CN118382696A - 新型启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供高活性的启动子。一种DNA，其中，由选自下述(a)～(c)的核苷酸序列构成，并且具有启动子活性：(a)编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列；(b)与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和(c)对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列，MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F。
Description
技术领域
本发明涉及新型启动子。
背景技术
在利用微生物进行的物质的工业生产中，提高目标物质的生产率是重要的课题之一。目前，进行这用于提高利用微生物的物质生产率的生物工程的研究。其中之一是关于高活性启动子的研究。专利文献1中，作为在棒状杆菌属菌中发挥功能的高活性的启动子，公开了延伸因子tu的启动子。
专利文献2中，公开了对来自埃希氏属菌、棒状杆菌属菌的各种启动子序列进行了分析，由此合成在棒状杆菌属菌中作为高活性的启动子发挥功能的SPL1、SPL7、SPL13的启动子。
(专利文献1)日本特开2008-212155号公报
(专利文献2)日本特表2019-528075号公报
发明内容
在一个方式中，本发明提供一种DNA，其由选自下述(a)～(c)的核苷酸序列构成，并且具有启动子活性：
(a)编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列；
(b)与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(c)对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
在另外的一个方式中，本发明提供一种启动子，其由选自下述(g)～(i)的DNA构成：
(g)由编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列构成的DNA；
(h)由与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(i)由对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
在另外的一个方式中，本发明提供一种表达载体，其包含上述DNA或启动子。
在另外的一个方式中，本发明提供一种DNA表达盒，其包含上述DNA或启动子。
在另外的一个方式中，本发明提供一种棒状杆菌，其包含上述表达载体或上述DNA表达盒。
在另外的一个方式中，本发明提供一种目标物质的制造方法，其包括：培养上述棒状杆菌的步骤；和
从通过该培养得到的培养物回收目标物质的步骤。
附图说明
[图1]在tu启动子、SPL13启动子、或cg2875启动子的控制下利用HFM122从ABA向AHBA的转变活性。
[图2]在tu启动子、SPL13启动子、或cg2875启动子的控制下利用HFM122的AHBA转变率。
[图3]在tu启动子、SPL13启动子、或cg2875启动子的控制下报告蛋白的表达量(用相对于tu启动子的相对荧光强度表示)。
[图4]在tu启动子、SPL13启动子、cg2875启动子、或缩短的cg2875启动子的控制下利用HFM122的AHBA转变率。
[图5]在tu启动子、SPL13启动子、或cg2875基因的同源启动子的控制下利用HFM122的AHBA转变率。
具体实施方式
在本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性根据Lipman-Pearson法(Science，1985，227：1435-1441)计算。具体而言，利用遗传信息处理软件GENETYX Ver.12的同源性分析程序，将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析，由此来算出。
在本说明书中，核苷酸序列相关的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选为95％以上、更优选为96％以上、进一步优选为97％以上、更进一步优选为98％以上、特别优选为99％以上的同一性。
在本说明书中，只要没有另外进行定义，核苷酸序列中关于核苷酸的缺失、取代、添加或插入所使用的“1个或数个”是指优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、更进一步优选为1～3个、特别优选为1个或2个。在本说明书中，核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加1个或数个核苷酸。
在本说明书中，“氨基酸残基”是指构成蛋白质的20种氨基酸残基、丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。
在本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”，是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，基因的“上游序列”、“下游序列”分别是指在DNA正义链中位于该基因的5’侧和3’侧的序列。例如，“与基因的上游连结的启动子”是指在DNA正义链中在基因的5’侧存在启动子。另外，例如，“基因的上游的核苷酸序列”是指在DNA正义链中存在于基因的5’侧、即该基因的起始密码子相邻的5’侧的核苷酸序列。
在本说明书中，基因与启动子等的控制区域的“能够工作地连结”是指基因与控制区域以该基因能够在该控制区域的控制下表达的方式连结。基因与控制区域“能够工作地连结”的步骤对于本领域技术人员来说是公知的。
在本说明书中，“启动子活性”是指促进DNA(基因)向mRNA的转录的活性。启动子活性能够通过使用适当的报告基因来确认。例如，能够通过在启动子的下游连结编码能够检测的蛋白质的DNA、即报告基因，测定该报告基因的基因产物的生产量，来确认启动子活性。作为报告基因的例子，可以列举β-半乳糖苷酶(LacZ)基因、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、编码EtbC(2,3-dihydroxy-ethylbenzene 1,2-dioxygenase，2,3-二羟基-乙基苯1,2-双加氧酶)的基因等的对显色底物产生作用的酶的基因、编码GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)的基因等的荧光蛋白质的基因等。或者，启动子活性也能够通过对从报告基因转录的mRNA的表达量通过定量RT-PCR等进行测定来确认。或者，启动子活性也能够通过测定报告基因所编码的蛋白质涉及的反应来确认。例如，作为4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶(EC1.14.13.2)已知的HFM122(NCBIReference Sequence：WP_010920262.1)及其突变体(参照日本特开2021-73914号公报)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性，能够将4-氨基苯甲酸(4-ABA)转变为4-氨基-3-羟基苯甲酸(4,3-AHBA)。将编码HFM122的基因作为报告基因使用时，能够测定4-ABA、4,3-AHBA或双方的浓度或者基于该浓度算出从4-ABA向4,3-AHBA的转变率，来测定启动子的活性。
在本说明书中，“目标物质”是指细胞所生产的物质，并且是期待其生产或生产量的增加的物质。作为目标物质，包含基因(目标基因)所编码的物质、由于基因(目标基因)所编码的物质的工作所生产的物质、由于基因(目标基因)所编码的物质的工作而生产量增加的物质。
本发明提供新型启动子、和使用了该启动子的目标物质的制造方法。
本发明的发明人对来自棒状杆菌属菌的启动子进行了研究，发现了具有高的转录活性的新型的启动子。
本发明的启动子的转录活性高、能够显著提高作为控制对象的基因的转录量。根据本发明的启动子，能够提高目标物质的微生物学的生产的效率。
