannidi等人(doi.org/10.1101/2021.11.01.466786)中所述，PASTE不产生双链断裂，但允许整合大至约36kb的序列。在一些实施方案中，丝氨酸整合酶可以是本领域已知的任何酶。在一些实施方案中，丝氨酸整合酶具有足够的正交性，使得PASTE可以用于多重基因整合，同时在至少两个基因组基因座处整合至少两个不同的基因。在一些实施方案中，PASTE具有与基于同源定向修复或非同源末端连接的整合相当或更好的编辑效率，在非分裂细胞中具有活性和较少的可检测的脱靶事件。

在一些实施方案中，该一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组B2M基因座、TAP1基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、MIC-A基因座、MIC-B基因座和安全港基因座。在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。

在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于受体受试者后引发降低水平的免疫活化或不引发免疫活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的全身性TH1活化或不引发全身性TH1活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化或不引发PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的针对细胞的供体特异性IgG抗体或不引发所述供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的针对细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发所述IgM和IgG抗体产生。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的细胞的细胞毒性T细胞杀伤。

在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞包含“自杀基因”或“自杀开关”。可以掺入自杀基因或自杀开关用作“安全开关”，其可以导致工程化细胞(例如，原代工程化细胞或从工程化多能干细胞分化的细胞)死亡，诸如在将工程化细胞施用于受试者之后以及如果细胞以不期望的方式生长和分裂时。“自杀基因”消融方法包括基因转移载体中的自杀基因，其编码只有在被特定化合物活化时才导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化为高毒性代谢物的酶。结果是特异性地消除表达所述酶的细胞。在一些实施方案中，自杀基因是疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，并且触发基因是更昔洛韦。在其他实施方案中，自杀基因是大肠杆菌(Escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因，并且触发基因是5-氟胞嘧啶(5-FC)(Barese等人,Mol.Therap.20(10):1932-1943(2012)；Xu等人,Cell Res.8:73-8(1998))，这两篇文献的公开内容据此全文以引用方式并入本文。

在其他实施方案中，自杀基因是诱导型胱天蛋白酶蛋白。诱导型胱天蛋白酶蛋白包含能够诱导细胞凋亡的胱天蛋白酶蛋白的至少一部分。在优选的实施方案中，诱导型胱天蛋白酶蛋白是iCasp9。其包含具有F36V突变的人FK506结合蛋白FKBP12的序列，通过一系列氨基酸与编码人胱天蛋白酶9的基因连接。FKBP12-F36V以高亲和力与小分子二聚剂API903结合。因此，本发明中iCasp9的自杀功能通过施用二聚化化学诱导剂(CID)来触发。在一些实施方案中，CID是小分子药物API 903。二聚化引起细胞凋亡的快速诱导。(参见WO2011146862；Stasi等人,N.Engl.J.Med 365；18(2011)；Tey等人,Biol.Blood MarrowTransplant.13:913-924(2007)，这些文献中的每一篇均全文以引用方式并入本文。)

包含安全开关或自杀基因允许在细胞毒性或对受体产生其他负面后果的情况下对细胞进行受控杀伤，从而提高基于细胞的疗法(包括使用致耐受性因子的那些疗法)的安全性。

在一些实施方案中，可以将安全开关掺入(诸如引入)本文提供的工程化细胞中，以提供诱导含有安全开关的工程化细胞死亡或细胞凋亡的能力，例如如果细胞以不期望的方式生长和分裂或对宿主造成过度毒性时。因此，安全开关的使用使得人们能够有条件地体内消除异常细胞，并且可能是细胞疗法应用于临床的关键步骤。安全开关及其用途以下文献中有所描述：例如，Duzgune§,Origins of Suicide Gene Therapy(2019)；Duzgune§(编辑),Suicide Gene Therapy.Methods in Molecular Biology,第1895卷(HumanaPress,New York,NY)(针对HSV-tk、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、嘌呤核苷磷酸化酶和辣根过氧化物酶)；Zhou和Brenner,Exp Hematol 44(11):1013-1019(2016)(针对iCaspase9)；Wang等人,Blood 18(5):1255-1263(2001)(针对huEGFR)；美国专利申请公开号20180002397(针对HER1)；以及Philip等人,Blood124(8):1277-1287(2014)(针对RQR8)。

在一些实施方案中，安全开关可以以受控方式(例如，在药物或前药的存在下或在被选择性外源化合物活化时)导致细胞死亡。在一些实施方案中，安全开关选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、胞嘧啶脱氨酶(CyD)、硝基还原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、辣根过氧化物酶、诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)、雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)、CCR4、CD16、CD19、CD20、CD30、EGFR、GD2、HER1、HER2、MUC1、PSMA和RQR8。

在一些实施方案中，安全开关可以是编码在被药物或前药活化时具有细胞杀伤能力(例如通过在细胞内将无毒前药转化为有毒代谢物)的产物的转基因。在这些实施方案中，通过将工程化细胞与药物或前药接触来活化细胞杀伤。在一些情况下，安全开关是HSV-tk，其将更昔洛韦(GCV)转化为GCV三磷酸盐，从而干扰DNA合成并杀伤分裂的细胞。在一些情况下，安全开关是CyD或其变体，它通过催化胞嘧啶水解脱氨基为尿嘧啶将抗真菌药物5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为细胞毒性5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU进一步被细胞酶转化为有效的抗代谢物(5-FdUMP、5-FdUTP、5-FUTP)。这些化合物抑制胸苷酸合酶以及RNA和DNA的产生，导致细胞死亡。在一些情况下，安全开关是NTR或其变体，它可以通过将硝基基团还原为在增殖和非增殖细胞中有毒的反应性N-羟胺中间体来作用于前药CB 1954。在一些情况下，安全开关是PNP或其变体，它可以将前药6-甲基嘌呤脱氧核苷或氟达拉滨转化为对增殖和非增殖细胞都有毒的代谢物。在一些情况下，安全开关是辣根过氧化物酶或其变体，它可以将吲哚-3-乙酸(IAA)催化为有效的细胞毒素，从而实现细胞杀伤。

在一些实施方案中，安全开关可以是iCasp9。胱天蛋白酶9是内在线粒体凋亡途径的组分，其在生理条件下通过受损线粒体释放细胞色素C而活化。活化的胱天蛋白酶9然后活化胱天蛋白酶3，其触发导致细胞凋亡的末端效应分子。iCasp9可以通过经由肽接头将截短的胱天蛋白酶9(没有其生理二聚化结构域或胱天蛋白酶活化结构域)与FK506结合蛋白(FKBP)FKBP12-F36V融合而产生。iCasp9具有低二聚体非依赖性基础活性，并且可以在宿主细胞(例如，人T细胞)中稳定表达，而不损害其表型、功能或抗原特异性。然而，在二聚化化学诱导剂(CID)(诸如rimiducid(AP1903)、AP20187和雷帕霉素)的存在下，iCasp9可以经历可诱导的二聚化并活化下游胱天蛋白酶分子，导致表达iCasp9的细胞凋亡。参见例如，PCT专利公开号WO2011/146862；Stasi等人,N.Engl.J.Med.365；18(2011)；Tey等人,Biol.Blood Marrow Transplant 13:913-924(2007)。特别地，雷帕霉素诱导的胱天蛋白酶9变体被称为rapaCasp9。参见Stavrou等人,Mal.Ther.26(5):1266-1276(2018)。因此，iCasp9可以用作安全开关来实现宿主细胞的受控杀伤。

在一些实施方案中，安全开关可以是膜表达的蛋白质，其允许在施用针对该蛋白质的特异性抗体之后的细胞耗尽。这种类别的安全开关可以包括例如编码CCR4、CD16、CD19、CD20、CD30、EGFR、GD2、HER1、HER2、MUC1、PSMA或RQR8的一种或多种转基因用于它们的表面表达。这些蛋白质可能具有可以被特异性抗体靶向的表面表位。在一些实施方案中，安全开关包含CCR4，其可以被抗CCR4抗体识别。合适的抗CCR4抗体的非限制性实例包括莫格利珠单抗及其生物类似药。在一些实施方案中，安全开关包含CD16或CD30，其可以被抗CD16抗体或抗CD30抗体识别。这种抗CD16抗体或抗CD30抗体的非限制性实例包括AFM13及其生物类似药。在一些实施方案中，安全开关包含CD19，其可以被抗CD19抗体识别。这种抗CD19抗体的非限制性实例包括MOR208及其生物类似药。在一些实施方案中，安全开关包含CD20，其可以被抗CD20抗体识别。这种抗CD20抗体的非限制性实例包括奥妥珠单抗、乌利妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、利妥昔单抗、利妥昔单抗-Rllb及其生物类似药。因此，表达安全开关的细胞是CD20阳性的，并且可以通过施用如所述的抗CD20抗体而被靶向杀伤。在一些实施方案中，安全开关包含EGFR，其可以被抗EGFR抗体识别。这种抗EGFR抗体的非限制性实例包括托木妥昔单抗、RO5083945(GA201)、西妥昔单抗及其生物类似药。在一些实施方案中，安全开关包含GD2，其可以被抗GD2抗体识别。这种抗GD2抗体的非限制性实例包括Hul4.18K322A、Hul4.18-IL2、Hu3F8、达妥昔单抗、c.60C3-Rllc及其生物类似药。

在一些实施方案中，安全开关可以是识别在工程化细胞表面上的一种或多种致耐受性因子的外源性施用的剂。在一些实施方案中，外源施用的剂是针对或特异于致耐受性剂的抗体，例如抗CD47抗体。通过识别和阻断工程化细胞上的致耐受性因子，外源施用的抗体可以阻断致耐受性因子的免疫抑制功能，从而使免疫系统对工程化细胞重新致敏。例如，对于过表达CD47的工程化细胞，可以向受试者施用外源施用的抗CD47抗体，导致工程化细胞上的CD47被掩蔽并触发对工程化细胞的免疫反应。

在一些实施方案中，方法还包括将包含诱导型自杀开关的表达载体引入细胞中。

在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47，并且细胞包括编码CD47蛋白的外源多核苷酸。在一些实施方案中，细胞表达外源CD47多肽。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用CD47-SIRPα阻断剂，其中所述受试者先前被施用过经工程化以表达外源CD47多肽的细胞群。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂包含CD47结合结构域。在一些实施方案中，CD47结合结构域包含信号调节蛋白α(SIRPα)或其片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂包含免疫球蛋白G(IgG)Fc结构域。在一些实施方案中，IgG Fc结构域包含IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1Fc结构域包含人抗体的片段。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂选自由以下组成的组：TTI-621、TTI-622和ALX148。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是TTI-621、TTI-622和ALX148。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是TTI-622。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是ALX148。在一些实施方案中，IgG Fc结构域包含IgG4Fc结构域。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂是抗体。在一些实施方案中，抗体选自由以下组成的组：MIAP410、B6H12和莫洛利单抗。在一些实施方案中，抗体是MIAP410。在一些实施方案中，抗体是B6H12。在一些实施方案中，抗体是莫洛利单抗。在一些实施方案中，抗体选自由以下组成的组：AO-176,IBI188(来他普利单抗(letaplimab))、STI-6643和ZL-1201。在一些实施方案中，抗体是AO-176(Arch)。在一些实施方案中，抗体是IBI188(来他普利单抗)(Innovent)。在一些实施方案中，抗体是STI-6643(Sorrento)。在一些实施方案中，抗体是ZL-1201(Zai)。

在一些实施方案中，结合CD47的有用抗体或其片段可以选自下组，该组包括莫洛利单抗(Hu5F9-G4)(Forty Seven,Inc.；Gilead Sciences,Inc.)、乌拉瑞利单抗(urabrelimab)、CC-90002(Celgene；Bristol-Myers Squibb)、IBI-188(InnoventBiologics)、IBI-322(Innovent Biologics)、TG-1801(TG Therapeutics；也称为NI-1701、Novimmune SA)、ALX148(ALX Oncology)、TJ011133(也称为TJC4、I-Mab Biopharma)、FA3M3、ZL-1201(Zai Lab Co.,Ltd)、AK117(Akesbio Australia Pty,Ltd.)、AO-176(ArchOncology)、SRF231(Surface Oncology)、GenSci-059(GeneScience)、C47B157(JanssenResearch and Development)、C47B161(Janssen Research and Development)、C47B167(Janssen Research and Development)、C47B222(Janssen Research and Development)、C47B227(Janssen Research and Development)、Vx-1004(Corvus Pharmaceuticals)、HMBD004(Hummingbird Bioscience Pte Ltd)、SHR-1603(Hengrui)、AMMS4-G4(北京生物技术研究所(Beijing Institute of Biotechnology))、RTX-CD47(University ofGroningen)和IMC-002(Samsung Biologics；ImmuneOncia Therapeutics)。在一些实施方案中，抗体或其片段不与选自下组的抗体竞争CD47结合，该组包括：莫洛利单抗、乌拉瑞利单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。在一些实施方案中，抗体或其片段与选自以下的抗体竞争CD47结合：莫洛利单抗、乌拉瑞利单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。在一些实施方案中，结合CD47的抗体或其片段选自下组，该组包括：抗CD47的单链Fv片段(scFv)、抗CD47的Fab、抗CD47的VHH纳米抗体、抗CD47的DARPin及其变体。在一些实施方案中，抗CD47的scFv、抗CD47的Fab及其变体基于选自下组的抗体中的任何一种的抗原结合结构域，该组包括：莫洛利单抗、乌拉瑞利单抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47和IMC-002。

在一些实施方案中，CD47拮抗剂提供CD47阻断。PCT/US2021/054326(其公开内容据此通过引用整体并入本文)中描述了用于CD47阻断的方法和剂。

在一些实施方案中，工程化细胞源自已经包含一种或多种期望的修饰的源细胞。在一些实施方案中，鉴于本文提供的教导，本领域普通技术人员将容易理解如何评估需要什么修饰来达到工程化细胞的期望最终形式，并且并非所有降低或增加水平的靶标组分都是通过主动工程化实现的。在一些实施方案中，工程化细胞的修饰可以按任何顺序进行，并且不一定是本文提供的描述性语言中所列出的顺序。

一旦改变，本文所述的任何分子的存在或表达都可以使用已知技术进行测定，所述技术诸如蛋白质印迹、ELISA测定、FACS测定、流式细胞术等。

A.表达降低的靶标

在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的MICA和/或MICB表达。如本文所述，工程化细胞可以包含在生物学上涉及最终蛋白质表达和靶标定位的任何数量水平(包括多于一个水平)上降低的表达。例如，在一些实施方案中，MICA和/或MICB是在基因组物质(诸如基因组DNA)中内源编码的，被转录成RNA(诸如mRNA)，被翻译成多肽，被整合到细胞膜中使得其部分暴露于细胞外环境，并且在细胞中具有一定的存在寿命。因此，在一些实施方案中，表达可以通过基因和/或其功能、RNA表达和功能、蛋白质表达和功能、定位(诸如细胞表面表达)和寿命来降低。

在一些实施方案中，靶标的表达降低使得工程化细胞中的表达被降低至比在被工程化以降低靶标表达之前在源细胞中靶标的对应表达水平(例如，与蛋白质表达相比的蛋白质表达水平)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中任一者)的水平。在一些实施方案中，靶标的表达降低使得工程化细胞中的表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群(诸如同一细胞类型的细胞或群体或免疫原性反应降低或消除的细胞)中靶标的对应表达水平(例如，与蛋白质表达相比的蛋白质表达水平)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中任一者)的水平。在一些实施方案中，靶标的表达降低使得工程化细胞中的表达被降低至等于或低于测量表达水平(诸如已知由于靶标的存在而表现出免疫原性反应降低或消除的水平)的水平。在一些实施方案中，在受刺激或未受刺激状态下的工程化细胞、参考细胞或参考细胞群中评估靶标的水平。在一些实施方案中，在受刺激状态下的工程化细胞、参考细胞或参考细胞群中评估靶标的水平，使得靶标被表达(或者如果它是细胞响应于刺激的能力，则将被表达)。在一些实施方案中，刺激代表体内刺激。

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞包含调节(例如，降低或消除)一种或多种MHC I类分子、一种或多种MHC II类分子、或一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHCII类分子的表达的一种或多种靶多核苷酸序列(也可互换地称为靶基因)的修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，人类中的MHC也被称为人白细胞抗原(HLA)。例如，人MHC I类分子也被称为HLA I类分子，并且人MHC II类分子也被称为HLA II类分子。在一些实施方案中，待修饰或工程化的细胞是先前未被引入一个或多个修饰的未修饰细胞或非工程化细胞。在一些实施方案中，使用基因编辑系统来修饰调节一种或多种MHC I类分子、一种或多种MHCII类分子、或一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子的表达的一种或多种靶多核苷酸序列。在某些实施方案中，细胞基因组已被改变以减少或缺失促进HLA表达(诸如一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子在细胞表面上的表达)所需或涉及的组分。例如，在一些实施方案中，细胞中一种或多种MHC I类分子的组分β-2-微球蛋白(B2M)的表达被降低或消除，从而通过工程化细胞降低或消除一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达(例如，细胞表面表达)。

在一些实施方案中，工程化细胞中调节(例如，降低或消除)工程化细胞中一种或多种靶多核苷酸或蛋白质表达的任何所述的修饰可以与一个或多个修饰组合在一起，以过表达本文所述的多核苷酸(例如，致耐受性因子，诸如CD47)。

在一些实施方案中，降低一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达可以通过例如以下中的一种或多种来实现：(1)直接靶向多态性HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和一种或多种MHC II类分子基因；(2)去除B2M，这将减少所有MHC I类分子的表面运输；和/或(3)缺失MHC增强体的一种或多种组分，诸如对HLA表达至关重要的LRC5、RFX-5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。

在某些实施方案中，HLA表达被干扰。在一些实施方案中，通过以下方式来干扰HLA表达：靶向单独的HLA(例如，敲除HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的表达)、靶向HLA表达的转录调节因子(例如，敲除NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的表达)、阻断一种或多种MHC I类分子的表面运输(例如，敲除B2M和/或TAP1的表达)和/或使用HLA-Razor进行靶向(参见例如，WO2016183041)。

人白细胞抗原(HLA)复合物与人MHC同义。在一些实施方案中，本文公开的工程化细胞是人类细胞。在某些方面，本文公开的工程化细胞不表达与一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子对应的一种或多种人白细胞抗原(例如，HLA-A、HLA-B和/或HLA-C)，并且因此被表征为低免疫原性。例如，在某些方面，本文公开的工程化细胞已经被修饰，使得细胞(包括任何干细胞或由其制备的分化干细胞)不表达或表现出一种或多种以下MHC I类分子的表达降低：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种可以从细胞“敲除”。具有敲除HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可能表现出每个敲除基因的降低或消除表达。

在某些实施方案中，通过靶向和缺失基因组DNA的连续段来调节一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达，从而降低或消除选自由B2M、CIITA和NLRC5组成的组的靶基因的表达。

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞包含调节一种或多种MHC I类分子的一种或多种靶多核苷酸序列的修饰，诸如遗传修饰。在以下章节中描述了用于降低一种或多种MHC I类分子表达的示例性方法。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是B2M和NLRC5中的一者或两者。在一些实施方案中，细胞包含对B2M基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和CIITA基因的遗传编辑修饰。

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞包含调节一种或多种MHC II类分子的一种或多种靶多核苷酸序列的修饰，诸如遗传修饰。在以下章节中描述了用于降低一种或多种MHC I类分子表达的示例性方法。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA基因的遗传编辑修饰。

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞包含调节一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子的一种或多种靶多核苷酸序列的修饰，诸如遗传修饰。在以下章节中描述了用于降低一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子表达的示例性方法。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在特定实施方案中，细胞包含对B2M、CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。

在一些实施方案中，降低B2M、CIITA和/或NLRC5表达的修饰降低B2M、CIITA和/或NLRC5mRNA表达。在一些实施方案中，B2M、CIITA和/或NLRC5的mRNA表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，B2M、CIITA和/或NLRC5的mRNA表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，B2M、CIITA和/或NLRC5的mRNA表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，B2M、CIITA和/或NLRC5的mRNA表达被消除(例如，0％的B2M、CIITA和/或NLRC5mRNA表达)。在一些实施方案中，降低B2M、CIITA和/或NLRC5mRNA表达的修饰消除了B2M、CIITA和/或NLRC5基因活性。

在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的MICA表达，其中降低如本文所述，诸如相对于在经工程化以降低MICA表达之前、参考细胞或参考细胞群(诸如具有期望的免疫原性反应缺乏的细胞)或测量值。在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以降低MICA多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上MICA多肽的细胞表面表达被降低至比在经工程化以降低MICA多肽细胞表面呈递之前的MICA多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞上MICA多肽的细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的MICA多肽细胞表面表达的水平(诸如MICA多肽细胞表面表达的平均量)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在MICA多肽细胞表面呈递(包括不可检测的细胞表面表达，包括如使用已知技术(例如，流式细胞术)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出MICA多肽的蛋白质表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞上MICA多肽的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低MICA多肽的蛋白质表达之前的MICA多肽蛋白质表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的MICA多肽蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低MICA多肽蛋白质表达之前的MICA多肽水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表现出MICA多肽的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含MICA多肽(包括不可检测的蛋白质，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出编码MICA多肽的mRNA表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的编码MICA多肽的mRNA表达被降低至比在经工程化以降低MICA多肽的mRNA表达之前的编码MICA多肽的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的编码MICA多肽的mRNA表达被降低至比参考细胞或参考细胞群的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表达编码MICA多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA表达，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码MICA多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含MICA基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含两个等位基因中MICA基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含所有等位基因中MICA基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞是MICA敲除的。

在一些实施方案中，工程化细胞包含降低的MICB表达，其中降低如本文所述，诸如相对于在经工程化以降低MICB表达之前、参考细胞或参考细胞群(诸如具有期望的免疫原性反应缺乏的细胞)或测量值。在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以降低MICB多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上MICB多肽的细胞表面表达被降低至比在经工程化以降低MICB多肽细胞表面呈递之前的MICB多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞上MICB多肽的细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的MICB多肽细胞表面表达的水平(诸如MICB多肽细胞表面表达的平均量)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在MICB多肽细胞表面呈递(包括不可检测的细胞表面表达，包括如使用已知技术(例如，流式细胞术)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出MICB多肽的蛋白质表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞上MICB多肽的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低MICB多肽的蛋白质表达之前的MICB多肽蛋白质表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的MICB多肽蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低MICB多肽蛋白质表达之前的MICB多肽水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表现出MICB多肽的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含MICB多肽(包括不可检测的蛋白质，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出编码MICB多肽的mRNA表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的编码MICB多肽的mRNA表达被降低至比在经工程化以降低MICB多肽的mRNA表达之前的编码MICB多肽的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的编码MICB多肽的mRNA表达被降低至比参考细胞或参考细胞群的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表达编码MICB多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA表达，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码MICB多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含MICB基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含两个等位基因中MICB基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含所有等位基因中MICB基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞是MICB敲除的。

在一些实施方案中，工程化细胞包含一种或多种MHC I类分子或其组分的降低的表达，其中降低如本文所述，诸如相对于在经工程化以降低一种或多种MHC I类分子或其组分的表达之前、参考细胞或参考细胞群(诸如具有期望的免疫原性反应缺乏的细胞)、或测量值。在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以降低一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的细胞表面表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的细胞表面呈递之前的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)细胞表面表达的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞上一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)细胞表面表达的水平(诸如一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)细胞表面表达的平均量)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)细胞表面呈递(包括不可检测的细胞表面表达，包括如使用已知技术(例如，流式细胞术)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达之前的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)蛋白质表达的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达之前的一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表现出一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)(包括不可检测的蛋白质，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的mRNA表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的mRNA表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的mRNA表达之前的编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分(诸如B2M)的mRNA表达被降低至比参考细胞或参考细胞群的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表达编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分的mRNA(包括不可检测的mRNA表达，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码一种或多种MHC I类分子多肽或其组分的mRNA(包括不可检测的mRNA，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含MHC I类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含两个等位基因中MHC I类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含所有等位基因中MHC I类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞是MHC I类分子敲除的或MHC I类分子组分(诸如B2M)敲除的。

在一些实施方案中，工程化细胞包含一种或多种MHC II类分子的降低的表达，其中降低如本文所述，诸如相对于在经工程化以降低一种或多种MHC II类分子的表达之前、参考细胞或参考细胞群(诸如具有期望的免疫原性反应缺乏的细胞)、或测量值。在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以降低一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面呈递之前的一种或多种MHCII类分子多肽的细胞表面表达的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞上一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面表达的水平(诸如一种或多种MHC II类分子多肽的细胞表面表达平均量)低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，在工程化细胞上不存在一种或多种MHCII类分子多肽的细胞表面呈递(包括不可检测的细胞表面表达，包括如使用已知技术(例如，流式细胞术)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达之前的一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达之前的一种或多种MHC II类分子多肽的水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表现出一种或多种MHC II类分子多肽的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含一种或多种MHC II类分子多肽(包括不可检测的蛋白质，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA表达降低。在一些实施方案中，工程化细胞的编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA表达被降低至比在经工程化以降低一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA表达之前的编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA表达被降低至比参考细胞或参考细胞群的mRNA表达水平低约60％或更低(诸如约55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或1％或更低中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞不表达编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA表达，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码一种或多种MHC II类分子多肽的mRNA(包括不可检测的mRNA，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含MHC II类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含两个等位基因中MHC II类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞包含所有等位基因中MHC II类分子基因的基因失活或破坏。在一些实施方案中，工程化细胞是MHC II类分子敲除的。

1.降低表达的方法

在一些实施方案中，本文提供的细胞被修饰，诸如遗传修饰，以降低所描述的一种或多种靶多核苷酸的表达。在一些实施方案中，用一个或多个修饰工程化以降低(例如，消除)多核苷酸或蛋白质表达的细胞是如本文所述的任何源细胞。在一些实施方案中，源细胞是本文所述的任何细胞。在某些实施方案中，本文公开的细胞(例如，干细胞、诱导多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、间充质细胞或原代细胞)包含一个或多个修饰，诸如遗传修饰，以降低一种或多种靶多核苷酸的表达。一种或多种靶多核苷酸的非限制性实例包括如上所述的任何一种，诸如MICA和/或MICB，以及一种或多种MHC I类分子或其组分、一种或多种MHC II类分子、CIITA、B2M、NLRC5、HLA-A、HLA-B、HLA-C、LRC5、RFX-ANK、RFX5、RFX-AP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、IRF1和TAP1。在一些实施方案中，降低一种或多种靶多核苷酸表达的一个或多个修饰(诸如遗传修饰)与增加所需转基因(诸如本文所述的任何转基因)的表达的一个或多个修饰组合。在一些实施方案中，一个或多个修饰(诸如遗传修饰)产生工程化细胞，其为免疫特权或低免疫原性的细胞。通过调节(例如，降低或缺失)一个或多个靶多核苷酸的表达，此类细胞在植入到受体受试者中时表现出降低的免疫活化。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。

可以使用用于降低靶多核苷酸表达的任何方法。在一些实施方案中，修饰是遗传修饰。在一些实施方案中，修饰(诸如遗传修饰)导致靶多核苷酸表达的永久消除或降低。例如，在一些实施方案中，通过在靶多核苷酸中引入DNA断裂(诸如通过使用靶向核酸内切酶)来破坏靶多核苷酸或基因。在其他实施方案中，修饰(诸如遗传修饰)导致靶多核苷酸表达的短暂降低。例如，在一些实施方案中，基因阻遏通过以下方式来实现：使用与靶多核苷酸互补的抑制性核酸来选择性地抑制或阻遏基因的表达，例如使用反义技术，诸如通过RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)和/或核酶。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。

在一些实施方案中，通常以靶向方式通过在基因中诱导一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂来进行基因破坏。在一些实施方案中，双链或单链断裂由核酸酶(例如核酸内切酶，诸如基因靶向核酸酶)产生。在一些实施方案中，靶向核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和RNA指导的核酸酶(诸如CRISPR相关核酸酶(Cas)，其被特别设计为靶向基因序列或其部分)。在一些实施方案中，靶向核酸酶产生双链或单链断裂，其然后通过易错非同源末端连接(NHEJ)进行修复，或者在一些情况下，使用模板进行精确同源定向修复(HDR)。在一些实施方案中，靶向核酸酶产生DNA双链断裂(DSB)。在一些实施方案中，产生和修复断裂的过程通常容易出错，并导致NHEJ修复中DNA碱基的插入和缺失(插入缺失)。在一些实施方案中，遗传修饰可以诱导靶基因核苷酸序列的缺失、插入或突变。在一些情况下，遗传修饰可能导致移码突变，这可能导致过早终止密码子。在核酸酶介导的基因编辑的实例中，靶向编辑发生在基因的两个等位基因上，导致基因的双等位基因破坏或编辑。在一些实施方案中，通过基因编辑靶向基因的所有等位基因。在一些实施方案中，用靶向核酸酶(诸如使用CRISPR/Cas系统)的遗传修饰导致基因的完全敲除。

在一些实施方案中，将核酸酶(诸如稀切核酸内切酶)引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。可以将核酸酶以编码核酸酶的核酸的形式引入细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，引入细胞中的核酸是DNA。在一些实施方案中，将核酸酶以蛋白质的形式引入细胞中。例如，在CRISPR/Cas系统的情况下，可以将核糖核蛋白(RNP)引入细胞中。

在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可以采用多种Cas蛋白(Haft等人,PLoS Comput Biol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。

CRISPR/Cas系统包括可以用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列的靶向系统。在一些实施方案中，本文提供的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白以及能够将Cas蛋白引导到靶多核苷酸序列的靶基序并与之杂交的一种或多种(诸如至少一种至两种)核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))。

在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含肽键置换(例如，尿素、硫脲、氨基甲酸酯和磺酰脲)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、同型半胱氨酸和磷酸丝氨酸)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含修饰以包括部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂质化、乙酰化和封端)。

在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性的Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12a和Cas13。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌亚型(也称为CASS2)的Cas蛋白。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包括RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。参见，例如，Klompe等人,Nature 571,219–225(2019)；Strecker等人,Science365,48–53(2019)。

在一些实施方案中，用于遗传修饰细胞以敲除、敲低或以其他方式修饰一种或多种基因的方法包括使用定点核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、转座酶和成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统。

ZFN是包含一系列位点特异性DNA结合结构域的融合蛋白，所述结构域改编自附接至细菌FokI限制酶的核酸内切酶结构域的含锌指转录因子。ZFN可具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)DNA结合结构域或锌指结构域。参见，例如，Carroll等人,Genetics Society of America(2011)188:773-782；Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:1156-1160。每个锌指结构域都是被一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序，并且通常识别3至4bp的DNA序列。因此，串联结构域可以潜在地与细胞基因组中独特的延伸核苷酸序列结合。

可以组合特异性已知的各种锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。可以对锌指进行工程化以结合预定的核酸序列。工程化锌指以结合预定核酸序列的标准是本领域已知的。参见，例如，Sera等人,Biochemistry(2002)41:7074-7081；Liu等人,Bioinformatics(2008)24:1850-1857。

含有FokI核酸酶结构域或其他二聚核酸酶结构域的ZFN用作二聚体。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须通过适当间隔开的核酸酶结合DNA的相反链。参见Bitinaite等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:10570-10575。为了切割基因组中的指定位点，设计了一对ZFN以识别侧接所述位点的两个序列，一个在正向链上，而另一个在反向链上。当ZFN在所述位点的任一侧结合后，核酸酶结构域二聚化并且切割所述位点处的DNA，从而生成具有5'突出端的DSB。然后可以借助含有被同源臂侧接的期望突变的修复模板，利用HDR来引入特定突变。修复模板通常是引入到细胞中的外源双链DNA载体。参见Miller等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:731-734。

TALEN是可以用于编辑靶基因的人工核酸酶的另一个实例。TALEN来源于被称为TALE重复序列的DNA结合结构域，它通常包含具有10至30个重复序列的串联阵列，所述重复序列结合并识别延伸的DNA序列。每个重复序列长度为33至35个氨基酸，两个相邻的氨基酸(称为重复可变双残基或RVD)赋予四个DNA碱基对之一的特异性。因此，重复序列与靶DNA序列中的碱基对之间存在一一对应关系。

通过将一个或多个TALE DNA结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)融合至核酸酶结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)而人工产生TALEN。参见Zhang,Nature Biotech.(2011)29:149-153。为了在TALEN中使用，已经对FokI进行了若干种突变；例如，这些改善了切割特异性或活性。参见Cermak等人,Nucl.Acids Res.(2011)39:e82；Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nature Biotech.(2011)29:731-734；Wood等人,Science(2011)333:307；Doyon等人,Nature Methods(2010)8:74-79；Szczepek等人,Nature Biotech(2007)25:786-793；Guo等人,J.Mol.Biol.(2010)200:96。FokI结构域用作二聚体，需要具有独特的DNA结合结构域的两个构建体，用于靶基因组中的具有正确的取向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148。

通过将工程化TALE重复序列与核酸酶结构域相组合，可以产生对任何期望的DNA序列具有特异性的位点特异性核酸酶。与ZFN类似，可以将TALEN引入到细胞中以在基因组中的期望靶位点生成DSB，因此TALEN可以用于以类似的HDR介导的途径敲除基因或敲入突变。参见Boch,Nature Biotech.(2011)29:135-136；Boch等人,Science(2009)326:1509-1512；Moscou等人,Science(2009)326:3501。

大范围核酸酶是内切核酸酶家族中的酶，其特征在于它们能够识别并切割大DNA序列(14至40个碱基对)。基于大范围核酸酶的影响核酸酶活性和/或DNA识别的结构基序，将大范围核酸酶分为多个家族。最广泛和最有名的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，其名称来源于保守的氨基酸序列。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。另一方面，GIY-YIG家族成员具有GIY-YIG模块，其长度为70-100个残基，并且包括具有四个不变残基的四个或五个保守序列基序，其中两个是活性所需的。参见Van Roey等人,Nature Struct.Biol.(2002)9:806-811。His-Cys家族大范围核酸酶的特征在于在涵盖数百个氨基酸残基的区域中的一系列高度保守的组氨酸和半胱氨酸。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。NHN家族的成员由含有被天冬酰胺残基包围的两对保守组氨酸的基序定义。参见Chevalier等人,Nucleic AcidsRes.(2001)29(18):3757-3774。

由于高特异性要求，鉴定特定靶DNA序列的天然大范围核酸酶的机会较低，因此已使用各种方法(包括诱变和高通量筛选方法)来创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。用于对具有改变的DNA结合特异性的大范围核酸酶进行工程化(例如以结合预定核酸序列)的策略是本领域已知的。参见，例如,Chevalier等人,Mol.Cell.(2002)10:895-905；Epinat等人,Nucleic Acids Res(2003)31:2952-2962；Silva等人,J Mol.Biol.(2006)361:744-754；Seligman等人,Nucleic Acids Res(2002)30:3870-3879；Sussman等人,J Mol Biol(2004)342:31-41；Doyon等人,J Am Chem Soc(2006)128:2477-2484；Chen等人,ProteinEng Des Sel(2009)22:249-256；Arnould等人,J Mol Biol.(2006)355:443-458；Smith等人,Nucleic Acids Res.(2006)363(2):283-294。

与ZFN和TALEN一样，大范围核酸酶可以在基因组DNA中产生DSB，如果修复不当(例如，经由NHEJ)，它可以产生移码突变，从而导致靶基因在细胞中的表达降低。或者，可以将外来DNA与大范围核酸酶一起引入到细胞中。根据外来DNA的序列和染色体序列，此过程可用于修饰靶基因。参见Silva等人,Current Gene Therapy(2011)11:11-27。

转座酶是结合转座子的末端并且通过剪切和粘贴机制或复制性转座机制催化其移动到基因组另一部分的酶。通过将转座酶连接至其他系统(诸如CRISPER/Cas系统)，可以开发新的基因编辑工具以实现基因组DNA的位点特异性插入或操作。有两种已知的使用转座子的DNA整合方法，其使用催化无活性的Cas效应蛋白和Tn7样转座子。转座酶依赖性DNA整合不在基因组中引发DSB，这可以保证更安全和更具特异性的DNA整合。

CRISPR系统作为提供一种获得性免疫的参与防御入侵噬菌体和质粒的系统最初在原核生物(例如，细菌和古细菌)中发现。现在它已被改编并用作研究和临床应用中流行的基因编辑工具。

CRISPR/Cas系统通常包含至少两种组件：一个或多个指导RNA(gRNA)和Cas蛋白。Cas蛋白是一种将DSB引入到靶位点中的核酸酶。CRISPR-Cas系统有两大类：1类系统使用多种Cas蛋白的复合物来降解核酸；2类系统使用单一大Cas蛋白来达到相同目的。1类分为I、III和IV型；2类分为II、V和VI型。适用于基因编辑应用的不同Cas蛋白包括但不限于Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3和Mad7。最广泛使用的Cas9是II型Cas蛋白，并且在本文中作为示例进行描述。这些Cas蛋白可来源于不同的来源物种。例如，Cas9可以来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。

在原始微生物基因组中，II型CRISPR系统将来自入侵DNA的序列掺入到宿主基因组内编码为阵列的CRISPR重复序列之间。来自CRISPR重复序列阵列的转录物被加工成CRISPR RNA(crRNA)，每个都具有从入侵DNA转录的可变序列(称为“原间隔”序列)，以及CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且这两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原间隔编码部分指导Cas9复合物切割互补的靶DNA序列，前提条件是它们与被称为“原间隔相邻基序”(PAM)的短序列相邻。

自发现以来，CRISPR系统已被改编用于在从细菌到真核细胞(包括人类细胞)的广泛细胞和生物体中诱导序列特异性DSB和靶向基因组编辑。在基因编辑应用的用途中，人工设计的合成gRNA已经替代了原始的crRNA:tracrRNA复合物。例如，gRNA可以是由crRNA、四环和tracrRNA构成的单指导RNA(sgRNA)。crRNA通常包含互补区域(也称为间隔子，长度通常为约20个核苷酸)，其经过用户设计以识别感兴趣的靶DNA。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列通过四环连接，每个都具有用于彼此杂交的短重复序列，因此生成嵌合sgRNA。可以通过简单地改变gRNA中存在的间隔子或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组靶标。互补区域将通过标准的RNA-DNA互补碱基配对规则将Cas核酸酶引导至靶DNA位点。

为了使Cas核酸酶发挥作用，紧邻基因组DNA中的靶序列的下游必须有PAM的存在。Cas蛋白对PAM的识别被认为会破坏相邻基因组序列的稳定性，从而允许gRNA询问序列并且在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特定序列因Cas基因的种类而异。例如，最常用的来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶识别5'-NGG-3'的PAM序列，或者以较低的效率识别5'-NAG-3'，其中“N”可以是任何核苷酸。具有替代PAM的其他Cas核酸酶变体也已被表征并成功用于基因组编辑，其总结于下表1a中。

表1a.示例性Cas核酸酶变体及其PAM序列

R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T；V＝A或C或G；N＝任何碱基

在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一个或多个突变以改变它们的活性、特异性、识别和/或其他特征。例如，Cas核酸酶可具有一个或多个突变，所述突变改变其保真度以减轻脱靶效应(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高保真变体)。再例如，Cas核酸酶可具有一个或多个改变其PAM特异性的突变。

在一些实施方案中，Cas蛋白包括本文所述的Cas蛋白中的任一种或其功能部分。如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，其保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并且切割靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas9蛋白功能结构域的组合，所述Cas9蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas12a(也称为Cpf1)蛋白功能结构域的组合，所述Cas12a蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。

在一些实施方案中，合适的Cas蛋白包括但不限于Cas0、Cas12a(即Cpf1)、Cas12b、Cas12i、CasX和Mad7。

在一些实施方案中，可以将外源Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别指代促进分子摄取到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测标记。

在某些实施方案中，Cas蛋白可以与带电蛋白质(例如，携带正电荷、负电荷或全部中性电荷的蛋白质)缀合或融合。这种连接可以是共价的。在一些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至超正电荷GFP以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS ChemBiol.2010；5(8):747-52)。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至蛋白转导结构域(PTD)以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡精氨酸和穿透肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与寡精氨酸结构域融合的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含与寡精氨酸结构域融合的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas12a多肽。

在一些实施方案中，可以将Cas蛋白以编码Cas蛋白的核酸的形式引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含修饰的DNA，如本文所述。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。

在一些实施方案中，将Cas蛋白与一个至两个核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。

在提供的实施方案中，CRISPR/Cas系统通常包括两种组分：一种或多种指导RNA(gRNA)和Cas蛋白。在一些实施方案中，将Cas蛋白与一种或多种(诸如一种至两种)核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。

在一些实施方案中，gRNA是由用于Cas结合的支架序列和用户设计的称为crRNA的间隔区或互补部分构成的短合成RNA。cRNA由限定待修饰的基因组靶标的crRNA靶向序列(下文也称为gRNA靶向序列；通常约20个核苷酸长)和crRNA重复(例如，GUUUUAGA GCUA；SEQID NO:26)区域构成。人们可以通过简单地改变gRNA中存在的互补部分序列(例如，gRNA靶向序列)来改变Cas蛋白的基因组靶标。在一些实施方案中，用于Cas结合的支架序列由通过其反重复序列与crRNA杂交的tracrRNA序列组成(例如，UAGCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCUUU；SEQ ID NO:27)。crRNA:tracrRNA之间的复合物募集Cas核酸酶(例如，Cas9)并在原间隔区邻近基序(PAM)的上游进行切割。为了使Cas蛋白发挥作用，紧邻基因组DNA中的靶序列的下游必须有PAM的存在。Cas蛋白对PAM的识别被认为会破坏相邻基因组序列的稳定性，从而允许gRNA询问序列并且在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特定序列因Cas基因的种类而异。例如，最常用的来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶识别NGG的PAM序列。其他Cas9变体和其他具有替代PAM的核酸酶也已被表征并成功用于基因组编辑。因此，CRISPR/Cas系统可以用于在与为靶基因座设计的gRNA互补的特定基因组基因座上产生靶向DSB。crRNA和tracrRNA可以与环序列(例如，四环；GAAA)连接在一起用于产生为嵌合单指导RNA(sgRNA；Hsu等人2013)的gRNA。sgRNA可以产生用于基于DNA的表达或通过化学合成产生。

在一些实施方案中，gRNA的互补部分序列(例如，gRNA靶向序列)将根据感兴趣的靶位点而变化。在一些实施方案中，gRNA包含对表1b中所列出的基因序列具有特异性的互补部分。在一些实施方案中，由gRNA靶向的基因组基因座位于所描述的任何基因座的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内。

本文公开的方法考虑使用能够将Cas蛋白引导到靶多核苷酸序列的靶基序并与之杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单个核糖核酸包含指导RNA，所述指导RNA将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交。在一些实施方案中，核糖核酸中的至少一个核糖核酸包含指导RNA，所述指导RNA将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。如本领域技术人员所理解的，，可以选择本文提供的核糖核酸与多种不同的靶基序(取决于所采用的特定CRISPR/Cas系统)和靶多核苷酸的序列杂交。也可以选择一个至两个核糖核酸以使与除靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交最小化。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述脱氧核糖核酸基序在位于靶基序之间的突变等位基因的两侧。

在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每个核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。

在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相同链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。

在一些实施方案中，通过病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一个至两个核糖核酸的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。

表1b中提供了可用于基于CRISPR/Cas靶向本文所述的基因的示例性gRNA序列。序列可以在2016年5月9日提交的WO2016183041中找到，包括表格、附录和序列表的公开内容据此通过引用整体并入本文。