本发明的发明人发现，来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因之中、Gene ID：cg2875所示的基因的起始密码子的上游613bp的核苷酸序列(序列号1)所构成的DNA与作为公知的高活性启动子的tu启动子、SPL13启动子相比具有高的启动子活性(图1～3)。谷氨酸棒状杆菌所具有的cg2875基因由编码序列号3的氨基酸序列的序列号2的核苷酸序列构成，是通过ORF预测软件Glimmer预测为ORF的基因。cg2875基因所编码的蛋白质已知是膜蛋白质，被分枝菌酸化，但其功能、表达量至今仍是未知的(Issa，H.et al.，PLoS One，2017，12(2)：e0171955)。
另外，本发明的发明人发现，cg2875基因的上游的核苷酸序列之中、cg2875基因的上游208bp的核苷酸序列(序列号23)所构成的DNA与tu启动子、SPL13启动子相比，具有高的启动子活性(图4)。该DNA只要包含3’末端的至少86bp的核苷酸序列(序列号21)，则具有与tu启动子、SPL13启动子同等的启动子活性。
另外，本发明的发明人发现，cg2875基因的同源基因的上游的核苷酸序列(序列号26～41)所构成的DNA与tu启动子、SPL13启动子相比，具有高的启动子活性(图5)。其中，“cg2875基因的同源基因”是指推测为编码具有与cg2875蛋白质同等的功能的多肽的基因，例如，在将cg2875基因的启动子的核苷酸序列(序列号23)设为query的BLAST检索中Querycover为98％以上的核苷酸序列的下游的基因、编码在将cg2875蛋白质的氨基酸序列(序列号3)设为query的BLAST检索中Query cover为100％的氨基酸序列的基因等。该同源基因所编码的氨基酸序列也包含cg2875基因所编码的氨基酸序列，能够如下所示地表示。
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS(序列号169)
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
作为“cg2875基因的同源启动子”，例如，可以列举在将cg2875基因的启动子的核苷酸序列(序列号23)设为query的BLAST检索中Query cover为98％以上的核苷酸序列所构成的启动子、编码在将cg2875蛋白质的氨基酸序列(序列号3)设为query的BLAST检索中Query cover为100％的氨基酸序列的基因的上游的核苷酸序列所构成的启动子等。
本发明涉及具有新型启动子活性的DNA、新型启动子、含有该DNA或该启动子的表达载体、DNA表达盒和转化体、以及使用了该转化体的目标物质的制造方法。
作为本发明的具有启动子活性的DNA，可以列举由选自下述(a)～(c)的核苷酸序列构成的、具有启动子活性的DNA。
(a)编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列；
(b)与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(c)对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
编码由上述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列长只要具有启动子活性即可，没有特别限定，优选为85bp以上、更优选为100bp以上、进一步优选为200bp以上，优选为800bp以下、更优选为650bp以下、进一步优选为250bp以下，并且更进一步优选为208bp。该核苷酸序列长的范围优选为85～800bp、更优选为85～650bp、进一步优选为100～650bp、更进一步优选为100～250bp、特别优选为200～250bp、特别更优选为208bp。
优选本发明的具有启动子活性的DNA由选自下述(d)～(f)的核苷酸序列构成。(d)序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列；(e)与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和(f)对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
其中，由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA如后述实施例所示，具有启动子活性。将由序列号26～41的核苷酸序列构成的DNA来源的微生物种类示于下述表7。
更优选本发明的具有启动子活性的DNA由选自下述(d’)～(f’)的核苷酸序列构成。
(d’)序列号23的核苷酸序列；
(e’)与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f’)对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
进一步优选本发明的具有启动子活性的DNA在选自上述(d’)～(f’)的核苷酸序列中包含选自下述(d”)～(f”)的核苷酸序列。
(d”)序列号21的核苷酸序列；
(e”)与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f”)对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
本发明的具有启动子活性的DNA是至少在棒状杆菌中具有启动子活性的DNA。优选本发明的具有启动子活性的DNA与tu启动子相比提高了启动子活性。更优选本发明的具有启动子活性的DNA与SPL13启动子相比提高了启动子活性。
作为本发明的启动子，可以列举由选自下述(g)～(i)的DNA构成的启动子。
(g)由编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列构成的DNA；
(h)由与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(i)由对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
编码由上述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列长只要具有启动子活性即可，没有特别限定，优选为85bp以上、更优选为100bp以上、进一步优选为200bp以上、优选为800bp以下、更优选为650bp以下、进一步优选为250bp以下，并且更进一步优选为208bp。该核苷酸序列长的范围优选为85～800bp、更优选为85～650bp、进一步优选为100～650bp、更进一步优选为100～250bp、特别优选为200～250bp、特别更优选为208bp。
优选本发明的启动子由选自下述(j)～(l)的DNA构成。
(j)由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA；
(k)由与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l)由对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
其中，由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA如后述实施例所示，具有启动子活性。将由序列号26～41的核苷酸序列构成的DNA来源的微生物种类示于下述表7。
更优选本发明的启动子由选自下述(j’)～(l’)的DNA构成。
(j’)由序列号23的核苷酸序列构成的DNA；
(k’)由与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l’)由对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
进一步优选本发明的启动子在选自上述(j’)～(l’)的DNA中包含选自下述(j”)～(l”)的DNA。
(j”)由序列号21的核苷酸序列构成的DNA；
(k”)由与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l”)由对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
本发明的启动子至少在棒状杆菌中具有启动子活性。优选本发明的启动子与tu启动子相比提高了启动子活性。更优选本发明的启动子与SPL13启动子相比提高了启动子活性。
以下，将本发明的具有启动子活性的DNA和本发明的启动子一起称为“本发明的启动子等”。
作为本发明的启动子等的获得方法，没有特别限制，能够通过通常的化学合成法或基因工程的手法获得。例如，能够基于本发明的启动子等的核苷酸序列(例如，序列号1、21～23和26～41)，人工合成本发明的启动子等。人工合成中，例如，能够利用由GenScript公司等提供的市售的DNA合成服务。或者，从谷氨酸棒状杆菌等的微生物，例如，能够根据《分子克隆实验指南》(第3版)(Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRDEDITION)(Joseph Sambrook，David W.Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)记载的方法，克隆本发明的启动子等的核苷酸序列(例如，序列号1、21～23和26～41)。
本发明的启动子等还能够通过对本发明的启动子等的核苷酸序列(例如，序列号1、21～23和26～41)的DNA导入突变来制造。作为突变导入的手法，例如，可以列举紫外线照射和位点特异性突变导入法。作为位点特异性突变导入的手法，可以列举重叠延伸(Splicing overlap extension(SOE))PCR(Horton et al.，Gene 77，61-68，1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995)、Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，488)等。或者，还能够利用Site-DirectedMutagenesis System Mutan-SuperExpress Km试剂盒(TAKARA BIO)、TransformerTM Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)等的市售的位点特异性突变导入用试剂盒。通过从进行了突变导入的DNA选择所期望的具有启动子活性的DNA，能够获得本发明的启动子等。例如，通过在进行突变导入的DNA的下游能够工作地连结目标基因，并进行该目标基因的表达量解析，能够选择具有启动子活性的DNA。
或者，对核苷酸序列进行核苷酸的缺失、取代、添加、或插入的方法例如记载于Dieffenbach等(Cold Spring Harbar Laboratory Press，New York，581-621，1995)。
通过使用上述的手法，能够获得由与本发明的启动子等的核苷酸序列(例如，序列号1、21～23和26～41)具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成的本发明的启动子等、或由对本发明的启动子等的核苷酸序列(例如，序列号1、21～23和26～41)缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成的本发明的启动子等。
本发明的启动子等具有控制配置于其下游的基因的表达的功能。通过利用本发明的启动子等，能够得到具有转录活性优异的表达控制区域的DNA片段。例如，能够构建包含目标基因和在其上游能够工作地连结的本发明的启动子等的DNA片段。该DNA片段中，除了本发明的启动子等和目标基因以外，还可以含有提高该启动子等的转录活性这样的顺式作用元件、或终止子。另外，该DNA片段还可以含有耐药性基因、营养需求性标记基因等的选择标记基因。优选包含该目标基因和本发明的启动子等的DNA片段是用于表达该目标基因的DNA表达盒。
上述的包含本发明的启动子等的DNA片段能够以在两末端具有限制酶识别序列的方式构建。使用该限制酶识别序列，能够将本发明的启动子等导入载体中。例如，通过将载体用限制酶切断，在其中添加包含本发明的启动子等且在端部具有限制酶切断序列的DNA片段，能够将本发明的启动子等导入载体中(限制酶法)。
包含本发明的启动子等的DNA片段可以直接导入宿主细胞的基因组中。例如，可以将包含本发明的启动子等的DNA片段导入宿主细胞的基因组中的目标基因的上游。另外，例如，也可以将上述的包含目标基因和本发明的启动子等的DNA表达盒导入宿主细胞的基因组中。
或者，通过将本发明的启动子等插入能够表达目标基因的表达载体中，可以得到能够将该目标基因的表达提高到转录水平的表达载体。在该表达载体中，本发明的启动子等可以能够工作地与编码目标基因的DNA的上游连结。具有本发明的启动子等的表达载体可以是用于导入宿主细胞的染色体的载体，也可以是在染色体外保持的载体。优选能够在宿主细胞内复制。
作为表达载体的例子，可以列举大肠杆菌用载体、棒状杆菌用载体等，例如能够使用质粒、黏粒、噬菌粒、噬菌体、转座子、BAC载体等。作为优选的载体的例子，可以列举pET21-a(+)、pUC18/19、pUC118/119、pBR322、pMW218/219、pZ1(Applied andEnvironmental Microbiology，1989，55：684-688)、pEKEx1(Gene，1991，102：93-98)、pHS2-1(Gene，1991，107：69-74)、pCLiK5MCS(日本特表2005-522218号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pNG2(FEMS Microbiology Letters，1990，66：119-124)、pAG1(日本特开昭61-52290号公报)、pHKPsacB1(国际公开公报第2014/007273号)等。
在上述表达载体、DNA片段中，配置于本发明的启动子等的下游的目标基因没有特别限定。例如，目标基因是编码目标物质或其合成相关的酶的基因。目标基因可以是编码异种表达产物的异种基因，也可以是从外部导入的同种来源的基因，也可以是编码宿主细胞本来具有的表达产物的基因，也可以是编码其它任意的蛋白质、肽、核酸等的基因。作为目标基因所编码的物质的例子，可以列举酶、激素、细胞因子、其它的生理活性肽、转运蛋白、非编码RNA等。作为酶的例子，可以列举氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂解酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase或Synthetase)、糖酵解系的酶、戊糖磷酸循环的酶、TCA循环的酶、参与芳香族化合物的合成的酶等。作为目标基因的优选例子，可以列举编码参与宿主细胞的芳香族化合物的合成的酶、例如没食子酸合成酶(记载于日本特开2009-065839号公报、日本特开2009-213392号公报)、AroF、AroG、PabAB、PabC等的基因等。作为芳香族化合物的例子，可以列举没食子酸、原儿茶酸(PCA)、氨基羟基苯甲酸(AHBA)、吡啶二羧酸(PDCA)、儿茶酚、4-羟基苯甲酸等。
通过使用通常的转化法、例如电穿孔法、转化(transformation)法、转染法、接合法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法等将包含本发明的启动子等的表达载体或DNA片段导入宿主细胞中，能够得到本发明的转化体。
作为导入上述载体、DNA片段的宿主细胞，只要是本发明的启动子等能够在其细胞内作为启动子发挥功能即可，没有特别限定，优选列举细菌、更优选列举棒状杆菌。作为棒状杆菌的例子，优选谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)等，更优选谷氨酸棒状杆菌。此外，根据分子生物学上的分类，黄短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)等的棒状杆菌型细菌的菌名统一为谷氨酸棒状杆菌(Liebl Wet al，Int J Syst Bacteriol，1991，41：255-260；驹形和男等，发酵和工业，1987，45：944-963)。
上述转化体能够用于目标物质的制造。例如，对包含具有编码目标物质或其合成相关的酶的基因和与该基因的上游能够工作地连结的本发明的启动子等的表达载体或DNA片段的转化体进行培养，在本发明的启动子等的控制下使该基因表达，生产目标物质。
目标物质的例子如上所述，作为优选的例子，可以列举上述的目标基因所编码的物质、和该物质的工作而合成的生成物、例如由上述的参与芳香族化合物的生产的酶生成的芳香族化合物。作为芳香族化合物的例子，可以列举没食子酸、原儿茶酸(PCA)、氨基羟基苯甲酸(AHBA)、吡啶二羧酸(PDCA)、儿茶酚、4-羟基苯甲酸等。