表1b.可用于靶向基因的示例性gRNA靶向序列

表1c中提供了可用于基于CRISPR/Cas靶向本文所述的基因的另外的示例性Cas9指导RNA序列。

表2A.可用于靶向基因的另外的示例性Cas9指导RNA序列

在一些实施方案中，本领域技术人员有能力鉴定新的基因座和/或gRNA靶向序列，用于遗传破坏方法中以降低或消除所描述的基因的表达。例如，对于CRISPR/Cas系统，当特定基因座(例如，在靶基因内，例如表1b中所列出的)的现有gRNA靶向序列已知时，通过扫描PAM序列基因座(其通常在基因组中每100个碱基对(bp)出现一次)任一侧的侧翼区域，可以使用“英寸蠕动(inch worming)”方法来鉴定用于靶向插入转基因的另外基因座。PAM序列将取决于所用的特定Cas核酸酶，因为不同的核酸酶通常具有不同的相应PAM序列。在基因座任一侧的侧翼区域可以长约500bp至4000bp之间，例如长约500bp、约1000bp、约1500bp、约2000bp、约2500bp、约3000bp、约3500bp或约4000bp。当在搜索范围内鉴定出PAM序列时，可以根据该基因座的序列设计新的指南，用于遗传破坏方法中。虽然CRISPR/Cas系统被作为示例进行描述，但是所描述的任何基因编辑方法都可以用于这种鉴定新基因座的方法，包括使用ZFN、TALEN、大范围核酸酶和转座酶的那些方法。

在一些实施方案中，使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)方法制备本文所述的细胞。“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常来源于转录活化因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的用以切割核酸靶序列的融合蛋白。催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地是具有核酸内切酶活性的结构域，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在特定实施方案中，可以将TALE结构域与大范围核酸酶(例如I-CreI和I-OnuI或其功能变体)融合。在一些实施方案中，核酸酶是单体TALE-核酸酶。单体TALE-核酸酶是不需要二聚化进行特异性识别和切割的TALE-核酸酶，诸如在WO2012138927中描述的工程化TAL重复序列与I-TevI的催化结构域的融合物。转录激活因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，包含多个重复序列，每个重复包含位置12和13中对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基特异的二残基(RVD)。具有相似模块化逐碱基核酸结合性质(MBBBD)的结合结构域也可以来源于申请人最近在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有比TAL重复序列显示更多序列可变性的优势。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN；和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT；以及用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变，以便调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性，特别是增强这种特异性。TALEN试剂盒在商业上出售。

在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)对细胞进行操作。“锌指结合蛋白”是一种由于通过锌离子的配位稳定蛋白质结构而优选地以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽。术语锌指结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。单个DNA结合结构域通常被称为“指”。ZFP具有至少一个指，通常具有两个指、三个指或六个指。每个指结合两个至四个DNA碱基对，通常是三个或四个DNA碱基对。ZFP与被称为靶位点或靶区段的核酸序列结合。每个指通常包含一个大约30个氨基酸的锌螯合DNA结合亚结构域。研究已经证明，这类单个锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单个β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见例如，Berg和Shi,Science 271:1081-1085(1996))。

在一些实施方案中，使用归巢核酸内切酶制备本文所述的细胞。此类归巢核酸内切酶是本领域熟知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶具有高度特异性，识别长度范围为12个至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14bp至40bp的DNA靶位点。归巢核酸内切酶可以例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。在一些实施方案中，归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。

在一些实施方案中，使用大范围核酸酶制备本文所述的细胞。按照定义，大范围核酸酶是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier,B.S.and B.L.Stoddard,NucleicAcids Res.,2001,29,3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向性提高1000倍或更多(Puchta等人,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040；Rouet等人,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106；Choulika等人,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973；Puchta等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060；Sargent等人,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77；Donoho等人,Mol.Cell.Biol,1998,18,4070-4078；Elliott等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101；Cohen-Tannoudji等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。

在一些实施方案中，使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)敲低(例如，降低、消除或抑制)多肽的表达来制备本文提供的细胞。适用的RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和本领域技术人员认可的其他瞬时敲落方法的那些方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的用于RNAi的试剂是可商购的。例如，通过将与靶多核苷酸的靶基序互补的抑制性核酸(诸如siRNA)引入细胞中，通过RNA干扰可以在细胞中敲低靶多核苷酸，诸如上文所述的任何靶多核苷酸，例如CIITA、B2M或NLRC5。在一些实施方案中，可以通过将表达shRNA的病毒转导到细胞中在细胞中敲低靶多核苷酸，诸如上文所述的任何靶多核苷酸，例如CIITA、B2M或NLRC5。在一些实施方案中，采用RNA干扰来降低或抑制选自由CIITA、B2M和NLRC5组成的组的至少一种的表达。

在一些实施方案中，基因编辑技术介导双链断裂(DSB)，包括结合非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括基于DNA的编辑或引物编辑。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)。

2.用于降低表达的示例性靶多核苷酸和方法

A.MICA

在某些实施方案中，修饰(诸如遗传修饰)降低或消除(诸如敲除)MICA的表达。MICA是一种具有已知同种型和变体的蛋白质(参见例如，UniProt Q29983，于2021年8月9日访问)；所有此类形式的MICA都涵盖在本文提供的公开内容中。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。例如，在一些实施方案中，可以使用具有靶向序列GATGACCCTGGCTCATATCA的gRNA。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统和gRNA靶向MICA(诸如具有靶向序列GATGACCCTGGCTCATATCA)的基因编辑方法敲除了细胞中MICA的所有等位基因。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中，其中所述受试者具有预先存在的抗MICA抗体或后来产生抗MICA抗体，而所述细胞仍在个体中循环。由于在MICA与MICB之间的序列相似性，在一些实施方案中，单个抗体可以结合MICA和MICB两者。出于本说明书的目的，结合两种抗体(即抗MICA抗体和抗MICB抗体)的抗体可以被归类为抗MICA抗体。术语抗MICA抗体的使用并不排除所述抗体也特异性结合MICB的可能性。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向MICA基因的修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，靶向MICA基因的遗传修饰是通过使用靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向MICA基因的指导核糖核酸序列。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入MICA基因。

测试MICA基因是否已失活的测定是已知的，并且本文提供了示例性描述。在一个实施方案中，通过PCR评估MICA基因的所得遗传修饰。在一些实施方案中，可以通过流式细胞术(诸如通过FACS分析)来测定所得的MICA表达降低。在另一个实施方案中，通过对用B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测MICA蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰(诸如遗传修饰)的存在。在一些实施方案中，使用免疫亲和技术，诸如免疫组织化学或免疫细胞化学来评估MICA表达的降低。

在一些实施方案中，工程化细胞中MICA表达或功能的降低可以使用本领域已知的技术来测量；例如，使用结合MICA的标记的抗体的FACS技术；例如使用可商购获得的抗MICA抗体。另外，可以对细胞进行测试，以确认MICA复合物不在细胞表面上表达。这可以通过FACS分析或其他已知技术诸如免疫化学技术(例如，IHC或ICC)使用如上所讨论的针对一种或多种MICA细胞表面组分的抗体进行测定。除了MICA降低之外，本文提供的工程化细胞对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的敏感性降低。下文进一步描述了测定工程化细胞的低免疫原性表型的方法。

B.MICB

在某些实施方案中，修饰(诸如遗传修饰)降低或消除(诸如敲除)MICB的表达。MICB是一种具有已知同种型和变体的蛋白质(参见例如，UniProt Q29980，于2021年8月9日访问)；所有此类形式的MICB都涵盖在本文提供的公开内容中。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。例如，在一些实施方案中，可以使用具有靶向序列GTTTCTGCCTGTCATAGCGC的gRNA。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统和gRNA靶向MICA(诸如具有靶向序列GTTTCTGCCTGTCATAGCGC)的基因编辑方法敲除了细胞中MICB的所有等位基因。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中，其中所述受试者具有预先存在的抗MICB抗体或后来产生抗MICB抗体，而所述细胞仍在个体中循环。由于在MICA与MICB之间的序列相似性，在一些实施方案中，单个抗体可以结合MICA和MICB两者。出于本说明书的目的，结合两种抗体(即抗MICA抗体和抗MICB抗体)的抗体可以被归类为抗MICB抗体。术语抗MICB抗体的使用并不排除所述抗体也特异性结合MICA的可能性。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向MICB基因的修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，靶向MICB基因的遗传修饰是通过使用靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向MICB基因的指导核糖核酸序列。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入MICB基因。

测试MICB基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR评估MICB基因的所得遗传修饰。在一些实施方案中，MICB表达的减少可以通过流式细胞术测定，例如通过FACS分析。在另一个实施方案中，通过对用B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测MICB蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰(诸如遗传修饰)的存在。在一些实施方案中，使用免疫亲和技术，诸如免疫组织化学或免疫细胞化学来评估MICB表达的降低。

在一些实施方案中，工程化细胞中MICB表达或功能的降低可以使用本领域已知的技术来测量；例如，使用结合MICB的标记的抗体的FACS技术；例如，使用可商购获得的抗MICB抗体。另外，可以对细胞进行测试，以确认MICB复合物不在细胞表面上表达。这可以通过FACS分析或其他已知技术诸如免疫化学技术(例如，IHC或ICC)使用如上所讨论的针对一种或多种MICB细胞表面组分的抗体进行测定。除了MICB降低之外，本文提供的工程化细胞对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的敏感性降低。下文进一步描述了测定工程化细胞的低免疫原性表型的方法。

C.MHC I类分子

在某些实施方案中，修饰(诸如遗传修饰)通过靶向附属链B2M来降低或消除(诸如敲除)一种或多种MHC I类分子基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。通过降低或消除(诸如敲除)B2M的表达，一种或多种MHC I类分子的表面运输被阻断，并且当植入到受体受试者体内时，此类细胞表现出免疫耐受性。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。

在一些实施方案中，本文提供的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的直向同源物。

在一些实施方案中，一种或多种MHC I类分子的表达降低或消除通过修饰来实现，所述修饰降低以下MHC I类分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达降低或消除了以下MHC I类分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达降低或消除了HLA-A蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达降低或消除了HLA-B蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达降低或消除了HLA-C蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的B2M表达通过敲除编码以下MHC I类分子中的一种或多种的基因来降低或消除所述分子的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-A蛋白的基因以降低或消除所述HLA-A蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-B蛋白的基因以降低或消除所述HLA-B蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-C蛋白的基因以降低或消除所述HLA-C蛋白的表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向B2M基因的修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，靶向B2M基因的遗传修饰是通过使用靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向B2M基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向B2M基因的至少一种指导核糖核酸序列(例如，gRNA靶向序列)选自由以下组成的组：WO2016/183041的附录2或表15的SEQID NO:81240-85644，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，用于特异性地靶向B2M基因的gRNA靶向序列是CGUGAGUAAACCUGAAUCUU(SEQ ID NO:33)。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入B2M基因。用于在B2M基因座处靶向插入的示例性转基因包括如本文所述的任何转基因。

在一些实施方案中，工程化细胞来源于不表达MHC II类分子的细胞，并且在这样的实施方案中，工程化细胞包含B2M敲除。例如，在一些实施方案中，工程化细胞来源于野生型人原代胰岛细胞，并且不表达HLA II类细胞，其中所述工程化细胞包含B2M敲除以降低一种或多种MHC I类分子的表达(包括基本上由其组成)。在一些实施方案中，不需要其他修饰来实现对一种或多种MHC I类分子的期望调节。

测试B2M基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR评估B2M基因的所得遗传修饰。在一些实施方案中，一种或多种MHC I类分子(诸如HLA-I)表达的降低可以通过流式细胞术(诸如通过FACS分析)进行测定。在另一个实施方案中，通过对用B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测B2M蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰(诸如遗传修饰)的存在。在一些实施方案中，使用免疫亲和技术，诸如免疫组织化学或免疫细胞化学来评估一种或多种MHC I类分子表达的降低。

在一些实施方案中，工程化细胞中一种或多种MHC I类分子(当细胞来源于人类细胞时为HLA I)的表达或功能的降低可以使用本领域已知的技术进行测量；例如，使用结合HLA复合物的标记的抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原的α链结合的可商购获得的HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体。另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。除了HLA I(或一种或多种MHC I类分子)降低之外，本文提供的工程化细胞对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的敏感性降低。下文进一步描述了测定工程化细胞的低免疫原性表型的方法。

在一些实施方案中，降低B2M表达的修饰降低B2M mRNA表达。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，B2M的mRNA表达被消除(例如，0％的B2M mRNA表达)。在一些实施方案中，降低B2M mRNA表达的修饰消除了B2M基因活性。

在一些实施方案中，降低B2M表达的修饰降低了B2M蛋白质表达。在一些实施方案中，B2M的蛋白质表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，B2M的蛋白质表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，B2M的蛋白质表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，B2M的蛋白质表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，B2M的蛋白质表达被消除(例如，0％的B2M蛋白质表达)。在一些实施方案中，降低B2M蛋白质表达的修饰消除了B2M基因活性。

在一些实施方案中，降低B2M表达的修饰包括B2M基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低B2M表达的修饰包括B2M基因的一个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低B2M表达的修饰包括失活或破坏，其包括B2M基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括细胞中一个或多个B2M编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括细胞中所有B2M编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括失活或破坏，其包括B2M基因中的插入缺失。在一些实施方案中，修饰是B2M基因的基因组DNA的移码突变。在一些实施方案中，修饰是B2M基因的基因组DNA的缺失。在一些实施方案中，修饰是B2M基因的基因组DNA的连续段的缺失。在一些实施方案中，B2M基因被敲除。

D.MHC II类分子

在某些方面，修饰(诸如遗传修饰)通过靶向II类分子反式激活因子(CIITA)表达来降低或消除(诸如敲除)一种或多种MHC II类分子基因的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。CIITA是蛋白质的LR或核苷酸结合结构域(NBD)富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的成员，并且通过与MHC增强体缔合来调节一种或多种MHC II类分子的转录。通过降低或消除(诸如敲除)CIITA的表达，一种或多种MHC II类分子的表达被降低，从而也降低表面表达。在一些情况下，此类细胞在植入到受体受试者体内时表现出免疫耐受性。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的直向同源物。

在一些实施方案中，一种或多种MHC II类分子的表达降低或消除是降低以下MHCII类分子中的一种或多种的表达的修饰：HHLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了以下MHC II类分子中的一种或多种的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DP蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DM蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DOA蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DOB蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DQ蛋白的表达。在一些实施方案中，降低或消除的CIITA表达降低或消除了HLA-DR蛋白的表达。在一些实施方案中，通过敲除编码以下MHC II类分子中的一种或多种的基因，降低或消除的CIITA表达降低或消除了所述分子的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DP蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DP蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DM蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DM蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DOA蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DOA蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DOB蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DOB蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DQ蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DQ蛋白的表达。在一些实施方案中，敲除编码HLA-DR蛋白的基因以降低或消除所述HLA-DR蛋白的表达。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向CIITA基因的修饰，诸如遗传修饰。在一些实施方案中，靶向CIITA基因的遗传修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向CIITA基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向CIITA基因的至少一种指导核糖核酸序列(例如，gRNA靶向序列)选自由以下组成的组：WO2016183041的附录1或表12的SEQ ID NO:5184-36352，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，用于特异性地靶向CIITA基因的gRNA靶向序列是GAUAUUGGCAUAAGCCUCCC(SEQ ID NO:34)。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入CIITA基因。用于在B2M基因座处靶向插入的示例性转基因包括如本文所述的任何转基因。

测试CIITA基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR评估CIITA基因的所得遗传修饰。在一些实施方案中，一种或多种MHC II类分子(诸如HLA-II)表达的降低可以通过流式细胞术(诸如通过FACS分析)进行测定。在另一个实施方案中，通过对用CIITA蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测CIITA蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰(诸如遗传修饰)的存在。在一些实施方案中，使用免疫亲和技术，诸如免疫组织化学或免疫细胞化学来评估一种或多种MHC II类分子表达的降低。

在一些实施方案中，工程化细胞中一种或多种MHC II类分子(当细胞来源于人类细胞时为HLA Ii)的表达或功能的降低可以使用本领域已知的技术进行测量，诸如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术和RT-PCR技术。在一些实施方案中，可以对工程化细胞进行测试，以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。用于评估表面表达的方法包括本领域已知的方法(例如参见WO2018132783的图21)并且通常基于与人HLA II类分子HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商用抗体使用蛋白质印迹或FACS分析来进行。除了HLA II(或一种或多种MHC II类分子)降低之外，本文提供的工程化细胞对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的敏感性降低。下文进一步描述了测定工程化细胞的低免疫原性表型的方法。

在一些实施方案中，降低CIITA表达的修饰降低CIITA mRNA表达。在一些实施方案中，CIITA的mRNA表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，CIITA的mRNA表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，CIITA的mRNA表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，CIITA的mRNA表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，CIITA的mRNA表达被消除(例如，0％的CIITA mRNA表达)。在一些实施方案中，降低CIITA mRNA表达的修饰消除了CIITA基因活性。

在一些实施方案中，降低CIITA表达的修饰降低CIITA蛋白质表达。在一些实施方案中，CIITA的蛋白质表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，CIITA的蛋白质表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，CIITA的蛋白质表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，CIITA的蛋白质表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，CIITA的蛋白质表达被消除(例如，0％的CIITA蛋白质表达)。在一些实施方案中，降低CIITA蛋白质表达的修饰消除了CIITA基因活性。

在一些实施方案中，降低CIITA表达的修饰包括CIITA基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低CIITA表达的修饰包括CIITA基因的一个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低CIITA表达的修饰包括失活或破坏，其包括CIITA基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括细胞中一个或多个CIITA编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括细胞中所有CIITA编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括失活或破坏，其包括CIITA基因中的插入缺失。在一些实施方案中，修饰是CIITA基因的基因组DNA的移码突变。在一些实施方案中，修饰是CIITA基因的基因组DNA的缺失。在一些实施方案中，修饰是CIITA基因的基因组DNA的连续段的缺失。在一些实施方案中，CIITA基因被敲除。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向T细胞受体α恒定(TRAC)基因的修饰。在一些实施方案中，靶向TRAC基因的修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向TRAC基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向TRAC基因的至少一种指导核糖核酸靶向序列选自由以下组成的组：US20160348073的SEQ ID NO:532-609和9102-9797，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，用于特异性地靶向TRAC基因的gRNA靶向序列是AGAGUCUCUCAGCUGGUACA(SEQ ID NO:35)。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入TRAC基因。用于在TRAC基因座处靶向插入的示例性转基因包括如本文所述的任何转基因。

测试TRAC基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的TRAC基因修饰和降低的HLA-II表达可以通过流式细胞术(诸如通过FACS分析)进行测定。在另一个实施方案中，通过对用TRAC蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测TRAC蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰的存在。

在一些实施方案中，降低TRAC表达的修饰降低TRAC mRNA表达。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达被消除(例如，0％的TRAC mRNA表达)。在一些实施方案中，降低TRAC mRNA表达的修饰消除了TRAC基因活性。

在一些实施方案中，降低TRAC表达的修饰降低TRAC蛋白质表达。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达被消除(例如，0％的TRAC蛋白质表达)。在一些实施方案中，降低TRAC蛋白质表达的修饰消除了TRAC基因活性。

在一些实施方案中，降低TRAC表达的修饰包括TRAC基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低TRAC表达的修饰包括TRAC基因的一个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低TRAC表达的修饰包括失活或破坏，其包括TRAC基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括细胞中一个或多个TRAC编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括细胞中所有TRAC编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括失活或破坏，其包括TRAC基因中的插入缺失。在一些实施方案中，修饰是TRAC基因的基因组DNA的移码突变。在一些实施方案中，修饰是TRAC基因的基因组DNA的缺失。在一些实施方案中，修饰是TRAC基因的基因组DNA的连续段的缺失。在一些实施方案中，TRAC基因被敲除。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向T细胞受体β恒定(TRBC)基因的修饰。在一些实施方案中，靶向TRBC基因的修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向TRBC基因的指导核糖核酸序列。

在一些实施方案中，将编码如本文公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受性因子)的外源核酸或转基因插入TRBC基因。用于在TR locBCus处靶向插入的示例性转基因包括如本文所述的任何转基因。在一些实施方案中，用于特异性地靶向TRBC基因的至少一种指导核糖核酸靶向序列选自由以下组成的组：US20160348073的SEQ ID NO:610-765和9798-10532，其公开内容据此通过引用整体并入本文。

测试TRBC基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的TRBC基因修饰和降低的HLA-II表达可以通过流式细胞术(诸如通过FACS分析)进行测定。在另一个实施方案中，通过对用TRBC蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测TRBC蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失活修饰的存在。

在一些实施方案中，降低TRBC表达的修饰降低TRBC mRNA表达。在一些实施方案中，TRAC的mRNA表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，TRBC的mRNA表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，TRBC的mRNA表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，TRBC的mRNA表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，TRBC的mRNA表达被消除(例如，0％的TRBC mRNA表达)。在一些实施方案中，降低TRBC mRNA表达的修饰消除了TRBC基因活性。

在一些实施方案中，降低TRBC表达的修饰降低TRBC蛋白质表达。在一些实施方案中，TRAC的蛋白质表达降低是相对于同一细胞类型的不包含修饰的未修饰或野生型细胞而言的。在一些实施方案中，TRBC的蛋白质表达被降低了超过约5％，诸如被降低了超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或更多。在一些实施方案中，TRBC的蛋白质表达被降低了至多约100％，诸如被降低了至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％中的任一者或更少。在一些实施方案中，TRBC的蛋白质表达被降低了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方案中，TRBC的蛋白质表达被消除(例如，0％的TRBC蛋白质表达)。在一些实施方案中，降低TRBC蛋白质表达的修饰消除了TRBC基因活性。

在一些实施方案中，降低TRBC表达的修饰包括TRBC基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低TRBC表达的修饰包括TRBC基因的一个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低TRBC表达的修饰包括失活或破坏，其包括TRBC基因的两个等位基因的失活或破坏。

在一些实施方案中，修饰包括细胞中一个或多个TRBC编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括细胞中所有TRBC编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，修饰包括失活或破坏，其包括TRBC基因中的插入缺失。在一些实施方案中，修饰是TRBC基因的基因组DNA的移码突变。在一些实施方案中，修饰是TRBC基因的基因组DNA的缺失。在一些实施方案中，修饰是TRBC基因的基因组DNA的连续段的缺失。在一些实施方案中，TRBC基因被敲除。

在一些实施方案中，工程化细胞包含降低一种或多种主要组织相容性复合物I类分子(MHC I类分子)和/或一种或多种MHC II类分子的表达的一个或多个修饰，其中所述修饰包含以下中的一种或多种的降低的表达：B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B或NFY-C。

在某些方面，本文教导的工程化细胞包含一个或多个进一步的修饰，其降低B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B、NFY-C、CTLA-4、PD-1、IRF1、MIC-A、MIC-B(参与氧化或ER应激的蛋白质)、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、PCDH11Y、NLGN4Y和/或RHD的表达。参与氧化或ER应激的示例性蛋白质包括硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、PKR样ER激酶(PERK)、肌醇需求酶1α(IRE1α)和DJ-1(PARK7)。

B.多核苷酸的过表达

在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞被修饰，诸如遗传修饰或工程化，诸如通过将一个或多个修饰引入细胞中以在细胞中过表达所需多核苷酸。在一些实施方案中，待修饰或工程化的细胞是先前未被引入一个或多个修饰的未修饰细胞或非工程化细胞。在一些实施方案中，可以理解，如果细胞在工程化之前不表达可检测的量的致耐受性因子，那么与不含有修饰的类似细胞相比，导致任何可检测的量的致耐受性因子表达的修饰是表达增加。在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞被遗传修饰以包含编码外源蛋白质的一个或多个外源多核苷酸(也可与术语“转基因”互换使用)。如所描述的，在一些实施方案中，细胞被修饰以增加为致耐受性(例如，免疫)因子的某些基因的表达，所述基因影响受体中的免疫识别和耐受性。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞(诸如T细胞或NK细胞)也表达嵌合抗原受体(CAR)。一种或多种多核苷酸(例如，外源多核苷酸)可以与一个或多个修饰(诸如遗传修饰)一起在工程化细胞中表达(例如，过表达)，以降低如本文所述的靶多核苷酸的表达，所述靶多核苷酸诸如一种或多种MHC I类分子、一种或多种MHC II类分子、MICA或MICB中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞在施用于受体受试者后不触发或活化免疫反应。

在一些实施方案中，靶标的表达增加使得工程化细胞中的表达被增加至比在被工程化以增加靶标表达之前在源细胞中靶标的对应表达水平(例如，与蛋白质表达相比的蛋白质表达水平)高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中任一者)的水平。在一些实施方案中，靶标的表达增加使得工程化细胞中的表达被增加至比在参考细胞或参考细胞群(诸如同一细胞类型的细胞或群体或免疫原性反应降低或消除的细胞)中靶标的对应表达水平(例如，与蛋白质表达相比的蛋白质表达水平)高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中任一者)的水平。在一些实施方案中，靶标的表达增加使得工程化细胞中的表达被增加至等于或高于测量表达水平(诸如已知由于靶标的存在而表现出免疫原性反应降低或消除的水平)的水平。在一些实施方案中，在受刺激或未受刺激状态下的工程化细胞、参考细胞或参考细胞群中评估靶标的水平。在一些实施方案中，在受刺激状态下的工程化细胞、参考细胞或参考细胞群中评估靶标的水平，使得靶标被表达(或者如果它是细胞响应于刺激的能力，则将被表达)。在一些实施方案中，刺激代表体内刺激。

在一些实施方案中，工程化细胞包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的过表达多核苷酸。在一些实施方案中，工程化细胞包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的过表达多核苷酸。.在一些实施方案中，过表达的多核苷酸是外源多核苷酸。在一些实施方案中，工程化细胞包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的外源多核苷酸。在一些实施方案中，工程化细胞包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的外源多核苷酸。在一些实施方案中，过表达的多核苷酸是在细胞中游离表达的外源多核苷酸。在一些实施方案中，过表达的多核苷酸是插入或整合到工程化细胞的一个或多个基因组基因座中的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，使用含有DNA靶向结构域和转录激活因子的融合蛋白来增加多核苷酸的表达，即过表达多核苷酸。使用反式激活因子结构域增加表达的靶向方法是技术人员已知的。

在一些实施方案中，工程化细胞含有一种或多种外源多核苷酸，其中一种或多种外源多核苷酸通过非靶向插入方法(诸如通过用慢病毒载体转导)插入或整合到细胞的基因组基因座中。在一些实施方案中，通过靶向插入方法(诸如通过使用同源定向修复(HDR))，将一种或多种外源多核苷酸插入或整合到细胞基因组中。可以使用任何合适的方法通过HDR将外源多核苷酸插入工程化细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将一种或多种外源多核苷酸插入一个或多个基因组基因座中，诸如本文(例如，表1b或2)所述的任何基因组基因座中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入相同的基因组基因座中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入不同的基因组基因座中。在一些实施方案中，将两种或更多种外源多核苷酸插入相同的基因组基因座中，诸如本文(例如，表1b或2)所述的任何基因组基因座。在一些实施方案中，将两种或更多种外源多核苷酸插入不同的基因组基因座中，诸如本文(例如，表1b或2)所述的两个或更多个基因组基因座中。

在一些实施方案中，任何基因编辑技术都可以用于增加所描述的一种或多种靶多核苷酸或靶蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括涉及核酸酶、整合酶、转座酶、重组酶的系统。在一些实施方案中，基因编辑技术可以用于修饰以增加内源基因活性(例如，通过修饰或活化与基因可操作地连接的启动子或增强子)。在一些实施方案中，基因编辑技术可以用于将DNA敲入或整合到基因组区域中(例如，以引入编码靶多核苷酸或靶蛋白的构建体，诸如编码任何致耐受性因子、CD55、CD46、CD59或本文所述用于在工程化细胞中增加表达的任何其他分子的构建体)。在一些实施方案中，基因编辑技术介导单链断裂(SSB)。在一些实施方案中，基因编辑技术介导双链断裂(DSB)，包括结合非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括基于DNA的编辑或引物编辑。在一些实施方案中，基因编辑技术可以包括经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)。在以下小节中描述示例性多核苷酸或过表达以及过表达多核苷酸的方法。

1.致耐受性因子

在一些实施方案中，致耐受性因子的表达在细胞中过表达或增加。可以理解，如果细胞在工程化之前不表达可检测的量的致耐受性因子，那么与不含有修饰的细胞相比，导致任何可检测的量的致耐受性因子表达的修饰是表达增加。

在一些实施方案中，工程化细胞包括至少一种致耐受性因子的表达增加，例如过表达。在一些实施方案中，致耐受性因子是促进或有助于促进或诱导免疫系统(例如，先天或适应性免疫系统)对工程化细胞的耐受性的任何因子。

在一些实施方案中，工程化细胞上的一种或多种致耐受性因子的每种致耐受性因子选自由以下组成的组：A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1或Serpinb9。

在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子是CD47。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD24。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括PD-L1。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD46。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD55。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD59。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CR1。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括MANF。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括A20/TNFAIP3。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E和CD47。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47、PDL1、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E或PD-L1中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或A20/TNFAIP中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或MANF中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1、A20/TNFAIP或MANF中的一种或多种，包括全部。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8。

在一些实施方案中，致耐受性因子是DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3。在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200或Mfge8或其任何组合。在一些实施方案中，细胞包括至少一种外源多核苷酸，其包括编码致耐受性因子的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，至少一种外源多核苷酸是编码CD47的多核苷酸。本文提供了在施用于受体受试者后不触发或活化免疫反应的细胞。如上所述，在一些实施方案中，细胞被修饰以增加影响受体中的免疫识别和耐受性的基因和致耐受性(例如，免疫)因子的表达。

在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，致耐受性因子的表达(例如，表面表达)被增加了约10％或更高，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了大于约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％或200％中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，致耐受性因子的表达(例如，表面表达)被增加了约2倍或更高，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约4倍或更高、6倍或更高、8倍或更高、10倍或更高、15倍或更高、20倍或更高、30倍或更高、40倍或更高、50倍或更高、60倍或更高、70倍或更高、80倍或更高、90倍或更高、100倍或更高、150倍或更高、或200倍或更高中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，致耐受性因子的表达被增加了约200倍或更低，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约150倍或更低、100倍或更低、90倍或更低、80倍或更低、70倍或更低、60倍或更低、50倍或更低、40倍或更低、30倍或更低、15倍或更低、10倍或更低、8倍或更低、6倍或更低、4倍或更低、或2倍或更低中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，致耐受性因子的表达被增加了约2倍与约200倍之间，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约2倍与约20倍之间、约10倍与约50倍之间、约30倍与约70倍之间、约50倍与约100倍之间、约80倍与约150倍之间以及约120倍与约200倍之间中的任一者。

在一些实施方案中，工程化细胞包括至少一种致耐受性因子的表达增加，例如过表达。在一些实施方案中，细胞包括至少一种外源多核苷酸，其包括编码致耐受性因子的多核苷酸。在一些实施方案中，DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)。在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，至少一种外源多核苷酸是编码CD47的多核苷酸。

在一些实施方案中，本公开提供了已被修饰以表达致耐受性因子(例如，免疫调节多肽)(诸如CD47)的细胞或其群体。在一些实施方案中，本公开提供了用于改变细胞基因组以表达致耐受性因子(例如，免疫调节多肽)(诸如CD47)的方法。在一些实施方案中，工程化细胞表达外源性致耐受性因子(例如，免疫调节多肽)，诸如外源CD47。在一些情况下，外源多核苷酸的过表达或表达增加是通过将包含编码人CD47多肽的核苷酸序列的表达载体引入细胞中(例如，转导细胞)来实现的。在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体(诸如慢病毒载体)或者可以是非病毒载体。在一些实施方案中，细胞被工程化以含有一种或多种外源多核苷酸，其中至少一种外源多核苷酸包括编码致耐受性因子的多核苷酸。在任何实施方案中的一些中，致耐受性因子是DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3。在一些实施方案中，致耐受性因子选自CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200或Mfge8或其任何组合。例如，在一些实施方案中，至少一种外源多核苷酸是编码CD47的多核苷酸。

在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47。在一些实施方案中，工程化细胞含有编码CD47(诸如人CD47)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，CD47在细胞中过表达。在一些实施方案中，与尚未被工程化具有修饰的同一细胞类型的类似细胞(诸如参考细胞或未修饰的细胞，例如未用编码CD47的外源多核苷酸进行工程化的细胞)相比，CD47的表达在工程化细胞中过表达或增加。CD47是一种白细胞表面抗原，并且在细胞粘附和整联蛋白调节中发挥作用。其通常在细胞表面上表达，并且向循环巨噬细胞发出信号不要吞噬细胞。在例如NP_001768.1、NP_942088.1、NM_001777.3和NM_198793.2中提供了关于人CD47的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。

在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，CD47的表达(例如，表面表达)被增加了约10％或更高，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了大于约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％或200％中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，CD47的表达(例如，表面表达)被增加了约2倍或更高，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约4倍或更高、6倍或更高、8倍或更高、10倍或更高、15倍或更高、20倍或更高、30倍或更高、40倍或更高、50倍或更高、60倍或更高、70倍或更高、80倍或更高、90倍或更高、100倍或更高、150倍或更高、或200倍或更高中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，CD47的表达被增加了约200倍或更低，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约150倍或更低、100倍或更低、90倍或更低、80倍或更低、70倍或更低、60倍或更低、50倍或更低、40倍或更低、30倍或更低、15倍或更低、10倍或更低、8倍或更低、6倍或更低、4倍或更低、或2倍或更低中的任一者。在一些实施方案中，与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，CD47的表达被增加了约2倍与约200倍之间，诸如与不包含修饰的同一细胞类型的细胞相比，增加了约2倍与约20倍之间、约10倍与约50倍之间、约30倍与约70倍之间、约50倍与约100倍之间、约80倍与约150倍之间以及约120倍与约200倍之间中的任一者。

在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBIRef.Sequence No. NP_001768.1和NP_942088.1.中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No. NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No. NM_001777.3和NM_198793.2中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBIRef.Sequence No. NM_001777.3和NM_198793.2中列出的CD47核苷酸序列。

在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含具有NCBIRef.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽。

在一些实施方案中，细胞包含与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含与如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的CD47多肽。

在某些实施方案中，编码CD47的多核苷酸可操作地连接至启动子。

在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸通过靶向或非靶向插入方法整合到细胞基因组中，诸如下文进一步所述的。在一些实施方案中，靶向插入是通过同源依赖性插入到靶基因座中，诸如通过插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中，例如B2M基因、CIITA基因、TRAC基因、TRBC基因中。在一些实施方案中，靶向插入是通过同源非依赖性插入，诸如通过插入到安全港基因座中。在一些情况下，编码CD47的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码CD47的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码CD47的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码CD47的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码CD47的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对CD47蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测CD47蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD47mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码CD200(诸如人CD200)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，CD200在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码CD200的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，CD200的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC03P112332、HGNC编号7203、NCBI基因ID 4345、Uniprot编号P41217、以及NCBI RefSeq编号NP_001004196.2、NM_001004196.3、NP_001305757.1、NM_001318828.1、NP_005935.4、NM_005944.6、XP_005247539.1和XM_005247482.2中提供了关于人CD200的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码CD200的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码CD200的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码CD200的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码CD200的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码CD200的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码CD200的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码CD200的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对CD200蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测CD200蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD200mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码HLA-E(诸如人HLA-E)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，HLA-E在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码HLA-E的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，HLA-E的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC06P047281、HGNC编号4962、NCBI基因ID 3133、Uniprot编号P13747、以及NCBI RefSeq编号NP_005507.3和NM_005516.5中提供了关于人HLA-E的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码HLA-E的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码HLA-E的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码HLA-E的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码HLA-E的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码HLA-E的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码HLA-E的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码HLA-E的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用抗HLA-E蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测HLA-E蛋白质表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源HLA-E mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码HLA-G(诸如人HLA-G)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，HLA-G在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码HLA-G的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，HLA-G的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC06P047256、HGNC编号4964、NCBI基因ID 3135、Uniprot编号P17693、以及NCBI RefSeq编号NP_002118.1和NM_002127.5中提供了关于人HLA-G的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码HLA-G的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码HLA-G的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码HLA-G的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码HLA-G的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码HLA-G的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码HLA-G的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码HLA-G的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用抗HLA-G蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测HLA-G蛋白质表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源HLA-G mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码PD-L1(诸如人PD-L1)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，PD-L1在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码PD-L1的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，PD-L1的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC09P005450、HGNC编号17635、NCBI基因ID 29126、Uniprot编号Q9NZQ7、以及NCBI RefSeq编号NP_001254635.1、NM_001267706.1、NP_054862.1和NM_014143.3中提供了关于人PD-L1或CD274的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码PD-L1的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码PD-L1的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码PD-L1的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码PD-L1的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码PD-L1的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码PD-L1的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码PD-L1的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对PD-L1蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测PD-L1蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源PD-L1mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码FasL(诸如人FasL)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，FasL在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码FasL的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，FasL的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC01P172628、HGNC编号11936、NCBI基因ID 356、Uniprot编号P48023、以及NCBI RefSeq编号NP_000630.1、NM_000639.2、NP_001289675.1和NM_001302746.1中提供了关于人Fas配体(其被称为FasL,FASLG,CD178,TNFSF6等)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码Fas-L的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码Fas-L的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码Fas-L的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码Fas-L的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码Fas-L的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码Fas-L的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码Fas-L的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用抗Fas-L蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测Fas-L蛋白质表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源Fas-L mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码CCL21(诸如人CCL21)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，CCL21在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码CCL21的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，CCL21的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC09M034709、HGNC编号10620、NCBI基因ID 6366、Uniprot编号O00585、以及NCBI RefSeq编号NP_002980.1和NM_002989.3中提供了关于人CCL21的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码CCL21的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码CCL21的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码CCL21的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码CCL21的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码CCL21的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码CCL21的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码CCL21的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对CCL21蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测CCL21蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CCL21mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码CCL22(诸如人CCL22)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，CCL22在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码CCL22的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，CCL22的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC16P057359、HGNC编号10621、NCBI基因ID 6367、Uniprot编号O00626、以及NCBI RefSeq编号NP_002981.2、NM_002990.4、XP_016879020.1和XM_017023531.1中提供了关于人CCL22的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码CCL22的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码CCL22的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码CCL22的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码CCL22的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码CCL22的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码CCL22的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码CCL22的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对CCL22蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测CCL22蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CCL22mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码Mfge8(诸如人Mfge8)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，Mfge8在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码Mfge8的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，Mfge8的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC15M088898、HGNC编号7036、NCBI基因ID 4240、Uniprot编号Q08431、以及NCBI RefSeq编号NP_001108086.1、NM_001114614.2、NP_001297248.1、NM_001310319.1、NP_001297249.1、NM_001310320.1、NP_001297250.1、NM_001310321.1、NP_005919.2和NM_005928.3中提供了关于人Mfge8的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码Mfge8的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码Mfge8的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码Mfge8的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码Mfge8的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码Mfge8的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码Mfge8的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码Mfge8的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对Mfge8蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测Mfge8蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源Mfge8mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞含有编码SerpinB9(诸如人SerpinB9)的外源多核苷酸。在一些实施方案中，SerpinB9在细胞中过表达。在一些实施方案中，除了参考细胞或未修饰细胞不包含编码SerpinB9的外源多核苷酸之外，与相似的参考细胞或未修饰细胞(包括具有任何其他修饰，诸如遗传修饰)相比，SerpinB9的表达在工程化细胞中增加。在例如GeneCard标识符GC06M002887、HGNC编号8955、NCBI基因ID 5272、Uniprot编号P50453、以及NCBI RefSeq编号NP_004146.1、NM_004155.5、XP_005249241.1和XM_005249184.4中提供了关于人SerpinB9的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息。在某些实施方案中，编码SerpinB9的多核苷酸与启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，编码SerpinB9的多核苷酸被插入到表1b或2中描绘的任何一个基因座中。在一些情况下，编码SerpinB9的多核苷酸被插入到安全港基因座中，所述安全港基因座诸如但不限于选自AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231的基因座。在特定实施方案中，编码SerpinB9的多核苷酸被插入到CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座或CLYBL基因座中。在一些实施方案中，编码SerpinB9的多核苷酸被插入到B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、MICA基因座或MICB基因座中。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，并且编码SerpinB9的多核苷酸被插入到TRAC基因座或TRBC基因座中。在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进编码SerpinB9的多核苷酸插入到细胞的基因组基因座中。

在一些实施方案中，通过对用针对SerpinB9蛋白的抗体探测的细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测SerpinB9蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源SerpinB9mRNA的存在。

在一些实施方案中，工程化细胞包含致耐受性因子诸如CD47的表达增加，其中增加如本文所述，诸如相对于：在工程化以增加致耐受性因子的表达之前的状态；参考细胞或参考细胞群(诸如具有期望的免疫原性反应缺乏的细胞)；或测量值。在一些实施方案中，工程化细胞被工程化以增加致耐受性因子诸如CD47的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上致耐受性因子诸如CD47的细胞表面表达被增加至比在被工程化以增加致耐受性因子诸如CD47的细胞表面呈递之前致耐受性因子诸如CD47细胞表面表达的水平高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞上致耐受性因子诸如CD47的细胞表面表达被增加至比在参考细胞或参考细胞群上的致耐受性因子诸如CD47细胞表面表达的水平(诸如致耐受性因子诸如CD47细胞表面表达的平均量)高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，在工程化细胞上存在致耐受性因子诸如CD47的细胞表面呈递(包括一些可检测的细胞表面表达，包括如使用已知技术(例如，流式细胞术)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达增加。在一些实施方案中，工程化细胞的致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达被增加至比在被工程化以增加致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达之前致耐受性因子诸如CD47蛋白质表达的水平高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达被增加至比在被工程化以增加致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达之前致耐受性因子诸如CD47的水平高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞表现出致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达(包括可检测的蛋白质表达，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含致耐受性因子诸如CD47的蛋白质表达(包括可检测的蛋白质，包括如使用已知技术(例如，蛋白质印迹或质谱法)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞表现出编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA表达增加。在一些实施方案中，工程化细胞的编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA表达被增加至比在被工程化以增加致耐受性因子诸如CD47的mRNA表达之前编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA表达水平高40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞的编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA表达被增加至比参考细胞或参考细胞群的mRNA表达水平高约40％或更高(诸如约45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、100％或更高、150％或更高、200％或更高、250％或更高、或500％或更高中的任一者)的水平。在一些实施方案中，工程化细胞表达编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA(包括可检测的mRNA表达，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码致耐受性因子诸如CD47的mRNA(包括可检测的mRNA，包括如使用已知技术(例如，测序技术或PCR)所测量的)。在一些实施方案中，工程化细胞包含编码致耐受性因子诸如CD47的多核苷酸。在一些实施方案中，编码致耐受性因子诸如CD47的多核苷酸被整合到工程化细胞的基因组DNA中。

2.嵌合抗原受体

在一些实施方案中，进一步修饰所提供的工程化细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，所提供的细胞含有一种或多种靶多核苷酸序列的遗传修饰，所述一种或多种靶多核苷酸序列调节MICA和/或MICB、MHC I分子、MHC II分子或MHC I和MHC II分子的表达，过表达如本文所述的致耐受性因子(例如，CD47)，并且表达CAR。在一些实施方案中，细胞是如下细胞，其中MICA和/或MICB被降低或消除(例如，敲除)，B2M被降低或消除(例如，敲除)，CIITA被降低或消除(例如，敲除)，CD47被过表达并且CAR被表达。在一些实施方案中，细胞是MICA^-/-和/或MICB^-/-、B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg、CAR+的。在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以另外是其中TRAC被降低或消除(例如，敲除)的细胞。在一些实施方案中，细胞是MICA^-/-和/或MICB^-/-、B2M^-/-、CIITA^-/-、CD47tg、TRAC^-/-CAR+的。