转化体的培养条件只要是该转化体的细胞能够增殖和目标物质能够生产的条件即可，没有特别限定。例如，在转化体为棒状杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以列举LB培养基、CGXII培养基(Journal of Bacteriology，1993，175：5595-5603)等，作为培养条件，可以列举培养温度为15℃～45℃、培养时间为1天～7天。转化体为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以列举LB培养基、M9培养基等，作为培养条件，可以列举培养温度为15℃～45℃、培养时间为1天～7天。
通过在培养后从培养物回收目标物质，能够获得目标物质。根据需要，还可以将回收的目标物质进一步进行精制。从培养物回收目标物质或进行精制的方法没有特别限定，根据公知的回收或精制方法进行即可。例如，回收培养物，根据需要通过超声波、加压等进行菌体破裂处理，接着，通过梯度法、过滤、离心分离等除去细胞成分之后，回收剩余的包含目标物质的组分即可。根据需要通过对所回收的组分施以透析、盐析、离子交换法、蒸馏、溶剂提取等的方法、或这些方法的组合，能够对目标物质进行精制。本发明的目标物质的制造方法中，转化体的培养和目标物质的回收可以通过分批式、半分批式和连续式的任一方法进行。
作为本发明的例示的实施方式，在本说明书中还公开了以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明不限定于这些实施方式。
〔1〕一种DNA，其中，所述DNA由选自下述(a)～(c)的核苷酸序列构成，并且具有启动子活性：
(a)编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列；
(b)与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(c)对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
〔2〕如〔1〕所述的DNA，其中，编码由上述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列长优选为85bp以上、更优选为100bp以上、进一步优选为200bp以上，优选为800bp以下、更优选为650bp以下、进一步优选为250bp以下，并且更进一步优选为208bp，该核苷酸序列长的范围优选为85～800bp、更优选为85～650bp、进一步优选为100～650bp、更进一步优选为100～250bp、特别优选为200～250bp、特别更优选为208bp。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的DNA，其中，所述DNA由选自下述(d)～(f)的核苷酸序列构成：
(d)序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列；
(e)与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f)对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的DNA，其中，所述DNA由选自下述(d’)～(f’)的核苷酸序列构成：
(d’)序列号23的核苷酸序列；
(e’)与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f’)对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔5〕如〔4〕所述的DNA，其中，所述DNA包含选自下述(d”)～(f”)的核苷酸序列：
(d”)序列号21的核苷酸序列；
(e”)与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f”)对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔6〕一种启动子，其中，所述启动子由选自下述(g)～(i)的DNA构成：
(g)由编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列构成的DNA；
(h)由与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(i)由对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
〔7〕如〔6〕所述的启动子，其中，编码由上述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列长优选为85bp以上、更优选为100bp以上、进一步优选为200bp以上，优选为800bp以下、更优选为650bp以下、进一步优选为250bp以下，并且更进一步优选为208bp，该核苷酸序列长的范围优选为85～800bp、更优选为85～650bp、进一步优选为100～650bp、更进一步优选为100～250bp、特别优选为200～250bp、特别更优选为208bp。
〔8〕如〔6〕或〔7〕所述的启动子，其中，所述启动子由选自下述(j)～(l)的DNA构成：
(j)由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA；
(k)由与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l)由对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔9〕如〔6〕～〔8〕中任一项所述的启动子，其中，所述启动子由选自下述(j’)～(l’)的DNA构成：
(j’)由序列号23的核苷酸序列构成的DNA；
(k’)由与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l’)由对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔10〕如〔9〕所述的启动子，其中，所述启动子包含选自下述(j”)～(l”)的DNA：
(j”)由序列号21的核苷酸序列构成的DNA；
(k”)由与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l”)由对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔11〕如〔1〕～〔5〕中任一项所述的DNA或〔6〕～〔10〕中任一项所述的启动子，其中，优选在棒状杆菌中具有启动子活性。
〔12〕一种表达载体，其中，所述表达载体包含〔1〕～〔5〕和〔11〕中任一项所述的DNA或〔6〕～〔11〕中任一项所述的启动子。
〔13〕如〔12〕所述的表达载体，其中，所述表达载体优选包含编码目标物质或其合成相关的酶的基因和与该基因的上游连结的上述DNA或启动子。
〔14〕如〔13〕所述的表达载体，其中，上述目标物质优选为芳香族化合物。
〔15〕一种DNA片段，其中，所述DNA片段包含〔1〕～〔5〕和〔11〕中任一项所述的DNA或〔6〕～〔11〕中任一项所述的启动子。
〔16〕如〔15〕所述的DNA片段，其中，所述DNA片段优选包含编码目标物质或其合成相关的酶的基因和与该基因的上游连结的上述DNA或启动子。
〔17〕如〔16〕所述的DNA片段，其中，上述目标物质优选为芳香族化合物。
〔18〕如〔15〕～〔17〕中任一项所述的DNA片段，其优选为DNA表达盒。
〔19〕一种转化体，其中，所述转化体包含〔12〕～〔14〕中任一项所述的表达载体、或〔15〕～〔17〕中任一项所述的DNA片段。
〔20〕如〔19〕所述的转化体，其中，所述转化体优选为棒状杆菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
〔21〕一种目标物质的制造方法，其中，包括：
培养〔19〕或〔20〕所述的转化体的步骤；和
从通过该培养得到的培养物回收目标物质的步骤。
〔22〕如〔21〕所述的方法，其中，上述目标物质优选为芳香族化合物，更优选为选自没食子酸、原儿茶酸、氨基羟基苯甲酸、吡啶二羧酸、儿茶酚和4-羟基苯甲酸中的至少1种。
〔23〕一种DNA，其中，所述DNA由选自下述(d)～(f)的核苷酸序列构成，并且具有启动子活性：
(d)序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列；
(e)与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f)对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔24〕如〔23〕所述的DNA，其中，所述DNA由选自下述(d’)～(f’)的核苷酸序列构成：
(d’)序列号23的核苷酸序列；
(e’)与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f’)对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔25〕如〔24〕所述的DNA，其中，所述DNA包含选自下述(d”)～(f”)的核苷酸序列：
(d”)序列号21的核苷酸序列；
(e”)与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f”)对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
〔26〕一种启动子，其中，所述启动子由选自下述(j)～(l)的DNA构成：
(j)由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA；
(k)由与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l)由对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔27〕如〔26〕所述的启动子，其中，所述启动子由选自下述(j’)～(l’)的DNA构成：
(j’)由序列号23的核苷酸序列构成的DNA；
(k’)由与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l’)由对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔28〕如〔27〕所述的启动子，其中，所述启动子包含选自下述(j”)～(l”)的DNA：
(j”)由序列号21的核苷酸序列构成的DNA；
(k”)由与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l”)由对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
〔29〕如〔23〕～〔25〕中任一项所述的DNA或〔26〕～〔28〕中任一项所述的启动子，其中，优选在棒状杆菌中具有启动子活性。
实施例
以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但是本发明不限定于此。
实施例1启动子活性评价用质粒的制作
1)pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L的制作
以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L(参照日本特开2021-073914号公报)为模板，使用引物(序列号4和5)扩增载体片段。另外，pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株所具有的tu启动子的控制下连结HFM122的47位的缬氨酸被亮氨酸取代、编码活性高于野生型的HFM122的HFM122_V47L的基因。另外，以ATCC13032株的基因组DNA为模板，使用引物(序列号6和7)，扩增在序列号1所示的Gene ID：cg2875的启动子序列(Pcg2875)添加了载体片段的接头序列的序列。将载体片段和Pcg2875片段用In-Fusion HD cloning kit(Clontech公司)连结，制作pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号8和9)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L。
2)pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L的制作
以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号10和11)扩增载体片段。另一方面，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务化学合成了专利文献2所公开的SPL13启动子序列(序列号12)。以所得到的包含SPL13启动子的DNA为模板，使用引物(序列号13和14)，扩增在SPL13启动子序列添加了载体片段的接头序列的序列。将载体片段和SPL13启动子片段用In-Fusion HDcloning kit(Clontech公司)连结，制作pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.ColiDH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号9和13)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L。
将上述1)和2)中所使用的引物示于表1。
[表1]
| 序列号 | 序列 |
| 4 | CCTGCAGGTACGTATTACAGAA |
| 5 | ATGCGCACTCAGGTGG |
| 6 | ATACGTACCTGCAGGCTCAACATGCGCGAAAATGG |
| 7 | CACCTGAGTGCGCATTGTGATCTCTCTTTCTGTTGTTC |
| 8 | CATTGCCCTTAAAGGTATCTAAATGAC |
| 9 | CGAGTGGCAGTCCTACG |
| 10 | ATGCGCACTCAGGTGGCTAT |
| 11 | CCTGCAGGTACGTATTACAG |
| 13 | ATACGTACCTGCAGGGGCGCTTCATGTCAACAATC |
| 14 | CACCTGAGTGCGCATTGTTTTGATCTCCTCCAATAATCTATG |
实施例2转化体的制作
使用实施例1中所得到的质粒pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L、和pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L，对后述的参考例1中得到的谷氨酸棒状杆菌KC341株通过电穿孔法(Bio-rad)进行转化。将所得到的转化细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基后，在30℃静置2天，将所得到的菌落作为转化体。
实施例3启动子活性的比较
1)转化体的培养
将实施例2中得到的转化体接种于加入有表2所示的CGXII培养基(含有硫酸卡那霉素50mg/L)10mL的试管中，在30℃以200rpm振荡培养2天。
[表2]
CGXII培养基组成(每1L)
| 葡萄糖 | 50g |
| (NH4)2SO4 | 10g |
| 脲 | 5g |
| KH2PO4 | 1g |
| K2HPO4 | 1g |
| MgSO4 7H2O | 0.25g |
| CaCl2 2H2O | 10mg |
| FeSO4 7H2O | 10mg |
| MnSO4 5H2O | 10mg |
| ZnSO4 7H2O | 1mg |
| CuSO4 5H2O | 0.2mg |
| NiCl2 6H2O | 0.02mg |
| 生物素(pH7) | 0.2mg |
| 胰蛋白胨 | 10g |
2)启动子活性的测定
通过HPLC进行4-氨基-3-羟基苯甲酸(4，3-AHBA，以下简称为AHBA)和4-氨基苯甲酸(4-ABA，以下简称为ABA)的定量。将提供给HPLC分析的培养液用37mM硫酸适当稀释后，使用AcroPrep 96滤板(0.2μmGHP膜，日本Pall)，进行杂质的除去。将HPLC的测定条件示于表3。另外，试验以N＝3进行。
[表3]
从AHBA浓度和ABA浓度根据以下的式子算出AHBA转变率。