在一些实施方案中，将编码CAR的多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，细胞是T细胞，诸如原代T细胞或从多能细胞(例如，iPSC)分化的T细胞。在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞，诸如原代NK细胞或从多能细胞(例如，iPSC)分化的NK细胞。

在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是或包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导时诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，该至少两个共刺激结构域不同。

在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。

在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞(例如，原代或iPSC衍生的T细胞或原代或iPSC衍生的NK细胞)包含编码CAR的多核苷酸，其中所述多核苷酸被插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。

在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源性或外源性的，该CAR包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见例如Zhang.C.等人,Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5:22(2017)；WO 2016126608；Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports,2017年1月27日,37(1)。

技术人员熟悉CAR以及CAR的不同组分和配置。结合所提供的实施方案可以采用任何已知的CAR。除了本文所述的CAR之外，各种CAR和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适合用于如本文所述的工程化细胞。参见例如WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人,Nature Nanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57，它们的公开内容据此通过引用并入本文。在以下小节中描述CAR的示例性特征和组分。

A.抗原结合结构域

在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域(ABD)是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。

在一些实施方案中，抗原结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是具体或特定细胞类型的特征(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。

在一些实施方案中，抗原可以是在肿瘤细胞上专门或优先表达的抗原、或者是自身免疫性疾病或炎性疾病的特征性抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞特征性抗原。例如，抗原结合结构域靶向由肿瘤细胞或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞的特征性抗原(例如，与肿瘤细胞或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道连接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，靶抗原是包括但不限于以下的抗原：表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体以及Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2)。EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、卵黄状黄斑病蛋白(Bestrophins)、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸(glycin)受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多次跨膜蛋白(multispan transmembrane protein)、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔蛋白、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、Canonical Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、T_REG、CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ²、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、腱生蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺癌相关蛋白(prostein)、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C)、H2-M3、CD49f、CD151CD340、CD200、tkrA、trkB、或trkC、或其抗原片段或抗原部分。

在一些实施方案中，示例性靶抗原包括但不限于CDS、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvlll、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRa、IL-13Ra、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。

在一些实施方案中，CAR是CD19CAR。在一些实施方案中，CD19CAR的胞外结合结构域包含与CD19(例如人CD19)特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，CD19CAR的胞外结合结构域包含衍生自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv抗体片段，其包含通过接头肽连接的FMC63的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，接头肽是“Whitlow”接头肽。FMC63和衍生的scFv已在Nicholson等人,Mal.lmmun.34(16-17):1157-1165(1997)以及PCT申请公开号WO2018/213337A 1中进行了描述，每篇文献的内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，CD19CAR的胞外结合结构域包含衍生自CD19特异性抗体之一的抗体，所述CD19特异性抗体包括例如SJ25C1(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人,J.lmmunol.138(9):2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人,Hybridoma 3:305-320(1984))、B43(Bejcek(1995))、BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人,70:418-427(1987))、B4HB12b(Kansas和Tedder,J.lmmunol.147:4094-4102(1991)；Yazawa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:15178-15183(2005)；Herbst等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335:213-222(2010))、BU12(Gallard等人,J.Immunology,148(10):2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.lmmunol.118:368-381(1989))。

在一些实施方案中，CAR是CD22CAR。CD22是一种跨膜蛋白，主要存在于成熟B细胞的表面，作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体起作用。CD22在60％-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，B-慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特氏淋巴瘤)中表达，并且在B细胞发育早期的细胞表面上或在干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22CAR包含特异性地结合CD22的胞外结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域。在一些实施方案中，CD22CAR的胞外结合结构域包含衍生自m971单克隆抗体(m971)的scFv抗体片段，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，CD22CAR的胞外结合结构域包含衍生自m971-L7的scFv抗体片段，其中m971的亲和力成熟变体与亲本抗体m971相比具有显著提高的CD22结合亲和力(从约2nM提高到小于50pM)。在一些实施方案中，衍生自m971-L7的scFv抗体片段包含通过3xG4S接头连接的m971-L7的VH和VL。在一些实施方案中，CD22CAR的胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是治疗剂，其包含与细菌毒素融合的对CD22具有特异性的scFv，并且因此可以结合表达CD22的癌细胞表面并杀死癌细胞。BL22包含抗CD22抗体RFB4的dsFv，其与38-kDa截短形式的假单胞菌外毒素A融合(Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗(moxetumomabpasudotox))是BL22的突变的、更高亲和力的形式(Ho等人,J.Biol.Chem.,280(1):607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034；7,355,012；和7,982,011，所述专利的内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，CAR是BCMACAR。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化的B细胞或成熟的B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。最近发现，BCMA的表达与多种癌症有关，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR包含特异性地结合BCMA的胞外结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含与BCMA(例如，人BCMA)特异性地结合的抗体。PCT申请公开号WO2016/014789、WO2016/014565、WO2013/154760和WO2015/128653中已经描述了针对BCMA的CAR。PCT申请公开号WO2015/166073和WO2014/068079中也公开了BCMA结合抗体。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)中描述的鼠单克隆抗体的scFv抗体片段。在一些实施方案中，scFv抗体片段是鼠单克隆抗体的人源化形式(Sommermeyer等人,Leukemia31:2191-2199(2017))。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含两条重链(VHH)的单个可变片段，其可以与BCMA的两个表位结合，如Zhao等人,J.Hematol.Oneal.11(1):141(2018)中所描述。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含完全人重链可变结构域(FHVH)，如Lam等人,Nat.Commun.11(1):283(2020)中所描述。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性病症特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫或炎性病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化、冷凝集素病、寻常型天疱疮、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，虽然同种免疫疾病的示例性非限制性实例包括同种异体致敏(参见例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或来自造血或实体器官移植、输血、妊娠与胎儿的异种致敏、新生儿同种免疫血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏，诸如用酶或蛋白质替代疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替代、血液制品和基因疗法可发生。在一些情况下，同种异体致敏(Allosensitization)是指针对受体受试者或怀孕受试者的免疫系统认为是非自身抗原的人白细胞抗原的免疫反应(诸如循环抗体)的发展。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与B细胞、浆细胞或成浆细胞上表达的配体结合。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2结合。参见US2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，这些文献的内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，CAR是抗CD19CAR。在一些实施方案中，CAR是抗BCMACAR。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞特征性抗原，例如尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。

在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由受感染性疾病感染的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8型(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人T-淋巴细胞病毒-1性(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦-巴尔病毒、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。

在这些实施方案中的任一个中，CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合结构域的功能。

在一些实施方案中，CAR对两种靶抗原是双特异性的。在一些实施方案中，靶抗原是不同的靶抗原。在任何此类实施方案中的一些中，两种不同的靶抗原是上文所述的任何两种不同的抗原。在一些实施方案中，胞外结合结构域是不同的，并且结合来自以下的两种不同的抗原：(i)CD19和CD20、(ii)CD20和L1-CAM、(iii)L1-CAM和GD2、(iv)EGFR和L1-CAM、(v)CD19和CD22、(vi)EGFR和C-MET、(vii)EGFR和HER2、(viii)C-MET和HER2或(ix)EGFR和ROR1。在一些实施方案中，两个不同抗原结合结构域中的每一个都是scFv。在一些实施方案中，第一scFv的一个可变结构域(VH或VL)的C末端经由多肽接头拴系到第二scFv(分别为VL或VH)的N末端。在一些实施方案中，接头将VH的N末端与VL的C末端连接，或者将VH的C末端与VL的N末端连接。这些scFv缺乏在天然抗体的重链和轻链中存在的恒定区(Fc)。对至少两种不同抗原具有特异性的scFv串联排列，并且经由跨膜结构域与共刺激结构域和细胞内信号传导结构域连接。在一个实施方案中，可以在抗原特异性结合区与跨膜结构域之间连接胞外间隔区。

在另一个实施方案中，CAR的每个抗原特异性靶向区域包含二价(或双价)单链可变片段(二scFv、双scFv)。在包含二scFV的CAR中，对每种抗原具有特异性的两个scFv通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链而连接在一起，从而产生串联scFv。(Xiong,Cheng-Yi；Natarajan,A；Shi,X B；Denardo,G L；Denardo,S J(2006).“Development of tumortargeting anti-MUC-1multimer:effects of di-scFv unpaired cysteine location onPEGylation and tumor binding”.Protein Engineering Design and Selection 19(8):359-367；Kufer,Peter；Lutterbüse,Ralf；Baeuerle,Patrick A.(2004).“A revival ofbispecific antibodies”.Trends in Biotechnology 22(5):238-244)。包含至少两个抗原特异性靶向区域的CAR将表达对两种抗原中的每一种都具有特异性的两种scFv。将对至少两种不同抗原具有特异性的所得抗原特异性靶向区域经由跨膜结构域与共刺激结构域和胞内信号传导结构域连接。在一个实施方案中，可以在抗原特异性结合结构域与跨膜结构域之间连接胞外间隔区结构域。

在另一个实施方案中，CAR的每个抗原特异性靶向区域包含双抗体。在双抗体中，scFv由接头肽产生，所述接头肽太短而无法使两个可变区折叠在一起，从而驱动scFv二聚化。更短的接头(一个或两个氨基酸)又导致三聚体的形成，即所谓的三抗体(triabodies或tribodies)。也可以使用四抗体。

在一些实施方案中，细胞被工程化以表达超过一种CAR，诸如两种不同的CAR，其中每种CAR具有针对不同靶抗原的抗原结合结构域。在任何此类实施方案中的一些中，两种不同的靶抗原是上文所述的任何两种不同的抗原。在一些实施方案中，胞外结合结构域是不同的，并且结合来自以下的两种不同的抗原：(i)CD19和CD20、(ii)CD20和L1-CAM、(iii)L1-CAM和GD2、(iv)EGFR和L1-CAM、(v)CD19和CD22、(vi)EGFR和C-MET、(vii)EGFR和HER2、(viii)C-MET和HER2或(ix)EGFR和ROR1。

在一些实施方案中，制备了含有所提供的修饰的两种不同工程化细胞，每种工程化细胞用不同的CAR进行工程化。在一些实施方案中，两种不同CAR中的每一种都具有针对不同靶抗原的抗原结合结构域。在任何此类实施方案中的一些中，两种不同的靶抗原是上文所述的任何两种不同的抗原。在一些实施方案中，胞外结合结构域是不同的，并且结合来自以下的两种不同的抗原：(i)CD19和CD20、(ii)CD20和L1-CAM、(iii)L1-CAM和GD2、(iv)EGFR和L1-CAM、(v)CD19和CD22、(vi)EGFR和C-MET、(vii)EGFR和HER2、(viii)C-MET和HER2或(ix)EGFR和ROR1。在一些实施方案中，将表达针对第一靶抗原的第一CAR的工程化细胞(例如，低免疫原性的)群体和表达针对第二靶抗原的第二CAR的工程化细胞(例如，低免疫原性的)群体单独施用于受试者。在一些实施方案中，第一细胞群和第二细胞群以任何顺序依次施用。例如，在施用表达第一CAR的细胞群之后施用表达第二CAR的细胞群。

B.间隔区

在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔子，例如，其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中，第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中，间隔区是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第二间隔区是寡肽，例如，其中寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，例如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔区，例如抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区以及跨膜结构域与信号传导结构域之间的间隔区。

C.跨膜结构域

在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包含至少以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。

D.信号传导结构域

在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整联蛋白α4/CD49d；整联蛋白α4β1；整联蛋白α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。

在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域，该共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体中的一种或多种。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是不同的。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是相同的。

在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。

E.示例性CAR

在一些实施方案中，CAR包含与抗原(例如，肿瘤抗原)结合的细胞外抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，诸如scFv)、间隔子(例如含有铰链结构域，诸如本文所述的任何一种)、跨膜结构域(例如，本文所述的任何一种)和细胞内信号传导结构域(例如，任何细胞内信号传导结构域，诸如本文所述的初级信号传导结构域或共刺激信号传导结构域)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是或包括初级胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域另外包括共刺激分子的细胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域)。任何此类组分可以是如上所述的任何一种。

CAR的示例性组分的实例描述于表3中。在所提供的方面，CAR中的每个组分的序列可以包括表3中列出的任何组合。

表3：CAR组分和示例性序列

3.增加多核苷酸表达(例如，过表达)的方法

在一些实施方案中，可以通过多种技术中的任何一种来增加多核苷酸的表达。例如，用于调节基因和因子(蛋白质)表达的方法包括基因组编辑技术以及RNA或蛋白质表达技术等。对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文所概述的重组核酸。在一些实施方案中，用一个或多个修饰进行工程化以过表达多核苷酸或增加多核苷酸表达的细胞是如本文所述的任何源细胞。在一些实施方案中，源细胞是本文所述的任何细胞。

在一些实施方案中，通过增加内源基因活性(例如，增加外源基因的转录)来增加基因的表达。在一些情况下，通过增加与内源基因可操作地连接的启动子或增强子的活性来增加内源基因活性。在一些实施方案中，增加启动子或增强子的活性包括对内源启动子或增强子进行一个或多个修饰，从而增加内源启动子或增强子的活性。在一些情况下，增加内源基因的基因活性包括修饰基因的内源启动子。在一些实施方案中，增加内源基因的基因活性包括引入异源启动子。在一些实施方案中，异源启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1a启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和UBC启动子。

A.DNA结合融合蛋白

在一些实施方案中，靶基因(例如，CD47或另一种致耐受性因子)的表达通过表达融合蛋白或蛋白质复合物而增加，所述融合蛋白或蛋白质复合物包含有(1)对内源CD47或其他基因具有特异性的位点特异性结合结构域和(2)转录激活因子。

在一些实施方案中，调控因子由位点特异性DNA结合核酸分子(诸如指导RNA(gRNA))组成。在一些实施方案中，方法通过位点特异性DNA结合靶蛋白来实现，诸如通过锌指蛋白(ZFP)或含有ZFP的融合蛋白(其也被称为锌指核酸酶(ZFN))来实现。

在一些实施方案中，调控因子包含位点特异性结合结构域，诸如使用DNA结合蛋白或DNA结合核酸，其与靶向区域的基因特异性结合或杂交。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸或多肽与位点特异性核酸酶(诸如修饰的核酸酶)偶联或复合。例如，在一些实施方案中，使用包含修饰的核酸酶的DNA靶向蛋白的融合物来实现施用，诸如使用大范围核酸酶或RNA指导的核酸酶，诸如成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，诸如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，核酸酶经修饰以缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的核酸酶是催化死亡的dCas9。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域可来源于核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，诸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。另见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人,(1989)Gene 82:115-118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。此外，可以对归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程化以结合非天然靶位点。参见例如，Chevalier等人,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人,(2003)NucleicAcids Res.31:2952-2962；Ashworth等人,(2006)Nature 441:656-659；Paques等人,(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号2007/0117128。

锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开号20110301073。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的较大蛋白质内的蛋白质或结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区域。

在ZFP中，有靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，长度通常为9-18个核苷酸，由个别指组装生成。ZFP包括其中单一指结构域的长度为大约30个氨基酸并且含有α螺旋，并且具有两个、三个、四个、五个或六个指的ZFP，所述α螺旋含有两个不变的组氨酸残基，所述组氨酸残基通过锌与单一β转角的两个半胱氨酸配位。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代来改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如，被工程化以与选择的靶位点结合。参见例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所有这些文献的内容据此通过引用整体并入本文。

许多基因特异性工程化锌指是可商购获得的。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma–Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了用于锌指构建的平台(CompoZr)，其允许研究人员绕过锌指构建与验证，并且为数千种蛋白质提供特异性靶向的锌指(Gaj等人,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405)。在一些实施方案中，使用或定制设计可商购获得的锌指。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录激活因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，诸如在转录激活因子样蛋白效应物(TALE)蛋白中，参见例如美国专利公开号20110301073，其内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，位点特异性结合结构域来源于CRISPR/Cas系统。一般来讲，“CRISPR系统”统指参与表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣序列(在内源CRISPR系统的上下文中涵盖“同向重复序列”和tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也被称为“间隔子”，或“靶向序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。

一般来讲，指导序列包括靶向结构域，所述靶向结构域包含与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些实例中，gRNA的靶向结构域与靶核酸上的靶序列互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补。

在一些实施方案中，gRNA可以是如本文所述的任何一种。在特定实施方案中，gRNA具有与以下的靶位点互补的靶向序列：CD47，诸如SEQ ID NO:200784-231885(WO2016183041的表29、附录22)中任一者所示；HLA-E，诸如SEQ ID NO:189859-193183(WO2016183041的表19、附录12)中任一者所示；HLA-F，诸如SEQ ID NO:688808-699754(WO2016183041的表45、附录38)中任一者所示；HLA-G，诸如SEQ ID NO:188372-189858(WO2016183041的表18、附录11)中任一者所示；或PD-L1，诸如SEQ ID NO:193184-200783(WO2016183041的表21、附录14)中任一者所示。

在一些实施方案中，靶位点在靶基因的转录起始位点的上游。在一些实施方案中，靶位点与基因的转录起始位点相邻。在一些实施方案中，靶位点与基因转录起始位点下游的RNA聚合酶暂停位点相邻。

在一些实施方案中，靶向结构域被配置为靶向靶基因的启动子区域以促进转录起始、一种或多种转录增强子或活化因子和/或RNA聚合酶的结合。一种或多种gRNA可用于靶向基因的启动子区域。在一些实施方案中，可以靶向基因的一个或多个区域。在某些方面，靶位点位于基因转录起始位点(TSS)任一侧的600个碱基对内。

设计或鉴定作为或包含靶向基因的序列(包括外显子序列和调控区(包括启动子和活化因子)的序列)的gRNA序列在技术人员的水平内。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公开可用的，其含有人类基因组或小鼠基因组中的基因的组成型外显子中的示例性单指导RNA(sgRNA)靶序列(参见，例如，genescript.com/gRNA-database.html；另见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4；www.e-crisp.org/E-CRISP/；crispr.mit.edu/)。在一些实施方案中，gRNA序列是或包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。

在一些实施方案中，调控因子还包含功能结构域，例如转录活化因子。

在一些实施方案中，转录活化因子是或含有一种或多种调控元件，诸如靶基因的一种或多种转录控制元件，由此识别如上文所提供的位点特异性结构域以驱动这种基因的表达。在一些实施方案中，转录活化因子驱动靶基因的表达。在一些情况下，转录活化因子可以是或含有异源反式活化结构域的全部或一部分。例如，在一些实施方案中，转录活化因子选自单纯疱疹衍生的反式活化结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。

在一些实施方案中，调控因子是锌指转录因子(ZF-TF)。在一些实施方案中，调控因子是VP64-p65-Rta(VPR)。

在某些实施方案中，调控因子还包含转录调控结构域。常见结构域包括，例如，转录因子结构域(活化因子、抑制因子、共活化因子、共抑制因子)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb和mos家族成员)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如，激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)及其相关因子和修饰因子。参见例如，美国公开号2013/0253040，其内容据此通过引用整体并入本文。

用于实现活化的合适结构域包括HSV VP 16活化结构域(参见，例如，Hagmann等人,J.Virol.71,5952-5962(1 97))核激素受体(参见，例如，Torchia等人,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Bank,J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle和Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997))；Liu等人,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域，诸如VP64(Beerli等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)、和降解决定子(Molinari等人,(1999)EMBO J.18,6439-6447)。另外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Spl、AP-2和CTF1(Seipel等人,EMBOJ.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见，例如，Robyr等人,(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等人,(1999)J.Mol.Endocrinol 23:255-275；Leo等人,(2000)Gene245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等人,(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等人,(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；和Lemon等人,(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6、-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，参见，例如，Ogawa等人，(2000)Gene 245:21-29；Okanami等人,(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等人,(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等人,(1999)Plant Mol Biol 40:419-429；Ulmason等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等人,(2000)Plant J.22:1-8；Gong等人,(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。

可用于制备遗传阻遏物的示例性阻遏结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L)、Rb和MeCP2。参见，例如，Bird等人,(1999)Cell99:451-454；Tyler等人,(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人,(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等人,(2000)Nature Genet.25:338-342。另外的示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见，例如，Chem等人,(1996)Plant Cell 8:305-321；和Wu等人,(2000)Plant J.22:19-27。

在一些情况下，所述结构域参与染色体的表观遗传调控。在一些实施方案中，结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，例如A型、核定位的，诸如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300或Rttl09(Bemdsen和Denu(2008)Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689)。在其他情况下，所述结构域是组蛋白去乙酰化酶(HD AC)，诸如I类(HDAC-l、2、3和8)、II类分子(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HD ACIIB(HDAC6和10))、IV类(HDAC-l 1)、III类(也称为sirtuin(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等人,(2015)Molecules 20(3):3898-394l)。在一些实施方案中使用的另一个结构域是组蛋白磷酸化酶或激酶，其中实例包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bubl、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域并且其可以选自诸如Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h的组。参与苏木化和生物素化的结构域(Lys9、13、4、18和12)也可用于一些实施方案中(综述参见Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。

融合分子通过本领域技术人员众所周知的克隆和生化缀合方法构建。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子还任选地包含核定位信号(例如，来自SV40培养基T抗原的信号)和表位标签(诸如，例如，FLAG和血凝素)。设计融合蛋白(和编码它们的核酸)，使得翻译阅读框保留在融合组分中。

一个方面的功能结构域(或其功能片段)的多肽组分与另一方面的非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合物、核酸)之间的融合体通过本领域技术人员已知的生化缀合方法来构建。参见，例如Pierce Chemical Company(Rockford,IL)目录。已经描述了用于进行小沟结合物与多肽之间的融合的方法和组合物。Mapp等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。同样，CRISPR/Cas TF以及包含与多肽组分功能结构域缔合的sgRNA核酸组分的核酸酶也是本领域技术人员已知的并在本文中详细描述。

B.外源多肽

在一些实施方案中，多核苷酸的表达增加(例如，过表达)是通过将编码待过表达的多核苷酸的外源多核苷酸引入细胞中来介导的。在一些实施方案中，外源多核苷酸是重组核酸。熟知的重组技术可以用于产生如本文所概述的重组核酸。

在某些实施方案中，编码外源多核苷酸(诸如致耐受性因子或嵌合抗原受体)的重组核酸可以与表达构建体中的一个或多个调节核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适用于待治疗的宿主细胞和受体受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。还考虑了如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或结合了超过一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可插入染色体中。在特定实施方案中，表达载体包括选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括包含编码变体多肽的核苷酸序列的表达载体，所述变体多肽可操作地连接到至少一个调控序列。本文使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和/或载体编码的任何其他蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。

在一些实施方案中，外源多核苷酸可操作地连接到启动子上，用于在工程化细胞中表达外源多核苷酸。合适的哺乳动物启动子的实例包括例如来自以下基因的启动子：延伸因子1α(EF1α)启动子、仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或一种或多种热休克启动子。在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞中的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子以SV40限制性片段方便地获得，所述限制性片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers等人,Nature 273:113-120(1978))。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子以HindIII限制酶片段方便地获得(Greenaway等人,Gene 18:355-360(1982))。前述参考文献据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，表达载体是双顺反子或多顺反子表达载体。双顺反子或多顺反子表达载体可包括(1)与每个开放阅读框融合的多个启动子；(2)基因之间的剪接信号的插入；(3)表达受单一启动子驱动的基因的融合；和(4)基因之间的蛋白水解切割位点(自切割肽)的插入或基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)的插入。在一些情况下，编码外源多肽的外源多核苷酸(例如，编码本文所述的致耐受性因子或补体抑制剂的外源多核苷酸)编码可切割肽或核糖体跳过元件，诸如在由多顺反子转基因编码的外源多肽的N末端或C末端的T2A。

在一些实施方案中，本文的表达载体或构建体是多顺反子构建体。术语“多顺反子构建体”和“多顺反子载体”在本文中可互换使用，并且是指将被转录成单个mRNA分子的重组DNA构建体，其中所述单个mRNA分子编码两个或更多个基因(例如，两个或更多个转基因)。如果多顺反子构建体编码两个基因，则其被称为双顺反子构建体；如果多顺反子构建体编码三个基因，则其被称为三顺反子构建体；如果多顺反子构建体编码四个基因，则其被称为四顺反子构建体，依此类推。

在一些实施方案中，由载体或构建体包含的两种或更多种外源多核苷酸(例如，转基因)各自被多顺反子分离元件分开。在一些实施方案中，多顺反子分离元件是IRES或编码可切割肽或核糖体跳过元件的序列。在一些实施方案中，多顺反子分离元件是IRES，诸如脑心肌炎(EMCV)病毒IRES。在一些实施方案中，多顺反子分离元件是可切割肽，诸如2A肽。示例性的2A肽包括P2A肽、T2A肽、E2A肽和F2A肽。在一些实施方案中，可切割肽是T2A。在一些实施方案中，两种或更多种外源多核苷酸(例如，第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸)与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸各自与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是相同的启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1启动子。

在一些情况下，编码外源多肽的外源多核苷酸(例如，编码本文所述的致耐受性因子或补体抑制剂的外源多核苷酸)编码可切割肽或核糖体跳过元件，诸如在由多顺反子载体编码的外源多肽的N末端或C末端的T2A。在一些实施方案中，包含可切割肽或核糖体跳过元件允许从单个翻译起始位点表达两种或更多种多肽。在一些实施方案中，可切割肽是T2A。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，载体或构建体包括驱动外源多核苷酸的一个或多个转录单位的表达的单一启动子。在一些实施方案中，此类载体或构建体可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方案中，转录单位可以被工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单位，这允许从单个启动子转录的RNA中共表达基因产物(例如，一种或多种致耐受性因子诸如CD47)。在一些实施方案中，本文提供的载体或构建体是双顺反子的，允许载体或构建体表达两种单独的多肽。在一些情况下，由载体或构建体编码的两种单独的多肽是致耐受性因子(例如，选自以下的两种因子：DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合))。在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)中的两种或更多种。在一些实施方案中，由载体或构建体编码的两种单独的多肽是致耐受性因子(例如，CD47)。在一些实施方案中，本文提供的载体或构建体是三顺反子的，允许载体或构建体表达三种单独的多肽。在一些情况下，三顺反子载体或构建体的三个核酸序列是致耐受性因子，诸如CD47。在一些情况下，三顺反子载体或构建体的三种核酸序列是选自以下的三种致耐受性因子：DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)。在一些实施方案中，三种致耐受性因子选自CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)。在一些实施方案中，本文提供的载体或构建体是四顺反子的，允许载体或构建体表达四种单独的多肽。在一些情况下，四顺反子载体或构建体的四种单独的多肽是选自以下的四种致耐受性因子：DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)。在一些实施方案中，四种致耐受性因子选自CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种载体或构建体，其中每种载体或构建体是如上所述的单顺反子或多顺反子构建体，并且所述单顺反子或多顺反子构建体以任何组合或顺序编码一种或多种致耐受性因子。

在一些实施方案中，单个启动子引导在单个开放阅读框(ORF)中含有两个、三个或四个基因(例如，编码致耐受性因子(例如，CD47))的RNA的表达，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或之后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，肽(诸如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端肽键的合成，导致2A序列末端与下游下一个肽之间的分离(参见例如，de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)以及deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件是本领域已知的。可以用于本文公开的方法和核酸的2A序列的实例包括但不限于来自口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:20)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:19)、东亚细亚病毒(thosea asigna virus)(T2A，例如SEQ ID NO:15、16、21或22)和猪捷申病毒1(P2A，例如SEQ ID NO:63或64)的2A序列，如在美国专利公开号20070116690中所述。

在载体或构建体(例如，转基因)含有超过一个编码蛋白质的核酸序列(例如，编码CD47的第一外源多核苷酸和编码第二转基因的第二外源多核苷酸)的情况下，载体或构建体(例如，转基因)还可以包含编码在第一外源多核苷酸序列与第二外源多核苷酸序列之间的肽的核酸序列。在一些情况下，位于第一外源多核苷酸与第二外源多核苷酸之间的核酸序列编码在翻译期间或之后将第一外源多核苷酸的翻译产物和第二外源多核苷酸的翻译产物分开的肽。在一些实施方案中，肽含有自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(核糖体跳过元件)，诸如T2A肽。在一些实施方案中，包含可切割肽或核糖体跳过元件允许从单个翻译起始位点表达两种或更多种多肽。在一些实施方案中，肽是自切割肽，其为T2A肽。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQID NO:16所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。

将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、转座酶介导的递送和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，慢病毒转导)或者以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合原介导的递送)，将多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方案中，包装编码外源多核苷酸的多核苷酸的载体可以用于将包装的多核苷酸递送至细胞或细胞群。这些载体可以是任何种类的载体，包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒载体和颗粒。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以用于将外源多核苷酸递送至细胞。在一些实施方案中，病毒载体可以用于将外源多核苷酸递送至细胞。病毒载体技术是熟知的，并且在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中有所描述。可用作载体的病毒包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、溶瘤病毒等。在一些实施方案中，将外源多核苷酸引入细胞中可以是特异性的(靶向的)或非特异性的(例如，非靶向的)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸引入细胞中可以导致整合或插入到细胞的基因组中。在其他实施方案中，引入的外源多核苷酸在细胞中可以是非整合的或游离的。技术人员熟悉将核酸转基因引入细胞中的方法，包括本文所述的任何示例性方法，并且可以选择合适的方法。

1)非靶向递送

在一些实施方案中，通过多种非靶向方法中的任一种将外源多核苷酸引入细胞(例如，源细胞)中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到宿主细胞的随机基因组基因座中。如本领域技术人员已知的，病毒载体(包括例如逆转录病毒载体和慢病毒载体)通常用于将遗传物质递送至宿主细胞中，并且将外来或外源基因随机插入到宿主细胞基因组中以促进基因的稳定表达和复制。在一些实施方案中，将外源多核苷酸非靶向引入细胞中是在外源多核苷酸在细胞中稳定表达的条件下进行的。在一些实施方案中，用于引入核酸以在细胞中稳定表达的方法包括导致核酸稳定整合到细胞基因组中，使得如果核酸已经整合到的细胞分裂，核酸可以繁殖的任何方法。

在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体是成功进行病毒转导的特别有用的手段，因为它们允许所递送的核酸转录物中所含的基因稳定表达。慢病毒载体表达逆转录酶和整合酶，这两种酶是所递送的核酸转录物中所含的基因稳定表达所必需的。逆转录酶将RNA转录物转化为DNA，而整合酶将DNA插入并整合到靶细胞的基因组中。一旦DNA已经稳定地整合到基因组中，其就会随着宿主一起分裂。整合的DNA中所含的感兴趣的基因可以组成型表达，或者其可以是诱导型表达。作为宿主细胞基因组的一部分，其可能受到细胞调节，包括活化或抑制，这取决于靶细胞中的许多因子。

慢病毒是逆转录病毒科病毒的亚群，因为在整合到宿主基因组中之前需要将病毒RNA基因组逆转录为DNA而得名。因此，慢病毒媒介物/颗粒最重要的特征是将其遗传物质整合到靶细胞/宿主细胞的基因组中。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒HIV-1病毒和HIV-2病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、杰姆布拉纳病病毒(JDV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马传染性贫血病毒、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。

通常，构成基因递送媒介物的慢病毒颗粒自身存在复制缺陷(也称为“自身失活”)。由于通过完整宿主核包膜的进入机制，慢病毒能够感染分裂和非分裂细胞两者(Naldini L等人,Curr.Opin.Bioiecknol,1998,9:457-463)。重组慢病毒媒介物/颗粒已经通过多重削弱HIV毒力基因而产生，例如基因Env、Vif、Vpr、Vpu、Nef和Tat被缺失，使得载体在生物学上是安全的。相应地，例如来源于HIV-1/HIV-2的慢病毒媒介物可以介导转基因在非分裂细胞中的有效递送、整合和长期表达。

可以通过在生产者细胞诸如人HEK293T细胞中共表达病毒包装元件和载体基因组本身来产生慢病毒颗粒。这些元件通常以三个(在第二代慢病毒系统中)或四个单独的质粒(在第三代慢病毒系统中)提供。将生产者细胞与编码包括病毒的核心(即结构蛋白)和酶组分、以及包膜蛋白(称为包装系统)在内的慢病毒组分的质粒共转染，和与待被转移至靶细胞的编码包含外来转基因的基因组的质粒(即媒介物本身(也称为转移载体))共转染。一般来讲，质粒或载体包含在生产者细胞系中。通过转染、转导或感染将质粒/载体引入生产者细胞系中。用于转染、转导或感染的方法是本领域技术人员熟知的。作为非限制性实例，可以将包装和转移构建体通过磷酸钙转染、脂转染或电穿孔引入生产者细胞系中，通常与显性选择标记(诸如新霉素(neo)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶或腺苷脱氨酶(ADA))一起引入，随后在适当的药物的存在下进行选择并分离克隆。

生产者细胞产生含有外来基因(例如编码外源多核苷酸的多核苷酸)的重组病毒颗粒。从培养基中回收重组病毒颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法滴定。重组慢病毒媒介物可以用于感染靶细胞，此类源细胞包括第II.C节中描述的任何细胞。

可以用于产生高滴度慢病毒颗粒的细胞可以包括但不限于HEK293T细胞、293G细胞、STAR细胞(Relander等人,Mol Ther.2005,11:452-459)、FreeStyle^TM293表达系统(ThermoFisher,Waltham,MA)、以及其他基于HEK293T的生产者细胞系(例如，Stewart等人,Hum Gene Ther._2011,2,2.(3):357～369；Lee等人,Biotechnol Bioeng,2012,10996):1551-1560；Throm等人.Blood.2009,113(21):5104-5110)。

慢病毒颗粒中提供的另外元件可以包含位于5’或3’末端的逆转录病毒LTR(长末端重复序列)、逆转录病毒输出元件(任选地慢病毒反向反应元件(RRE))、启动子或其活性部分、以及基因座控制区域(LCR)或其活性部分。其他元件包括提高在非分裂细胞中的转导效率的中央多嘌呤链段(cPPT)序列、增强转基因表达并增加滴度的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。

用于产生重组慢病毒颗粒的方法是技术人员已知的，例如美国专利号：8,846,385；7,745,179；7,629,153；7,575,924；7,179,903；和6,808,905。所用的慢病毒载体可以选自但不限于pLVX、pLenti、pLenti6、pLJMl、FUGW、pWPXL、pWPI、pLenti CMV puro DEST、pLJMl-EGFP、pULTRA、pInducer2Q、pHIV-EGFP、pCW57.1、pTRPE、pELPS、pRRL和pLionII，也可以使用任何已知的慢病毒媒介物(参见美国专利号9,260,725；9,068,199；9,023,646；8,900,858；8,748,169；8,709,799；8,420,104；8,329,462；8,076,106；6,013,516；和5,994、136；国际专利公开号：WO2012079000)。

在一些实施方案中，在细胞瞬时表达的条件下，诸如通过导致外源多核苷酸游离递送的方法，将外源多核苷酸引入细胞中。

在一些实施方案中，可以将编码外源多核苷酸的多核苷酸包装到重组腺相关病毒(rAAV)载体中。可以将此类载体或病毒颗粒设计成利用任何已知的血清型衣壳或血清型衣壳的组合。血清型衣壳可以包括来自任何已鉴定的AAV血清型及其变体(例如AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAVrh10)的衣壳。在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如在以下文献中所述的序列：美国公开号US20030138772；Pulicherla等人Molecular Therapy,2011,19(6):1070-1078；美国专利号：6,156,303；7,198,951；美国专利公开号：US2015/0159173和US2014/0359799；以及国际专利公开号：WO1998/011244、WO2005/033321和WO2014/14422。

AAV载体不仅包括单链载体，还包括自身互补AAV载体(scAAV)。scAAV载体含有退火在一起形成双链载体基因组的DNA。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。可以通过本领域的标准方法(诸如通过三重转染)在sf9昆虫细胞中或在人类细胞诸如HEK293细胞的悬浮细胞培养物中制备rAAV载体。

在一些实施方案中，可以使用基于非病毒的方法。例如，在一些方面，包含多核苷酸的载体可以通过物理方法诸如针、电穿孔、声穿孔(sonoporation)、水穿孔(hyrdoporation)；化学载剂诸如无机颗粒(例如，磷酸钙、二氧化硅、金)和/或化学方法通过非病毒方法转移到细胞中。在其他方面，合成或天然生物可降解剂可以用于递送，诸如阳离子脂质、脂质纳米乳液、纳米颗粒、基于肽的载体或基于聚合物的载体。

2)靶向递送

可以将外源多核苷酸插入到细胞的任何合适的靶基因组基因座中。在一些实施方案中，通过靶向整合到靶位点中将外源多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，靶向整合可以通过在涉及同源依赖性或同源非依赖性重组的过程中使用一种或多种核酸酶和/或切口酶以及供体模板进行基因编辑来实现。

许多基因编辑方法可以用于将外源多核苷酸插入到选择的特定基因组基因座中，包括例如同源定向修复(HOR)、同源介导的末端连接(HMEJ)、同源非依赖性靶向整合(HITI)、专性连接门控重组(ObliGaRe)或精确整合到靶染色体中(PITCh)。

在一些实施方案中，核酸酶在基因组中的期望位置(例如，靶位点)处产生特定的双链断裂(DSB)，并且利用细胞的内源性机制来修复诱导的断裂。切口酶在基因组中的期望位置处产生特定的单链断裂。在一个非限制性实例中，可以使用两种切口酶在靶DNA的相反链上产生两个单链断裂，从而产生平端或粘端。可以将任何合适的核酸酶引入细胞中以诱导靶DNA序列的基因组编辑，包括但不限于CRISPR相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切或外切核酸酶、它们的变体、它们的片段及其组合。在一些实施方案中，当将核酸酶或切口酶与含有外源多核苷酸序列(也称为转基因)的供体模板一起引入时，所述外源多核苷酸序列的侧翼是与内源基因组靶基因座(例如，安全港基因座)处或附近的序列同源的同源序列(例如，同源臂)，DNA损伤修复途径可以导致转基因序列整合到细胞中的靶位点。这可以通过同源依赖性过程发生。在一些实施方案中，供体模板是环状双链质粒DNA、单链供体寡核苷酸(ssODN)、线性双链聚合酶链式反应(PCR)片段或完整姐妹染色单体的同源序列。取决于供体模板的形式，同源介导的基因插入和替换可以通过特定的DNA修复途径进行，所述DNA修复途径诸如同源定向修复(HDR)、合成依赖性链退火(SDSA)、微同源介导的末端连接(MMEJ)和同源介导的末端连接(HMEJ)途径。

例如，DNA修复机制可以在以下情况之后由核酸酶诱导：(i)两个SSB，其中每条链上有一个SSB，从而诱导单链突出端；或(ii)在两条链上的相同切割位点出现的DSB，从而诱导平端断裂。在被这些试剂之一切割后，具有SSB或DSB的靶基因座经历两种主要DNA损伤修复途径之一：(1)易错非同源末端连接(NHEJ)或(2)高保真同源定向修复(HDR)途径。在一些实施方案中，引入存在SSB或DSB的细胞中的供体模板(例如，环状质粒DNA或线性DNA片段，诸如ssODN)可以导致HDR和供体模板整合到靶基因座中。一般来说，在不存在供体模板的情况下，NHEJ过程重新连接切割DNA链的末端，这经常导致切割位点处的核苷酸缺失和插入。

在一些实施方案中，外源多核苷酸在细胞中的定点插入可以通过基于HDR的方法实现。HDR是细胞修复DNA中的双链断裂(DSB)的机制，并且可以用于使用各种基因编辑系统修饰许多生物体的基因组，所述基因编辑系统包括成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和转座酶。

在一些实施方案中，通过引入一种或多种序列特异性或靶向核酸酶来进行靶向整合，所述核酸酶包括DNA结合靶向核酸酶和基因编辑核酸酶(诸如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN))以及RNA指导的核酸酶(诸如CRISPR相关核酸酶(Cas)系统)，它们被特别设计为靶向靶基因的至少一个靶位点序列。示例性的ZFN、TALE和TALEN在例如Lloyd等人,Frontiers in Immunology,4(221):1-7(2013)中有所描述。在特定实施方案中，使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)在靶位点处或附近进行靶向遗传破坏。参见Sander和Joung,(2014)Nature Biotechnology,32(4):347-355。

第II节中描述的任何基因破坏系统。A.1可以被使用，并且当还与含有外源多核苷酸的适当供体模板(例如，转基因序列)一起引入时，可以导致外源多核苷酸在遗传破坏的靶位点处或附近的靶向整合。在特定实施方案中，使用含有一种或多种指导RNA(gRNA)和Cas蛋白的CRISPR/Cas系统介导遗传破坏。在上文第II.A节中描述了示例性的Cas蛋白和gRNA，其中的任何一种都可以用于将外源多核苷酸HDR介导整合到Crispr/Cas系统特异的靶位点中。本领域技术人员有能力选择适当的Cas核酸酶和gRNA，诸如取决于HDR切割和整合外源多核苷酸的特定靶基因座和靶位点。此外，取决于靶位点，技术人员可以容易地制备适当的供体模板，诸如下文进一步所述。

在一些实施方案中，DNA编辑系统是RNA指导的CRISPR/Cas系统(诸如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在靶基因座(例如，安全港基因座)中产生双链断裂以诱导转基因插入到靶基因座中。在一些实施方案中，核酸酶系统是CRISPR/Cas9系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包含基于质粒的Cas9。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包含基于RNA的Cas9。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包含Cas9mRNA和gRNA。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包含蛋白质/RNA复合物、或质粒/RNA复合物、或蛋白质/质粒复合物。在一些实施方案中，提供了用于产生工程化细胞的方法，所述方法包括将含有转基因或外源多核苷酸序列的供体模板以及包括DNA核酸酶系统(例如，Cas9)和基因座特异性gRNA的DNA核酸酶系统引入源细胞(例如，原代细胞或多能干细胞，例如iPSC)中。在一些实施方案中，Cas9作为mRNA被引入。在一些实施方案中，Cas9作为与gRNA的核糖核蛋白复合物被引入。

通常，待插入的供体模板将至少包含含有感兴趣的外源多核苷酸(例如，致耐受性因子或CAR)的转基因盒，并且还将任选地包含启动子。在某些实施方案中，含有待插入的外源多核苷酸和/或启动子的转基因盒将在供体模板中侧翼有与紧邻靶切割位点上游和下游的序列同源的同源臂，即左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA)。典型地，供体模板的同源臂是为靶基因组基因座特别设计的，用作HDR的模板。每个同源臂的长度通常取决于被引入的插入物的大小，较大的插入需要较长的同源臂。

在一些实施方案中，供体模板(例如，重组供体修复模板)包含：(i)包含外源多核苷酸序列的转基因盒(例如，可操作地连接到启动子的转基因，例如异源启动子)；和(ii)两个同源臂，其位于转基因盒的侧翼并与DNA核酸酶(例如，Cas核酸酶，诸如Cas9或Cas12)切割位点任一侧的靶基因座(例如，安全港基因座)的部分同源。供体模板还可以包含选择标记、可检测标记和/或纯化标记。