AHBA转变率＝AHBA浓度/(AHBA浓度+ABA浓度)
如图1和2所示，与以tu启动子或SPL13启动子表达HFM122_V47L的菌株相比，以cg2875启动子表达的菌株中，底物ABA的浓度低、生产物的AHBA浓度高、AHBA转变率高。因此，显示cg2875启动子的活性高于tu启动子和SPL13启动子。
实施例4使用了报告蛋白的启动子活性评价用质粒的制作
1)pECsf_Pcg2875_mCherry的制作
以从TAKARA BIO株式会社购入的pmCherry Vector为模板，使用引物(序列号156和157)，扩增报告蛋白mCherry序列(序列号168)。以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L(参照日本特开2021-073914号公报)为模板，使用引物(序列号158和159)，扩增添加了mCherry片段的接头序列的载体片段。以ATCC13032株的基因组DNA为模板，使用引物(序列号160和161)，扩增在序列号1所示的Gene ID：cg2875的启动子序列(Pcg2875)添加了mCherry片段的接头序列和载体片段的接头序列的序列。将载体片段与mCherry片段、Pcg2875片段使用In-Fusion HD cloning kit(Clontech公司)连结，制作pECsf_Pcg2875_mCherry。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号162和163)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_Pcg2875_mCherry。
2)pECsf_tuD_mCherry的制作
以从TAKARA BIO株式会社购入的pmCherry Vector为模板，使用引物(序列号156和157)，扩增报告蛋白mCherry序列。以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L(参照日本特开2021-073914号公报)为模板，使用引物(序列号158和159)，扩增添加了mCherry片段的接头序列的载体片段。以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L(参照日本特开2021-073914号公报)为模板，使用引物(序列号164和165)，扩增在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株所具有的tu启动子的序列添加了mCherry片段的接头序列和载体片段的接头序列的序列。将载体片段与mCherry片段、tuD片段使用In-Fusion HD cloning kit(Clontech公司)连结，制作pECsf_tuD_mCherry。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPONGENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号162和163)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_tuD_mCherry。
3)pECsf_SPL13_mCherry的制作
以从TAKARA BIO株式会社购入的pmCherry Vector为模板，使用引物(序列号156和157)，扩增报告蛋白mCherry序列。以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L(参照日本特开2021-073914号公报)为模板，使用引物(序列号158和159)，扩增添加了mCherry片段的接头序列的载体片段。利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务化学合成了专利文献2所示的SPL13启动子序列。以所得到的包含SPL13启动子的DNA为模板，使用引物(序列号166和167)，扩增在SPL13启动子序列添加了mCherry片段的接头序列和载体片段的接头序列的序列。将载体片段与mCherry片段、SPL13启动子片段使用In-Fusion HD cloning kit(Clontech公司)连结，制作pECsf_SPL13_mCherry。使用所得到的质粒溶液，对ECOSCompetent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号162和163)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpinPlasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_SPL13_mCherry。
将上述1)～3)中所使用的引物示于表4。
[表4]
| 序列号 | 序列 |
| 156 | ATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| 157 | CTACTTGTACAGCTCGTCCA |
| 158 | CTATGCCAAGCTTCTTTCACCC |
| 159 | GAGCTGTACAAGTAGGGAGGTTTAAACAAGCGGCC |
| 160 | AGAAGCTTGGCATAGCTCAACATGCGCGAAAATGG |
| 161 | GCCCTTGCTCACCATTGTGATCTCTCTTTCTGTTGTTCG |
| 162 | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| 163 | GGCCTTTTGCTCACATGTTC |
| 164 | AGAAGCTTGGCATAGTAGCGTGTCAGTAGGCGCG |
| 165 | GCCCTTGCTCACCATTTAATTAATTCCTCCTTTTATATTATTCATAATTTAGATCC |
| 166 | AGAAGCTTGGCATAGGGCGCTTCATGTCAACAATCT |
| 167 | GCCCTTGCTCACCATTGTTTTGATCTCCTCCAATAATCTATG |
实施例5转化体的制作
使用实施例4中所得到的各质粒，通过电穿孔法(Bio-rad)对谷氨酸棒状杆菌DRHG145株(参照日本专利第6322576号公报)进行转化。将所得到的转化细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基后，在30℃静置2天，将所得到的菌落作为转化体。
实施例6启动子活性的比较
1)转化体的培养
将实施例5中得到的转化体接种于加入有表2所示的CGXII培养基(含有硫酸卡那霉素50mg/L)10mL的试管中，在30℃以200rpm振荡培养2天。
2)启动子活性的测定
使用酶标仪Infinite M Plex(TECAN社制)，以激发波长587nm、荧光波长610nm测定报告蛋白mCherr的荧光强度。另外，试验以N＝3进行。
将相对于tu启动子的相对荧光强度示于图3。与以tu启动子或SPL13启动子表达mCherry的菌株相比，以cg2875启动子表达的菌株中，荧光强度高。因此，显示cg2875启动子的活性高于tu启动子和SPL13启动子。
实施例7启动子区域的缩短
1)将启动子区域缩短为80bp的质粒的制作
以pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号15和16)，实施反向PCR(Inverse PCR)，制作将cg2875启动子(Pcg2875)缩短为80bp(序列号20)的质粒。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD One PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号24和25)，进行菌落PCR。将确认了将启动子区域缩短为80bp的质粒的导入的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S1_HFM122_V47L。
2)将启动子区域缩短为86bp的质粒的制作
作为反向PCR(Inverse PCR)的引物使用序列号15和17的引物，除此以外，与上述1)同样操作，得到将cg2875启动子缩短为86bp(序列号21)的质粒pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S2_HFM122_V47L。
3)将启动子区域缩短为96bp的质粒的制作
作为反向PCR(Inverse PCR)的引物使用序列号15和18的引物，除此以外，与上述1)同样操作，得到将cg2875启动子缩短为96bp(序列号22)的质粒pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S3_HFM122_V47L。
4)将启动子区域缩短为208bp的质粒的制作
作为反向PCR(Inverse PCR)的引物使用序列号15和19的引物，除此以外，与上述1)同样操作，得到将cg2875启动子缩短为208bp(序列号23)的质粒pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S4_HFM122_V47L。
将上述1)～4)中所使用的引物示于表5，将上述1)～4)中制备的启动子区域示于表6。
[表5]
[表6]
| 启动子名称序列 | 序列长 | 序列号 |
| Pcg2875序列号1 | 613bp | 1 |
| Pcg2875_S1序列号1第533-613位 | 80bp | 20 |
| Pcg2875_S2序列号1第527-613位 | 86bp | 21 |
| Pcg2875_S3序列号1第513-613位 | 96bp | 22 |
| Pcg2875_S4序列号1第405-613位 | 208bp | 23 |
实施例8转化体的制作
使用实施例7中得到的质粒pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S1_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S2_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S3_HFM122_V47L和pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S4_HFM122_V47L，除此以外，与实施例2同样操作，得到转化体。
实施例9启动子活性的比较
1)转化体的培养
使用实施例2和8中得到的转化体，除此以外，与实施例3的1)同样操作，对转化体进行培养。
2)启动子活性的测定
对于所得到的各培养液，与实施例3的2)同样操作，测定启动子活性。另外，试验以N＝3进行。
如图4所示，以将cg2875启动子缩短为208bp的cg2875_S4启动子表达HFM122_V47L的菌株与以tu或SPL13启动子表达HFM122_V47L的菌株相比，AHBA转变率高。因此，显示只要启动子区域具有208bp的长度，则cg2875启动子的活性高于tu启动子和SPL13启动子。另外，以将cg2875启动子缩短为86bp的cg2875_S2启动子表达HFM122_V47L的菌株，AHBA转变率为以tu或SPL13启动子表达HFM122_V47L的菌株的同等以上。另一方面，以将cg2875启动子缩短为80bp的cg2875_S1启动子表达HFM122_V47L的菌株与以tu或SPL13启动子表达HFM122_V47L的菌株相比，AHBA转变率低。因此，显示只要启动子区域具有86bp的长度，则cg2875启动子的活性为tu启动子和SPL13启动子的同等以上。
实施例10同源启动子的探索
1)cg2875启动子的核苷酸序列的BLAST检索
将208bp的cg2875_S4启动子的核苷酸序列(序列号23)提供给BLAST检索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TY PE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)。根据检索结果，提取Query cover为98％以上的匹配序列，结果获得42个的核苷酸序列(启动子序列)。另外，根据检索结果从各基因组序列提取Query cover为98％以上的匹配序列下游的基因的核苷酸序列42个。
2)cg2875的氨基酸序列的BLAST检索
将cg2875的氨基酸序列(序列号3)提供给BLAST检索。根据检索结果，获得提取Query cover为100％的匹配序列的8个的同源基因的氨基酸序列。另外，从各基因组序列提取8个的同源基因所编码的氨基酸序列的基因的上游的208bp的核苷酸序列(启动子序列)作为同源启动子序列。
3)同源启动子序列的提取
从208bp的cg2875_S4启动子的核苷酸序列、上述1)的42个的启动子的核苷酸序列、和上述2)的8个的启动子的核苷酸序列的计51个的核苷酸序列除去重复的序列，获得16个的同源启动子的核苷酸序列(序列号23和26～41)。将各同源启动子的来源示于表7，将该各同源启动子的下游的基因所编码的氨基酸序列(序列号3和42～57)示于表8。
[表7]
[表8]
各同源启动子的下游的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列能够用以下的式子表示。
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
(其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F)。
4)同源启动子活性评价用质粒的制作1
以pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号4和5)，扩增载体片段。另一方面，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务化学合成了cgUSDA启动子序列(PcgUSDA、序列号28)。以所得到的包含cgUSDA启动子的DNA为模板，使用引物(序列号58和59)，扩增在cgUSDA启动子序列添加了载体片段的接头序列的序列。将载体片段和cgUSDA启动子片段用In-Fusion HD cloning kit(Clontech公司)连结。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。以产生的菌落为模板，使用KOD OnePCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(序列号60和58)，进行菌落PCR。将确认了具有目标基因的质粒的导入的转化体接种于包含卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_PcgUSDA_HFM122_V47L。
对于cgR启动子(PcgR、序列号29)、cgB414启动子(PcgB414、序列号30)、bfZL1启动子(PbfZL1、序列号31)、cgScgG1启动子(PcgScgG1、序列号33)、cgYI启动子(PcgYI、序列号34)、csN24启动子(PcsN24、序列号35)、ccjz16启动子(Pccjz16、序列号37)、cdgimn1启动子(Pcdgimn1、序列号38)、cgCS176启动子(PcgCS176、序列号39)、cgBCo启动子(PcgBCo、序列号40)和cgKbcgl启动子(PcgKbcgl、序列号41)的各启动子，作为用于扩增在启动子序列添加了载体片段的接头序列的序列的引物和用于菌落PCR的引物，使用下述表9所示的引物，除此以外，也与cgUSDA启动子的情况同样操作，得到具有各启动子的质粒、pECsf_gapS_pabABC_PcgR_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcgB414_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PbfZL1_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcgScgG1_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcgYI_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcsN24_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_Pccjz16_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_Pcdgimn1_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcgCS176_HFM122_V47L、pECsf_gapS_pabABC_PcgBCo_HFM122_V47L和pECsf_gapS_pabABC_PcgKbcgl_HFM122_V47L。