在一些实施方案中，同源臂长度相同。在其他实施方案中，同源臂长度不同。同源臂可以是至少约10个碱基对(bp)，例如，至少约10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、45bp、55bp、65bp、75bp、85bp、95bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1.1千碱基(kb)、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2、1kb、2,2kb、2,3kb、2,4kb、2,5kb、2,6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3.0kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb或更长。同源臂可以为约10bp至约4kb，例如约10bp至约20bp、约10bp至约50bp、约10bp至约100bp、约10bp至约200bp、约10bp至约500bp、约10bp至约I kb、约10bp至约2kb、约10bp至约4kb、约100bp至约200bp、约100bp至约500bp、约100bp至约1kb、约100bp至约2kb、约100bp至约4kb、约500bp至约I kb、约500bp至约2kb、约500bp至约4kb、约1kb至约2kb、约1kb至约2kb、约1kb至约4kb、或约2kb至约4kb。

在一些实施方案中，可以将供体模板克隆到表达载体中。可以使用本领域普通技术人员已知的常规基于病毒和非病毒的表达载体。

在一些实施方案中，靶向整合的靶基因座可以是外源多核苷酸或转基因靶向整合可接受或期望的任何基因座。靶基因座的非限制性实例包括但不限于CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D基因(也称为HY)、B2M基因、CIITA基因、TRAC基因、TRBC基因、CCR5基因、F3(即，CD142)基因、MICA基因、MICB基因、LRP1基因、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D(即，HY)基因、PDGFRa基因、OLIG2基因和/或GFAP基因。在一些实施方案中，可以将外源多核苷酸插入到靶基因座(例如，安全港基因座)的合适区域中，所述合适区域包括例如内含子、外显子和/或基因编码区(也称为编码序列或“CDS”)。在一些实施方案中，插入发生在靶标基因组基因座的一个等位基因中。在一些实施方案中，插入发生在靶标基因组基因座的两个等位基因中。在这些实施方案的任一个中，转基因插入到靶基因组基因座中的取向可以与该基因座中基因的方向相同或相反。

在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到安全港基因座的内含子、外显子或编码序列区域中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到内源基因中，其中插入导致内源基因的沉默或表达降低。用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座在表4中描述。

表4：用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座

在一些实施方案中，靶基因座是安全港基因座。在一些实施方案中，安全港基因座是允许整合的DNA稳定表达而对附近或邻近的内源基因、调控元件等影响最小的基因组位置。在一些情况下，安全港基因能够实现可持续的基因表达，并且可以被工程化核酸酶靶向用于各种细胞类型中的基因修饰，所述细胞类型包括原代细胞和多能干细胞，包括其衍生物及其分化细胞。安全港基因座的非限制性实例包括但不限于CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、CLYBL基因座和/或Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)。在一些实施方案中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1基因座、CCR5基因座和CLYBL基因座。在一些情况下，SHS231可以作为许多细胞类型中的安全港基因座。在一些情况下，某些基因座可以在某些细胞类型中起到安全港基因座的作用。例如，PDGFRa是神经胶质祖细胞(GPC)的安全港，OLIG2是少突胶质细胞的安全港基因座，并且GFAP是星形胶质细胞的安全港基因座。本领域技术人员有能力根据特定的工程化细胞类型选择适当的安全港基因座。在一些情况下，可以靶向超过一个安全港基因，从而将超过一个转基因引入遗传修饰的细胞中。

在一些实施方案中，提供了用于产生工程化细胞的方法，所述方法包括向源细胞(例如，原代细胞或多能干细胞，例如iPSC)中引入含有转基因或外源多核苷酸序列的供体模板以及包括DNA核酸酶系统(例如，Cas9)和基因座特异性gRNA的DNA核酸酶系统，所述基因座特异性gRNA包含对CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、CLYBL基因座和/或Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)具有特异性的互补部分(例如，gRNA靶向序列)。在一些实施方案中，由gRNA靶向的基因组基因座位于所描述的任何基因座的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内。

在一些实施方案中，本文用于HDR介导的转基因插入的gRNA包含识别AAVS1中的靶序列的互补部分(例如，gRNA靶向序列)。在这些实施方案中的某些中，靶序列位于AAVS1的内含子1中。AAVS1位于染色体19:55,090,918-55,117,637反链，并且AAVS1内含子1(基于转录物ENSG00000125503)位于染色体19:55,117,222-55,112,796反链。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体19:55,117,222-55,112,796的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体19:55,115,674的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体19:55,115,674处或在染色体19:55,115,674的5个、10个、15个、20个、30个、40个或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA是在Li等人,Nat.Methods 16:866-869(2019)中所述的GET000046(也称为“sgAAVS1-1”)。该gRNA包含具有在例如表5中所列出的核酸序列的互补部分(例如，gRNA靶向序列)，并且靶向AAVS1的内含子1(也称为PPP1R12C)。

在一些实施方案中，本文用于HDR介导的转基因插入的gRNA包含识别CLYBL中的靶序列的互补部分(例如，gRNA靶向序列)。在某些实施方案中，靶序列位于CL YBL的内含子2中。CLYBL位于染色体13:99,606,669-99,897,134正链，并且CLYBL内含子2(基于转录物ENST00000376355.7)位于染色体13:99,773,011-99,858,860正链。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体13:99,773,011-99,858,860的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体13:99,822,980的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体13:99,822,980处或在染色体13:99,822,980的5个、0个、15个、20个、30个、40个或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA是GET000047，其包含具有在例如表5中所列出的核酸序列的互补部分(例如，gRNA靶向序列)，并且靶向CLYBL的内含子2。该靶位点类似于如在Cerbini等人,PLoS One,10(1):e0116032(2015)中所述的TALEN的靶位点。

在一些实施方案中，本文用于HDR介导的转基因插入的gRNA包含识别CCR5中的靶序列的互补部分(例如，gRNA靶向序列)。在某些实施方案中，靶序列位于CCR5的外显子3中。CCR5位于染色体3:46,370,854-46,376,206正链，并且CCR5外显子3(基于转录物ENST00000292303.4)位于染色体3:46,372,892-46,376,206正链。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体3:46,372,892-46,376,206的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA靶向染色体3:46,373,180的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内的基因组基因座。在某些实施方案中，gRNA被配置为在染色体3:46,373,180处或在染色体3:46,373,180的5个、10个、15个、20个、30个、40个或50个核苷酸内的位置处产生切割位点。在某些实施方案中，gRNA是在Mandal等人,Cell Stem Cell15:643-652(2014)中所述的GET000048(也称为“crCCR5_D”)。该gRNA包含具有在例如表5中所列出核酸序列的互补部分，并且靶向CCR5的外显子3(可替代地在Ensembl基因组数据库中标注为外显子2)。参见Gomez-Ospina等人,Nat.Comm.10(1):4045(2019)。

表5列出了示例性gRNA靶向序列。在一些实施方案中，gRNA靶向序列可以在表5中所列出的序列的互补部分中含有一个或多个胸腺嘧啶，所述胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。本领域普通技术人员可以理解，尿嘧啶和胸腺嘧啶都可以用‘t’表示，而不是尿嘧啶用‘u’表示并且胸腺嘧啶用‘t’表示；在核糖核酸的情况下，除非另有说明，应当理解‘t’用于表示尿嘧啶。

表5.示例性gRNA靶向序列。

描述	核酸序列	SEQ ID NO:
			GET000046指导	(5'→3')accccacagtggggccacta	23
GET000047指导	(5'→3')tgttggaaggatgaggaaat	24
			GET000048指导	(5'→3')tcactatgctgccgcccagt	25

在一些实施方案中，靶基因座是细胞中期望被敲除的基因座。在此类实施方案中，这样的靶基因座是在细胞中期望破坏或消除诸如以调节细胞的表型或功能的任何靶基因座。例如，第II.A节中描述的降低靶基因表达的任何基因修饰可以是外源多核苷酸靶向整合的期望靶基因座，其中通过外源多核苷酸靶向插入引起的靶基因的遗传破坏或敲除以及过表达可以在细胞中的相同靶位点或基因座处实现。例如，HDR方法可以用于导致遗传破坏，以消除或降低(例如，敲除)表1中所列出的任何靶基因的表达，同时还通过使用具有侧翼同源臂的供体模板将外源多核苷酸整合到(例如，敲入)靶基因中，所述同源臂与遗传破坏的靶位点处或附近的核酸序列同源。

在一些实施方案中，提供了用于产生工程化细胞的方法，所述方法包括将含有转基因或外源多核苷酸序列的供体模板以及包括DNA核酸酶系统(例如，Cas9)和基因座特异性gRNA的DNA核酸酶系统引入源细胞(例如，原代细胞或多能干细胞，例如iPSC)中，所述基因座特异性gRNA包含对B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座具有特异性的互补部分。在一些实施方案中，由gRNA靶向的基因组基因座位于所描述的任何基因座的4000bp以内、3500bp以内、3000bp以内、2500bp以内、2000bp以内、1500bp以内、1000bp以内或500bp以内。

在特定实施方案中，靶基因座是B2M。在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向B2M基因的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向B2M基因的遗传修饰是通过使用靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向B2M基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向B2M基因的至少一种指导核糖核酸(gRNA)序列选自由以下组成的组：WO2016/183041的附录2或表15的SEQ ID NO:81240-85644，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，外源多核苷酸通过引入含有外源多核苷酸序列的供体模板通过HDR整合到破坏的B2M基因座中，所述外源多核苷酸序列具有与邻近由gRNA靶向的靶位点的序列同源的侧翼同源臂。

在特定实施方案中，靶基因座是CIITA。在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向CIITA基因的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向CIITA基因的遗传修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向CIITA基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向CIITA基因的至少一种指导核糖核酸序列选自由以下组成的组：WO2016183041的附录1或表12的SEQ ID NO:5184-36352，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，外源多核苷酸通过引入含有外源多核苷酸序列的供体模板通过HDR整合到破坏的CIITA基因座中，所述外源多核苷酸序列具有与邻近由gRNA靶向的靶位点的序列同源的侧翼同源臂。

在一些实施方案中，细胞是T细胞，并且通过基因编辑方法在细胞中降低或消除内源TRAC或TRBC基因座的表达。例如，HDR方法可以用于导致遗传破坏，以消除或降低(例如，敲除)TRAC或TRBC基因的表达，同时还通过使用具有侧翼同源臂的供体模板将外源多核苷酸整合到(例如，敲入)相同基因座中，所述同源臂与遗传破坏的靶位点处或附近的核酸序列同源。表6中提供了可用于基于CRISPR/Cas靶向本文所述的基因的示例性gRNA序列。序列可以在US20160348073中找到，包括序列表的公开内容据此通过引用整体并入本文。

表6.可用于靶向基因的示例性gRNA靶向序列

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向TRAC基因的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向TRAC基因的遗传修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向TRAC基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向TRAC基因的至少一种指导核糖核酸序列(例如，gRNA靶向序列)选自由以下组成的组：US20160348073的SEQ ID NO:532-609和SEQ IDNO:9102-9797，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，外源多核苷酸通过引入含有外源多核苷酸序列的供体模板通过HDR整合到破坏的TRAC基因座中，所述外源多核苷酸序列具有与邻近由gRNA靶向的靶位点的序列同源的侧翼同源臂。

在一些实施方案中，工程化细胞包含靶向TRBC基因的遗传修饰。在一些实施方案中，靶向TRBC基因的遗传修饰是通过靶向核酸酶系统进行的，所述靶向核酸酶系统包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸、以及至少一种用于特异性地靶向TRBC基因的指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性地靶向TRBC基因的至少一种指导核糖核酸序列(例如，gRNA靶向序列)选自由以下组成的组：US20160348073的SEQ ID NO:610-765和SEQ IDNO:9798-10532，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，外源多核苷酸通过引入含有外源多核苷酸序列的供体模板通过HDR整合到破坏的TRBC基因座中，所述外源多核苷酸序列具有与邻近由gRNA靶向的靶位点的序列同源的侧翼同源臂。

在一些实施方案中，本领域技术人员有能力鉴定可用于所描述的HDR介导的整合方法的新基因座和/或gRNA序列。例如，对于CRISPR/Cas系统，当特定基因座(例如，在靶基因内，例如表1中所列出的)的现有gRNA已知时，通过扫描PAM序列基因座(其通常在基因组中每100个碱基对(bp)出现一次)任一侧的侧翼区域，可以使用“英寸蠕动(inch worming)”方法来鉴定用于靶向插入转基因的另外基因座。PAM序列将取决于所用的特定Cas核酸酶，因为不同的核酸酶通常具有不同的相应PAM序列。在基因座任一侧的侧翼区域可以长约500bp至4000bp之间，例如长约500bp、约1000bp、约1500bp、约2000bp、约2500bp、约3000bp、约3500bp或约4000bp。当在搜索范围内鉴定出PAM序列时，可以根据该基因座的序列设计新的指南，用于遗传破坏方法中。虽然CRISPR/Cas系统被作为示例进行描述，但是所描述的任何HDR介导的方法都可以用于这种鉴定新基因座的方法，包括使用ZFN、TALEN、大范围核酸酶和转座酶的那些方法。

在一些实施方案中，外源多核苷酸编码外源CD47多肽(例如，人CD47多肽)，并且将外源多肽插入到如本文所公开的安全港基因座或安全港位点中，或插入到引起内源基因的沉默或表达降低的基因组基因座中。在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸被插入CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、CLYBL基因座和/或Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因座中。

C.细胞

在一些实施方案中，本公开提供了具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47表达的细胞(例如，干细胞、诱导多能干细胞、从这种干细胞衍生或产生的分化细胞、造血干细胞、间充质细胞或原代细胞)或其群体。在一些实施方案中，本公开提供了具有降低的MICA和/或MICB表达以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达的细胞(例如，干细胞、诱导多能干细胞、从这种干细胞衍生或产生的分化细胞、造血干细胞、间充质细胞或原代细胞)或其群体。在一些实施方案中，提供了已经被工程化(或修饰)以减少或缺失MICA和/或MICB、减少或缺失一种或多种MHC I类分子或其组分和/或一种或多种MHC II类分子并且增加(诸如过表达)致耐受性因子(诸如CD47)的细胞(例如，干细胞、诱导多能干细胞、从这种干细胞衍生或产生的分化细胞、造血干细胞、间充质细胞或原代细胞)或其群体。在一些实施方案中，提供了已经被工程化(或修饰)以减少或缺失MICA和/或MICB并且增加(诸如过表达)致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)的细胞(例如，干细胞、诱导多能干细胞、从这种干细胞衍生或产生的分化细胞、造血干细胞、间充质细胞或原代细胞)或其群体。

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是多能干细胞或者是从多能干细胞分化的细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代细胞。

细胞可以是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，诸如人细胞或小鼠细胞。细胞也可以是脊椎动物干细胞，例如哺乳动物干细胞，诸如人干细胞或小鼠干细胞。优选地，细胞或干细胞适于修饰，诸如遗传修饰。优选地，细胞或干细胞或从这种干细胞衍生的细胞具有或被认为具有治疗价值，使得细胞或干细胞或从这种干细胞衍生或分化的细胞可以用于治疗需要治疗的受试者的疾病、病症、缺陷或损伤。

在一些实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞(例如，iPSC、胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅觉成体干细胞、毛囊干细胞、多能性干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞或神经干细胞或祖细胞)。在一些实施方案中，干细胞是成体干细胞(例如，体干细胞或组织特异性干细胞)。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞能够被分化(例如，干细胞是全能的、多能的或多能性的)。在一些实施方案中，从胚胎或新生组织中分离细胞。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、

外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、祖细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红系白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、

或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，细胞被操作(例如，转化或分化)成肌肉细胞、红系-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管上皮细胞或棕色

脂肪细胞。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞)、红系-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞(例如，红细胞、白细胞或血小板)、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、或白色或棕色脂肪细胞。在一些实施方案中，细胞是激素分泌细胞(例如，分泌胰岛素、催产素、内啡肽、加压素、血清素、生长抑素、胃泌素、胰泌素、胰高血糖素、甲状腺激素、铃蟾肽、胆囊收缩素、睾酮、雌激素或孕酮、肾素、饥饿素(ghrelin)、胰淀素或胰多肽的细胞)、表皮角质形成细胞、上皮细胞(例如，外分泌上皮细胞、甲状腺上皮细胞、角化上皮细胞、胆囊上皮细胞、或者角膜、舌头、口腔、食管、肛管、尿道远端或阴道的表面上皮细胞)、肾细胞、生殖细胞、骨关节滑膜细胞、骨膜细胞、骨细胞(例如，破骨细胞或成骨细胞)、软骨膜细胞(例如，成软骨细胞或软骨细胞)、软骨细胞(cartilage cell)(例如，软骨细胞(chondrocyte))、成纤维细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、或浆膜细胞(例如，衬在体腔上的浆膜细胞)。

在一些实施方案中，细胞是体细胞。在一些实施方案中，细胞来源于皮肤或其他器官，例如心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃。细胞可以来自人或其他哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物、牛或猪细胞)。

在一些实施方案中，细胞是T细胞、NK细胞、β胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞(诸如RPE、甲状腺、皮肤或肝细胞)。在一些实施方案中，细胞是已经从工程化iPSC分化而来的iPSC衍生细胞。在一些实施方案中，细胞是根据本文提供的描述已经从原代细胞修饰的工程化细胞。例如，在一些实施方案中，原代细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，原代细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的T细胞，其包含(诸如经工程化以含有)本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的T细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的T细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，细胞是原代T细胞，其包含(诸如经工程化以含有)本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，原代T细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHCI类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，原代T细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。

在一些实施方案中，可以用嵌合抗原受体(CAR)(包括如本文所述的任何一种)对T细胞进行工程化。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)T细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)T细胞可以用于治疗癌症。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的NK细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，细胞是原代NK细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的NK细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的NK细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，可以用嵌合抗原受体(CAR)(包括如本文所述的任何一种)对NK细胞进行工程化。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)NK细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)NK细胞可以用于治疗癌症。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的β胰岛细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，细胞是原代β胰岛细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的β胰岛细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的β胰岛细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)β胰岛细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)β胰岛细胞可以用于治疗糖尿病，诸如I型糖尿病。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的内皮细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，细胞是原代内皮细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的内皮细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的内皮细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)内皮细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)内皮细胞可以用于治疗血管化或眼部疾病。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的上皮细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，细胞是原代上皮细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，上皮细胞是RPE。在一些实施方案中，上皮细胞是甲状腺细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是皮肤细胞。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的上皮细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的上皮细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)上皮细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)上皮细胞可以用于治疗甲状腺疾病或皮肤疾病。

在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的肝细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。在一些实施方案中，细胞是原代肝细胞，其被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。例如，在一些实施方案中，iPSC衍生的肝细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，iPSC衍生的肝细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性)上皮细胞可以用于通过同种异体细胞疗法治疗多种适应症，包括如本文(例如，第IV节)中所述的任何一种。在一些实施方案中，工程化(例如，低免疫原性的)肝细胞可以用于治疗肝病。

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是来自健康受试者的细胞，所述健康受试者诸如不是已知或怀疑患有待治疗的特定疾病或疾患的受试者。例如，在细胞β胰岛细胞从供体受试者中分离或获得，诸如用于治疗糖尿病的情况下，如果所述受试者不是已知或怀疑患有糖尿病或另外的疾病或疾患，则供体受试者是健康受试者。

在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后能够逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后被成熟NK细胞保护免于细胞裂解。在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后不会诱导对所述细胞的免疫反应。在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后不会诱导对所述细胞的全身性炎症反应。在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后不会诱导对所述细胞的局部炎症反应。在一些实施方案中，工程化细胞或源自工程化细胞的后代或分化细胞在施用于受体患者后不会诱导补体途径激活。在一些实施方案中，受体患者具有针对细胞表面上的人白细胞抗原(HLA)非依赖性抗原的预先存在的抗体。

在一些实施方案中，工程化细胞是多能干细胞，诸如诱导多能干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化多能细胞，并且所述方法还包括使工程化细胞分化成期望的细胞类型(诸如在分化之前完成期望的修饰，诸如遗传修饰)。在一些实施方案中，期望的细胞类型选自β胰岛细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心脏细胞和血细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是从供体受试者中分离的原代细胞。

对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。

在一些实施方案中，工程化细胞选自β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌肉细胞、心脏细胞、血细胞、胰岛细胞、平滑肌细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心肌细胞、视觉细胞(optic cell)、干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(PSC)。在一些实施方案中，细胞选自由以下组成的组：胰岛细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。

在一些实施方案中，靶细胞(诸如用于工程化的细胞)是造血干细胞(HSC)。HSC是补充所有血细胞类型并自我更新的干细胞。造血干细胞可以具体定义为当注射到造血系统耗尽的受体小鼠的循环中时，将骨髓细胞、T细胞和B细胞的水平保持在稳定可检测的水平(通常多于1％的外周血细胞)达16周的细胞(Schroeder(2010)Cell Stem Cell6:203-207)。

在一些实施方案中，靶细胞(诸如用于工程化的细胞)来自患有造血疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，造血病症可能是由于血液疾病，特别是涉及造血细胞的疾病。在一些实施方案中，造血病症是单基因造血疾病，诸如由于单个基因的突变。在一些实施方案中，造血病症是脊髓发育不良、再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞病、戴-布二氏贫血、沙赫曼戴蒙氏病、科斯特曼综合征、慢性肉芽肿病、肾上腺脑白质营养不良、白细胞粘附缺陷、血友病、地中海贫血、β-地中海贫血、白血病诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性(髓系)白血病(AML)、成人淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性髓系白血病(CML)、幼年型慢性髓性白血病(CML)和幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、严重联合免疫缺陷病(SCID)、X连锁严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽肿病、Chediak-Higashi综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或AIDS。

在一些实施方案中，靶细胞(诸如用于工程化的细胞)来自患有自身免疫性疾病的受试者。在一些实施方案中，自身免疫性疾病是急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增殖综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病、巴洛同心硬化症、贝赫切特综合征、伯杰氏病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈病、德库姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、附着点炎相关性关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化纤维发育不良、纤维化肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线性IgA病(LAD)、卢伽雷氏病、狼疮性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、米勒-费雪综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆哈-哈伯曼病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、视神经鞘炎、神经性肌强直、眼部瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、甲状腺炎、回文性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、拉斯穆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳氏病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、斯威特综合征(Sweet'ssyndrome)、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，靶细胞(诸如用于工程化的细胞)来自患有癌症的受试者。在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，白血病是B-CLL、CML或基于T细胞的白血病诸如ALT。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。

1.原代细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化的细胞包括从原代细胞衍生的细胞，所述原代细胞从一个或多个个体受试者或供体获得或分离。在一些实施方案中，细胞源自分离的原代细胞库，所述分离的原代细胞从一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)不同的供体受试者获得。在一些实施方案中，将从多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)不同的供体受试者分离或获得的原代细胞分批汇集在一起，并且根据所提供的方法进行工程化。

在一些实施方案中，原代细胞来自一个或多个供体受试者的原代细胞库，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。原代细胞可以从1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、50个、100个或更多个供体受试者获得并汇集在一起。原代细胞可以从1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、或100个或更多个供体受试者获得并且汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获原代细胞，并且在一些情况下，在体外培养原代细胞或原代T细胞库。在一些实施方案中，根据本文所提供的方法工程化或修饰原代细胞或原代T细胞库。

在一些实施方案中，方法包括从个体供体受试者获得或分离所需类型的原代细胞(例如，T细胞、NK细胞、内皮细胞、β胰岛细胞、肝细胞或如本文所述的其他原代细胞)，汇集细胞以获得一批原代细胞类型，并且通过本文提供的方法对细胞进行工程化。在一些实施方案中，方法包括获得或分离所需类型的原代细胞(例如，T细胞、NK细胞、内皮细胞、β胰岛细胞、肝细胞或本文所述的其他原代细胞)，通过本文提供的方法工程化每个个体供体的细胞，以及汇集至少两个个体样品的工程化(修饰)细胞以获得一批所述原代细胞类型的工程化细胞。

在一些实施方案中，原代细胞从个体中分离或获得，或者从分离自或获自多于一个个体供体的原代细胞库中分离或获得。原代细胞可以是本文所述的任何类型的原代细胞，包括在第II.C.3节中所述的任何一种。在一些实施方案中，原代细胞选自T细胞、NK细胞、β胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞(诸如RPE、甲状腺、皮肤或肝细胞)。在一些实施方案中，来自个体供体或个体供体库的原代细胞被工程化以含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)。

例如，在一些实施方案中，原代细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子诸如CD47的表达。在一些实施方案中，原代细胞具有降低的MICA和/或MICB表达、以及增加的一种或多种致耐受性因子(诸如CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8中的任何一种)表达。

在一些实施方案中，工程化细胞是肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞)、红系-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛簇、胰岛细胞、β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞(例如，红细胞、白细胞或血小板)、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β胰岛细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、或白色或棕色脂肪细胞。在一些实施方案中，细胞是激素分泌细胞(例如，分泌胰岛素、催产素、内啡肽、加压素、血清素、生长抑素、胃泌素、胰泌素、胰高血糖素、甲状腺激素、铃蟾肽、胆囊收缩素、睾酮、雌激素或孕酮、肾素、饥饿素(ghrelin)、胰淀素或胰多肽的细胞)、表皮角质形成细胞、上皮细胞(例如，外分泌上皮细胞、甲状腺上皮细胞、角化上皮细胞、胆囊上皮细胞、或者角膜、舌头、口腔、食管、肛管、尿道远端或阴道的表面上皮细胞)、肾细胞、生殖细胞、骨关节滑膜细胞、骨膜细胞、骨细胞(例如，破骨细胞或成骨细胞)、软骨膜细胞(例如，成软骨细胞或软骨细胞)、软骨细胞(cartilage cell)(例如，软骨细胞(chondrocyte))、成纤维细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、或浆膜细胞(例如，衬在体腔上的浆膜细胞)。

2.诱导性多能干细胞的生成

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化的细胞是诱导多能干细胞或者是从诱导多能干细胞衍生或分化的工程化细胞。小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC；对于鼠细胞为miPSC或对于人细胞为hiPSC)的产生在本领域中通常是已知的。如本领域技术人员将理解的，有多种不同的方法用于产生iPSC。使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入，从小鼠胚胎或成人成纤维细胞进行最初的诱导；参见Takahashi和YamanakaCell 126:663-676(2006)，其公开内容据此整体并且特别是针对其中概述的技术通过引用并入本文。从那时起，已经开发了许多方法；参见Seki等人,World J.Stem Cells 7(1):116-125(2015)进行回顾，以及Lakshmipathy和Vermuri编辑,Methods in MolecularBiology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013，这两篇文献的公开内容据此通过引用整体并入本文，特别是用于产生hiPSC的方法(参见例如后一篇参考文献的第3章)。

通常，iPSC通过在宿主细胞中瞬时表达一种或多种重编程因子来生成，所述重编程因子通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(一般来说，这一步的效率很低，因为没有使用选择标记)。一旦细胞被“重编程”并且变成多能细胞，它们就失去了附加型载体并使用内源基因产生因子。

如本领域技术人员还理解的，可以使用或被使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞转化为多能状态的效率下降，“多能性”也下降，例如，较少的重编程因子可能导致细胞不是完全多能的，而是可能只能够分化成较少的细胞类型。

在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。一般来讲，这些重编程因子基因是在附加型载体上提供的，诸如是本领域已知的和可商购获得的。

在一些实施方案中，用于转染一种或多种重编程因子的宿主细胞是非多能干细胞。一般来讲，如本领域已知的，iPSC通过瞬时表达如本文所述的重编程因子由非多能细胞(诸如但不限于血细胞和成纤维细胞)制成。在一些实施方案中，在重编程细胞之前，从一个或多个个体受试者或供体中获得或分离非多能细胞，诸如成纤维细胞。在一些实施方案中，由从从一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、二十个或更多个、五十个或更多个、或一百个或更多个)不同的供体受试者获得的分离的非多能干细胞(例如，成纤维细胞)库制得iPSC。在一些实施方案中，从多名(例如，两名或更多名、三名或更多名、四名或更多名、五名或更多名、十名或更多名、二十名或更多名、五十名或更多名、或一百名或更多名)不同的供体受试者分离或获得非多能细胞(诸如成纤维细胞)，将它们分批汇集在一起，重编程为iPSC，并且根据所提供的方法进行工程化。

在一些实施方案中，iPSC来源于，诸如通过将一种或多种重编程因子瞬时转染到细胞中，所述细胞来自不同于受体受试者(例如，施用细胞的患者)的一个或多个供体受试者的非多能细胞(例如，成纤维细胞)库。待被诱导为iPSC的非多能细胞(例如，成纤维细胞)可以获自1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、50个、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。非多能细胞(例如，成纤维细胞)可以从1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、或100个或更多个供体受试者获得并且汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获非多能细胞(例如，成纤维细胞)，并且在一些情况下，将非多能细胞(例如，成纤维细胞)或非多能细胞(例如，成纤维细胞)库进行体外培养并用一种或多种重编程因子转染以诱导iPSC的产生。在一些实施方案中，根据本文提供的方法工程化或修饰非多能细胞(例如，成纤维细胞)或非多能细胞(例如，成纤维细胞)库。在一些实施方案中，工程化iPSC或工程化iPSC库然后经历分化过程以分化成生物体和组织的任何细胞。

如在WO2016183041和WO2018132783中所述，一旦已经产生了工程化iPSC细胞，就可以对它们的低免疫原性和/或多能性保留进行测定。在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如，畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫反应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞反应。使用FACS或Luminex来评估B细胞反应或抗体反应。另外或可替代地，可以测定细胞避免先天免疫反应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中通常所示。

在一些实施方案中，使用本领域技术人员认可的T细胞免疫测定(诸如T细胞增殖测定、T细胞活化测定和T细胞杀伤测定)来评价细胞的免疫原性。在一些情况下，T细胞增殖测定包括用干扰素-γ预处理细胞并将细胞与标记的T细胞共培养，并且在预先选择的时间量后测定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定包括将T细胞与本文概述的细胞共培养并测定T细胞中T细胞活化标记的表达水平。

可以执行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来确定工程化或修饰的iPSC的存活和免疫原性。在一些情况下，将工程化或修饰的iPSC移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，移植的工程化iPSC或其分化细胞在小鼠模型中显示出长期存活。

用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的另外技术描述于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，包括附图、附图说明和此类方法的描述的公开内容据此通过引用整体并入本文。

类似地，以多种方式测试多能性保留。在一个实施方案中，多能性是通过某些多能性特异性因子的表达来测定的，如本文通常描述和在WO2018132783的图29中所示。另外或可替代地，将多能细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指示。

一旦已经产生工程化多能干细胞(工程化iPSC)，就可以将它们维持在未分化状态，这对于维持iPSC是已知的。例如，可以使用防止分化和维持多能性的培养基在基质胶上培养细胞。此外，所述细胞在维持多能性的条件下可以在培养基中。

本文所述的任何多能干细胞都可以分化成生物体和组织的任何细胞。在一个方面，本文提供了从iPSC分化成不同细胞类型的工程化细胞，用于后续移植到受体受试者中。可以如本领域已知的那样，通常通过评价细胞特异性标记的存在来测定分化。如本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的技术来移植分化的工程化(例如，低免疫原性)多能细胞衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。分化细胞的示例性类型及其产生方法如下所述。在一些实施方案中，iPSC可以分化成本文所述的任何类型的细胞，包括在第II.C.3节中所述的任何一种。在一些实施方案中，iPSC分化成选自T细胞、NK细胞、β胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞(诸如RPE、甲状腺、皮肤或肝细胞)的细胞类型。在一些实施方案中，分离或获得来自个体供体或个体供体库的宿主细胞诸如非多能细胞(例如，成纤维细胞)，将它们生成iPSC，其中iPSC然后被工程化以含由本文所述的修饰(例如，遗传修饰)，然后分化成期望的细胞类型。

3.细胞类型

A.T细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是T淋巴细胞(也称为T细胞)，诸如原代T细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的T细胞群或亚群。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得T淋巴细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化T淋巴细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成T淋巴细胞的工程化多能细胞分化的T淋巴细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成T淋巴细胞的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞的方法在例如Iriguchi等人,NatureCommunications 12,430(2021)；Themeli等人,16(4):357-366(2015)；Themeli等人,Nature Biotechnology 31:928-933(2013)中描述。

原代T细胞的非限制性实例包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调节性T(Treg)细胞、非调节性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδ和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及其组合的组。

本公开的示例性T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应记忆RA T细胞、调节性T细胞、组织浸润淋巴细胞及其组合。在许多实施方案中，T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。在一些实施方案中，中央T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆T细胞表达PD-1、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆RA T细胞表达PD-1、CD57和CD45RA。

在一些实施方案中，在如本文所述的工程化之前，T细胞(诸如分离的原代T细胞或分化的T细胞)可以经历一个或多个扩增或活化步骤。在一些实施方案中，通过与抗CD3抗体试剂和抗CD28抗体试剂一起孵育来刺激或活化待工程化的T细胞群。抗CD3和抗CD28可以合适地以涂覆有这些试剂的混合物的珠的形式提供。抗CD3珠和抗CD28珠可以与待工程化的T细胞群以1:1的比率合适地提供。在一些实施方案中，孵育期间的培养基还可以含有一种或多种重组细胞因子，诸如重组IL-2或重组IL-15。

在一些实施方案中，本文所述的工程化T细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代T细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的T细胞)包含被工程化(例如，被修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。任何合适的CAR都可以包括在T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，工程化T细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体与以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位结合：受损细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变体细胞及其组合。在其他情况下，工程化T细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。对T细胞(包括原代T细胞)的有用修饰在US2016/0348073和WO2020/018620中详细描述，所述文献的公开内容据此整体并入本文。

在一些实施方案中，T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到T细胞的基因组基因座中，所述方法包括基于慢病毒的转导方法或本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、PD1或CTLA4基因中。

在一些实施方案中，本文描述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。在一些实施方案中，破坏或消除细胞中的TRAC或TRBC基因座，诸如通过本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸或转基因(诸如编码CAR的多核苷酸或所描述的其他多核苷酸)插入破坏的TRAC或TRBC基因座中。

在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的表达。在一些实施方案中，破坏或消除细胞中的CTLA-4基因座，诸如通过本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸或转基因(诸如编码CAR的多核苷酸或所描述的其他外源多核苷酸)插入破坏的CTLA-4基因座中。

在其他实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的程序性细胞死亡(PD1)的表达。在一些实施方案中，破坏或消除细胞中的PD1基因座，诸如通过本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸或转基因(诸如编码CAR的多核苷酸或所描述的其他外源多核苷酸)插入破坏的PD1基因座中。在某些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的CTLA4和PD1的表达。

在某些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括增强的PD-L1表达。在一些实施方案中，破坏或消除细胞中的PD-L1基因座，诸如通过本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸或转基因(诸如编码CAR的多核苷酸或所描述的其他外源多核苷酸)插入破坏的PD-L1基因座中。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化T细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代T细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的T细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达。在某些实施方案中，工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化T细胞也被工程化以表达CAR。在一些实施方案中，工程化T细胞具有降低的TCR复合物分子表达或缺乏其表达，诸如通过TRAC基因或TRBC基因中的基因组修饰(例如，基因破坏)。在一些实施方案中，T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M、CIITA、TRAC和TRBC基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化T细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化T细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代T细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的T细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化T细胞群来治疗疾病的方法。

本文提供的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。

B.自然杀伤细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是自然杀伤(NK)细胞，诸如原代NK细胞。在一些实施方案中，原代NK细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。在一些情况下，NK细胞是来自一个或多个个体的原代NK细胞群或亚群。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得NK细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代NK细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。例如，通过将工程化NK细胞输注到受试者体内，将工程化T细胞施用于受试者(例如，受体，诸如患者)。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)NK细胞。在一些实施方案中，由NK细胞库产生NK细胞，使得NK细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，NK细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用工程化NK细胞的受体)不同。在一些实施方案中，NK细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得NK细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，NK细胞(包括从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代NK细胞)表达CD56(例如，CD56^暗或CD56^亮)并缺乏CD3(例如，CD3^neg)。在一些实施方案中，如本文所述的NK细胞也可以表达介导ADCC的低亲和力Fcγ受体CD16。在一些实施方案中，NK细胞还表达一种或多种自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D或一种或多种天然细胞毒性受体NKp46、NKp44、NKp30。例如，对于原代NK细胞的情况，在特定情况下，可以通过耗尽对CD3、CD14和/或CD19呈阳性的细胞从NK细胞的起始来源(诸如含有外周血单核细胞(PBMC)的样品)中分离原代细胞。例如，可以使用分别附着了抗CD3、CD14和/或CD19抗体的免疫磁珠使细胞进行耗尽，从而产生富集的NK细胞群。在其他情况下，可以通过对细胞选择NK细胞上一种或多种标记(例如CD56、CD16、NKp46和/或NKG2D)的存在，从混合群体的起始来源(诸如PBMC)中分离原代NK细胞。

在一些实施方案中，在如本文所述的工程化之前，可以使NK细胞(诸如分离的原代NK细胞)经历一个或多个扩增或活化步骤。在一些实施方案中，可以通过将NK细胞与饲养细胞(诸如可以受辐照或可以不受辐照的抗原呈递细胞)一起培养来实现扩增。在扩增步骤中，NK细胞与抗原呈递细胞(APC)的比率可以是某个数值，诸如1:1、1:1.5、1:2或1:3。在某些方面，APC被工程化以表达膜结合的IL-21(mblL-21)。在特定方面，APC可替代地或另外被工程化以表达IL-21、IL-15和/或IL-2。在特定实施方案中，发生扩增步骤的培养基包含一种或多种促进扩增的试剂，诸如一种或多种重组细胞因子。在具体实施方案中，培养基包含一种或多种来自IL-2、IL-15、IL-18和/或IL-21的重组细胞因子。在一些实施方案中，通过引入如本文所述的修饰对NK细胞进行工程化的步骤在扩增开始后2-12天进行，诸如在或约在第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天或第12天。

在一些实施方案中，本文所述的工程化NK细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代NK细胞)包含被工程化(例如，被修饰)以表达嵌合抗原受体的NK细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。任何合适的CAR都可以包括在NK细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，工程化NK细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体与以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位结合：受损细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变体细胞及其组合。在其他情况下，工程化NK细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。

在一些实施方案中，NK细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到NK细胞的基因组基因座中，所述方法包括基于慢病毒的转导方法或本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化NK细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代NK细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达。在某些实施方案中，工程化NK细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰。在一些实施方案中，工程化NK细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰。在一些实施方案中，工程化NK细胞也被工程化以表达CAR。

在一些实施方案中，所提供的工程化NK细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化NK细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代NK细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化NK细胞群来治疗疾病的方法。

本文提供的NK细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。

C.β胰岛细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代β胰岛细胞(也称为胰岛细胞或胰腺β细胞)。在一些实施方案中，原代β胰岛细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得β胰岛细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代β胰岛细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)β胰岛细胞。在一些实施方案中，由β胰岛细胞库产生原代β胰岛细胞，使得β胰岛细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代β胰岛细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，β胰岛细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得β胰岛细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成β胰岛细胞的工程化iPSC衍生的β胰岛细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成各种β胰岛细胞的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。在一些实施方案中，胰岛细胞衍生自本文所述的工程化多能细胞。用于将多能干细胞分化为胰岛细胞的有用方法描述于例如US9,683,215；US9,157,062；和US8,927,280。

在一些实施方案中，本文所述的工程化多能细胞被分化成β样细胞或胰岛类器官用于移植以解决I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的有希望的方法，参见例如Ellis等人,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2017年10月；14(10):612-628，其公开内容据此通过引用并入本文。此外，Pagliuca等人(Cell,2014,159(2):428-39)报告了从hiPSC成功分化β细胞，其内容据此通过引用整体(以及特别是对于其中所概述的从人多能干细胞大规模生产功能性人β细胞的方法和试剂)并入本文。此外，Vegas等人展示了从人多能干细胞生产人β细胞，随后进行封装以避免宿主的免疫排斥；Vegas等人,Nat Med,2016,22(3):306-11，其内容据此通过引用整体(以及特别是对于其中所概述的从人多能干细胞大规模生产功能性人β细胞的方法和试剂)并入本文。

在一些实施方案中，通过体外分化从工程化多能细胞群产生工程化胰岛细胞群的方法包括：(a)在包含选自由以下组成的组的一种或多种因子的第一培养基中培养工程化iPSC：胰岛素样生长因子、转化生长因子、FGF、EGF、HGF、SHH、VEGF、转化生长因子-b超家族、BMP2、BMP7、GSK抑制剂、ALK抑制剂、BMP 1型受体抑制剂和视黄酸，以产生未成熟的胰岛细胞群；以及(b)在与第一培养基不同的第二培养基中培养未成熟的胰岛细胞群，以产生工程化胰岛细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

如本领域已知的那样，通常通过评价β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。也可以在功能上测量分化，诸如测量葡萄糖代谢，一般参见Muraro等人,Cell Syst.2016年10月26日；3(4):385–394.e3，其内容据此整体并且特别是针对其中概述的生物标记通过引用并入。一旦产生β细胞，就可以将其移植(作为细胞悬浮液或在本文讨论的凝胶基质内)到门静脉/肝脏、网膜、胃肠粘膜、骨髓、肌肉或皮下囊中。

用于本发明技术中的包括的胰岛细胞的另外描述可见于WO2020/018615，其公开内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，在施用之前，工程化β胰岛细胞群(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代β胰岛细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的内皮细胞)被维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存工程化β胰岛细胞群。

示例性胰岛细胞类型包括但不限于胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞、成熟胰岛细胞等。在一些实施方案中，将本文所述的胰腺细胞施用于受试者以治疗糖尿病。

在一些实施方案中，如本文所公开的工程化的胰岛细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代β胰岛细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的β胰岛细胞)分泌胰岛素。在一些实施方案中，胰岛细胞表现出内源胰岛细胞的至少两个特征，例如但不限于响应于葡萄糖而分泌胰岛素和β细胞标志物的表达。

示例性β细胞标志物或β细胞祖细胞标志物包括但不限于c肽、Pdxl、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、HNF6、VEGF、葡萄糖激酶(GCK)、激素原转换酶(PC 1/3)、Cdcpl、NeuroD、Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.l、Nkx6.2、Pax4、Pax6、Ptfla、Isll、Sox9、Soxl7和FoxA2。

在一些实施方案中，胰岛细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代β胰岛细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的β胰岛细胞)响应于葡萄糖的增加而产生胰岛素。在各种实施方案中，胰岛细胞响应于葡萄糖的增加而分泌胰岛素。在一些实施方案中，细胞具有独特的形态，诸如鹅卵石细胞形态和/或约17pm至约25pm的直径。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化β胰岛细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代β胰岛细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的β胰岛细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化β胰岛细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化β胰岛细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，β胰岛细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化β胰岛细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化β胰岛细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代β胰岛细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的β胰岛细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化β胰岛细胞群来治疗疾病的方法。

D.内皮细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代内皮细胞。在一些实施方案中，原代内皮细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得内皮细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代内皮细胞类型，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代内皮细胞。在一些实施方案中，由内皮细胞库产生原代内皮细胞，使得内皮细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代内皮细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，内皮细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得内皮细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成内皮细胞类型的工程化iPSC分化的内皮细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成各种内皮细胞类型的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，本文所述的工程化多能细胞被分化成内皮集落形成细胞(ECFC)，以形成新血管来解决外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如Prasain等人,doi:10.1038/nbt.3048，其公开内容据此整体并且特别是针对从人多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂以及针对移植技术通过引用并入本文。可以如本领域已知的那样，通常通过评价内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。

在一些实施方案中，通过体外分化从工程化多能细胞群产生工程化内皮细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的第一培养基中培养工程化iPSC细胞群；(b)在包含VEGF和bFGF的第二培养基中培养工程化iPSC细胞群以产生前内皮细胞群；和(c)在包含ROCK抑制剂和ALK抑制剂的第三培养基中培养前内皮细胞群以产生分化的内皮细胞群，所述分化的内皮细胞群被工程化以含有本文所述的修饰。

在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约1mM至约10mM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约20pM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约0.5pM至约10pM。

在一些实施方案中，第一培养基包含2pM至约10pM的CHIR-99021。在一些实施方案中，第二培养基包含50ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF。在其他实施方案中，第二培养基还包含Y-27632和SB-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10pM Y-27632和1pM SB-431542。在某些实施方案中，第三培养基还包含VEGF和bFGF。在特定情况下，第一培养基和/或第二培养基不含胰岛素。

本文提供的细胞可以在表面诸如合成表面上培养，以支持和/或促进多能细胞分化成内皮细胞。在一些实施方案中，表面包含聚合物材料，包括但不限于所选的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性实例包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.0^2,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯按照本领域已知的方式合成或从商业供应商获得，诸如Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.和Sartomer,Inc。

在一些实施方案中，内皮细胞可以接种到聚合物基质上。在一些情况下，聚合物基质是可生物降解的。合适的可生物降解的基质是本领域众所周知的并且包括胶原-GAG、胶原、纤维蛋白、PLA、PGA和PLA/PGA共聚物。另外的可生物降解的材料包括聚(酸酐)、聚(羟基酸)、聚(原酸酯)、聚(富马酸丙酯)、聚(己内酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯和多糖。

也可以使用不可生物降解的聚合物。其他不可生物降解但生物相容的聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚苯乙烯、聚酯、不可生物降解的聚氨酯、聚脲、聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚(环氧乙烷)。聚合物基质可以形成为任何形状，例如颗粒、海绵、管、球、线、卷绕线、毛细管网络、膜、纤维、网或片。聚合物基质可被修饰以包含天然或合成的细胞外基质材料和因子。

聚合物材料可以分散在支撑材料的表面上。适用于培养细胞的有用的支撑材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合、或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些情况下，玻璃包括钠钙玻璃、耐热玻璃、高硅氧玻璃、石英玻璃、硅或这些玻璃的衍生物等。

在一些情况下，包括树枝状聚合物的塑料或聚合物包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺或这些的衍生物等。在一些情况下，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或这些的衍生物等。

用于本文提供的方法中的内皮细胞及其分化的另外描述可见于WO2020/018615，其公开内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，在施用之前，工程化内皮细胞群(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代内皮细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的内皮细胞)被维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存内皮细胞群。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化内皮细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代内皮细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的内皮细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化内皮细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化内皮细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化内皮细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化内皮细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化内皮细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代内皮细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的内皮细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化内皮细胞群来治疗疾病的方法。

在一些实施方案中，将工程化内皮细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代内皮细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的内皮细胞)施用于患者，例如有需要的人类患者。工程化内皮细胞可以施用于患有疾病或疾患的患者，所述疾病或疾患诸如但不限于心血管疾病、血管疾病、外周血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体缺血、神经病变(例如，周围神经病变或糖尿病性神经病变)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松、血管损伤、组织损伤、高血压、心绞痛以及冠状动脉疾病引起的心肌梗塞、肾血管性高血压、肾动脉狭窄引起的肾功能衰竭、下肢跛行等。在某些实施方案中，患者已经患有或正患有短暂性脑缺血发作或中风，在一些情况下，这可能是由于脑血管疾病引起的。在一些实施方案中，施用工程化内皮细胞以治疗组织缺血，例如在动脉粥样硬化、心肌梗塞和肢体缺血中发生的组织缺血，并且修复损伤的血管。在一些情况下，细胞用于移植物的生物工程。

例如，工程化内皮细胞可用于细胞疗法，用于修复缺血组织、形成血管和心脏瓣膜、工程化人工血管、修复受损血管以及诱导工程化组织中血管的形成(例如，移植前)。此外，内皮细胞可被进一步修饰以递送剂来靶向和治疗肿瘤。

在许多实施方案中，本文提供了一种修复或替换需要血管细胞或血管化的组织的方法。所述方法涉及向需要这种治疗的人类患者施用含有工程化内皮细胞(诸如分离的原代内皮细胞或分化的内皮细胞)的组合物，以促进这种组织中的血管化。需要血管细胞或血管化的组织可以是心脏组织、肝脏组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等，其可以是受损的并且以过度细胞死亡为特征的组织、有受损风险的组织或人工工程化组织。

在一些实施方案中，可通过施用内皮细胞来治疗可能与心脏疾病或病症相关的血管疾病，所述内皮细胞诸如但不限于如本文所述衍生的定形血管内皮细胞和心内膜内皮细胞。此类血管疾病包括但不限于冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉瓣狭窄、主动脉瘤、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、静脉曲张、血管病、缺乏冠状动脉灌注的心脏梗塞区域、不愈合的伤口、糖尿病或非糖尿病性溃疡，或希望诱导血管形成的任何其他疾病或病症。

在某些实施方案中，内皮细胞用于改进在血管重建手术中使用的假体植入物(例如，由诸如Dacron和Gortex的合成材料制成的血管)。例如，假体动脉移植物通常用于替代灌注重要器官或肢体的患病动脉。在其他实施方案中，工程化内皮细胞用于覆盖假体心脏瓣膜的表面，以通过使瓣膜表面不易形成血栓来降低栓塞形成的风险。

可使用众所周知的外科技术将所概述的内皮细胞移植到患者体内，以将组织和/或分离的细胞移植到血管中。在一些实施方案中，通过注射(例如，心肌内注射、冠状动脉内注射、经心内膜注射、经心外膜注射、经皮注射)、输注、移植和植入将细胞引入患者的心脏组织中。

内皮细胞的施用(递送)包括但不限于皮下或肠胃外施用，包括静脉内、动脉内(例如，冠状动脉内)、肌内、腹膜内、心肌内、经心内膜、经心外膜、鼻内施用以及鞘内施用，和输液技术。

如本领域技术人员将理解，使用本领域已知的技术移植细胞，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。在一些实施方案中，静脉内或通过注射将本文提供的细胞移植到患者体内的特定位置。当移植到特定位置时，可将细胞悬浮在凝胶基质中，以防止它们在固定时分散。

示例性内皮细胞类型包括但不限于毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、肾内皮细胞、脑内皮细胞、肝内皮细胞等。

本文所概述的内皮细胞(诸如分离的原代内皮细胞或分化的内皮细胞)可以表达一种或多种内皮细胞标记。此类标志物的非限制性实例包括VE-钙粘蛋白(CD 144)、ACE(血管紧张素转换酶)(CD 143)、BNH9/BNF13、CD31、CD34、CD54(ICAM-l)、CD62E(E-选择素)、CD105(Endoglin)、CD146、Endocan(ESM-l)、Endoglyx-l、内皮粘蛋白(Endomucin)、Eotaxin-3、EPAS1(内皮PAS结构域蛋白1)、因子VIII相关抗原、FLI-l、Flk-l(KDR、VEGFR-2)、FLT-l(VEGFR-l)、GATA2、GBP-l(鸟苷酸结合蛋白-l)、GRO-α、HEX、ICAM-2(细胞间粘附分子2)、LM02、LYVE-l、MRB(神奇迂回(magic roundabout))、核仁素、PAL-E(病理解剖学Leiden-内皮(pathologische anatomie Leiden-endothelium))、RTK、sVCAM-l、TALI、TEM1(肿瘤内皮标志物1)、TEM5(肿瘤内皮标志物5)、TEM7(肿瘤内皮标志物7)、血栓调节蛋白(TM、CD141)、VCAM-l(血管细胞粘附分子-1)(CD106)、VEGF、vWF(冯威里氏因子)、ZO-l、内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)、CD102、CD93、CD184、CD304和DLL4。

在一些实施方案中，内皮细胞被进一步遗传修饰以表达编码可用于治疗病症/疾患或改善所述病症/疾患的症状的感兴趣的蛋白质(诸如但不限于酶、激素、受体、配体或药物)的外源基因。用于遗传修饰内皮细胞的标准方法描述于例如US5,674,722中。

此类内皮细胞可用于提供可用于预防或治疗疾病的多肽或蛋白质的组成型合成和递送。以此方式，多肽被直接分泌到个体的血流或身体其他区域(例如，中枢神经系统)中。在一些实施方案中，内皮细胞可被修饰以分泌胰岛素、凝血因子(例如，因子VIII或冯威里氏因子)、α-l抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素(例如，IL-l、IL-2、IL-3)等。

在某些实施方案中，可以改善内皮细胞在植入的移植物的情况下的性能的方式修饰内皮细胞。非限制性说明性实例包括分泌或表达血栓溶解剂以防止管腔内凝块形成、分泌平滑肌增殖抑制剂以防止由于平滑肌肥大导致的管腔狭窄、以及表达和/或分泌内皮细胞有丝分裂原或自分泌因子以刺激内皮细胞增殖并改善移植物管腔内皮细胞衬里的程度或持续时间。

在一些实施方案中，工程化内皮细胞用于将治疗水平的分泌产物递送至特定器官或肢体。例如，可将体外工程化(转导)的内皮细胞内衬的血管植入物移植到特定的器官或肢体中。转导的内皮细胞的分泌产物将以高浓度递送至灌注组织，从而达到目标解剖位置的预期效果。

在其他实施方案中，内皮细胞被进一步遗传修饰以含有当由血管化肿瘤中的内皮细胞表达时破坏或抑制血管生成的基因。在一些情况下，还可以对内皮细胞进行遗传修饰以表达本文所述的任何一种选择性自杀基因，其允许在完成肿瘤治疗后对移植的内皮细胞进行阴性选择。

在一些实施方案中，将本文所述的内皮细胞(诸如分离的原代内皮细胞或分化的内皮细胞)施用于受体受试者以治疗选自由以下组成的组的血管病症：血管损伤、心血管疾病、血管疾病、外周血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周血管阻塞性疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌注损伤、肢体缺血、中风、神经病变(例如，周围神经病变或糖尿病性神经病变)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松、脑血管疾病、高血压、心绞痛以及冠状动脉疾病引起的心肌梗塞、肾血管性高血压、肾动脉狭窄引起的肾功能衰竭、下肢跛行、其他血管疾患或疾病。

E.上皮细胞

3)视网膜色素上皮(RPE)细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代视网膜色素上皮(RPE)细胞。在一些实施方案中，原代RPE细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得RPE细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代RPE细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代RPE细胞。在一些实施方案中，由RPE细胞库产生原代RPE细胞，使得RPE细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代RPE细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，RPE细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得RPE细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成RPE细胞的工程化iPSC分化的RPE细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成RPE细胞的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

用于将多能干细胞分化成RPE细胞的有用方法在例如US9,458,428和US9,850,463中有所描述，这些文献的公开内容据此通过引用整体(包括说明书)并入本文。用于从人诱导性多能干细胞产生RPE细胞的另外方法可见于例如Lamba等人,PNAS,2006,103(34):12769-12774；Mellough等人,Stem Cells,2012,30(4):673-686；Idelson等人,Cell StemCell,2009,5(4):396-408；Rowland等人,Journal of Cellular Physiology,2012,227(2):457-466、Buchholz等人,Stem Cells Trans Med,2013,2(5):384-393和da Cruz等人,Nat Biotech,2018,36:328-337。

已经使用Kamao等人,Stem Cell Reports 2014:2:205-18(其公开内容据此通过引用整体并入本文)中概述的技术(特别是该文献中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂的技术)使人多能干细胞分化成RPE细胞；还可参见Mandai等人,N Engl J Med,2017,376:1038-1046，其内容对于用于产生RPE细胞片和移植到患者体内的技术据此通过引用整体并入本文。可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容据此整体并且特别是针对结果部分的第一段中所概述的标记通过引用并入本文。

在一些实施方案中，通过体外分化从工程化多能细胞群产生工程化视网膜色素上皮(RPE)细胞群的方法包括：(a)在包含选自由以下组成的组的任一种因子的第一培养基中培养工程化多能细胞群：活化素A、bFGF、BMP4/7、DKK1、IGF1、noggin、BMP抑制剂、ALK抑制剂、ROCK抑制剂和VEGFR抑制剂，以产生前RPE细胞群；以及(b)在与第一培养基不同的第二培养基中培养前RPE细胞群，以产生工程化RPE细胞群。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10pM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容据此整体并且特别是针对结果部分通过引用并入本文。

RPE细胞(包括用其分化和用于本发明技术中的方法)的其他描述可见于WO2020/018615，其公开内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，在施用之前，工程化RPE细胞群(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代RPE细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的RPE细胞)被维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存RPE细胞群。

示例性RPE细胞类型包括但不限于视网膜色素上皮(RPE)细胞、RPE祖细胞、未成熟RPE细胞、成熟RPE细胞、功能性RPE细胞等。

在一些实施方案中，RPE细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代RPE细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的RPE细胞)具有与天然RPE细胞相似或基本相似的基因表达谱。当在平面基底上生长至汇合时，此类RPE细胞可具有天然RPE细胞的多边形、平面片状形态。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化RPE细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代RPE细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的RPE细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化RPE细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化RPE细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化RPE细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化RPE细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化RPE细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代RPE细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的RPE细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化RPE细胞群来治疗疾病的方法。

可将RPE细胞植入患有黄斑变性的患者或具有受损RPE细胞的患者体内。在一些实施方案中，患者患有年龄相关性黄斑变性(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)、湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)、青少年黄斑变性(JMD)(例如，斯塔加特病(Stargardt disease)、贝斯特病(Best disease)和青少年视网膜劈裂)、莱伯氏先天性黑蒙症(Leber's CongenitalAmeurosis)或色素性视网膜炎。在其他实施方案中，患者患有视网膜脱离。

对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。对于细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见"Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,"Morstyn和Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；和"Hematopoietic Stem Cell Therapy,"E.D.Ball、J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。

4)甲状腺细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代甲状腺细胞。在一些实施方案中，原代甲状腺细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得甲状腺细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代甲状腺细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代甲状腺细胞。在一些实施方案中，由甲状腺细胞库产生原代甲状腺细胞，使得甲状腺细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代甲状腺细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，甲状腺细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得甲状腺细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成甲状腺细胞的工程化iPSC分化的甲状腺细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成甲状腺细胞的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。

在一些实施方案中，将含有本文所述的修饰的工程化多能细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官，其可以分泌甲状腺激素来解决自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如Kurmann等人,Cell Stem Cell,2015年11月5日；17(5):527-42，其公开内容据此整体并且特别是针对从人多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂以及针对移植技术通过引用并入本文。可以如本领域已知的那样，通常通过评价甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。

在一些实施方案中，在施用之前，工程化甲状腺细胞群(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代甲状腺细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的甲状腺细胞)被维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存甲状腺细胞群。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化甲状腺细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代甲状腺细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的甲状腺细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化甲状腺细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化甲状腺细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化甲状腺细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化甲状腺细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化甲状腺细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代甲状腺细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的β胰岛细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化内皮细胞群来治疗疾病的方法。

F.肝细胞

在一些实施方案中，如本文所提供的被工程化或修饰的细胞是原代肝细胞。在一些实施方案中，原代肝细胞从一个或多个个体供体受试者中分离或获得，所述一个或多个个体供体受试者诸如一个或多个个体健康供体(例如，不是已知或怀疑患有疾病或感染(例如，未表现出疾病或感染的临床体征)的受试者)。如本领域技术人员将理解的，从个体中分离或获得肝细胞的方法可以使用已知技术来实现。本文提供了含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)的工程化原代肝细胞，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。在一些实施方案中，工程化原代肝细胞可以作为细胞疗法施用，以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。

在一些实施方案中，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、去除或取得)原代肝细胞。在一些实施方案中，由肝细胞库产生原代肝细胞，使得肝细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代肝细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，肝细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得肝细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。

在一些实施方案中，如本文所提供的细胞是从含有本文所述的修饰(例如，遗传修饰)并且分化成肝细胞的工程化iPSC分化的肝细胞。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。在一些实施方案中，可以将分化成肝细胞的细胞用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。在一些实施方案中，从多能干细胞分化的工程化肝细胞可以作为细胞疗法施用，以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。

在一些实施方案中，将含有本文所述的修饰的工程化多能细胞分化成肝细胞。有许多技术可以用于将工程化多能细胞分化成肝细胞；参见例如，Pettinato等人,doi:10.1038/spre32888；Snykers等人,Methods Mol Biol,2011 698:305-314；Si-Tayeb等人,Hepatology,2010,51:297-305；以及Asgari等人,Stem Cell Rev,2013,9(4):493-504，所有这些文献据此整体并且特别是针对分化的方法和试剂通过引用并入本文。可以如本领域已知的那样，通常通过评价肝细胞相关和/或特异性标志物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原。还可以在功能上(诸如氨的代谢、LDL储存和摄取、ICG摄取和释放以及糖原储存)测量分化。

在一些实施方案中，在施用之前，工程化肝细胞群(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代肝细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的肝细胞)被维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存肝细胞群。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化肝细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)中分离的原代肝细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的肝细胞)，所述工程化T细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化肝细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化肝细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化肝细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化肝细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化肝细胞(诸如从一个或多个个体供体(例如，健康供体)分离的原代肝细胞或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的肝细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化肝细胞群来治疗疾病的方法。

G.心脏细胞

本文提供了从HIP细胞分化的心脏细胞类型，用于后续移植或植入到受试者(例如，受体)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性心脏细胞类型包括但不限于心肌细胞、结节心肌细胞、传导心肌细胞、工作心肌细胞、心肌细胞前体细胞、心肌祖细胞、心脏干细胞、心肌细胞、心房心脏干细胞、心室心脏干细胞、心外膜细胞、造血细胞、血管内皮细胞、心内膜内皮细胞、心脏瓣膜间质细胞、心脏起搏细胞等。

在一些实施方案中，将本文所述的心脏细胞施用于受体受试者以治疗选自由以下组成的组的心脏病症：小儿心肌病、年龄相关性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎症性心肌病、特发性心肌病、其他心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌缺血、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心脏缺血、心脏损伤、心肌缺血、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺动脉高压、心律失常、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉变性、心肌炎、感染性心肌炎、药物或毒素引起的肌肉异常、过敏性心肌炎和自身免疫性心内膜炎。

因此，本文提供了用于在有需要的受试者中治疗和预防心脏损伤或心脏病或心脏病症的方法。本文所述的方法可用于治疗、改善、预防多种心脏病或其症状(诸如导致心脏结构和/或功能病理性损伤的那些疾病或其症状)或减缓其进展。术语“心脏病”、“心脏病症”和“心脏损伤”在本文中可互换使用，并且是指与心脏(包括瓣膜、内皮、梗塞区或心脏的其他组件或结构)相关的疾患和/或病症。此类心脏病或心脏相关疾病包括但不限于心肌梗塞、心力衰竭、心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能障碍、心内膜炎、风湿热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、心脏扩大和/或二尖瓣关闭不全等。

在一些实施方案中，心肌细胞前体包括能够产生包括成熟(末期)心肌细胞的后代的细胞。通常可以使用选自GATA-4、Nkx2.5和MEF-2转录因子家族的一种或多种标志物来鉴定心肌细胞前体细胞。在一些情况下，心肌细胞是指表达来自以下列表的一种或多种标志物(有时至少2、3、4或5种标志物)的未成熟心肌细胞或成熟心肌细胞：心肌肌钙蛋白I(cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β2-肾上腺素受体、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心房利尿钠因子(ANF)。在一些实施方案中，心脏细胞表现出自发的周期性收缩活动。在一些情况下，当心脏细胞在具有适当Ca²⁺浓度和电解质平衡的合适组织培养环境中培养时，不必向培养基中添加任何另外的组分就可以观察到细胞沿细胞的一个轴以周期性方式收缩，然后从收缩中释放。在一些实施方案中，心脏细胞是低免疫原性心脏细胞。

在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能(HIP)细胞群产生低免疫原性心脏细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的培养基中培养HIP细胞群；(b)在包含WNT拮抗剂的培养基中培养HIP细胞群以产生前心脏细胞群；和(c)在包含胰岛素的培养基中培养前心脏细胞群以产生免疫低下的心脏细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，WNT拮抗剂是IWR1、其衍生物或其变体。在一些情况下，WNT拮抗剂的浓度范围为约2mM至约10mM。

在一些实施方案中，低免疫原性心脏细胞群与非心脏细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性心脏细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性心脏细胞群并将其冷冻保存。

用于将诱导性多能干细胞或多能干细胞分化成心脏细胞的其他有用方法描述于例如US2017/0152485；US2017/0058263；US2017/0002325；US2016/0362661；US2016/0068814；US9,062,289；US7,897,389；和US7,452,718中。用于从诱导性多能干细胞或多能干细胞产生心脏细胞的另外方法描述于例如Xu等人,Stem Cells and Development,2006,15(5):631-9,Burridge等人,Cell Stem Cell,2012,10:16-28和Chen等人,Stem CellRes,2015,l5(2):365-375中。

在各种实施方案中，低免疫原性心脏细胞可以在包含以下的培养基中培养：BMP途径抑制剂、WNT信号传导活化剂、WNT信号传导抑制剂、WNT激动剂、WNT拮抗剂、Src抑制剂、EGFR抑制剂、PCK活化剂、细胞因子、生长因子、心肌剂、化合物等。

WNT信号传导活化剂包括但不限于CHIR99021。PCK活化剂包括但不限于PMA。WNT信号传导抑制剂包括但不限于选自KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)和SO3042(KY03-I)以及XAV939的化合物。Src抑制剂包括但不限于A419259。EGFR抑制剂包括但不限于AG1478。

用于从iPSC产生心脏细胞的剂的非限制性实例包括活化素A、BMP4、Wnt3a、VEGF、可溶性卷曲蛋白、环孢菌素A、血管紧张素II、去氧肾上腺素、抗坏血酸、二甲基亚砜、5-氮杂-2'-脱氧胞苷等。

本文提供的细胞可以在表面诸如合成表面上培养，以支持和/或促进低免疫原性多能细胞分化成心脏细胞。在一些实施方案中，表面包含聚合物材料，包括但不限于所选的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性实例包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.0^2,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯按照本领域已知的方式合成或从商业供应商获得，诸如Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.和Sartomer,Inc。

可以在心脏冷冻损伤的动物模型中评估如本文所述制备的心脏细胞的功效，所述心脏冷冻损伤导致55％的左心室壁组织在未经治疗的情况下变成疤痕组织(Li等人,Ann.Thorac.Surg.62:654,1996；Sakai等人,Ann.Thorac.Surg.8:2074,1999,Sakai等人,Thorac.Cardiovasc.Surg.118:715,1999)。成功的治疗可以减少疤痕面积，限制疤痕扩张，并改善心脏功能(通过收缩压、舒张压和发展压确定)。还可以使用左前降支的远端部分中的栓塞线圈来对心脏损伤进行建模(Watanabe等人,Cell Transplant.7:239,1998)，并且可以通过组织学和心脏功能来评价治疗功效。

在一些实施方案中，在施用之前，将工程化心脏细胞群(诸如从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的心脏细胞)维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存心脏细胞群。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化心脏细胞(诸如从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的心脏细胞)，所述工程化心脏细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化心脏细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化心脏细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化心脏细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化心脏细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化心脏细胞(诸如或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的心脏细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化心脏细胞群来治疗疾病的方法。

在一些实施方案中，施用包括植入受试者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。

在一些实施方案中，施用了工程化心脏细胞的患者还施用了心脏药物。适用于联合疗法的心脏药物的说明性实例包括但不限于生长因子、编码生长因子的多核苷酸、血管生成剂、钙通道阻断剂、抗高血压剂、抗有丝分裂剂、正性肌力剂、抗动脉粥样硬化剂、抗凝血剂、β-受体阻滞剂、抗心律失常剂、抗炎剂、血管扩张剂、溶栓剂、强心苷、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、原生动物抑制剂、硝酸盐、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、脑钠肽(BNP)；抗肿瘤剂、类固醇等。

可以多种方式监测根据本文提供的方法的治疗效果。例如，可以利用心电图(ECG)或霍特监测器(holier monitor)来确定治疗功效。ECG是心律和电脉冲的量度，并且是一种用于确定治疗是否改善或维持、预防或减缓受试者心脏电传导的退化的非常有效且非侵入性方式。使用可以长时间佩戴的便携式ECG霍特监测器来监测心脏异常、心律失常病症等也是评估治疗有效性的可靠方法。ECG或核研究可用于确定心室功能的改善。

H.神经细胞

本文提供了从所描述的工程化多能细胞(例如，iPSC)分化的不同神经细胞类型，其可用于后续移植或植入到受体受试者中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性神经细胞类型包括但不限于脑内皮细胞、神经元(例如，多巴胺能神经元)、神经胶质细胞等。

在一些实施方案中，诱导性多能干细胞的分化通过将细胞暴露或接触已知产生特定细胞谱系的特定因子来进行，以便将其分化物靶向特定的、期望的谱系和/或感兴趣的细胞类型。在一些实施方案中，终末分化细胞表现出专门的表型特性或特征。在某些实施方案中，本文所述的干细胞分化成神经外胚层、神经元、神经内分泌、多巴胺能、胆碱能、血清素能(5-HT)、谷氨酸能、GABA能、肾上腺素能、去甲肾上腺素能、交感神经元、副交感神经元、交感周围神经元或神经胶质细胞群。在一些情况下，神经胶质细胞群包括小胶质(例如，变形、分支、活化的吞噬和活化的非吞噬)细胞群或大胶质(中枢神经系统细胞：星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和放射状胶质细胞；和周围神经系统细胞：雪旺氏细胞(Schwanncell)和卫星细胞)细胞群，或任何前述细胞的前体和祖细胞。

用于产生不同类型的神经细胞的方案描述于PCT申请号WO2010144696、美国专利号9,057,053；9,376,664；和10,233,422。用于分化低免疫原性多能细胞的方法的另外描述可见于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc NatlAcad Sci USA,2019,116(21),10441-10446。以下参考文献中描述了用于确定神经细胞移植在神经系统病症或疾患的动物模型中的效果的方法：对于脊髓损伤，Curtis等人,CellStem Cell,2018,22,941-950；对于帕金森病(Parkinson’s disease)，Kikuchi等人,Nature,2017,548:592-596；对于ALS–Izrael等人,Stem Cell Research,2018,9(1):152和Izrael等人,IntechOpen,DOI:10.5772/intechopen.72862；对于癫痫，Upadhya等人,PNAS,2019,116(1):287-296。

在一些实施方案中，在施用之前，将工程化神经细胞群(诸如从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的神经细胞)维持在培养物中，在一些情况下被扩增。在某些实施方案中，在施用之前冷冻保存神经细胞群。

在一些实施方案中，本发明技术涉及工程化神经细胞(诸如从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的神经细胞)，所述工程化心脏细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)，并且具有降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)表达或缺乏其表达，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在某些实施方案中，工程化神经细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在B2M基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化神经细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)并且在CIITA基因中包含基因组修饰，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。在一些实施方案中，工程化神经细胞过表达致耐受性因子(例如，CD47)和CAR，并且包含破坏以下基因中的一种或多种的基因组修饰：B2M和CIITA基因，并且具有降低的MICA和/或MICB表达(诸如通过在MICA和/或MICB中包含基因组修饰)。

在一些实施方案中，所提供的工程化神经细胞逃避免疫识别。在一些实施方案中，本文所述的工程化神经细胞(诸如或从源自一个或多个个体供体(例如，健康供体)的iPSC分化的神经细胞)不激活患者(例如，施用后的受体)的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用本文所述的工程化神经细胞群来治疗疾病的方法。

在一些实施方案中，向受试者施用神经细胞以治疗帕金森病、亨廷顿病(Huntington disease)、多发性硬化症、其他神经变性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、其他神经精神障碍。在一些实施方案中，将本文所述的神经细胞施用于受试者以治疗或改善中风。在一些实施方案中，将神经元和神经胶质细胞施用于患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)的受试者。

1)脑内皮细胞

在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在包含促进EC或神经细胞产生的一种或多种因子的培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞)分化。在一些情况下，培养基包含以下中的一种或多种：CHIR-99021、VEGF、碱性FGF(bFGF)和Y-27632。在一些实施方案中，培养基包含被设计用于促进神经细胞的存活和功能性的补充物。

在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在非条件或条件培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞分化。在一些情况下，培养基包含促进或促成分化的因子或小分子。在一些实施方案中，培养基包含选自由以下组成的组的一种或多种因子或小分子：VEGR、FGF、SDF-1、CHIR-99021、Y-27632、SB 431542及其任何组合。在一些实施方案中，用于分化的表面包含一种或多种细胞外基质蛋白。表面可以涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白。可以使细胞在悬浮液中分化，然后将其放入凝胶基质形式(诸如基质胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式)中以促进细胞存活。在一些情况下，如本领域已知的那样，通常通过评价细胞特异性标志物的存在来测定分化。

在一些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由CD31、VE钙粘蛋白及其组合组成的组的因子。在某些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由以下组成的组的一种或多种因子：CD31、CD34、CD45、CD117(c-kit)、CD146、CXCR4、VEGF、SDF-1、PDGF、GLUT-1、PECAM-1、eNOS、封闭蛋白-5、闭锁蛋白、ZO-1、p-糖蛋白、冯威里氏因子(von Willebrandfactor)、VE-钙粘蛋白、低密度脂蛋白受体LDLR、低密度脂蛋白受体相关蛋白1LRP1、胰岛素受体INSR、瘦素受体LEPR、基底细胞粘附分子BCAM、转铁蛋白受体TFRC、晚期糖基化终产物特异性受体AGER、视黄醇摄取受体STRA6、大中性氨基酸转运蛋白小亚基1SLC7A5、兴奋性氨基酸转运蛋白3SLC1A1、钠偶联中性氨基酸转运蛋白5SLC38A5、溶质载体家族16成员1SLC16A1、ATP依赖性转位酶ABCB1、ATP-ABCC2结合盒转运蛋白ABCG2、多药耐药相关蛋白1ABCC1、小管多特异性有机阴离子转运蛋白1ABCC2、多药耐药相关蛋白4ABCC4和多药耐药相关蛋白5ABCC5。

在一些实施方案中，脑EC的特征在于具有选自由以下组成的组的一种或多种特征：紧密连接的高表达、高电阻、低开窗、小血管周围空间、胰岛素和转铁蛋白受体的普遍存在以及高线粒体数量。

在一些实施方案中，使用正选择策略来选择或纯化脑EC。在一些情况下，根据内皮细胞标志物诸如但不限于CD31对脑EC进行分选。换句话说，将CD31阳性脑EC分离出来。在一些实施方案中，使用负选择策略来选择或纯化脑EC。在一些实施方案中，通过选择表达多能性标志物(包括但不限于TRA-1-60和SSEA-1)的细胞来去除未分化或多能干细胞。

在一些实施方案中，施用脑内皮细胞以减轻脑出血的症状或影响。在一些实施方案中，将多巴胺能神经元施用于患有帕金森病的患者。在一些实施方案中，将去甲肾上腺素能神经元、GABA能中间神经元施用于经历过癫痫发作的患者。在一些实施方案中，将运动神经元、中间神经元、雪旺氏细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞施用于经历过脊髓损伤的患者。

2)多巴胺能神经元

在一些实施方案中，本文所述的HIP细胞分化成多巴胺能神经元，包括神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟多巴胺能神经元和成熟多巴胺能神经元。

在一些情况下，术语“多巴胺能神经元”包括表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元细胞，所述酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶。在一些实施方案中，多巴胺能神经元分泌神经递质多巴胺，并且很少或不表达多巴胺羟化酶。多巴胺能(DA)神经元可以表达以下标志物中的一种或多种：神经元特异性烯醇化酶(NSE)、1-芳香族氨基酸脱羧酶、囊泡单胺转运蛋白2、多巴胺转运蛋白、Nurr-l和多巴胺2受体(D2受体)。在某些情况下，术语“神经干细胞”包括沿着神经细胞途径部分分化并表达一种或多种神经标志物(包括例如巢蛋白)的多能细胞群。神经干细胞可以分化成神经元或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“神经祖细胞”包括表达FOXA2和低水平b-微管蛋白但不表达酪氨酸羟化酶的培养细胞。在培养适当的因子诸如本文所述的那些时，此类神经祖细胞具有分化成多种神经元亚型；特别是多种多巴胺能神经元亚型的能力。

在一些实施方案中，将来源于HIP细胞的DA神经元施用于患者，例如人类患者，以治疗神经变性疾病或疾患。在一些情况下，神经变性疾病或疾患选自由帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症组成的组。在其他实施方案中，DA神经元用于治疗或改善神经精神障碍的一种或多种症状，诸如注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病和抑郁症。在其他实施方案中，DA神经元用于治疗DA神经元受损的患者。

在一些实施方案中，DA神经元、其前体和祖细胞通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养干细胞来从多能干细胞分化。促进DA神经元分化、生长、扩增、维持和/或成熟的有用因子和添加剂包括但不限于Wntl、FGF2、FGF8、FGF8a、音猬因子(SHH)、脑源性神经营养因子(BDNF)、转化生长因子a(TGF-a)、TGF-b、白细胞介素1β、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、GSK-3抑制剂(例如，CHIR-99021)、TGF-b抑制剂(例如，SB-431542)、B-27补充剂、dorsomorphin、purmorphamine、noggin、视黄酸、cAMP、抗坏血酸、neurturin、敲除血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、c-kit配体、其修饰形式、其模拟物、其类似物、及其变体。在一些实施方案中，DA神经元在活化或抑制WNT途径、NOTCH途径、SHH途径、BMP途径、FGF途径等的一种或多种因子的存在下分化。分化方案及其详细描述提供于例如US9,968,637、US7,674,620、Kim等人,Nature,2002,418,50-56；Bjorklund等人,PNAS,2002,99(4),2344-2349；Grow等人,Stem Cells Transl Med.2016,5(9):1133-44和Cho等人,PNAS,2008,105:3392-3397，包括实施例、方法、附图和结果的详细描述的公开内容据此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，低免疫原性多巴胺能神经元群体是从非神经元细胞中分离的。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性多巴胺能神经元群体。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性多巴胺能神经元群体并将其冷冻保存。

为了表征和监测DA分化并评估DA表型，可以评价任何数量的分子和遗传标志物的表达。例如，遗传标志物的存在可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。分子标志物的表达可以通过定量方法来确定，诸如但不限于基于qPCR的测定、免疫测定、免疫细胞化学测定、免疫印迹测定等。DA神经元的示例性标志物包括但不限于TH、b-微管蛋白、配对盒蛋白(Pax6)、胰岛素基因增强蛋白(Isl1)、巢蛋白、二氨基联苯胺(DAB)、G蛋白活化的内向整流钾通道2(GIRK2)、微管相关蛋白2(MAP-2)、NURR1、多巴胺转运蛋白(DAT)、叉头盒蛋白A2(FOXA2)、FOX3、双皮质素和LIM同源盒转录因子l-β(LMX1B)等。在一些实施方案中，DA神经元表达选自corin、FOXA2、TuJ1、NURR1及其任何组合的一种或多种标志物。

在一些实施方案中，根据细胞电生理活性评估DA神经元。细胞的电生理学可以通过使用本领域技术人员已知的测定来评价。例如，全细胞和穿孔膜片钳、用于检测细胞电生理活性的测定、用于测量细胞动作电位大小和持续时间的测定、以及用于检测DA细胞的多巴胺产生的功能测定。

在一些实施方案中，DA神经元分化的特征在于自发节律性动作电位和在注入去极化电流后具有尖峰频率适应的高频动作电位。在其他实施方案中，DA分化的特征在于多巴胺的产生。产生的多巴胺水平是通过测量动作电位达到其最大幅度一半(尖峰半最大宽度)时的宽度来计算的。

在一些实施方案中，静脉内或通过注射将分化的DA神经元移植到患者体内的特定位置。在一些实施方案中，将分化的DA细胞移植到大脑的黑质(特别是致密区域中或附近)、腹侧被盖区(VTA)、尾状核、壳核、伏隔核、丘脑底核或其任何组合中，以替代其变性导致帕金森病的DA神经元。分化的DA细胞可以作为细胞悬浮液注射到目标区域中。或者，当包含在此种递送装置中时，可将分化的DA细胞嵌入支持基质或支架中。在一些实施方案中，支架是可生物降解的。在其他实施方案中，支架是不可生物降解的。支架可包含天然或合成(人工)材料。

DA神经元的递送可通过使用合适的媒介物来实现，所述媒介物诸如但不限于脂质体、微粒或微胶囊。在其他实施方案中，分化的DA神经元以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式施用。所述药物组合物是在对于人类施用而言足够无菌的条件下制备的。在一些实施方案中，从HIP细胞分化的DA神经元以药物组合物的形式提供。细胞组合物的治疗制剂的一般原则可见于Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and CellularImmunotherapy,G.Morstyn和W.Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996和Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.Ball、J.Lister和P.Law,Churchill Livingstone,2000，这些文献的公开内容据此通过引用整体并入本文。

对来源于干细胞的神经元及其制备方法的有用描述可见于例如Kirkeby等人,Cell Rep,2012,1:703-714；Kriks等人,Nature,2011,480:547-551；Wang等人,Stem CellReports,2018,11(1):171-182；Lorenz Studer,“Chapter 8-Strategies for BringingStem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial”in Progressin Brain Research,2017,第230卷,第191-212页；Liu等人,Nat Protoc,2013,8:1670-1679；Upadhya等人,Curr Protoc Stem Cell Biol,38,2D.7.1-2D.7.47；美国公布申请号20160115448和US8,252,586；US8,273,570；US9,487,752和US10,093,897，这些文献的内容据此通过引用整体并入本文。

除了DA神经元之外，其他神经元细胞、其前体和祖细胞也可以通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养细胞来从本文概述的HIP细胞分化。因子和添加剂的非限制性实例包括GDNF、BDNF、GM-CSF、B27、碱性FGF、碱性EGF、NGF、CNTF、SMAD抑制剂、Wnt拮抗剂、SHH信号传导活化剂及其任何组合。在一些实施方案中，SMAD抑制剂选自由以下组成的组：SB431542、LDN-193189、Noggin PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、BMP4、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI6、NPC-30345、K 26894、SB-203580、SD-093、活化素-M108A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、dorsomorphin二盐酸盐及其衍生物。在一些实施方案中，Wnt拮抗剂选自由以下组成的组：XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、DKK-4、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-059、LGK974、IWP-L6及其衍生物。在一些实施方案中，SHH信号传导活化剂选自由以下组成的组：平滑激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、C25-SHH、C24-SHH、purmorphamine、Hg-Ag和/或其衍生物。

在一些实施方案中，神经元表达选自由以下组成的组的一种或多种标记：离子型谷氨酸受体NMDA型亚基1GRIN1、谷氨酸脱羧酶1GAD1、γ-氨基丁酸GABA、酪氨酸羟化酶TH、LIM同源盒转录因子1-αLMX1A、叉头盒蛋白O1FOXO1、叉头盒蛋白A2FOXA2、叉头盒蛋白O4FOXO4、FOXG1、2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶CNP、髓磷脂碱性蛋白MBP、微管蛋白β链3TUB3、微管蛋白β链3NEUN、溶质载体家族1成员6SLC1A6、SST、PV、钙结合蛋白、RAX、LHX6、LHX8、DLX1、DLX2、DLX5、DLX6、SOX6、MAFB、NPAS1、ASCL1、SIX6、OLIG2、NKX2.1、NKX2.2、NKX6.2、VGLUT1、MAP2、CTIP2、SATB2、TBR1、DLX2、ASCL1、ChAT、NGFI-B、c-fos、CRF、RAX、POMC、下视丘分泌素、NADPH、NGF、Ach、VAChT、PAX6、EMX2p75、CORIN、TUJ1、NURR1和/或其任何组合。

3)神经胶质细胞

在一些实施方案中，所描述的神经细胞包括神经胶质细胞，诸如但不限于小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和雪旺氏细胞、神经胶质前体及其神经胶质祖细胞是通过将多能干细胞分化成治疗有效的神经胶质细胞等产生的。低免疫原性多能干细胞的分化产生低免疫原性神经细胞，诸如低免疫原性神经胶质细胞。

在一些实施方案中，通过在包含选自由以下组成的组的一种或多种剂的培养基中培养多能干细胞来产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞：视黄酸、IL-34、M-CSF、FLT3配体、GM-CSF、CCL2、TGFβ抑制剂、BMP信号传导抑制剂、SHH信号传导活化剂、FGF、血小板源性生长因子PDGF、PDGFR-α、HGF、IGF1、noggin、SHH、dorsomorphin、noggin及其任何组合。在某些情况下，BMP信号传导抑制剂是LDN193189、SB431542或其组合。在一些实施方案中，神经胶质细胞表达NKX2.2、PAX6、SOX10、脑源性神经营养因子BDNF、神经营养因子-3NT-3、NT-4、EGF、睫状神经营养因子CNTF、神经生长因子NGF、FGF8、EGFR、OLIG1、OLIG2、髓磷脂碱性蛋白MBP、GAP-43、LNGFR、nestin、GFAP、CD11b、CD11c、CX3CR1、P2RY12、IBA-1、TMEM119、CD45及其任何组合。示例性分化培养基可以包括可促进或能够产生本领域技术人员所认识的神经胶质细胞类型的任何特定因子和/或小分子。

为了确定根据体外分化方案产生的细胞是否表现出神经胶质细胞的特性和特征，可将细胞移植到动物模型中。在一些实施方案中，将神经胶质细胞注射到免疫受损的小鼠，例如免疫受损的shiverer小鼠中。将神经胶质细胞施用于小鼠的大脑中，并在预先选择的时间后对植入的细胞进行评价。在一些情况下，通过使用免疫染色和成像方法来使大脑中的植入细胞可视化。在一些实施方案中，确定神经胶质细胞表达已知的神经胶质细胞生物标志物。

用于从干细胞产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞的有用方法可见于例如US7,579,188；US7,595,194；US8,263,402；US8,206,699；US8,252,586；US9,193,951；US9,862,925；US8,227,247；US9,709,553；US2018/0187148；US2017/0198255；US2017/0183627；US2017/0182097；US2017/253856；US2018/0236004；WO2017/172976；和WO2018/093681。用于分化多能干细胞的方法描述于例如Kikuchi等人,Nature,2017,548,592-596；Kriks等人,Nature,2011,547-551；Doi等人,Stem Cell Reports,2014,2,337-50；Perrier等人,Proc Natl Acad Sci USA,2004,101,12543-12548；Chambers等人,Nat Biotechnol,2009,27,275-280；和Kirkeby等人,Cell Reports,2012,1,703-714。

神经细胞移植对于脊髓损伤的功效可在例如急性脊髓损伤的大鼠模型中进行评估，如McDonald等人,Nat.Med.,1999,5:1410)和Kim等人,Nature,2002,418:50所述。例如，成功的移植可能会显示2-5周后病灶处存在移植源细胞，分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并从病灶端沿着脊髓迁移，步态、协调性和负重能力改善。基于神经细胞类型和待治疗的神经疾病或疾患选择特定的动物模型。

神经细胞可以允许它们植入到预期组织部位并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。例如，根据所治疗的疾病，神经细胞可以直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位。在一些实施方案中，通过静脉内、脊柱内、脑室内、鞘内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内、腹内、眼内、球后及其组合将本文所述的任何神经细胞(包括脑内皮细胞、神经元、多巴胺能神经元、室管膜细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞)注射到患者体内。在一些实施方案中，细胞以推注或连续输注的形式注射或沉积。在某些实施方案中，神经细胞通过注射到脑内、脑部附近、及其组合来施用。例如，可通过在受试者的头骨中开的钻孔来进行注射。向脑施用神经细胞的合适位点包括但不限于脑室、侧脑室、小脑延髓池、壳核、基底核、海马皮层、纹状体、脑尾状区及其组合。

用于本技术的包括多巴胺能神经元的神经细胞的另外描述可见于WO2020/018615，其公开内容据此通过引用整体并入本文。

4.ABO血型与Rh抗原表达

根据人体内每个红细胞表面是否存在抗原(ABO血型)，血液制品可分成不同的组。A、B、AB和Al抗原是通过红细胞糖蛋白上的寡糖序列来决定。血型抗原组中的基因提供了制造抗原蛋白的指令。血型抗原蛋白在红细胞的细胞膜内发挥多种功能。这些蛋白质功能包括将其他蛋白质和分子转运进出细胞、维持细胞结构、附着到其他细胞和分子以及参与化学反应。

恒河猴(Rhesus)因子(Rh)血型是仅次于ABO血型系统的第二重要血型系统。Rh血型系统由49种确定的血型抗原组成，其中五种抗原D、C、c、E和e是最重要的。个体的Rh(D)状态通常在ABO型后用阳性或阴性后缀描述。术语“Rh因子”、“Rh阳性”和“Rh阴性”仅指Rh(D)抗原。Rh抗原的抗体可能参与溶血性输血反应，抗Rh(D)和Rh(c)抗原的抗体会给胎儿和新生儿带来重大的溶血病风险。ABO抗体在每个人的生命早期都会产生。然而，Rh-人体内的恒河猴抗体通常仅在人致敏时才会产生。举例来说，通过生下Rh+婴儿或通过接受Rh+输血可能会发生这种情况。

A、B、H和Rh抗原是血液、组织和细胞移植供体与受体之间组织相容性的主要决定因素。ABO基因编码的糖基转移酶活性负责产生A、B、AB、O组织血型抗原，这些抗原显示在细胞表面上。A型个体编码具有产生a(l,3)N-乙酰半乳糖氨基转移酶活性的特异性的ABO基因产物，并且B型个体编码具有产生a(l,3)半乳糖基转移酶活性发特异性的ABO基因产物。O型个体根本不产生功能性半乳糖基转移酶，因此不产生任一修饰。AB型个体各自拥有一个拷贝，并产生两种类型的修饰。ABO基因的酶产物作为底物作用于H抗原，因此缺乏ABO活性的O型个体呈现未修饰的H抗原，并因此通常称为O(H)型。

H抗原本身是由FUTI基因编码的a(l,2)岩藻糖基转移酶的产物。在非常罕见的个体中，由于FUTI基因的破坏而完全丧失了H抗原，并且不存在ABO产生A或B组织血型的底物。据说这些个体属于孟买(Bombay)组织血型。Rh抗原是由RHD基因编码，并且Rh阴性的个体携带RHD基因的缺失或破坏。

在一些实施方案中，本文提供的细胞或细胞群是ABO O型Rh因子阴性的。在一些实施方案中，本文所述的ABO O型Rh因子阴性细胞源自ABO O型Rh因子阴性供体。在一些实施方案中，本文所述的ABO O型Rh因子阴性细胞被工程化以缺乏ABO A型、ABO B型或Rh因子抗原的呈递。在一些实施方案中，ABO O型和/或Rh阴性细胞包含ABO基因的部分或完全失活(例如，通过ABO基因的有害变异或通过插入ABO基因的外显子6 258delG变异)，并且/或者RHD基因的表达被RHD基因的有害变异部分或完全失活。在一些实施方案中，ABO O型Rh阴性细胞包含FUT1基因的部分或完全失活，并且/或者RHD基因的表达被RHD基因的有害变异部分或完全失活。在一些实施方案中，使用基因编辑产生工程化ABO O型和/或Rh因子阴性细胞，以修饰例如A型细胞至O型细胞、B型细胞至O型细胞、AB型细胞至O型细胞、A+型细胞至O-型细胞、A-型细胞至O-型细胞、AB+型细胞至O-型细胞、AB-型细胞至O-型细胞、B+型细胞至O-型细胞、和B-型细胞至O-型细胞。WO2021/146222(其内容据此通过引用整体并入本文)中描述了示例性的工程化ABO O型Rh因子阴性细胞及其产生方法。

5.性染色体

在某些方面，具有性染色体的细胞可以表达某些抗原(例如，Y抗原)，并且受体可能对此类抗原具有预先存在的敏感性。例如，在一些实施方案中，已经怀上男性胎儿的女性可能排斥来自男性供体的细胞。因此，在一些实施方案中，供体是男性，并且受体是男性。在一些实施方案中，供体是女性，并且受体是女性。在一些实施方案中，工程化细胞包含降低抗原(诸如原钙粘蛋白Y和/或神经连接蛋白Y)表达的修饰。在一些实施方案中，编码原钙粘蛋白Y的基因(PCDH11Y；Ensembl ID ENSG00000099715)在工程化细胞中降低或消除，例如敲除。在一些实施方案中，编码神经连接蛋白Y的基因(NLGN4Y；Ensembl IDENSG00000165246)在工程化细胞中降低或消除，例如敲除。可以使用任何用于降低或消除基因表达的方法，诸如本文所述的任何一种。在一些实施方案中，通过诸如使用CRISPR/Cas系统的核酸酶介导的基因编辑方法在工程化细胞中降低或消除PCDH11Y和/或NLGN4Y。

D.工程化细胞的示例性实施方案

在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种MHC I类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种MHC II类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和MICB表达。在一些实施方案中，工程化原代细胞是恒河猴因子阴性的(Rh-)。

在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的B2M表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的CIITA表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的NLRC5表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种B2M和CIITA分子的表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种B2M和NLRC5分子的表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种CIITA和NLRC5分子的表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47表达以及降低的一种或多种B2M、CIITA和NLRC5分子的表达。本文所述的任何细胞还可以表现出一种或多种因子的表达增加，所述一种或多种因子选自包括但不限于以下的组：DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)。在一些实施方案中，因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和MICB表达。在一些实施方案中，工程化原代细胞是恒河猴因子阴性的(Rh-)。

在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种MHC I类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种MHC II类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达、增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子表达以及降低的一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的B2M表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的CIITA表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的NLRC5表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种B2M和CIITA分子的表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种B2M和NLRC5分子的表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种CIITA和NLRC5分子表达。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和/或MICB表达，增加的CD47和至少一种其他致耐受性因子的表达、以及降低的一种或多种B2M、CIITA和NLRC5分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子包括选自下组的任何一种，该组包括但不限于：DUX4、B2M-HLA-E、CD35、CD52、CD16、CD52、CD47、CD46、CD55、CD59、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8、SERPINB9、CD35、IL-39、CD16Fc受体、IL15-RF和H2-M3(包括其任何组合)。在一些实施方案中，致耐受性因子是CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FasL、Serpinb9、CD200和Mfge8(包括其任何组合)中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞及其群体表现出降低的MICA和MICB表达。在一些实施方案中，工程化原代细胞是恒河猴因子阴性的(Rh-)。

本领域技术人员将理解，表达水平(诸如增加或降低的基因、蛋白质或分子表达)可以参考可比较的细胞或与之进行比较。在一些实施方案中，具有增加的CD47表达的工程化干细胞是指与未修饰的干细胞相比CD47蛋白水平更高的修饰的干细胞。

在一个实施方案中，本文提供了工程化细胞(例如，原代细胞)，其表达外源CD47多肽并且具有降低的一种或多种MHC I类分子、一种或多种MHC II类分子、或一种或多种MHCI类分子和一种或多种MHC II类分子的任何组合的表达。在一些实施方案中，一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的组分被减少，例如一种或多种MHC I类分子的B2M被减少。在另一个实施方案中，细胞表达外源CD47多肽并且表达降低水平的B2M和CIITA多肽。在一些实施方案中，细胞表达外源CD47多肽并且具有修饰，诸如B2M和CIITA基因的遗传修饰。在一些情况下，修饰(诸如遗传修饰)使B2M和CIITA基因失活。在一些实施方案中，工程化原代细胞是ABO血型O型。在一些实施方案中，工程化原代细胞是恒河猴因子阴性的(Rh-)。

在一些实施方案中，本文提供了产生工程化细胞的方法，其中所述方法包括降低或消除细胞中MICA和/或MICB的表达；降低或消除B2M的表达；以及增加CD47的表达(例如，过表达)。在一些实施方案中，方法包括引入降低或消除MICA表达的修饰。在一些实施方案中，降低或消除MICA表达的修饰包括MICA基因的两个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低或消除MICA的修饰包括细胞中所有MICA编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，失活或破坏包括MICA基因中的插入缺失或MICA基因的基因组DNA连续段的缺失。在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。在一些实施方案中，MICA基因被敲除。在一些实施方案中，降低或消除MICA表达的修饰包括通过核酸酶介导的基因编辑降低或消除MICA蛋白表达。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或靶向MICA基因的CRISPR-Cas组合来进行，任选地其中所述Cas是Cas9。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，并且CRISPR-Cas组合包含具有与MICA基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方案中，方法包括引入降低或消除MICB表达的修饰。在一些实施方案中，降低或消除MICB表达的修饰包括MICB基因的两个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低或消除MICB的修饰包括细胞中所有MICB编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，失活或破坏包括MICB基因中的插入缺失或MICB基因的基因组DNA连续段的缺失。在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。在一些实施方案中，MICB基因被敲除。在一些实施方案中，降低或消除MICB表达的修饰包括通过核酸酶介导的基因编辑降低或消除MICB蛋白表达。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或靶向MICB基因的CRISPR-Cas组合来进行，任选地其中所述Cas是Cas9。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，并且CRISPR-Cas组合包含具有与MICB基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方案中，方法包括引入降低或消除B2M表达的修饰。在一些实施方案中，降低或消除B2M表达的修饰包括B2M基因的两个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低或消除B2M的修饰包括细胞中所有B2M编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，失活或破坏包括B2M基因中的插入缺失或B2M基因的基因组DNA连续段的缺失。在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。在一些实施方案中，B2M基因被敲除。在一些实施方案中，降低或消除B2M表达的修饰包括通过核酸酶介导的基因编辑降低或消除B2M蛋白表达。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过靶向B2M基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行，任选地其中所述Cas是Cas9。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，并且CRISPR-Cas组合包含具有与B2M基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方案中，方法还包括降低或消除细胞中CIITA的表达。在一些实施方案中，方法包括引入降低或消除CIITA表达的修饰。在一些实施方案中，降低或消除CIITA表达的修饰包括CIITA基因的两个等位基因的失活或破坏。在一些实施方案中，降低或消除CIITA的修饰包括细胞中所有CIITA编码序列的失活或破坏。在一些实施方案中，失活或破坏包括CIITA基因中的插入缺失或CIITA基因的基因组DNA连续段的缺失。在一些实施方案中，插入缺失是移码突变。在一些实施方案中，CIITA基因被敲除。在一些实施方案中，增加CD47表达的修饰包括与启动子连接的编码CD47蛋白的外源多核苷酸。在一些实施方案中，编码CD47的外源多核苷酸被整合到工程化细胞的基因组中。在一些实施方案中，整合是通过靶向插入到细胞的靶基因组基因座中进行的，任选地其中所述靶向插入是通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑进行的。在一些实施方案中，降低一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达的修饰是通过核酸酶介导的基因编辑进行的。在一些实施方案中，核酸酶介导的基因编辑是通过靶向靶基因组基因座的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合进行的，任选地其中所述Cas是Cas9。在一些实施方案中，增加表达的修饰包括增加的表面表达，并且/或者降低表达的修饰包括降低的表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞是低免疫原性细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自β胰岛细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、视网膜色素上皮细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞和血细胞(例如，浆细胞或血小板)。在一些实施方案中，工程化细胞选自T细胞和NK细胞，并且还包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，工程化细胞是ABO血型O型。在一些实施方案中，工程化细胞是恒河猴因子阴性的(Rh-)。

E.低免疫原性表型的测定

在一些实施方案中，所提供的工程化细胞被修饰，使得它们在施用于患者(例如，受体受试者)时能够逃避免疫识别和免疫反应。所述细胞可以逃避免疫细胞在体外和体内的杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避巨噬细胞和NK细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。

确定本文提供的工程化细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞移植动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或Xcelligence分析的杀伤测定、混合淋巴细胞反应和免疫荧光分析。

在一些实施方案中，一旦工程化细胞已经如本文所述被修饰或产生，就可以测定它们的低免疫原性。可以使用多种测定中的任何一种来评估细胞是否是低免疫原性的或可以逃避免疫系统。示例性测定包括WO2016183041和WO2018132783中所述的任何一种。

在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞在宿主中存活一周或更长时间而不刺激宿主免疫反应(例如，一周、两周、一个月、两个月、三个月、6个月、一年、两年、三年、四年、五年或更长时间，例如持续细胞和/或其后代的寿命)。只要细胞在宿主中存活，它们就保持转基因的表达和/或靶基因的表达缺失或降低。在一些方面，如果转基因不再被表达并且/或者如果靶基因被表达，则工程化细胞可以被宿主的免疫系统移除。在一些实施方案中，工程化细胞的持久性或存活可以在其施用于受体之后通过进一步表达编码蛋白质的转基因来监测，所述蛋白质允许细胞在体内被检测到(例如，荧光蛋白，诸如GFP、截短的受体或其他替代标记或其他可检测标记)。

如在WO2016183041和WO2018132783中所述，一旦已经产生了低免疫原性细胞，就可以对它们的低免疫原性、植入和功能进行测定。

低免疫原性细胞以允许它们植入到预期组织部位并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。在一些实施方案中，测定低免疫原性细胞的植入(例如，成功植入)。在一些实施方案中，在预先选定量的时间之后评价低免疫原性细胞的植入。在一些实施方案中，监测植入细胞的细胞存活。例如，可以通过生物发光成像(BLI)监测细胞存活，其中用荧光素酶表达构建体转导细胞以监测细胞存活。在一些实施方案中，植入的细胞通过本领域已知的免疫染色和成像方法可视化。在一些实施方案中，植入的细胞表达已知的生物标记，所述生物标记可以被检测以确定成功植入。例如，流式细胞术可以用于确定特定生物标记的表面表达。在一些实施方案中，将低免疫原性细胞按照预期植入到预期的组织部位(例如，低免疫原性细胞的成功植入)。在一些实施方案中，根据需要将低免疫原性细胞植入到预期的组织部位，诸如在细胞缺陷的部位。在一些实施方案中，将低免疫原性细胞以与非工程化细胞(例如，不包含修饰的细胞)将被植入到预期组织部位相同的方式植入到预期组织部位。在一些实施方案中，测定低免疫原性细胞的功能。在一些实施方案中，在其植入到预期组织部位之前，测定低免疫原性细胞的功能。在一些实施方案中，在植入到预期组织部位后测定低免疫原性细胞的功能。在一些实施方案中，在预先选定的量之后评价低免疫原性细胞的功能。在一些实施方案中，通过细胞产生可检测表型的能力来评价植入细胞的功能。例如，可以基于因糖尿病而失去的葡萄糖控制的恢复来评价植入的β胰岛细胞的功能。在一些实施方案中，低免疫原性细胞的功能是预期的(例如，低免疫原性细胞成功发挥功能，同时避免抗体介导的排斥)。在一些实施方案中，低免疫原性细胞的功能根据需要而定，诸如在细胞缺陷部位具有足够功能，同时避免抗体介导的排斥。在一些实施方案中，低免疫原性细胞以与非工程化细胞(例如，不包含修饰的细胞)将发挥功能相同的方式发挥功能，同时避免抗体介导的排斥。

在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如，畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫反应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞反应。使用FACS或Luminex来评估B细胞反应或抗体反应。另外或可替代地，可以测定细胞避免先天免疫反应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中通常所示。

可以执行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来确定低免疫原性细胞的存活率和免疫原性。在一些情况下，将低免疫原性细胞移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，移植的低免疫原性细胞在小鼠模型中显示出长期存活。

用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的另外技术描述于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，包括附图、附图说明和方法的描述的公开内容据此通过引用整体并入本文。

如本领域技术人员所理解的，多能细胞中一种或多种MHC I类分子(当细胞来源于人类细胞时为HLA I)功能的成功降低可以使用本领域已知并且如下所述的技术进行测量；例如，使用结合HLA复合物的标记的抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原的α链结合的可商购获得的HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体。

另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。

多能细胞或其衍生物中一种或多种MHC II类分子(当细胞来源于人类细胞时为HLA II)功能的成功降低可以使用本领域已知的技术进行测量，所述技术诸如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、RT-PCR技术等。

另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行(例如参见WO2018132783的图21)并且通常基于与人HLAII类分子HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商用抗体使用蛋白质印迹或FACS分析来进行。

除了HLA I和II(或一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II类分子)降低之外，本文提供的低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的敏感性降低。由于一种或多种CD24转基因的表达，由此产生的低免疫原性细胞“逃脱”了免疫巨噬细胞和先天途径。

D.工程化细胞群和组合物，诸如药物组合物

本文提供了含有多种本文所述的任何工程化细胞的工程化细胞群。在一些情况下，细胞群包含细胞混合物。在一些情况下，群体中至少约30％的细胞包含本文所述的一组修饰。在一些情况下，细胞群包含一种或多种不同的细胞类型。

在一些实施方案中，群体包含胰岛细胞的混合物。在一些实施方案中，群体包含胰岛细胞的混合物，包括选自由以下组成的组的两种或更多种不同的细胞类型：胰腺β细胞、胰腺α细胞和胰腺γ细胞。在一些情况下，群体包含胰腺α、β和γ细胞。在一些情况下，群体包含原代细胞。在一些实施方案中，群体包含从干细胞或祖细胞分化的细胞(例如，从诱导多能干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞、生殖干细胞、肺干细胞、脐带血干细胞、多能干细胞(PSC)和多能性干细胞分化的细胞)。

在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的工程化细胞包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的细胞不具有MICA多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽的细胞表面表达。在一些实施方案中，工程化细胞上降低的MICB多肽表面表达被降低至相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞的MICB多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％的细胞不具有MICB多肽的细胞表面表达。

在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码一种或多种致耐受性因子的外源多核苷酸。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸。

在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和CIITA表达。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使B2M基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。在一些实施方案中，相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使CIITA基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICA细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICA细胞表面表达被降低至比在被工程化以降低MICA细胞表面表达之前的MICA细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICA细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICA细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的MICA细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不具有MICA的细胞表面表达(包括不可检测的细胞表面表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA蛋白质表达水平被降低至比在被工程化以降低MICA蛋白质表达之前的MICA蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA蛋白质表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICA蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICA的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICA蛋白(包括不可检测的MICA蛋白)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA mRNA表达水平被降低至比在被工程化以降低MICAmRNA表达之前的MICA mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA mRNA表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICA mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICA的mRNA表达(包括不可检测的mRNA表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICA mRNA(包括不可检测的MICA mRNA)。在一些实施方案中，工程化细胞群包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达、以及增加的一种或多种如本文所述的致耐受性因子表达。

在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICB细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICB细胞表面表达被降低至比在被工程化以降低MICB细胞表面表达之前的MICB细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICB细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICB细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的MICB细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不具有MICB的细胞表面表达(包括不可检测的细胞表面表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICB蛋白质表达水平被降低至比在被工程化以降低MICB蛋白质表达之前的MICB蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICB蛋白质表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICB蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICB的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICB蛋白(包括不可检测的MICB蛋白)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICB mRNA表达水平被降低至比在被工程化以降低MICBmRNA表达之前的MICB mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICB mRNA表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICB mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICB的mRNA表达(包括不可检测的mRNA表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICB mRNA(包括不可检测的MICB mRNA)。在一些实施方案中，工程化细胞群包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达、以及增加的一种或多种如本文所述的致耐受性因子表达。

在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICA和MICB细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICA和MICB细胞表面表达被降低至比在被工程化以降低MICA和MICB细胞表面表达之前的MICA和MICB细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞具有降低的MICA和MICB细胞表面表达，使得工程化细胞上的MICA和MICB细胞表面表达被降低至比在参考细胞或参考细胞群上的MICA和MICB细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不具有MICA和MICB的细胞表面表达(包括不可检测的细胞表面表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA和MICB蛋白质表达水平被降低至比在被工程化以降低MICA和MICB蛋白质表达之前的MICA和MICB蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA和MICB蛋白质表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICA和MICB蛋白质表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICA和MICB的蛋白质表达(包括不可检测的蛋白质表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICA和MICB蛋白(包括不可检测的MICA和MICB蛋白)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA和MICB的mRNA表达水平被降低至比在被工程化以降低MICA和MICB的mRNA表达之前的MICA和MICB mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞表现出的MICA和MICB的mRNA表达水平被降低至比参考细胞或参考细胞群的MICA和MICB mRNA表达水平低约60％或更低的水平。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不表现出MICA和MICB的mRNA表达(包括不可检测的mRNA表达)。在一些实施方案中，群体中至少约50％的工程化细胞不包含MICA和MICB mRNA(包括不可检测的MICA和MICB mRNA)。在一些实施方案中，工程化细胞群包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达、以及增加的一种或多种如本文所述的致耐受性因子表达。

本文还提供了包含工程化细胞或工程化细胞群的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂或载剂。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(TWEEN^TM)、泊洛沙姆(PLURONICS^TM)或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，药物组合物包括药学上可接受的缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。在一些实施方案中，药物组合物可以含有一种或多种赋形剂，其用于改变、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解含有细胞的药物组合物可能不同于含有蛋白质的药物组合物。

术语“药物制剂”是指以允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式的配制物，并且其不含有对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。

“药学上可接受的载剂”是指对受试者无毒的药物制剂中活性成分以外的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于：缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂是缓冲溶液，诸如生理盐水，例如适合用于人类施用的生理盐水。

药物组合物在一些实施方案中含有有效治疗或预防疾病或疾患的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的如本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或疾患的量(例如治疗有效量或预防有效量)的如本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，通过对治疗的受试者进行定期评估来监测治疗或预防功效。对于几天或更长时间的重复施用，根据疾患，重复治疗，直到出现期望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的，并且可以被确定。可以通过组合物的单次快速施用、组合物的多次快速施用或组合物的连续输注施用来递送所需剂量。

在一些实施方案中，使用标准施用技术、制剂和/或装置施用如本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，使用标准施用技术、制剂和/或装置施用如本文所述的工程化细胞。提供了用于储存和施用组合物的制剂和装置，诸如注射器和小瓶。可以通过局部注射(包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用)来施用工程化细胞。当施用治疗组合物(例如，含有工程化细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

制剂包括用于静脉内、腹膜内或皮下施用的那些制剂。在一些实施方案中，细胞群是肠胃外施用的。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周系统递送将细胞群施用于受试者。

在一些实施方案中，将组合物作为在一些方面可以缓冲至选定pH的无菌液体制备物提供，所述无菌液体制备物例如等渗水溶液、悬浮液、乳液或分散液。液体组合物在某种程度上更便于施用，尤其是通过注射施用。液体组合物可以包含载剂，其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物的溶剂或分散介质。无菌注射溶液可通过将细胞掺入溶剂中来制备，诸如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。

在一些实施方案中，药学上可接受的载剂可以包括与药物施用相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science and practice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。此类载剂或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物诸如不挥发油。补充性有效化合物也可并入组合物中。药物载剂应该是适合用于工程化细胞的药物载剂，诸如盐水溶液、葡萄糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。在一些实施方案中，用于此类组合物的药学上可接受的载剂或媒介物是任何无毒水溶液，工程化细胞可以在所述无毒水溶液中维持或保持存活足以允许施用活细胞的时间。例如，药学上可接受的载剂或媒介物可以是盐水溶液或缓冲盐水溶液。

在一些实施方案中，包括药物组合物在内的组合物是无菌的。在一些实施方案中，细胞的分离、富集或培养在封闭或无菌环境中(例如并且比如在无菌培养袋中)进行，以使错误、用户操作和/或污染最小化。在一些实施方案中，可以容易地实现无菌，例如通过无菌过滤膜过滤。在一些实施方案中，培养使用气体可渗透培养容器进行。在一些实施方案中，使用生物反应器进行培养。

本文还提供了适合用于冷冻保存所提供的工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，在冷冻保存介质中冷冻保存所提供的工程化细胞。在一些实施方案中，冷冻保存介质是无血清冷冻保存介质。在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，冷冻保存介质是在为或约5％与为或约10％之间的DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约5％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约6％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约7％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约7.5％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约8％DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约9％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质是为或约10％ DMSO(v/v)。在一些实施方案中，冷冻保存介质含有可商购获得的冷冻保存溶液(CryoStor^TMCS10)。CryoStor^TMCS10是含有10％二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保存介质。在一些实施方案中，配制用于冷冻保存的组合物可以在低温(诸如超低温)下储存，例如在-40℃至-150℃范围内(诸如为或约80℃±6.0℃)的温度下储存。

在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的工程化细胞和药学上可接受的载剂，所述载剂包含31.25％(体积/体积)Plasma-Lyte A、31.25％(体积/体积)的5％右旋糖/0.45％氯化钠、10％葡聚糖40(LMD)/5％右旋糖、20％(体积/体积)的25％人血清白蛋白(HSA)和7.5％(体积/体积)二甲基亚砜(DMSO)。

在一些实施方案中，通过解冻制备冷冻保存的工程化细胞用于施用。在一些情况下，可以在解冻之后立即将工程化细胞施用于受试者。在这样的实施方案中，组合物无需任何进一步加工即可使用。在其他情况下，工程化细胞在解冻之后进一步加工，诸如通过用药学上可接受的载剂再悬浮，与活化剂或刺激剂一起孵育，或者在施用于受试者之前活化、洗涤并再悬浮于药学上可接受的缓冲液中。

在一些实施方案中，组合物包含本文所述的任何工程化细胞群，其中(a)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽细胞表面表达，并且其中工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。在一些实施方案中，其中用基于核酸酶的基因编辑对工程化细胞进行工程化。

在一些实施方案中，组合物包含本文所述的任何工程化细胞群，其中(a)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中在工程化细胞上降低的MICB多肽表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。在一些实施方案中，其中用基于核酸酶的基因编辑对工程化细胞进行工程化。

在一些实施方案中，组合物包含本文所述的任何工程化细胞群，其中(a)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICA多肽细胞表面表达，并且其中工程化细胞上降低的MICA多肽表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的MICB多肽细胞表面表达，并且其中在工程化细胞上降低的MICB多肽表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(c)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(d)相对于不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达，并且其中在工程化细胞上降低的一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含一个或多个修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。在一些实施方案中，其中用基于核酸酶的基因编辑对工程化细胞进行工程化。

在一些实施方案中，细胞群或其组合物包含来自超过一个供体受试者的细胞或来自超过一个样品回收物(诸如在同一供体受试者中)的细胞。在一些实施方案中，从超过一个来源汇集获得的工程化细胞以产生细胞群或其组合物。在一些实施方案中，超过一个供体受试者中的每一个都是健康受试者，或者在从供体受试者获得供体样品时没有被怀疑患有疾病或疾患。

E.试剂盒、组分和制品

在一些方面，本文提供了本文所述的方法、装置和系统的试剂盒、组分和组合物(诸如消耗品)。在一些实施方案中，试剂盒包含根据本文的公开内容的使用说明书。

在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的工程化细胞群的试剂盒或组合物。在一些实施方案中，本文提供了试剂盒或组合，所述试剂盒或组合包含：含有多种工程化细胞的细胞群，其中所述工程化细胞包含修饰，所述修饰(i)降低MICA和/或MICB的表达，(ii)增加CD47的表达，和(iii)降低一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子(例如，一种或多种MHC I类人白细胞抗原和/或一种或多种MHC II类人白细胞抗原)的表达，其中增加的表达和降低的表达是相对于不包含修饰的同一细胞类型的细胞而言的。在一些实施方案中，试剂盒的组分可以同时施用。在一些实施方案中，试剂盒的组分可以依次施用。

在本发明的一些实施方案中，提供了含有可用于临床移植疗法(包括细胞疗法)的材料的制品。在一些实施方案中，制品含有可用于治疗细胞缺陷的材料，所述细胞缺陷诸如但不限于糖尿病(例如，I型糖尿病)、血管疾患或疾病、自身免疫性甲状腺炎、肝病(例如，肝硬化)、角膜病(例如，角膜上皮营养不良(Fuchs dystrophy)或先天性遗传性内皮营养不良)、肾病和癌症(例如，B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌)。制品可包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等(例如，玻璃或塑料容器)。通常，容器容纳对同种异体细胞疗法有效的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉输液袋或小瓶)。药物组合物中的至少一种组分是工程化细胞群，诸如本文提供的任何工程化细胞。标签或包装插页说明组合物用于治疗特定疾患。标签或包装插页将还包含将药物组合物施用于患者的说明书。在一些实施方案中，制品包含组合治疗。

制品和/或试剂盒还可以包含包装插页。插页是指通常在治疗产品的商业包装中包括的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。

F.治疗方法

本文提供了与所提供的细胞组合物相关的组合物和方法，所提供的细胞组合物包含本文所述的可用于治疗受试者的疾病或疾患的工程化细胞群。本文提供了通过施用本文所述的工程化细胞群来治疗患者的方法。在一些实施方案中，细胞群被配制用于在药物组合物(诸如本文所述的任何一种)中施用。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及向患有疾病、疾患或病症的受试者施用工程化细胞群或含有工程化细胞群的组合物。本领域技术人员有能力选择如本文所提供的用于特定疾病指征的适当的工程化细胞。在一些实施方案中，以实现疾病或病症的治疗的有效量施用细胞或其药物组合物。用途包括工程化细胞或其药物组合物在此类方法和治疗中的用途以及在制备用于实施此类治疗方法的药物中的用途。在一些实施方案中，方法由此治疗受试者的疾病或疾患或病症。

可以将本文提供的工程化细胞施用于任何合适的患者，包括例如用于治疗疾病或病症的细胞疗法的候选者。用于细胞疗法的候选者包括患有可能潜在地受益于本文提供的受试工程化细胞的治疗效果的疾病或疾患的任何患者。在一些实施方案中，患者是所施用细胞的同种异体受体。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞可有效用于同种异体细胞疗法。受益于本文提供的受试工程化细胞的治疗效果的候选者表现出疾病或疾患的消除、减轻或改善。

在一些实施方案中，如本文所提供的工程化细胞(包括通过本文提供的任何方法产生的那些工程化细胞)可以用于细胞疗法。本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传病症、慢性感染性病、自身免疫性病症、神经病症等。

在一些实施方案中，患者患有细胞缺陷。如本文所用，“细胞缺陷”是指导致患者的细胞群功能障碍或丧失的任何疾病或疾患，其中所述患者不能自然替换或再生所述细胞群。示例性细胞缺陷包括但不限于自身免疫性疾病(例如，多发性硬化症、重症肌无力、类风湿性关节炎、糖尿病和系统性红斑狼疮)、神经退行性疾病(例如，亨廷顿病和帕金森病)、心血管疾患和疾病、血管疾患和疾病、角膜疾患和疾病、肝脏疾患和疾病、甲状腺疾患和疾病以及肾脏疾患和疾病。在一些实施方案中，施用工程化细胞的患者患有癌症。可通过本文提供的工程化细胞治疗的示例性癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。在某些实施方案中，通过施用本文提供的工程化CAR T细胞来治疗癌症患者。

在一些实施方案中，疾病或疾患选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮、1型糖尿病、脱发、乳糜泻、类风湿性关节炎、干燥综合征、妊娠(包括多胎妊娠，包括有或没有并发症的妊娠)。

在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞或包含工程化细胞的组合物可用于治疗对先前移植物(例如，细胞移植物、输血、组织移植物或器官移植物)中存在的一种或多种抗原致敏的患者。在某些实施方案中，先前移植物是同种异体移植物，并且患者对来自所述同种异体移植物的一种或多种同种异体抗原致敏。同种异体移植物包括但不限于同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物或同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者是正在或已经怀孕的致敏患者(例如，正在或已经具有妊娠同种异体免疫，包括多胎妊娠和通常与妊娠相关的任何疾患，包括先兆子痫)。在某些实施方案中，患者对先前移植物中包含的一种或多种抗原致敏，其中所述先前移植物是修饰的人类细胞、组织或器官。在一些实施方案中，修饰的人类细胞、组织或器官是修饰的自体人类细胞、组织或器官。在一些实施方案中，先前移植物是非人类细胞、组织或器官。在示例性实施方案中，先前移植物是修饰的非人类细胞、组织或器官。在某些实施方案中，先前移植物是包含人类组分的嵌合体。在某些实施方案中，先前移植物是CAR T细胞。在某些实施方案中，先前移植物是自体移植物，并且患者对来自自体移植物的一种或多种自体抗原致敏。在某些实施方案中，先前移植物是自体细胞、组织或器官。在某些实施方案中，致敏患者患有过敏症并且对一种或多种过敏原致敏。在示例性实施方案中，患者患有花粉热、食物过敏、昆虫过敏、药物过敏或特应性皮炎。

在一些实施方案中，本文所述的实施方案可用于自体环境，例如工程化细胞(及其使用方法)是自体细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体细胞。

在一些实施方案中，使用所提供的工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物进行治疗的患者接受过先前治疗。在一些实施方案中，工程化细胞或含有工程化细胞的组合物用于治疗与先前治疗相同的疾患。在某些实施方案中，工程化细胞或含有工程化细胞的组合物用于治疗与先前治疗不同的疾患。在一些实施方案中，施用于患者的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物对通过先前治疗进行治疗的相同疾患或疾病的治疗表现出增强的治疗效果。在某些实施方案中，与先前治疗相比，所施用的工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物对患者的疾患或疾病的治疗表现出更长的治疗效果。在示例性实施方案中，与先前治疗相比，所施用的细胞表现出增强的针对癌细胞的效力、功效和/或特异性。在特定实施方案中，工程化细胞是用于治疗癌症的CAR T细胞。

本文提供的方法可以在失败的一线治疗之后用作特定疾患或疾病的二线治疗。在一些实施方案中，先前治疗是治疗无效的治疗。如本文所用，“治疗无效”治疗是指在患者中产生低于期望临床结果的治疗。例如，关于细胞缺陷的治疗，治疗无效的治疗可以是指没有达到期望水平的功能细胞和/或细胞活性来替换患者中的缺陷细胞和/或缺乏治疗持久性的治疗。关于癌症治疗，治疗无效的治疗是指没有达到期望水平的效力、功效和/或特异性的治疗。可以使用本领域已知的任何合适的技术来测量治疗效果。在一些实施方案中，患者对先前治疗产生免疫反应。在一些实施方案中，先前治疗是被患者排斥的细胞、组织或器官移植。在一些实施方案中，先前治疗包括机械辅助治疗。在一些实施方案中，机械辅助治疗包括血液透析或心室辅助装置。在一些实施方案中，患者对机械辅助治疗产生免疫反应。在一些实施方案中，先前治疗包括含有安全开关的治疗细胞群，所述安全开关可以在治疗细胞以不期望的方式生长和分裂时导致它们死亡。在某些实施方案中，由于安全开关诱导治疗细胞死亡，患者产生免疫反应。在某些实施方案中，患者对先前治疗致敏。在示例性实施方案中，如本文所提供的施用的工程化细胞未使患者致敏。

在一些实施方案中，在向有需要的患者提供组织、器官或部分器官移植物之前，施用所提供的工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物。在特定实施方案中，患者不表现出对工程化细胞的免疫反应。在某些实施方案中，将工程化细胞施用于患者以治疗特定组织或器官中的细胞缺陷，随后患者接受用于相同特定组织或器官的组织或器官移植物。在此类实施方案中，工程化细胞治疗作为最终组织或器官替换的桥梁疗法。例如，在一些实施方案中，在接受肝移植之前，患者患有肝病并且接受本文提供的工程化肝细胞治疗。在某些实施方案中，将工程化细胞施用于患者以治疗特定组织或器官中的细胞缺陷，随后患者接受用于不同组织或器官的组织或器官移植物。例如，在一些实施方案中，患者是在接受肾移植之前用如本文所提供的工程化胰腺β细胞进行治疗的糖尿病患者。在一些实施方案中，方法用于治疗细胞缺陷。在示例性实施方案中，组织或器官移植物是心脏移植物、肺移植物、肾移植物、肝移植物、胰腺移植物、肠移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物或骨移植物。

治疗患者的方法通常是通过施用如本文所提供的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物来进行。应当理解，对于本文所述的与细胞和/或治疗时机相关的所有多个实施方案而言，细胞的施用是通过将引入的细胞至少部分定位在期望部位的方法或途径来实现的。可以将细胞直接植入期望部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望部位，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在一些实施方案中，施用细胞以治疗疾病或病症，诸如可以通过细胞疗法减轻的任何疾病、病症、疾患或其症状。

在一些实施方案中，在患者致敏之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周或至少1个月或更长时间施用工程化细胞群或含有工程化细胞群的组合物。在一些实施方案中，在患者被致敏或表现出致敏的特性或特征之后至少1周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更长时间)或更长时间施用工程化细胞群或含有工程化细胞群的组合物。在一些实施方案中，在患者已经接受移植物(例如，同种异体移植物)、已经怀孕(例如，正在或已经具有妊娠同种异体免疫)或致敏或表现出致敏的特性或特征之后至少1个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月或更长时间)或更长时间施用工程化细胞群或含有工程化细胞群的组合物。

在一些实施方案中，向已接受移植物的患者、已经怀孕(例如，正在或已经具有妊娠同种异体免疫)的患者和/或对抗原(例如，同种异体抗原)致敏的患者施用给药方案，所述给药方案包括本文所述的工程化细胞群的第一次剂量施用、第一次剂量后的恢复期和所描述的工程化细胞群的第二次剂量施用。在一些实施方案中，在第一细胞群和第二细胞群中存在的细胞类型复合物是不同的。在某些实施方案中，在第一工程化细胞群和第二工程化细胞群中存在的细胞类型复合物是相同的或基本上等同的。在许多实施方案中，第一工程化细胞群和第二工程化细胞群包含相同的细胞类型。在一些实施方案中，第一工程化细胞群和第二工程化细胞群包含不同的细胞类型。在一些实施方案中，第一工程化细胞群和第二工程化细胞群包含相同百分比的细胞类型。在其他实施方案中，第一工程化细胞群和第二细胞群包含不同百分比的细胞类型。

在一些实施方案中，恢复期在第一次施用工程化细胞群或含有工程化细胞群的组合物后开始，并且在患者体内不再存在或不再可检测到此类细胞时结束。在一些实施方案中，恢复期的持续时间为初始施用细胞后至少1周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更长时间)或更长时间。在一些实施方案中，恢复期的持续时间为初始施用细胞后至少1个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月或更长时间)或更长时间。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物在施用于受试者时是低免疫原性的。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫低下的。在一些实施方案中，与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的免疫反应水平相比，针对工程化细胞的免疫反应被降低了或下降了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物未能在患者体内引发针对工程化细胞的免疫反应。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或含有所述工程化细胞群的组合物在患者中引发降低或更低水平的系统性TH1活化。在一些情况下，由所述细胞引发的系统性TH1活化水平与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的系统性TH1活化水平相比低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物未能在患者体内引发系统性TH1活化。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物在患者体内引发降低或更低水平的外周血单核细胞(PBMC)免疫活化。在一些情况下，由所述细胞引发的PBMC免疫活化水平与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的PBMC免疫活化水平相比低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物未能在患者体内引发PBMC免疫活化。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或含有所述工程化细胞群的组合物在患者中引发降低或更低水平的供体特异性IgG抗体。在一些情况下，由所述细胞引发的供体特异性IgG抗体水平与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的供体特异性IgG抗体水平相比低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的工程化细胞群无法在患者中引发供体特异性IgG抗体。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或含有所述工程化细胞群的组合物在患者中引发降低或更低水平的IgM和IgG抗体产生。在一些情况下，由所述细胞引发的IgM和IgG抗体产生水平与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的IgM和IgG抗体产生水平相比低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物未能在患者体内引发IgM和IgG抗体产生。

在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或含有所述工程化细胞群的组合物在患者中引发降低或更低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些情况下，由所述细胞引发的细胞毒性T细胞杀伤水平与通过施用免疫原性细胞(例如，相同或相似细胞类型或表型的但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群)所产生的细胞毒性T细胞杀伤水平相比低了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所施用的工程化细胞群或包含所述工程化细胞群的组合物未能在患者体内引发细胞毒性T细胞杀伤。

如上文所讨论，本文提供了细胞，所述细胞在某些实施方案中可以被施用于对同种异体抗原(诸如人白细胞抗原)致敏的患者。在一些实施方案中，患者正在或已经怀孕，例如具有妊娠同种异体免疫(例如，胎儿和新生儿溶血病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性粒细胞减少症(NAN)或胎儿和新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT))。换句话说，患者患有或已经患有与妊娠同种异体免疫相关的病症或疾患，诸如但不限于胎儿和新生儿溶血病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性粒细胞减少症(NAN)、以及胎儿和新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。在一些实施方案中，患者已经接受了同种异体移植物，诸如但不限于同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物或同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者表现出针对同种异体抗原的记忆B细胞。在一些实施方案中，患者表现出针对同种异体抗原的记忆T细胞。此类患者可以表现出针对同种异体抗原的记忆B细胞和记忆T细胞。

在施用所描述的细胞后，与对非低免疫原性的细胞的反应相比，患者不表现出系统性免疫反应或表现出降低水平的系统性免疫反应。在一些实施方案中，与对非低免疫原性的细胞的反应相比，患者不表现出适应性免疫反应或表现出降低水平的适应性免疫反应。在一些实施方案中，与对非低免疫原性的细胞的反应相比，患者不表现出先天免疫反应或表现出降低水平的先天免疫反应。在一些实施方案中，与对非低免疫原性的细胞的反应相比，患者不表现出T细胞反应或表现出降低水平的T细胞反应。在一些实施方案中，与对非低免疫原性的细胞的反应相比，患者不表现出B细胞反应或表现出降低水平的B细胞反应。

在一些实施方案中，提供了使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用本文所述的工程化细胞群或本文所述的组合物。在一些实施方案中，疾患是疾病或细胞缺陷。在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、乳糜泻、格雷夫斯病、银屑病和结肠炎。在一些实施方案中，疾病是狼疮(诸如系统性红斑狼疮)。在一些实施方案中，疾病是多发性硬化症。在一些实施方案中，疾病是桥本氏病。在一些实施方案中，个体正在接受针对疾病或疾患的治疗，并且所述个体还患有狼疮(诸如系统性红斑狼疮)。在一些实施方案中，个体正在接受针对疾病或疾患的治疗，并且所述个体还患有多发性硬化症。在一些实施方案中，个体正在接受针对疾病或疾患的治疗，并且所述个体还患有桥本氏病。在一些实施方案中，个体在循环中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体。在一些实施方案中，个体表现出抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的持续存在。在一些实施方案中，个体患有导致抗MICA抗体和/或抗MICB抗体存在的自身免疫相关疾患。在一些实施方案中，自身免疫相关疾患是桥本氏病。

在一些实施方案中，基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。在一些实施方案中，方法还包括基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在选择个体进行治疗。在一些实施方案中，选择个体还包括测量个体中抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在。

在一些实施方案中，本文提供了使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括：(a)确定个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，其中阳性抗MICA抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICA抗体，并且其中阳性抗MICB抗体状态指示来自个体的血清样品中存在抗MICB抗体；和(b)基于抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，向个体施用包含本文所述的工程化细胞群的组合物或本文所述的组合物，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA表达，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICB表达，并且其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA和MICB表达。在一些实施方案中，方法还包括基于个体的抗MICA抗体状态和/或抗MICB抗体状态选择个体进行治疗。在一些实施方案中，方法还包括测量个体的抗MICA抗体状态和/或抗MICB抗体状态。

在一些实施方案中，提供了鉴定适用于有需要的个体的同种异体疗法的方法，其中所述同种异体疗法包含含有本文所述的工程化细胞群的组合物或本文所述的组合物，所述方法包括确定个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态以鉴定适用于在所述个体中使用的同种异体疗法，其中如果抗MICA抗体状态为阳性，合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA表达的群体的工程化细胞，其中如果抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICB表达的群体的工程化细胞，并且其中如果抗MICA抗体状态和抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA和MICB表达的群体的工程化细胞。

在一些实施方案中，其中造血疾病或病症是脊髓发育不良、再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞病、戴-布二氏贫血、沙赫曼戴蒙氏病、科斯特曼综合征、慢性肉芽肿病、肾上腺脑白质营养不良、白细胞粘附缺陷、血友病、地中海贫血、β-地中海贫血、白血病诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性(髓系)白血病(AML)、成人淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性髓系白血病(CML)、幼年型慢性髓性白血病(CML)和幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、严重联合免疫缺陷病(SCID)、X连锁严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽肿病、Chediak-Higashi综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或AIDS。

在一些实施方案中，自身免疫性疾病或疾患是急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增殖综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病、巴洛同心硬化症、贝赫切特综合征、伯杰氏病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈病、德库姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、附着点炎相关性关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化纤维发育不良、纤维化肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线性IgA病(LAD)、卢伽雷氏病、狼疮性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、米勒-费雪综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆哈-哈伯曼病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、视神经鞘炎、神经性肌强直、眼部瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、甲状腺炎、回文性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、拉斯穆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳氏病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、斯威特综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，细胞缺陷与糖尿病相关，或者细胞疗法用于治疗糖尿病(诸如I型糖尿病)，其中所述细胞群是胰岛细胞(包括β胰岛细胞)群体。在一些实施方案中，胰岛细胞选自由以下组成的组：胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞和成熟胰岛细胞。

在一些实施方案中，细胞缺陷与血管疾患或疾病相关，或者细胞疗法用于治疗血管疾患或疾病，其中所述细胞群是内皮细胞群。

在一些实施方案中，细胞缺陷与自身免疫性甲状腺炎相关，或者细胞疗法用于治疗自身免疫性甲状腺炎，其中所述细胞群是甲状腺祖细胞群。

在一些实施方案中，细胞缺陷与肝病相关，或者细胞疗法用于治疗肝病，其中所述肝病包括肝硬化。在一些实施方案中，细胞群是肝细胞群或肝祖细胞群。

在一些实施方案中，细胞缺陷与角膜疾病相关，或者细胞疗法用于治疗角膜疾病(诸如角膜上皮营养不良或先天性遗传性内皮营养不良)，其中所述细胞群是角膜内皮祖细胞群或角膜内皮细胞群。

在一些实施方案中，细胞缺陷与肾病相关，或者细胞疗法用于治疗肾病，其中所述细胞群是肾前体细胞群或肾细胞群。

在一些实施方案中，细胞疗法用于治疗癌症(诸如B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌或膀胱癌中的任何一种)，其中所述细胞群是T细胞群或NK细胞群。

1.剂量和给药方案

任何治疗有效量的本文所述的细胞都可以包括在药物组合物中，这取决于所治疗的适应症。细胞的非限制性实例包括原代细胞(例如，原代T细胞)和从所描述的工程化诱导多能干细胞分化的细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x10²、5x10²、1x10³、5x10³、1x10⁴、5x10⁴、1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰或5x10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约1x10²、5x10²、1x10³、5x10³、1x10⁴、5x10⁴、1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰或5x10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约6.0x10⁸个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约8.0x10⁸个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x10²至5x10²、5x10²至1x10³、1x10³至5x10³、5x10³至1x10⁴、1x10⁴至5x10⁴、5x10⁴至1x10⁵、1x10⁵至5x10⁵、5x10⁵至1x10⁶、1x10⁶至5x10⁶、5x10⁶至1x10⁷、1x10⁷至5x10⁷、5x10⁷至1x10⁸、1x10⁸至5x10⁸、5x10⁸至1x10⁹、1x10⁹至5x10⁹、5x10⁹至1x10¹⁰或1x10¹⁰至5x10¹⁰个细胞。在示例性实施方案中，药物组合物包括约1.0x10⁶至约2.5x10⁸个细胞。

在一些实施方案中，药物组合物具有至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、70-80ml、80-90ml或90-100ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有范围为约5ml至约80ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约70ml的体积。在许多实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约50ml的体积。

具体的量/剂量方案将因以下因素而异：个体的体重、性别、年龄和健康状况；制剂、生化性质、生物活性、生物利用度和细胞的副作用以及完整治疗方案中细胞的数量和特性。

在一些实施方案中，药物组合物的剂量包括约10mL至50mL体积的约1.0x10⁵个至约2.5x10⁸个细胞，并且药物组合物以单剂量施用。

在许多实施方案中，细胞为T细胞，并且所述药物组合物包含约2.0x10⁶个至约2.0x10⁸个细胞，诸如但不限于原代T细胞、由工程化诱导多能干细胞分化的T细胞。在一些情况下，所述剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x10⁵至约2.5x10⁸个本文所述的原代T细胞。在若干情况下，所述剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x10⁵至约2.5x10⁸个上文已经描述的原代T细胞。在各种情况下，所述剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x10⁵至约2.5x10⁸个本文所述的从工程化诱导性多能干细胞分化的T细胞。在其他情况下，所述剂量的范围低于约1.0x10⁵至约2.5x10⁸个T细胞，包括原代T细胞或从工程化诱导性多能干细胞分化的T细胞。在其他情况下，所述剂量的范围高于约1.0x10⁵至约2.5x10⁸个T细胞，包括原代T细胞和从工程化诱导性多能干细胞分化的T细胞。

在一些实施方案中，药物组合物作为单一剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约1.0x10⁵至约1.0x10⁷个工程化细胞(诸如原代细胞或从工程化诱导性多能干细胞分化的细胞)/kg体重。在一些实施方案中，药物组合物作为单一剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x10⁵至约1.0x10⁷、约1.0x10⁵至约1.0x10⁷、约1.0x10⁵至约1.0x10⁷、约5.0x10⁵至约1x10⁷、约1.0x10⁶至约1x10⁷、约5.0x10⁶至约1.0x10⁷、约1.0x10⁵至约5.0x10⁶、约1.0x10⁵至约1.0x10⁶、约1.0x10⁵至约5.0x10⁵、约1.0x10⁵至约5.0x10⁶、约2.0x10⁵至约5.0x10⁶、约3.0x10⁵至约5.0x10⁶、约4.0x10⁵至约5.0x10⁶、约5.0x10⁵至约5.0x10⁶、约6.0x10⁵至约5.0x10⁶、约7.0x10⁵至约5.0x10⁶、约8.0x10⁵至约5.0x10⁶或约9.0x10⁵至约5.0x10⁶个细胞/kg体重。在一些实施方案中，剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.2x10⁶至约5.0x10⁶个细胞/kg体重。在许多实施方案中，剂量对于50kg或更轻的受试者在低于约0.2x10⁶至约5.0x10⁶个细胞/kg体重的范围内。在许多实施方案中，剂量对于50kg或更轻的受试者在高于约0.2x10⁶至约5.0x10⁶个细胞/kg体重的范围内。在示例性实施方案中，单一剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。

在示例性实施方案中，细胞以单一剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x10⁶至约5.0x10⁸个细胞(诸如原代细胞和从工程化诱导性多能干细胞分化的细胞)。在一些实施方案中，药物组合物作为单一剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x10⁶至约1.0x10⁹、约1.0x10⁶至约1.0x10⁹、约1.0x10⁶至约1.0x10⁹、约5.0x10⁶至约1.0x10⁹、约1.0x10⁷至约1.0x10⁹、约5.0x10⁷至约1.0x10⁹、约1.0x10⁶至约5.0x10⁷、约1.0x10⁶至约1.0x10⁷、约1.0x10⁶至约5.0x10⁷、约1.0x10⁷至约5.0x10⁸、约2.0x10⁷至约5.0x10⁸、约3.0x10⁷至约5.0x10⁸、约4.0x10⁷至约5.0x10⁸、约5.0x10⁷至约5.0x10⁸、约6.0x10⁷至约5.0x10⁸、约7.0x10⁷至约5.0x10⁸、约8.0x10⁷至约5.0x10⁸或约9.0x10⁷至约5.0x10⁸个细胞/kg体重。在许多实施方案中，细胞以单一剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x10⁷至约2.5x10⁸个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一剂量施用，所述剂量的范围对于超过50kg的受试者小于约1.0x10⁷至约2.5x10⁸个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一剂量施用，所述剂量的范围对于超过50kg的受试者高于约1.0x10⁷至约2.5x10⁸个细胞。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。在示例性实施方案中，单一剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。

在示例性实施方案中，剂量以约每分钟1至50ml、每分钟1至40ml、每分钟1至30ml、每分钟1至20ml、每分钟10至20ml、每分钟10至30ml、每分钟10至40ml、每分钟10至50ml、每分钟20至50ml、每分钟30至50ml、每分钟40至50ml的速率静脉内施用。在多个实施方案中，药物组合物储存在一个或多个输液袋中用于静脉内施用。在一些实施方案中，剂量以不超过10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、240分钟或300分钟完全施用。

在一些实施方案中，单一剂量的药物组合物存在于单个输液袋中。在其他实施方案中，将单一剂量的药物组合物分成2、3、4或5个单独的输液袋。

在一些实施方案中，本文所述的细胞以多个剂量(诸如2、3、4、5、6或更多个剂量)施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1至24小时的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1小时至约24小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时)施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1天至28天的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1天至约28天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或约28天)施用。在许多实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1周至约6周的范围施用于受试者。在某些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1周至约6周(例如，约1、2、3、4、5或6周)施用。在若干实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1个月至约12个月的范围施用于受试者。在若干种情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1个月至约12个月(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)施用。

在一些实施方案中，在第一时间点向受试者施用第一剂量方案，然后随后在第二时间点向受试者施用第二剂量方案。在一些实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案相同。在其他实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数不同。

在一些实施方案中，细胞是工程化T细胞(例如，原代T细胞或从工程化诱导多能干细胞分化的T细胞)，并且第一剂量方案包括表达第一CAR的工程化T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的工程化T细胞，使得第一CAR和第二CAR不同。例如，第一CAR和第二CAR结合不同的靶抗原。在一些情况下，第一CAR包括结合抗原的scFv，而第二CAR包括结合不同抗原的scFv。在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的工程化T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的工程化T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR相同。第一剂量方案可以与第二剂量方案间隔至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1-3个月、1-6个月、4-6个月、3-9个月、3-12个月或更多个月施用于受试者。在一些实施方案中，在疾病(例如，癌症)过程期间向受试者施用多个剂量方案，并且所述剂量方案中的至少两个包含相同类型的本文所述的工程化T细胞。在其他实施方案中，多个剂量方案中的至少两个包含不同类型的本文所述的工程化T细胞。

2.免疫抑制剂

在一些实施方案中，在第一次施用工程化细胞群或包含工程化细胞群的组合物之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，可以向接受工程化细胞施用的患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

免疫抑制剂和/或免疫调节剂的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、皮质类固醇，诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或免疫调节剂选自由以下组成的免疫抑制抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体、以及与其任何配体结合的抗体。在其中在第一次施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂的一些实施方案中，施用的剂量低于表达一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子且没有CD47外源表达的细胞所需的剂量。

在一个实施方案中，这种免疫抑制剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和相似的剂。

在一些实施方案中，在第一次施用工程化细胞群之前，可向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在特定实施方案中，在第一次施用细胞后不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，或者在第一次施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在一些实施方案中，在施用工程化细胞群之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在许多实施方案中，在第一次和/或第二次施用工程化细胞群之前，向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次和/或第二次施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在特定实施方案中，在施用细胞之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在第一次和/或第二次施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。

在其中在施用细胞之前或之后向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂的一些实施方案中，施用的剂量低于免疫原性细胞(例如，具有相同或相似的细胞类型或表型但不含有工程化细胞的修饰(例如，遗传修饰)的细胞群，例如具有MICA和/或MICB表达、具有一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表达且没有CD47外源表达)所需的剂量。

3.选择患者进行治疗

如本文所述，在一些实施方案中，具有降低和/或消除的MICA和/或MICB表达的工程化细胞在具有针对MICA和/或MICB的预先存在抗体的个体中具有特定用途。因此，在一些方面，本文涵盖了将患者与特定治疗相匹配的基于选择的方法。例如，在一些实施方案中，个体具有针对MICA的预先存在抗体，并且适合用于施用于这种患者的工程化细胞将具有降低的MICA表达。在一些实施方案中，个体具有针对MICB的预先存在抗体，并且适合用于施用于这种患者的工程化细胞将具有降低的MICB表达。在一些实施方案中，个体具有针对MICA和MICB的预先存在抗体，并且适合用于施用于这种患者的工程化细胞将具有降低的MICA和MICB表达。在一些实施方案中，使用供体特异性抗体(DSA)结合技术来确定抗体(诸如抗MICA抗体和/或抗MICB抗体)的存在或不存在。在一些实施方案中，在移植本文所述的工程化细胞之前确定抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，在至少一次移植本文所述的工程化细胞之后(诸如在第一次(或任何先前的)施用之后且在后续施用之前)确定抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，工程化细胞的第一次(或任何先前的)施用是用不同的细胞进行的，并且后续的施用是用包含减少的MICA和/或MICB的工程化细胞进行的。

用于评估个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态(测量的存在或不存在)的方法是已知的。在一些实施方案中，方法包括从个体获得样品。在一些实施方案中，样品是血液样品，诸如血清样品。在一些实施方案中，方法包括评价血清样品中抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，使用蛋白质印迹技术评估抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，通过测量与特定细胞(诸如表达MICA和/或MICB的细胞)结合的抗体来评估抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，通过测量特定细胞(诸如表达MICA和/或MICB的细胞)的抗体介导的细胞死亡(诸如通过补体依赖性细胞毒性)来评估抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，在个体血清中的抗体将与MICA而非MICB特异性地结合。在一些实施方案中，在个体血清中的抗体将与MICB而非MICA特异性地结合。在一些实施方案中，在个体血清中的抗体将与MICA和MICB特异性地结合。

III.示例性实施方案

实施方案1.一种包含修饰的工程化细胞，所述修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低一种或多种主要组织相容性复合物I类(MHC I类)分子和/或一种或多种MHCII类分子的表达，其中表达的所述变化是相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

实施方案2.如实施方案1所述的工程化细胞，其中所述修饰降低所述一种或多种MHC I类分子和所述一种或多种MHC II类分子的表达。

实施方案3.如实施方案1或2所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDOl、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8和SERPINB9、及其任何组合。

实施方案4.如实施方案3所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8、及其任何组合。

实施方案5.如实施方案3所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

实施方案6.一种包含修饰的工程化细胞，所述修饰：(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；和(b)增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达，其中表达的变化是相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

实施方案7.如实施方案1-6中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含降低所述MICA的表达的修饰。

实施方案8.如实施方案1-7中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含所述MICA在所述工程化细胞上降低的表面表达。

实施方案9.如实施方案1-8中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICA的表达的修饰降低所述MICA的蛋白质表达。

实施方案10.如实施方案8或9所述的工程化细胞，其中在所述工程化细胞上不存在所述MICA的可检测的细胞表面表达。

实施方案11.如实施方案1-10中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICA的表达的修饰降低编码所述MICA的mRNA表达。

实施方案12.如实施方案1-11中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含消除MICA基因活性的修饰。

实施方案13.如实施方案12所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所述MICA基因的两个等位基因的失活或破坏。

实施方案14.如实施方案12或13所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所有MICA编码序列的失活或破坏。

实施方案15.如实施方案13或14所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述MICA基因中的插入缺失。

实施方案16.如实施方案13-15中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是所述MICA基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

实施方案17.如实施方案13-16中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是敲除。

实施方案18.如实施方案13-17中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是靶向所述MICA基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

实施方案19.如实施方案18所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑修饰是锌指核酸酶(ZFN)介导的修饰、TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的修饰或CRISPR-Cas组合介导的。

实施方案20.如实施方案19所述的工程化细胞，其中所述Cas选自Cas9或Cas12。

实施方案21.如实施方案19或20所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述MICA基因内的至少一个靶位点互补。

实施方案22.如实施方案24所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

实施方案23.如实施方案1-22中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含降低所述MICB的表达的修饰。

实施方案24.如实施方案1-23中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含所述MICB在所述工程化细胞上的降低的表面表达。

实施方案25.如实施方案1-24中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICB的表达的所述修饰降低所述MICB的蛋白质表达。

实施方案26.如实施方案24或25所述的工程化细胞，其中在所述工程化细胞上不存在所述MICB的可检测的细胞表面表达。

实施方案27.如实施方案1-26中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICB的表达的修饰降低编码所述MICB的mRNA表达。

实施方案28.如实施方案1-27中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含消除MICB基因活性的修饰。

实施方案29.如实施方案28所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所述MICB基因的两个等位基因的失活或破坏。

实施方案30.如实施方案28或29所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所有MICB编码序列的失活或破坏。

实施方案31.如实施方案29或30所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述MICB基因中的插入缺失。

实施方案32.如实施方案29-31中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是所述MICB基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

实施方案33.如实施方案29-32中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是敲除。

实施方案34.如实施方案29-33中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是靶向所述MICB基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

实施方案35.如实施方案34所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑修饰是锌指核酸酶(ZFN)介导的修饰、TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的修饰或CRISPR-Cas组合介导的。

实施方案36.如实施方案35所述的工程化细胞，其中所述Cas选自Cas9或Cas12。

实施方案37.如实施方案35或36所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述MICB基因内的至少一个靶位点互补。

实施方案38.如实施方案37所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

实施方案39.如实施方案1-38中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子的增加的表达包括所述一种或多种致耐受性因子的增加的细胞表面表达。

实施方案40.如实施方案39所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的一种是外源多肽。

实施方案41.如实施方案39或40所述的工程化细胞，其中所述修饰包含编码所述一种或多种致耐受性因子的一种或多种外源多核苷酸。

实施方案42.如实施方案41所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种与启动子可操作地连接。

实施方案43.如实施方案42所述的工程化细胞，其中所述启动子是组成型启动子。

实施方案44.如实施方案46或47所述的工程化细胞，其中所述启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1a启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。

实施方案45.如实施方案42-44中任一项所述的工程化细胞，其中将所述一种或多种外源多核苷酸整合到一个或多个基因组基因座中。

实施方案46.如实施方案45所述的工程化细胞，其中所述整合是非靶向插入。

实施方案47.如实施方案46所述的工程化细胞，其中所述非靶向插入是通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述细胞中进行的。

实施方案48.如实施方案45所述的工程化细胞，其中所述整合是靶向插入。

实施方案49.如实施方案50-52中任一项所述的工程化细胞，其中所述一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组：MICA基因座、MICB基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRBC基因座、CD142基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、ROSA26基因座、LRP1基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座、KDM5D基因座。

实施方案50.如实施方案38-49中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包含CD47。

实施方案51.如实施方案50所述的工程化细胞，其中CD47具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一部分具有至少约85％同一性的氨基酸序列。

实施方案52.如实施方案1-51中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC I类分子的表达的所述修饰降低所述一种或多种MHC I类分子的细胞表面表达。

实施方案53.如实施方案1-52中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC I类分子的表达的所述修饰降低β-2微球蛋白(B2M)的表达。

实施方案54.如实施方案53所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达的所述修饰降低B2M基因活性。

实施方案55.如实施方案53或54所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHCI类分子的表达的所述修饰包括所述B2M基因的两个等位基因的失活或破坏。

实施方案56.如实施方案53-55中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC I类分子的表达的所述修饰包括所有B2M编码序列的失活或破坏。

实施方案57.如实施方案55或56所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述B2M基因中的插入缺失或所述B2M基因的基因组DNA的连续段的缺失。

实施方案58.如实施方案57所述的工程化细胞，其中所述插入缺失是移码突变。

实施方案59.如实施方案52-58中任一项所述的工程化细胞，其中所述B2M基因被敲除。

实施方案60.如实施方案52-59中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达的所述修饰是通过核酸酶介导的基因编辑进行的。

实施方案61.如实施方案64所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过靶向所述B2M基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

实施方案62.如实施方案61所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

实施方案63.如实施方案62所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑是通过CRISPR-Cas组合进行的，并且所述CRISPR-Cas组合包含具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述B2M基因内的至少一个靶位点互补。

实施方案64.如实施方案63所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合是包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

实施方案65.如实施方案1-64中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC II类分子的表达的所述修饰降低所述一种或多种MHC II类分子的细胞表面表达。

实施方案66.如实施方案1-65中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC II类分子的表达的所述修饰降低CIITA的表达。

实施方案67.如实施方案66所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达的所述修饰降低CIITA基因活性。

实施方案68.如实施方案66或67所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHCII类分子的表达的所述修饰包括所述CIITA基因的两个等位基因的失活或破坏。

实施方案69.如实施方案65-68中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC II类分子的表达的所述修饰包括所有CIITA编码序列的失活或破坏。

实施方案70.如实施方案68或69所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述CIITA基因中的插入缺失或所述CIITA基因的基因组DNA的连续段的缺失。

实施方案71.如实施方案70所述的工程化细胞，其中所述插入缺失是移码突变。

实施方案72.如实施方案65-71中任一项所述的工程化细胞，其中所述CIITA基因被敲除。

实施方案73.如实施方案65-72中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达的所述修饰是通过核酸酶介导的基因编辑进行的。

实施方案74.如实施方案73所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过靶向所述CIITA基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行，

实施方案75.如实施方案74所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

实施方案76.如实施方案75所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑是通过CRISPR-Cas组合进行的，并且所述CRISPR-Cas组合包含具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述CIITA基因内的至少一个靶位点互补。

实施方案77.如实施方案76所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合是包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

78.如实施方案1-77中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于人类细胞或动物细胞。

实施方案79.如实施方案78所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于人类细胞。

实施方案80.如实施方案1-79中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于从多能干细胞或其后代衍生的分化细胞。

实施方案81.如实施方案80所述的工程化细胞，其中所述多能干细胞是或来源于诱导多能干细胞。

实施方案82.如实施方案1-81中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于从供体受试者分离的原代细胞。

实施方案83.如实施方案82所述的工程化细胞，其中所述供体受试者在从所述供体受试者获得所述原代时是健康的或没有被怀疑患有疾病或疾患。

实施方案84.如实施方案1-83中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自β胰岛细胞、B细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心脏细胞和血细胞。

实施方案85.如实施方案1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于内皮细胞。

实施方案86.如实施方案1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于上皮细胞。

实施方案87.如实施方案1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于多能干细胞。

实施方案88.如实施方案1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于胚胎干细胞。

实施方案89.如实施方案1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于间充质谱系的细胞。

实施方案90.如实施方案1-89中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是以下中的一种或多种：ABO血型O型；恒河猴因子阴性(Rh-)，其包含功能性ABO A等位基因和/或功能性ABO B等位基因；或恒河猴因子阳性(Rh+)。

实施方案91.如实施方案1-207中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。

实施方案92.一种来自实施方案1-91中任一项的工程化细胞群。

实施方案93.如实施方案92所述的工程化细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含所述修饰。

实施方案94.如实施方案92或93所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICA多肽的细胞表面表达。

实施方案95.如实施方案92-94中任一项所述的群体，其中所述工程化细胞上降低的所述MICA多肽的表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。

实施方案96.如实施方案92-95中任一项所述的群体，其中所述群体中至少约50％的细胞不具有所述MICA多肽的细胞表面表达。

实施方案97.如实施方案92-96中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达。

实施方案98.如实施方案92-97中任一项所述的群体，其中所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽的表面表达被降低至比相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平。

实施方案99.如实施方案92-98中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％的细胞不具有所述MICB多肽的细胞表面表达。

实施方案100.如实施方案92-99中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码所述一种或多种致耐受性因子的外源多核苷酸。

实施方案101.如实施方案92-100中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸。

实施方案102.如实施方案92-101中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达。

实施方案103.如实施方案92-102中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。

实施方案104.如实施方案92-103中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。

实施方案105.如实施方案92-104中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使B2M基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

实施方案106.如实施方案92-105中任一项所述的群体，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使CIITA基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

实施方案107.一种组合物，所述组合物包含如实施方案92-106中任一项所述的群体。

实施方案108.一种组合物，所述组合物包含来自实施方案92-107中任一项的工程化细胞群，其中：(a)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICA多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICA多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。

实施方案109.一种组合物，所述组合物包含来自实施方案92-107中任一项的工程化细胞群，其中：(a)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(c)其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。

实施方案110.一种组合物，所述组合物包含来自实施方案92-107中任一项的工程化细胞群，其中：(a)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICA多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICA多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平；(c)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和(d)其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平。

实施方案111.一种包含工程化原代β胰岛细胞群的组合物，其中所述工程化原代β胰岛细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案112.一种包含工程化原代T细胞群的组合物，其中所述工程化原代T细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(ii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案113.一种包含工程化原代甲状腺细胞群的组合物，其中所述工程化原代甲状腺细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案114.一种包含工程化原代皮肤细胞群的组合物，其中所述工程化原代皮肤细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案115.一种包含工程化原代内皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代内皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案116.一种包含工程化原代视网膜色素上皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代视网膜色素上皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案117.如实施方案111-116中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞在所述B2M基因的所有等位基因中包含插入缺失。

实施方案118.如实施方案111-117中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞还包含CIITA基因的所有等位基因的失活或破坏。

实施方案119.如实施方案111-118中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞在所述CIITA基因的所有等位基因中包含插入缺失。

实施方案120.如实施方案111-119中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

实施方案121.如实施方案111-119中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

实施方案122.如实施方案111-119中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

实施方案123.如实施方案107-122中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞使用基于核酸酶的基因编辑进行工程化。

实施方案124.如实施方案107-123中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

实施方案125.如实施方案107-124中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载剂。

实施方案126.如实施方案107-125中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。

实施方案127.如实施方案126所述的组合物，其中所述冷冻保护剂包含浓度为约5％至约10％ DMSO(v/v)的DMSO。

实施方案128.一种容器，所述容器包含如实施方案107-127中任一项所述的组合物。

实施方案129.如实施方案128所述的容器，其中所述容器是无菌袋。

实施方案130.如实施方案129所述的容器，其中所述无菌袋是冷冻保存相容的。

实施方案131.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)降低或消除源细胞中一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和(c)降低或消除所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

实施方案132.如实施方案131所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDOl、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8和SERPINB9、及其任何组合。

实施方案133.如实施方案131或132所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8、及其任何组合。

实施方案134.如实施方案131-133中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

实施方案135.如实施方案131-134中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述一种或多种MHC I类分子和所述一种或多种MHC II类分子的表达。

实施方案136.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：(a)增加源细胞中CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达；和(b)降低所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

实施方案137.如实施方案131-136中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICA的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICA蛋白质表达。

实施方案138.如实施方案131-137中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICB的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICB蛋白质表达。

实施方案139.如实施方案131-138中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICA和所述MICB的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICA和MICB蛋白质表达。

实施方案140.如实施方案131-139中任一项所述的方法，其中所述降低或消除表达包括降低或消除细胞表面表达。

实施方案141.如实施方案131-140中任一项所述的方法，其中降低或消除表达包括引入降低或消除相关基因活性的修饰。

实施方案142.如实施方案141所述的方法，所述修饰是基因的两个等位基因的失活或破坏。

实施方案143.如实施方案142所述的方法，其中所述失活或破坏包括插入缺失。

实施方案144.如实施方案143所述的方法，其中所述插入缺失是所述基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

实施方案145.如实施方案141-144中任一项所述的方法，其中所述方法包括敲除相关基因活性。

实施方案146.如实施方案141-145中任一项所述的方法，其中降低或消除所述一种或多种MHC I类分子表达的修饰是B2M的修饰。

实施方案147.如实施方案141-146中任一项所述的方法，其中降低或消除所述一种或多种MHC I类分子表达的修饰是CIITA的修饰。

实施方案148.如实施方案141-147中任一项所述的方法，其中所述修饰通过核酸酶介导的基因编辑来进行。

实施方案149.如实施方案148所述的方法，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

实施方案150.如实施方案149所述的方法，其中所述CRISPR-Cas组合包含选自由以下组成的组的Cas：Cas9或Cas12。

实施方案151.如实施方案149或150所述的方法，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，其中所述CRISPR-Cas组合包含指导RNA(gRNA)。

实施方案152.如实施方案151所述的方法，其中所述CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

实施方案153.如实施方案141-152中任一项所述的方法，其中增加所述一种或多种致耐受性因子表达的修饰包括引入编码所述一种或多种致耐受性因子的至少一种外源多核苷酸。

实施方案154.如实施方案153所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸是编码两种或更多种致耐受性因子的多顺反子载体。

实施方案155.如实施方案131-154中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

实施方案156.如实施方案142-155中任一项所述的方法，其中将所述至少一种多核苷酸整合到所述细胞的基因组中。

实施方案157.如实施方案156所述的方法，其中所述整合通过非靶向插入来进行。

实施方案158.如实施方案157所述的方法，其中所述整合通过慢病毒载体来进行。

实施方案159.如实施方案156所述的方法，其中所述整合通过靶向插入到靶标基因组基因座中来进行。

实施方案160.如实施方案159所述的方法，其中所述整合通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

实施方案161.如实施方案159或160所述的方法，其中所述靶基因组基因座选自由以下组成的组：B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座和ROSA26基因座。

实施方案162.如实施方案131-161中任一项所述的方法，所述方法还包括实施细胞分化技术，使得所述工程化细胞被分化成期望的细胞类型。

实施方案163.如实施方案131-162中任一项所述的方法，其中所述源细胞从供体受试者中分离。

实施方案164.如实施方案163所述的方法，其中所述供体受试者是健康的或者在分离的时候没有被怀疑患有疾病或疾患。

实施方案165.一种工程化细胞，所述工程化细胞使用如实施方案131-164中任一项所述的方法来产生。

实施方案166.一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用如实施方案92-106中任一项所述的工程化细胞群或如实施方案107-115中任一项所述的组合物。

实施方案167.如实施方案166所述的方法，其中所述疾患是疾病或细胞缺陷。

实施方案168.如实施方案166或167所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、乳糜泻、格雷夫斯病、银屑病和结肠炎。

实施方案169.如实施方案166-168中任一项所述的方法，其中所述个体在循环中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体。

实施方案170.如实施方案169所述的方法，其中所述个体表现出所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的持续存在。

实施方案171.如实施方案169或170所述的方法，其中所述个体患有导致所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体存在的自身免疫相关疾患。

实施方案172.如实施方案171所述的方法，其中所述自身免疫相关疾病是桥本氏病。

实施方案173.如实施方案166-172中任一项所述的方法，其中基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在选择所述个体进行所述治疗。

实施方案174.如实施方案166-173中任一项所述的方法，所述方法还包括基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在选择所述个体进行所述治疗。

实施方案175.如实施方案174所述的方法，其中选择所述个体还包括测量所述个体中所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在。

实施方案176.一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括：(a)确定所述个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，其中阳性抗MICA抗体状态指示来自所述个体的血清样品中存在抗MICA抗体，并且其中阳性抗MICB抗体状态指示来自所述个体的血清样品中存在抗MICB抗体；和(b)基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体状态，向所述个体施用包含如92-106中任一项所述的工程化细胞群的组合物或如实施方案107-115中任一项所述的组合物，其中如果所述抗MICA抗体状态为阳性，则所述群体的所述工程化细胞包含降低的MICA表达，其中如果所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的所述工程化细胞包含降低的MICB表达，并且其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的所述工程化细胞包含降低的MICA和MICB表达。

实施方案177.如实施方案176所述的方法，所述方法还包括基于所述个体的所述抗MICA抗体状态和/或所述抗MICB抗体状态选择所述个体进行所述治疗。

实施方案178.如实施方案176或177所述的方法，所述方法还包括测量所述个体的所述抗MICA抗体状态和/或所述抗MICB抗体状态。

实施方案179.一种鉴定适用于有需要的个体的同种异体疗法的方法，其中所述同种异体疗法包含含有如实施方案92-106中任一项所述的工程化细胞群的组合物或如实施方案107-115中任一项所述的组合物，所述方法包括确定所述个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态以鉴定适用于在所述个体中使用的同种异体疗法，其中如果所述抗MICA抗体状态为阳性，合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA表达的群体的工程化细胞，其中如果所述抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICB表达的群体的工程化细胞，并且其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性，则合适的同种异体疗法包含含有降低的MICA和MICB表达的群体的工程化细胞。

实施方案180.如实施方案166-178中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用一种或多种免疫抑制剂。

实施方案181.如实施方案166-178中任一项所述的方法，其中已经向所述个体施用一种或多种免疫抑制剂。

实施方案182.如实施方案180或181所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是小分子或抗体。

实施方案183.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂选自由以下组成的组：环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、霉酚酸酯、皮质类固醇、泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(胸腺肽-α)和免疫抑制抗体。

实施方案184.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环孢菌素。

实施方案185.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括霉酚酸酯。

实施方案186.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括皮质类固醇。

实施方案187.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环磷酰胺。

实施方案188.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括雷帕霉素。

实施方案189.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506)。

实施方案190.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括抗胸腺细胞球蛋白。

实施方案191.如实施方案180-183中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是一种或多种免疫调节剂。

实施方案192.如实施方案191所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂是小分子或抗体。

实施方案193.如实施方案182或实施方案192所述的方法，其中所述抗体结合一种或多种受体或配体，所述一种或多种受体或配体选自由以下组成的组：IL-2受体的p75、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD58、以及与其任何配体结合的抗体。

实施方案194.如实施方案180-193中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案195.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案196.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案197.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案198.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案199.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在第一次施用所述工程化细胞的同一天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案200.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案201.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案202.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案203.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案204.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案205.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案206.如实施方案180-194中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案207.如实施方案180-206中任一项所述的方法，其中与为了减少不包含所述工程化细胞的所述修饰的免疫原性细胞的免疫排斥而施用的一种或多种免疫抑制剂的剂量相比，以更低的剂量施用所述一种或多种免疫抑制剂。

实施方案208.如实施方案180-207中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞能够受控杀伤所述工程化细胞。

实施方案209.如实施方案180-208中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含自杀基因或自杀开关。

实施方案210.如实施方案209所述的方法，其中所述自杀基因或自杀开关在药物或前药的存在下或在被选择性外源化合物活化时诱导受控细胞死亡。

实施方案211.如实施方案209或实施方案210所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关是能够诱导所述工程化细胞的细胞凋亡的诱导蛋白。

实施方案212.如实施方案211所述的方法，其中能够诱导所述工程化细胞的细胞凋亡的诱导蛋白是胱天蛋白酶蛋白质。

实施方案213.如实施方案212所述的方法，其中所述胱天蛋白酶蛋白是胱天蛋白酶9。

实施方案214.如实施方案209-213中任一项所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

实施方案215.如实施方案209-214中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之后，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

实施方案216.如实施方案209-214中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之前，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

实施方案217.如实施方案209-216中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述工程化细胞之后，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

实施方案218.如实施方案209-217中任一项所述的方法，其中在对所述个体产生细胞毒性或其他负面后果的情况下，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

实施方案219.如实施方案180-218中任一项所述的方法，所述方法包括施用允许所述工程化细胞群的工程化细胞耗尽的剂。

实施方案220.如实施方案219所述的方法，其中允许所述工程化细胞耗尽的剂是识别所述工程化细胞的表面上表达的蛋白质的抗体。

实施方案221.如实施方案220所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：识别CCR4、CD16、CD19、CD20、CD30、EGFR、GD2、HER1、HER2、MUC1、PSMA和RQR8的抗体。

实施方案222.如实施方案220或实施方案221所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：莫格利珠单抗、AFM13、MOR208、奥妥珠单抗、乌利妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、利妥昔单抗、利妥昔单抗-Rllb、托木妥昔单抗、RO5083945(GA201)、西妥昔单抗、Hul4.18K322A、Hul4.18-IL2、Hu3F8、达妥昔单抗、c.60C3-Rllc及其生物类似药。

实施方案223.如实施方案166-178和219-222中任一项所述的方法，所述方法包括施用识别在所述工程化细胞的表面上的所述一种或多种致耐受性因子的剂。

实施方案224.如实施方案223所述的方法，其中所述工程化细胞被工程化以表达所述一种或多种致耐受性因子。

实施方案225.如实施方案223或224所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

实施方案226.如实施方案166-225中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用一种或多种另外的治疗剂。

实施方案227.如实施方案166-226中任一项所述的方法，其中已经向所述个体施用一种或多种另外的治疗剂。

实施方案228.如实施方案166-227中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述方法的治疗功效。

实施方案229.如实施方案166-228中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述方法的预防功效。

实施方案230.如实施方案166-229中任一项所述的方法，其中重复所述方法直到出现期望的对一种或多种疾病症状的抑制。

实施方案231.如实施方案1-91中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

实施方案232.如实施方案231所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

实施方案233.如实施方案231或实施方案232所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案234.如实施方案231或实施方案232所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及所述一种或多种致耐受性因子由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案235.如实施方案233或实施方案234所述的工程化细胞，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述工程化细胞的基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述细胞中来整合。

实施方案236.如实施方案235所述的工程化细胞，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中所述靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

实施方案237.如实施方案230-236中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

实施方案238.如实施方案131-164中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

实施方案239.如实施方案238所述的方法，其中所述自杀基因选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

实施方案240.如实施方案238或实施方案239所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案241.如实施方案238或实施方案239所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及所述一种或多种致耐受性因子由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案242.如实施方案240或实施方案241所述的方法，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述工程化细胞的基因组中来整合。

实施方案243.如实施方案240或实施方案241所述的方法，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述工程化细胞的靶基因组基因座中来整合。

实施方案244.如实施方案238-243中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

实施方案245.如实施方案107-127中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

实施方案246.如实施方案245所述的组合物，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

实施方案247.如实施方案245或实施方案246所述的组合物，其中所述自杀基因以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞群的工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案248.如实施方案245或实施方案247所述的组合物，其中所述自杀基因或所述自杀开关和所述外源CD47由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

实施方案249.如实施方案247或实施方案248所述的组合物，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述工程化细胞群的工程化细胞中来整合。

实施方案250.如实施方案247或实施方案248所述的组合物，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述工程化细胞群的工程化细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中所述靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

本发明的范围并不局限于具体公开的实施方案，这些实施方案是为了举例说明本发明的各个方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

实施例

包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1

本实施例描述了次要组织相容性抗原MHC I类分子多肽相关序列A(MICA)和/或MHC I类分子多肽相关序列B(MICB)表达降低的细胞的制备。工程化细胞(例如，用于细胞疗法中的细胞)将受益于MICA和/或MICB的降低以提供和/或进一步改善低免疫原性多能性(HIP)修饰。

将细胞工程化为降低MICA和/或MICB的表达。具体地，CRISPR/Cas9基因编辑技术用于敲除β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌肉细胞、心脏细胞、血细胞、胰岛细胞、平滑肌细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心肌细胞、干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞中的MICA和/或MICB。gRNA序列可以用于敲除MICA和MICB的所有等位基因；MICA：GATGACCCTGGCTCATATCA-SEQ ID NO:36；MICB：GTTTCTGCCTGTCATAGCGC-SEQ ID NO:37。本领域普通技术人员可以理解，尿嘧啶和胸腺嘧啶都可以用‘t’表示，而不是尿嘧啶用‘u’表示并且胸腺嘧啶用‘t’表示；在核糖核酸的情况下，除非另有说明，应当理解‘t’用于表示尿嘧啶。可以将所得细胞命名为MICA^indel/indel和/或MICB^indel/indel；

考虑了另外的修饰，包括B2M(例如，命名为B2M^indel/indel)的敲除和/或CIITA(例如，命名为CIITA^indel/indel)的敲除和/或一种或多种致耐受性因子诸如CD47(例如，命名为CD47tg)表达的增加。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的至少一种是异源多肽。在一些实施方案中，一种或多种致耐受性因子中的至少一种是内源多肽，其中所述内源多肽的表达通过修饰或引入启动子而增加。

实施例2.在各种人类细胞类型中的MICA和MICB表达以及MICA^INDEL/INDEL；MICB^INDEL ^/INDEL；B2M^INDEL/INDEL；CIITA^INDEL/INDEL；CD47TG的产生

本实施例描述了分析在人iPSC及其衍生物(诸如MSC)以及在原代T细胞和β胰岛细胞中的次要组织相容性抗原MHC I类分子多肽相关序列A(MICA)和MHC I类分子多肽相关序列B(MICB)表达的研究。

A.方法

细胞工程化和iPSC刺激。使用标准CRISPR/Cas9基因编辑技术对B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel诱导的人多能干细胞(hiPSC)进行工程化，并且通过用含有编码外源CD47蛋白的多核苷酸的慢病毒载体进行转导将编码外源CD47的转基因(tg)引入细胞中(在一些实施方案中，所得细胞被设计为B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg hiPSC)。在相关的情况下，使用标准CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除MICA和MICB(在一些实施方案中，将所得工程化细胞命名为MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg hiPSC)。用于敲除MICA和MICB的所有等位基因的gRNA序列如下：MICA：GATGACCCTGGCTCATATCA-SEQ IDNO:36；MICB：GTTTCTGCCTGTCATAGCGC-SEQ ID NO:37。本领域普通技术人员可以理解，尿嘧啶和胸腺嘧啶都可以用‘t’表示，而不是尿嘧啶用‘u’表示并且胸腺嘧啶用‘t’表示；在核糖核酸的情况下，除非另有说明，应当理解‘t’用于表示尿嘧啶。

在指示的情况下，如果此类抗原存在和/或由细胞产生，通过与一定浓度的IFN-γ和/或TNF-α一起孵育来刺激MICA和/或MICB细胞表面表达来刺激iPSC。

原代T细胞和β胰岛细胞的分离。从来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)样品中获得原代人T细胞。具体地，将样品解冻并通过CD3分选进行富集。使用标准技术从健康供体中分离原代人β胰岛。此类技术是本领域已知的，包括如在J.Kerr-Conte等人,Transplantation,89,2010中所述。

间充质细胞分化与工程化。将hiPSC细胞在间充质诱导培养基中培养，随后在MesenCult-ACF Plus培养基中培养(在第四天)。随后，将细胞在涂覆有MesenCult-SF附着基质的新培养皿上传代。将细胞在MesenCult-ACF Plus培养基中培养21天以成为类MSC的，然后再培养7天以成为MSC。如上文所讨论进行MICA、MICB、B2M、CIITA和CD47修饰。

流式细胞术。使用识别MICA和MICB的抗MICA/MICB抗体通过流式细胞术评估MICA和MICB的表面表达水平。将同种型抗体用作对照。

B.结果

对MICA和MICB在未工程化的hiPSC或B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg hiPSC上的表面表达的分析表明，即使响应于IFN-γ和TNF-α的刺激，这些细胞类型在细胞表面上也不表达MICA或MICB(图2)。如在图3A和3B中所示，MICA和MICB都不在原代人T细胞(图3A)、β胰岛细胞(图3B)或iPSC衍生的胰岛细胞(图3C)上表达。

相反，MICA和/或MICB在从人iPSC分化的MSC上表达(图4A)。相对于同种型(I)对照，未工程化的iPSC衍生的MSC表现出MICA和/或MICB表达增加16.7倍。相对于同种型(I)对照，B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg表现出MICA和/或MICB表达增加19.6倍。这表明降低B2M和CIITA表达的修饰和增加CD47表达的修饰不降低MICA和/或MICB的表达。在MSC衍生的B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg hiPSC中消除MICA和MICB的表面表达，以产生MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg hiPSC(图4B)。由于MICA和MICB表达可以诱导细胞和/或体液反应，特别是在患有某些自身免疫性疾病的受试者中，结果表明降低MICA和/或MICB的表达可以为将表达MICA和/或MICB的某些细胞类型(诸如MSC或iPSC衍生的MSC)同种异体移植到患有自身免疫性疾病的患者中提供益处。

实施例3.患有桥本氏自身免疫性病症的患者的血清包含抗MICA抗体和/或抗MICB抗体

为了评估患有桥本氏病(一种甲状腺自身免疫性疾病)的患者体内是否存在针对MICA和/或MICB的抗体，对来自桥本氏病患者的血清测试针对MICA或MICB的预先存在抗体的存在。

从5名患有桥本氏病的志愿者和1名健康志愿者中收集血清。将1.5mL血清与1.5mL奶和7μg重组蛋白(MICA或MICB)一起孵育过夜。然后将每个样品与人IgG抗体一起孵育1小时，以使用蛋白质印迹检测与MICA或MICB结合的抗体。

如在图5中所示，在患有桥本氏病的患者的血清中检测到针对MICA和/或MICB的抗体，但在健康志愿者的血清中未检测到。

使用来自患有桥本氏病的志愿者和健康志愿者的血清进行进一步分析以测量与工程化细胞(B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC；MICA^indel/indel、MICB^indel/indel、B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC；或B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg iPSC)的供体特异性抗体(DSA)结合。来自桥本氏病志愿者的血清含有抗MICA抗体和/或抗MICB抗体，如通过观察到与B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC结合(图6A)，然而不与MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC结合(图6B)所证明的。来自桥本氏病志愿者的血清也没有导致可检测的DSA与B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg iPSC的结合(图6C)。

如预期的那样，来自健康志愿者的血清不含有抗MICA抗体和/或抗MICB抗体，如通过由不可检测到DSA与B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC(图6D)的结合或与MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC的结合所指示(图6E)。

使用xCELLigence^TMMP平台进行了进一步分析，所述平台提供了对细胞增殖和细胞活力的无标记监测，以测量补体依赖性细胞毒性(CDC)。将B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel(dKO)MSC；B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC；或MICA^indel/indel、MICB^indel/indel、B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC在存在(右列)或不存在(左列)抗MICA/B阻断抗体的情况下与来自患有桥本氏病的志愿者的血清一起孵育。通过测量如通过阻抗的变化所确定的随着孵育时间推移的细胞裂解来分析CDC，所述阻抗的变化被报告为归一化细胞指数(归一化细胞指数的降低指示细胞裂解或杀伤的增加)。图7A中所示的一名患有桥本氏病的志愿者的代表性结果证明了通过CDC对dKO以及B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC的杀伤；这可以在抗MICA/B抗体的存在下被阻断(参见第(a)和(b)行)。相反，无论是否存在抗MICA/B阻断抗体，对于MICA^indel/indel、MICB^indel/indel、B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tgMSC，没有观察到通过CDC的细胞死亡(参见第(c)行)。从患有桥本氏病的其他志愿者的血清中观察到类似的结果。在与来自健康志愿者的血清一起孵育后，没有观察到任何工程化细胞的CDC介导的细胞杀伤(图7B)。

研究结果证明，抗MICA抗体和/或抗MICB抗体可能存在于患有某些自身免疫性疾病(诸如桥本氏病)的患者的血清中，然而这些抗体通常不存在于健康供体的血清中。这些结果支持，在一些方面，血清抗体测试可以用于确定需要移植细胞的患者是否可能由于存在可以识别细胞表面上的MICA或MICB的抗MICA抗体或抗MICB抗体(其可能导致非工程化细胞的杀伤)而易对细胞产生免疫反应。此外，这些结果还支持在同种异体细胞疗法中(特别是在涉及表达或上调MICA或MICB的某些细胞类型的细胞疗法中、或在用于施用于血清中存在抗MICA或MICB抗体的受试者的细胞疗法中)使用工程化细胞(诸如具有B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg修饰的细胞)，所述工程化细胞还包括另外MICA和/或MICB敲除。

实施例4.患有多发性硬化症的患者的血清包含抗MICB抗体

本实施例描述了证明在来自患有多发性硬化症的个体志愿者的血清中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体的一项分析。此外，还评估了血清样品的CDC功能。

如在图8中所示，在患有多发性硬化症的患者的血清中检测到针对MICB的抗体。如先前所述，在健康志愿者的血清中没有抗MICA抗体和抗MICB抗体。

使用来自患有多发性硬化症的志愿者的血清进行进一步分析以测量与工程化细胞(MICA^indel/indel、MICB^indel/indel、B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC；B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC；或CD47tg MSC；或B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg iPSC)的DSA结合。如在图9A中所示，来自多发性硬化症志愿者的血清含有与B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC结合的抗MICB抗体。如在图9B中所示，来自多发性硬化症志愿者的血清含有不与以下结合的抗MICB抗体：MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC。如在图9C中所示，来自多发性硬化症志愿者的血清不含有与不表现出MICA和/或MICB的细胞表面表达的B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg iPSC结合的抗体。

如在图10A-10C中所示，在多发性硬化症志愿者的血清中的预先存在的MICB抗体诱导B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg MSC的CDC。相反，对于MICA^indel/indel、MICB^indel ^/indel、B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg MSC，没有观察到通过CDC的细胞死亡。提供来自健康志愿者的血清分析作为对照(部分图10C)。

研究结果证明，抗MICB抗体可能存在于患有多发性硬化症的患者的血清中，然而此类抗体通常不存在于健康供体的血清中。这些结果支持，在一些方面，血清抗体测试可以用于确定需要移植细胞的患者是否可能由于存在可以识别细胞表面上的MICB的抗MICB抗体而易对细胞产生免疫反应。此外，这些结果还支持在同种异体细胞疗法中(特别是在涉及表达或上调MICB的某些细胞类型的细胞疗法中、或在用于施用于血清中存在抗MICB抗体的受试者的细胞疗法中)使用工程化细胞(诸如具有B2M^indel/indel、CIITA^indel/indel、CD47tg修饰的细胞)，所述工程化细胞还包括另外MICB敲除。

实施例5.疾患和物种的抗MICA抗体和抗MICB抗体分析。

本实施例展示了分析各种血清来源的抗MICA抗体和抗MICB抗体的存在。

如在图11中所示，在两名患有系统性红斑狼疮的志愿者的血清中检测到抗MICB抗体。

序列

Claims

1.一种包含修饰的工程化细胞，所述修饰：

(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；

(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达；和

(c)降低一种或多种主要组织相容性复合物I类分子(MHC I类分子)和/或一种或多种MHC II类分子的表达，

其中表达的改变是相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

2.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述修饰包括以下的表达降低：

(i)一种或多种MHC I类分子；

(ii)一种或多种MHC II类分子；或

(iii)所述一种或多种MHC I类分子和所述一种或多种MHC II类分子。

3.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述修饰包括B2M、TAP I、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B或NFY-C中的一种或多种的表达降低。

4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子。

5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞不表达B2M、TAPI、NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、RFX5、RFXANK、RFXAP、NFY-A、NFY-B或NFY-C中的一种或多种。

6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低所述一种或多种MHC I类分子的细胞表面表达来降低所述一种或多种MHC I类分子的表达。

7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低β-2微球蛋白(B2M)的表达来降低所述一种或多种MHC I类分子的表达。

8.如权利要求7所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低B2M基因活性来降低所述一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达。

9.如权利要求7或8所述的工程化细胞，其中所述修饰通过使B2M基因的两个等位基因失活或破坏来降低所述一种或多种MHC I类分子的表达。

10.如权利要求7-9中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过使所有B2M编码序列失活或破坏来降低所述一种或多种MHC I类分子的表达。

11.如权利要求9或10所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述B2M基因中的插入缺失或所述B2M基因的基因组DNA的连续段的缺失。

12.如权利要求11所述的工程化细胞，其中所述插入缺失是移码突变。

13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞，其中所述B2M基因被敲除。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述修饰通过CRISPR相关转座酶、先导编辑或经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)来进行。

15.如权利要求1-14中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过核酸酶介导的基因编辑降低所述一种或多种MHC I类分子的蛋白质表达。

16.如权利要求14或15所述的工程化细胞，其中所述CRISPR相关转座酶、先导编辑、经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)或核酸酶介导的基因编辑通过选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质来进行：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和CRISPR相关转座酶。

17.如权利要求15所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过靶向所述B2M基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

18.如权利要求17所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

19.如权利要求18所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑是通过CRISPR-Cas组合进行的，并且所述CRISPR-Cas组合包含具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述B2M基因内的至少一个靶位点互补。

20.如权利要求19所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合是包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

21.如权利要求1-20中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低所述一种或多种MHC II类分子的细胞表面表达来降低所述一种或多种MHC II类分子的表达。

22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低CIITA的表达来降低所述一种或多种MHC II类分子的表达。

23.如权利要求22所述的工程化细胞，其中所述修饰通过降低CIITA基因活性来降低所述一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达。

24.如权利要求22或23所述的工程化细胞，其中所述修饰通过使CIITA基因的两个等位基因失活或破坏来降低所述一种或多种MHC II类分子的表达。

25.如权利要求21-24中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过使所有CIITA编码序列失活或破坏来降低所述一种或多种MHC II类分子的表达。

26.如权利要求24或25所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括在所述CIITA基因中的插入缺失或所述CIITA基因的基因组DNA的连续段的缺失。

27.如权利要求26所述的工程化细胞，其中所述插入缺失是移码突变。

28.如权利要求21-27中任一项所述的工程化细胞，其中所述CIITA基因被敲除。

29.如权利要求21-28中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰通过核酸酶介导的基因编辑降低所述一种或多种MHC II类分子的蛋白质表达。

30.如权利要求29所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过靶向所述CIITA基因的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

31.如权利要求30所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合的Cas选自Cas9或Cas12。

32.如权利要求29所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑是通过CRISPR-Cas组合进行的，并且所述CRISPR-Cas组合包含具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述CIITA基因内的至少一个靶位点互补。

33.如权利要求32所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合是包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

34.如权利要求28所述的工程化细胞，其中所述修饰通过CRISPR相关转座酶、先导编辑或经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)来进行。

35.如权利要求34所述的工程化细胞，其中所述CRISPR相关转座酶、先导编辑、经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)或核酸酶介导的基因编辑通过选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质来进行：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和CRISPR相关转座酶。

36.一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：

(a)降低MHC I类链相关蛋白A(MICA)和/或MHC I类链相关蛋白B(MICB)的表达；和

(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达，

其中表达的改变是相对于不包含所述一个或多个修饰的同一细胞类型的细胞而言的。

37.一种包含一个或多个修饰的工程化细胞，所述一个或多个修饰：

(b)增加一种或多种致耐受性因子的表达，其中所述一种或多种致耐受性因子增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达，

38.如权利要求36或37所述的工程化细胞，其中所述一个或多个修饰：

降低一种或多种主要组织相容性复合物I类分子(MHC I类分子)和/或一种或多种MHCII类分子的表达，

增加CD47和任选地CD24和/或PD-L1的表达，并且/或者

增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达。

39.如权利要求38所述的工程化细胞，其中所述细胞包含一种或多种MHC I类分子MICA和/或MICB、以及TXNIP中的任何一种的敲除、PD-L1和HLAE的敲入。

40.如权利要求39所述的工程化细胞，其中所述细胞包含A20/TNFAIP3和MANF的敲入。

41.如权利要求1-40中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含一个或多个修饰以降低所述MICA的表达。

42.如权利要求1-41中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含所述MICA在所述工程化细胞上降低的表面表达，任选地其中不存在可检测的表面表达。

43.如权利要求1-42中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICA表达的所述修饰降低所述MICA的蛋白质表达。

44.如权利要求42或43所述的工程化细胞，其中在所述工程化细胞上不存在所述MICA的可检测的细胞表面表达。

45.如权利要求1-44中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICA的表达的所述修饰降低编码所述MICA的mRNA表达。

46.如权利要求1-45中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含消除MICA基因活性的一个或多个修饰。

47.如权利要求46所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所述MICA基因的两个等位基因的失活或破坏。

48.如权利要求46或47所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所有MICA编码序列的失活或破坏。

49.如权利要求47或48所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括所述MICA基因中的插入缺失。

50.如权利要求47-49中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所述MICA基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

51.如权利要求47-50中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰包括敲除。

52.如权利要求47-51中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是靶向所述MICA基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

53.如权利要求48所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑修饰是锌指核酸酶(ZFN)介导的修饰、TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的修饰或CRISPR-Cas组合介导的。

54.如权利要求49所述的工程化细胞，其中所述Cas选自Cas9或Cas12。

55.如权利要求49或50所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述MICA基因内的至少一个靶位点互补。

56.如权利要求51所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

57.如权利要求51所述的工程化细胞，其中所述修饰通过CRISPR相关转座酶、先导编辑或经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)来进行。

58.如权利要求57所述的工程化细胞，其中所述CRISPR相关转座酶、先导编辑、经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)或核酸酶介导的基因编辑通过选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质来进行：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和CRISPR相关转座酶。

59.如权利要求1-58中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含降低所述MICB的表达的修饰。

60.如权利要求1-59中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含所述MICB在所述工程化细胞上降低的表面表达，任选地其中不存在可检测的表面表达。

61.如权利要求1-60中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICB表达的所述修饰降低所述MICB的蛋白质表达。

62.如权利要求60或61所述的工程化细胞，其中在所述工程化细胞上不存在所述MICB的可检测的细胞表面表达。

63.如权利要求1-62中任一项所述的工程化细胞，其中降低所述MICB表达的所述修饰降低编码所述MICB的mRNA表达。

64.如权利要求1-63中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含消除MICB基因活性的修饰。

65.如权利要求64所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所述MICB基因的两个等位基因的失活或破坏。

66.如权利要求64或65所述的工程化细胞，其中所述修饰包括所有MICB编码序列的失活或破坏。

67.如权利要求65或66所述的工程化细胞，其中所述失活或破坏包括所述MICB基因中的插入缺失。

68.如权利要求65-67中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是所述MICB基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

69.如权利要求65-68中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是敲除。

70.如权利要求65-69中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰是靶向所述MICB基因的核酸酶介导的基因编辑修饰。

71.如权利要求70所述的工程化细胞，其中所述核酸酶介导的基因编辑修饰是锌指核酸酶(ZFN)介导的修饰、TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的修饰或CRISPR-Cas组合介导的。

72.如权利要求71所述的工程化细胞，其中所述Cas选自Cas9或Cas12。

73.如权利要求71或72所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用具有靶向结构域的指导RNA(gRNA)，所述靶向结构域与所述MICB基因内的至少一个靶位点互补。

74.如权利要求73所述的工程化细胞，其中所述CRISPR-Cas组合介导的修饰包括使用包含所述gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

75.如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞，其中所述修饰降低NLRC5、TRAC、TRB、CD142、ABO、CD38、CD52、PCDH11Y、NLGN4Y和RHD中的任何一种或多种的表达。

76.如权利要求1-75中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1或Serpinb9。

77.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E。

78.如权利要求1-77中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD24。

79.如权利要求1-78中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括PD-L1。

80.如权利要求1-79中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD46。

81.如权利要求1-80中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD55。

82.如权利要求1-81中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD59。

83.如权利要求1-82中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CR1。

84.如权利要求1-83中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括MANF。

85.如权利要求1-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括A20/TNFAIP3。

86.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E和CD47。

87.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

88.如权利要求1-76和87中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

89.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

90.如权利要求1-76和89中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

91.如权利要求1-76、89和90中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、CD24、CD47、PDL1、CD46、CD55、CD59或CR1中的一种或多种，包括全部。

92.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E或PD-L1中的一种或多种，包括全部。

93.如权利要求1-76和92中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或A20/TNFAIP以及任选地MANF中的一种或多种，包括全部。

94.如权利要求1-76、92和93中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子包括HLA-E、PD-L1或MANF、以及任选地A20/TNFAIP中的一种或多种，包括全部。

95.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E、HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8。

96.如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含根据以下的修饰：

(i)

(a)降低一种或多种MHC I分子和/或一种或多种MHC II分子的表达；和

(b)增加CD47的表达；

(ii)

(a)降低一种或多种MHC I分子和/或一种或多种MHC II分子的表达；

(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

(c)增加CD47、以及任选地CD24和PD-L1的表达；和

(d)增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达；

(iii)

(a)降低一种或多种MHC I类分子的表达；

(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

(c)降低TXNIP的表达；

(d)增加PD-L1和HLA-E的表达；和

(e)任选地，增加A20/TNFAIP3和MANF的表达；

(iv)

(a)增加CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达；和

(b)降低MICA和/或MICB的表达；

(v)

(a)上述(i)-(iv)中任一项还包括增加或减少靶标表达的另外的编辑。

97.如权利要求75所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

98.如权利要求1-75中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

99.如权利要求97或98所述的工程化细胞，其中CD47具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一部分具有至少约85％同一性的氨基酸序列。

100.如权利要求1-99中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子的增加的表达包括所述一种或多种致耐受性因子的增加的细胞表面表达。

101.如权利要求100所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的一种是外源多肽。

102.如权利要求100或101所述的工程化细胞，其中所述修饰包含编码所述一种或多种致耐受性因子的一种或多种外源多核苷酸。

103.如权利要求102所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种与启动子可操作地连接。

104.如权利要求103所述的工程化细胞，其中所述启动子是组成型启动子。

105.如权利要求103或104所述的工程化细胞，其中所述启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1a启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和UBC启动子。

106.如权利要求103-105中任一项所述的工程化细胞，其中将所述一种或多种外源多核苷酸整合到一个或多个基因组基因座中。

107.如权利要求106所述的工程化细胞，其中所述整合是非靶向插入。

108.如权利要求107所述的工程化细胞，其中所述非靶向插入是通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述细胞中进行的。

109.如权利要求106所述的工程化细胞，其中所述整合是靶向插入。

110.如权利要求106-109中任一项所述的工程化细胞，其中所述一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组：MICA基因座、MICB基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRBC基因座、CD142基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、ROSA26基因座、LRP1基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

111.如权利要求106-110中任一项所述的工程化细胞，其中所述一个或多个基因组基因座中的每一个选自由以下组成的组：B2M基因座、TAP1基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、MIC-A基因座、MIC-B基因座和安全港基因座。

112.如权利要求106所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26和SHS231基因座。

113.如权利要求1-107中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子的表达增加包括经由启动子增加内源基因的基因活性的修饰。

114.如权利要求113所述的工程化细胞，其中所述增加基因活性的修饰通过修饰内源启动子或引入异源启动子来进行。

115.如权利要求1-114中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于人类细胞或动物细胞，任选地猪细胞、牛细胞或羊细胞。

116.如权利要求115所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于人类细胞。

117.如权利要求1-116中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于从多能干细胞或其后代衍生的分化细胞。

118.如权利要求117所述的工程化细胞，其中所述多能干细胞是或来源于诱导多能干细胞。

119.如权利要求1-118中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于从供体受试者分离的原代细胞。

120.如权利要求119所述的工程化细胞，其中所述供体受试者在从所述供体受试者获得所述原代时是健康的或没有被怀疑患有疾病或疾患。

121.如权利要求1-120中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞选自β胰岛细胞、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、内皮细胞、皮肤细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、肌肉细胞、心脏细胞、血细胞、胰岛细胞、平滑肌细胞、神经胶质祖细胞、神经细胞、心肌细胞、视觉细胞、干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(PSC)。

122.如权利要求1-121中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于内皮细胞。

123.如权利要求1-121中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于上皮细胞。

124.如权利要求1-121中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于多能干细胞。

125.如权利要求1-121中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于胚胎干细胞。

126.如权利要求1-121中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是或来源于间充质谱系的细胞。

127.如权利要求1-126中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是以下中的一种或多种：ABO血型O型；恒河猴因子阴性(Rh-)，其包含功能性ABO A等位基因和/或功能性ABO B等位基因；或恒河猴因子阳性(Rh+)。

128.如权利要求1-127中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。

129.一种细胞群，所述细胞群包含如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞。

130.如权利要求129所述的细胞群，其中所述群体中至少约30％的细胞包含来自权利要求91中任一项的工程化细胞。

131.如权利要求129或130所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含所述修饰。

132.如权利要求129-131中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICA多肽的细胞表面表达。

133.如权利要求129-132中任一项所述的细胞群，其中所述工程化细胞上降低的所述MICA多肽的表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

134.如权利要求129-133中任一项所述的细胞群，其中所述群体中至少约50％的细胞不具有所述MICA多肽的细胞表面表达。

135.如权利要求129-134中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达。

136.如权利要求129-135中任一项所述的细胞群，其中所述工程化细胞上所述MICB多肽的降低的表面表达被降低至比相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低约60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

137.如权利要求129-136中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％的细胞不具有所述MICB多肽的细胞表面表达。

138.如权利要求129-137中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码所述一种或多种致耐受性因子的外源多核苷酸。

139.如权利要求129-138中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸。

140.如权利要求129-139中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHCI类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达。

141.如权利要求129-140中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。

142.如权利要求129-141中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的B2M和/或CIITA表达。

143.如权利要求129-142中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使B2M基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

144.如权利要求129-143中任一项所述的细胞群，其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含使CIITA基因的两个等位基因均失活的一个或多个改变。

145.一种组合物，所述组合物包含如权利要求129-144中任一项所述的细胞群。

146.一种组合物，所述组合物包含如权利要求129-145中任一项所述的工程化细胞群，其中：

(a)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICA多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICA多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；

(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和

(c)其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

147.一种组合物，所述组合物包含如权利要求129-145中任一项所述的工程化细胞群，其中：

(a)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；

148.一种组合物，所述组合物包含如权利要求129-145中任一项所述的工程化细胞群，其中：

(b)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞具有降低的所述MICB多肽的细胞表面表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述MICB多肽表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICB多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达；

(c)相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含编码CD47的外源多核苷酸；和

(d)其中相对于不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞，所述群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％中任一者的细胞包含降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子的表达，并且其中在所述工程化细胞上降低的所述一种或多种MHC I类分子和/或所述一种或多种MHC II类分子表面表达被降低至比在不包含所述修饰的同一细胞类型的未修饰或未改变的细胞上的所述MICA多肽细胞表面表达的水平低60％或更低的水平，任选地其中不存在可检测的表面表达。

149.一种包含工程化原代β胰岛细胞群的组合物，其中所述工程化原代β胰岛细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

150.一种包含工程化原代T细胞群的组合物，其中所述工程化原代T细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因；和(ii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

151.一种包含工程化原代甲状腺细胞群的组合物，其中所述工程化原代甲状腺细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

152.一种包含工程化原代皮肤细胞群的组合物，其中所述工程化原代皮肤细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

153.一种包含工程化原代内皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代内皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

154.一种包含工程化原代视网膜色素上皮细胞群的组合物，其中所述工程化原代视网膜色素上皮细胞包含：(i)MICA基因的所有等位基因的失活或破坏和/或MICB基因的所有等位基因的失活或破坏；(ii)包含编码CD47的外源多核苷酸的转基因(CD47tg)；和(iii)B2M基因的所有等位基因的失活或破坏。

155.如权利要求149-154中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞在所述B2M基因的所有等位基因中包含插入缺失。

156.如权利要求149-155中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞还包含CIITA基因的所有等位基因的失活或破坏。

157.如权利要求149-156中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞在所述CIITA基因的所有等位基因中包含插入缺失。

158.如权利要求149-157中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

159.如权利要求149-157中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

160.如权利要求149-157中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞具有表型MICA^indel/indel；MICB^indel/indel；B2M^indel/indel；CIITA^indel/indel；CD47tg。

161.如权利要求145-160中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞使用基于核酸酶的基因编辑进行工程化。

162.如权利要求145-161中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

163.如权利要求145-162中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载剂。

164.如权利要求145-163中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。

165.如权利要求164所述的组合物，其中所述冷冻保护剂包含浓度为约5％至约10％DMSO(v/v)的DMSO。

166.一种容器，所述容器包含如权利要求145-165中任一项所述的组合物。

167.如权利要求166所述的容器，其中所述容器是无菌袋。

168.如权利要求167所述的容器，其中所述无菌袋是冷冻保存相容的。

169.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：

(a)降低或消除源细胞中一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；

(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和

(c)降低或消除所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

170.一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，其中所述受试者被怀疑患有或患有自身免疫性疾病，所述方法包括：

(a)降低或消除源细胞中MHC I类分子和/或MHC II类分子的表达；

(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和

(c)降低或消除所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

171.一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，其中所述受试者被确定具有抗MICA抗体和/或抗MICB抗体，所述方法包括：

(a)降低或消除源细胞中MHC I类分子和/或MHC II类分子的表达；

(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和

(c)降低或消除所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

172.如权利要求169-171中任一项所述的方法，其中所述方法包括如果受试者具有抗MICA抗体，则降低或消除MICA的表达，任选地进一步降低或消除MICB的表达。

173.如权利要求169-171中任一项所述的方法，其中所述方法包括如果受试者具有抗MICB抗体，则降低或消除MICB的表达，任选地进一步降低或消除MICA的表达。

174.如权利要求169-171中任一项所述的方法，其中所述方法包括如果受试者具有抗MICA抗体和抗MICB抗体，则降低或消除MICA和MICB的表达。

175.一种制备用于受试者的工程化细胞的方法，所述方法包括：

(b)增加所述源细胞中一种或多种致耐受性因子的表达；和

(c)当个体被确定具有特异性地识别多肽的抗体时，降低或消除所述源细胞中所述多肽的表面表达。

176.如权利要求169-175中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDOl、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、MFGE8和SERPINB9、及其任何组合。

177.如权利要求169-176中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子选自由以下组成的组：CD47、PD-L1、HLA-E或HLA-G、CCL21、FASL、SERPINB9、CD200和MFGE8、及其任何组合。

178.如权利要求169-177中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

179.如权利要求169-178中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述一种或多种MHC I类分子和所述一种或多种MHC II类分子的表达。

180.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：

(a)增加源细胞中CCL21、PD-L1、FASL、SERPINB9、HLA-G、CD47、CD200和MFGE8的表达；和

(b)降低所述源细胞中MICA和/或MICB的表达。

181.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括任何以下组合之一：

(i)

(b)降低MICA和/或MICB的表达；

(c)增加CD47、任选地CD24和PD-L1的表达；和

(d)增加CD46、CD55、CD59和CR1的表达；

(ii)

(a)降低一种或多种MHC I类分子的表达；

(b)降低MIC-A和/或MIC-B的表达；

(c)降低TXNIP的表达；

(d)增加PD-L1和HLA-E的表达；和

(e)任选地，增加A20/TNFAIP3和MANF的表达；

(iii)

(b)降低MICA和/或MICB的表达；

(iv)

(a)降低一种或多种MHC I类分子和/或一种或多种MHC II类分子的表达；和

(b)增加CD47的表达；

(v)

(i)-(iv)中任一项还包括增加或减少基因表达的另外的编辑。

182.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：

(a)敲除一种或多种MHC I分子；

(b)敲除MICA和/或MICB；

(c)敲除TXNIP；和

(d)敲入PD-L1和HLAE。

183.如权利要求180-182中任一项所述的方法，所述方法还包括敲入A20/TNFAIP3和MANF。

184.如权利要求169-183中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICA的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICA蛋白质表达。

185.如权利要求169-184中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICB的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICB蛋白质表达。

186.如权利要求169-185中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低或消除所述MICA和所述MICB的表达，并且其中所述降低或消除表达包括降低或消除MICA和MICB蛋白质表达。

187.如权利要求169-186中任一项所述的方法，其中所述降低或消除表达包括降低或消除细胞表面表达。

188.如权利要求169-187中任一项所述的方法，其中降低或消除表达包括引入降低或消除相关基因活性的修饰。

189.如权利要求188所述的方法，所述修饰是基因的两个等位基因的失活或破坏。

190.如权利要求189所述的方法，其中所述失活或破坏包括插入缺失。

191.如权利要求190所述的方法，其中所述插入缺失是所述基因的基因组DNA的连续段的移码突变或缺失。

192.如权利要求188-191中任一项所述的方法，其中所述方法包括敲除相关基因活性。

193.如权利要求188-192中任一项所述的方法，其中降低或消除所述一种或多种MHC I类分子表达的修饰是B2M的修饰。

194.如权利要求188-193中任一项所述的方法，其中降低或消除所述一种或多种MHC I类分子表达的修饰是CIITA的修饰。

195.如权利要求188-194中任一项所述的方法，其中所述修饰通过核酸酶介导的基因编辑来进行。

196.如权利要求195所述的方法，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas组合来进行。

197.如权利要求196所述的方法，其中所述CRISPR-Cas组合包含选自由以下组成的组的Cas：Cas9或Cas12。

198.如权利要求196或197所述的方法，其中所述核酸酶介导的基因编辑通过CRISPR-Cas组合来进行，其中所述CRISPR-Cas组合包含指导RNA(gRNA)。

199.如权利要求198所述的方法，其中所述CRISPR-Cas组合是包含gRNA和Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物。

200.如权利要求188-199中任一项所述的方法，其中增加所述一种或多种致耐受性因子表达的修饰包括引入编码所述一种或多种致耐受性因子的至少一种外源多核苷酸。

201.如权利要求200所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸是编码两种或更多种致耐受性因子的多顺反子载体。

202.如权利要求169-201中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子中的至少一种是CD47。

203.如权利要求189-202中任一项所述的方法，其中将所述至少一种多核苷酸整合到所述细胞的基因组中。

204.如权利要求203所述的方法，其中所述整合通过非靶向插入来进行。

205.如权利要求204所述的方法，其中所述整合通过慢病毒载体来进行。

206.如权利要求203所述的方法，其中所述整合通过靶向插入到靶标基因组基因座中来进行。

207.如权利要求206所述的方法，其中所述整合通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

208.如权利要求206或207所述的方法，其中所述靶基因组基因座选自由以下组成的组：MICA基因座、MICB基因座、B2M基因座、CIITA基因座、CD142基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、ROSA26基因座、LRP1基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。

209.如权利要求169-208中任一项所述的方法，所述方法还包括实施细胞分化技术，使得所述工程化细胞被分化成期望的细胞类型。

210.如权利要求169-209中任一项所述的方法，其中所述源细胞从供体受试者中分离。

211.如权利要求210所述的方法，其中所述供体受试者是健康的或者在分离的时候没有被怀疑患有疾病或疾患。

212.一种工程化细胞，所述工程化细胞使用如权利要求169-211中任一项所述的方法来产生。

213.一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞、如权利要求129-144中任一项所述的工程化细胞群或如权利要求145-165中任一项所述的组合物。

214.如权利要求213所述的方法，其中所述疾患是疾病或细胞缺陷。

215.如权利要求213或214所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、乳糜泻、格雷夫斯病、银屑病、结肠炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、阿狄森氏病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎和恶性贫血。

216.如权利要求214所述的方法，其中所述细胞缺陷与造血疾病或病症相关，或者所述疾病或疾患是造血疾病或病症。

217.如权利要求216所述的方法，其中所述造血疾病或病症是脊髓发育不良、再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞病、戴-布二氏贫血、沙赫曼戴蒙氏病、科斯特曼综合征、慢性肉芽肿病、肾上腺脑白质营养不良、白细胞粘附缺陷、血友病、地中海贫血、β-地中海贫血、白血病诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性(髓系)白血病(AML)、成人淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性髓系白血病(CML)、幼年型慢性髓性白血病(CML)和幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、严重联合免疫缺陷病(SCID)、X连锁严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽肿病、Chediak-Higashi综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或AIDS。

218.如权利要求213或214所述的方法，其中所述细胞缺陷与白血病或骨髓瘤相关，或者其中所述疾病或疾患是白血病或骨髓瘤。

219.如权利要求213或214所述的方法，其中所述细胞缺陷与自身免疫性疾病或疾患相关，或者所述疾病或疾患是自身免疫性疾病或疾患。

220.如权利要求219所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或疾患是急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增殖综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病、巴洛同心硬化症、贝赫切特综合征、伯杰氏病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈病、德库姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、附着点炎相关性关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化纤维发育不良、纤维化肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线性IgA病(LAD)、卢伽雷氏病、狼疮性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、米勒-费雪综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆哈-哈伯曼病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、视神经鞘炎、神经性肌强直、眼部瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、甲状腺炎、回文性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、拉斯穆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳氏病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、斯威特综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。

221.如权利要求216-220中任一项所述的方法，其中所述细胞群是包含造血干细胞(HSC)和/或其衍生物的群体。

222.如权利要求214所述的方法，其中所述细胞缺陷与帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、神经精神障碍性中风或肌萎缩侧索硬化症(ALS)相关，或者其中所述疾病或疾患是帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、神经退行性疾病或疾患、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、神经精神障碍性中风或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

223.如权利要求222所述的方法，其中所述细胞群是包含神经细胞和/或神经胶质细胞的群体。

224.如权利要求213-223中任一项所述的方法，其中所述个体在循环中存在抗MICA抗体和/或抗MICB抗体。

225.如权利要求224所述的方法，其中所述个体表现出所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的持续存在。

226.如权利要求224或225所述的方法，其中所述个体患有导致所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体存在的自身免疫相关疾患。

227.如权利要求226所述的方法，其中所述自身免疫相关疾病是桥本氏病。

228.如权利要求226所述的方法，其中所述自身免疫相关疾病是狼疮。

229.如权利要求226所述的方法，其中所述自身免疫相关疾病是多发性硬化症。

230.如权利要求213-229中任一项所述的方法，其中基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在选择所述个体进行所述治疗。

231.如权利要求213-230中任一项所述的方法，所述方法还包括基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在选择所述个体进行所述治疗。

232.如权利要求231所述的方法，其中选择所述个体还包括测量所述个体中所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体的存在。

233.一种使用同种异体疗法治疗个体的疾患的方法，所述方法包括：

(a)确定所述个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态，

其中阳性抗MICA抗体状态表明来自所述个体的血清样品中存在抗MICA抗体，并且

其中阳性抗MICB抗体状态表明来自所述个体的血清样品中存在抗MICB抗体；和

(b)基于所述抗MICA抗体和/或所述抗MICB抗体状态，向所述个体施用包含如129-144中任一项所述的工程化细胞群的组合物或如权利要求145-165中任一项所述的组合物，

其中如果所述抗MICA抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA表达，

其中如果所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICB表达，并且

其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述群体的工程化细胞包含降低的MICA和MICB表达。

234.如权利要求233所述的方法，所述方法还包括基于所述个体的所述抗MICA抗体状态和/或所述抗MICB抗体状态选择所述个体进行所述治疗。

235.如权利要求233或234所述的方法，所述方法还包括测量所述个体的所述抗MICA抗体状态和/或所述抗MICB抗体状态。

236.一种鉴定适用于有需要的个体的同种异体疗法的方法，

其中所述同种异体疗法包括包含如权利要求129-144中任一项所述的工程化细胞群的组合物或如权利要求145-165中任一项所述的组合物，

所述方法包括确定所述个体的抗MICA抗体和/或抗MICB抗体状态以鉴定适用于所述个体的同种异体疗法，

其中如果所述抗MICA抗体状态为阳性，则所述合适的同种异体疗法包括包含降低的MICA表达的群体的工程化细胞，

其中如果所述抗MICB抗体状态为阳性，则所述合适的同种异体疗法包括包含降低的MICB表达的群体的工程化细胞，并且

其中如果所述抗MICA抗体状态和所述抗MICB抗体状态为阳性的，则所述合适的同种异体疗法包括包含降低的MICA和MICB表达的群体的工程化细胞。

237.如权利要求213-235中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用一种或多种免疫抑制剂。

238.如权利要求213-235中任一项所述的方法，其中已经向所述个体施用一种或多种免疫抑制剂。

239.如权利要求237或238所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是小分子或抗体。

240.如权利要求237-239中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂选自由以下组成的组：环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、霉酚酸酯、皮质类固醇、泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(胸腺肽-α)和免疫抑制抗体。

241.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环孢菌素。

242.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括霉酚酸酯。

243.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括皮质类固醇。

244.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括环磷酰胺。

245.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括雷帕霉素。

246.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506)。

247.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括抗胸腺细胞球蛋白。

248.如权利要求237-240中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂是一种或多种免疫调节剂。

249.如权利要求248所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂是小分子或抗体。

250.如权利要求239或权利要求249所述的方法，其中所述抗体结合一种或多种受体或配体，所述一种或多种受体或配体选自由以下组成的组：IL-2受体的p75、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD58、以及与其任何配体结合的抗体。

251.如权利要求237-250中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

252.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

253.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

254.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

255.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

256.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在第一次施用所述工程化细胞的同一天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

257.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化细胞之后，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

258.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

259.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

260.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

261.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

262.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

263.如权利要求237-251中任一项所述的方法，其中在所述工程化细胞的第一次施用和/或第二次施用的施用之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间，向所述个体施用或已经向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂。

264.如权利要求237-263中任一项所述的方法，其中与为了减少不包含所述工程化细胞的所述修饰的免疫原性细胞的免疫排斥而施用的一种或多种免疫抑制剂的剂量相比，以更低的剂量施用所述一种或多种免疫抑制剂。

265.如权利要求237-264中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞能够受控杀伤所述工程化细胞。

266.如权利要求237-265中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含自杀基因或自杀开关。

267.如权利要求266所述的方法，其中所述自杀基因或自杀开关在药物或前药的存在下或在被选择性外源化合物活化时诱导受控细胞死亡。

268.如权利要求266或权利要求267所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关是能够诱导所述工程化细胞的细胞凋亡的诱导蛋白。

269.如权利要求268所述的方法，其中能够诱导所述工程化细胞的细胞凋亡的诱导蛋白是胱天蛋白酶蛋白质。

270.如权利要求269所述的方法，其中所述胱天蛋白酶蛋白是胱天蛋白酶9。

271.如权利要求266-270中任一项所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

272.如权利要求266-271中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之后，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

273.如权利要求266-271中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述一种或多种免疫抑制剂之前，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

274.如权利要求266-273中任一项所述的方法，其中在向所述个体施用所述工程化细胞之后，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

275.如权利要求266-274中任一项所述的方法，其中在对所述个体产生细胞毒性或其他负面后果的情况下，所述自杀基因或所述自杀开关被活化以诱导受控细胞死亡。

276.如权利要求180-275中任一项所述的方法，所述方法包括施用允许所述工程化细胞群的工程化细胞耗尽的剂。

277.如权利要求276所述的方法，其中允许所述工程化细胞耗尽的剂是识别所述工程化细胞的表面上表达的蛋白质的抗体。

278.如权利要求277所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：识别CCR4、CD16、CD19、CD20、CD30、EGFR、GD2、HER1、HER2、MUC1、PSMA和RQR8的抗体。

279.如权利要求277所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：莫格利珠单抗、AFM13、MOR208、奥妥珠单抗、乌利妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、利妥昔单抗、利妥昔单抗-Rllb、托木妥昔单抗、RO5083945(GA201)、西妥昔单抗、Hul4.18K322A、Hul4.18-IL2、Hu3F8、达妥昔单抗、c.60C3-Rllc及其生物类似药。

280.如权利要求213-236和276-278中任一项所述的方法，所述方法包括施用识别在所述工程化细胞的表面上的所述一种或多种致耐受性因子的剂。

281.如权利要求279所述的方法，其中所述工程化细胞被工程化以表达所述一种或多种致耐受性因子。

282.如权利要求279或280所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

283.如权利要求213-281中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用一种或多种另外的治疗剂。

284.如权利要求213-282中任一项所述的方法，其中已经向所述个体施用一种或多种另外的治疗剂。

285.如权利要求213-283中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述方法的治疗功效。

286.如权利要求213-284中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述方法的预防功效。

287.如权利要求213-285中任一项所述的方法，其中重复所述方法直到出现期望的对一种或多种疾病症状的抑制。

288.如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

289.如权利要求287所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

290.如权利要求287或权利要求288所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

291.如权利要求287或权利要求288所述的工程化细胞，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及所述一种或多种致耐受性因子由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

292.如权利要求289或权利要求290所述的工程化细胞，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述工程化细胞的基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述细胞中来整合。

293.如权利要求291所述的工程化细胞，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中所述靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

294.如权利要求286-292中任一项所述的工程化细胞，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

295.如权利要求169-211中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

296.如权利要求294所述的方法，其中所述自杀基因选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

297.如权利要求294或权利要求295所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

298.如权利要求294或权利要求295所述的方法，其中所述自杀基因或所述自杀开关以及所述一种或多种致耐受性因子由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

299.如权利要求296或权利要求297所述的方法，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述工程化细胞的基因组中来整合。

300.如权利要求296或权利要求297所述的方法，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述工程化细胞的靶基因组基因座中来整合。

301.如权利要求294-299中任一项所述的方法，其中所述一种或多种致耐受性因子是CD47。

302.如权利要求145-165中任一项所述的组合物，其中所述工程化细胞群的工程化细胞包含编码自杀基因或自杀开关的外源多核苷酸。

303.如权利要求301所述的组合物，其中所述自杀基因或所述自杀开关选自由以下组成的组：胞嘧啶脱氨酶(CyD)、疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)、诱导型胱天蛋白酶9(iCaspase9)和雷帕霉素活化的胱天蛋白酶9(rapaCasp9)。

304.如权利要求301或权利要求302所述的组合物，其中所述自杀基因以及与所述自杀基因或所述安全开关相关的基因由整合到所述工程化细胞群的工程化细胞基因组中的双顺反子盒表达。

305.如权利要求301或权利要求303所述的组合物，其中所述自杀基因或所述自杀开关和所述外源CD47由整合到所述工程化细胞的基因组中的双顺反子盒表达。

306.如权利要求303或权利要求304所述的组合物，其中所述双顺反子盒通过非靶向插入到所述基因组中来整合，任选地通过使用慢病毒载体将所述外源多核苷酸引入所述工程化细胞群的工程化细胞中来整合。

307.如权利要求303或权利要求304所述的组合物，其中所述双顺反子盒通过靶向插入到所述工程化细胞群的工程化细胞的靶基因组基因座中来整合，任选地其中所述靶向插入通过具有同源定向修复的核酸酶介导的基因编辑来进行。

308.如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞、如权利要求129-144中任一项所述的细胞群或如权利要求169-286中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞包含一个或多个修饰以增加一种或多种致耐受性因子的表达，其中所述一种或多种致耐受性因子中的每一种选自由以下组成的组：A20/TNFAIP3、C1-抑制剂、CCL21、CCL22、CD16、CD16 Fc受体、CD24、CD27、CD35、CD39、CD46、CD47、CD52、CD55、CD59、CD200、CR1、CTLA4-Ig、DUX4、FasL、H2-M3、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、IDO1、IL-10、IL15-RF、IL-35、MANF、Mfge8、PD-1、PD-L1或Serpinb9。

309.如权利要求1-128中任一项所述的工程化细胞或如权利要求169-286中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞是自体细胞。

310.如权利要求1-128中任一项所述的方法或如权利要求169-286中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞是同种异体细胞。