[表9]
5)同源启动子活性评价用质粒的制作2
以pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号83和84、或85和86)，实施反向PCR(Inverse PCR)，制作cgTQ2223启动子序列(PcgTQ2223、序列号26)或cgATCC21831启动子序列(PcgATCC21831、序列号27)和HFM122_V47L连结得到的质粒。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。将产生的菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_PcgTQ2223_HFM122_V47L和pECsf_gapS_pabABC_PcgATCC21831_HFM122_V47L。
6)同源启动子活性评价用质粒的制作3
以pECsf_gapS_pabABC_PbfZL1_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号87和88)，实施反向PCR(Inverse PCR)，制作cgmcc1启动子序列(Pcgmcc1、序列号32)和HFM122_V47L连结得到的质粒。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPONGENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。将产生的菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_Pcgmcc1_HFM122_V47L。
7)同源启动子活性评价用质粒的制作4
以pECsf_gapS_pabABC_PcgYI_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号89和90)，实施反向PCR(Inverse PCR)，制作cgYI启动子序列(PcgYI、序列号34)的第138位的A取代为G、第139位的T取代为C的cgYImut启动子序列(PcgYImut、序列号91)与HFM122_V47L连结得到的质粒。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.Coli DH5α株(NIPPON GENE公司)转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。将产生的菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。使用NucleoSpin PlasmidEasyPure(TAKARA BIO)从所得到的培养液进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_PcgYImut_HFM122_V47L。接着，以pECsf_gapS_pabABC_PcgYImut_HFM122_V47L为模板，使用引物(序列号92和93)，实施反向PCR(Inverse PCR)，制作cgB253启动子序列(PcgB253、序列号36)和HFM122_V47L连结得到的质粒。使用所得到的质粒溶液，对ECOS Competent E.ColiDH5α株转化，将所得到的细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃静置过夜。将产生的菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃培养过夜。从所得到的培养液，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure进行质粒的精制，得到pECsf_gapS_pabABC_PcgB253_HFM122_V47L。
将上述5)～7)中所使用的引物示于表10。
[表10]
| 序列号 | 序列 |
| 83 | ATAAAATTACATTGCCCTTAAAGGTATCTAAA |
| 84 | GCAATGTAATTTTATTCATCGTAAAAAATTATTAAATTTTTTTCC |
| 85 | AATAATTTTTTTACGATGAATAAAATTACATTGCC |
| 86 | CGTAAAAAAATTATTAAATTTTTTCCAAAATGGCC |
| 87 | CTAAATGATCCTTATTGAACAGTGTTC |
| 88 | ATAAGGATCATTTAGATACCTTTAAGGGC |
| 89 | GCTATGGGCCACACTTGAGTCATCC |
| 90 | AGTGTGGCCCATAGCGCCCCTCGACCGCAAC |
| 92 | GCACTGCCCTTAAAGGTATCTAAATG |
| 93 | CTTTAAGGGCAGTGCAATTTTATTC |
实施例11转化体的制作
使用实施例10的4)～7)中所得到的合计16个的质粒，除此以外，与实施例2同样操作，得到转化体。
实施例12启动子活性的比较
1)转化体的培养
使用实施例2和11中所得到的转化体，除此以外，与实施例3的1)同样操作，对转化体进行培养。
2)启动子活性的测定
对于所得到的各培养液，与实施例3的2)同样操作，测定启动子活性。另外，试验以N＝3进行。
如图5所示，与以tu或SPL13启动子表达HFM122_V47L的菌株相比，以同源启动子表达HFM122_V47L的菌株中，AHBA转变率均高。因此，显示同源启动子的活性均高于tu启动子和SPL13启动子。
参考例1转化体(KC341株)的制作
1)在cg2391(aroG)启动子区域导入了tu启动子的转化体的制作
i)用于在cg2391启动子区域导入tu启动子的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号95和96)扩增cg2391基因区域的5’侧上游区域(序列号94)，并且用2种DNA引物(序列号98和99)扩增cg2391基因ORF中的5’侧区域(序列号97)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号101和102)扩增包含谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下，称为tu启动子)的DNA片段(序列号100)，得到DNA片段。另外，以pHKPsacB1(参照国际公开公报第2014/007273号)为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的4种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_Ptu-aroG。
ii)在cg2391启动子区域导入了tu启动子的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_Ptu-aroG导入谷氨酸棒状杆菌HT23株(参照国际公开公报第2014/007273号)，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC265sr株。通过使用序列号95和105的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC265sr株进行解析，确认了KC265sr株为质粒pHKPsacB_Ptu-aroG导入了cg2391的启动子区域的1次交叉型同源重组体。
将KC265sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC265株。通过使用序列号105和106的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC265株为如预想那样在cg2391(aroG)启动子区域导入了tu启动子的2次交叉型同源重组体。
2)在cg1835(aroE3)启动子区域导入了tu启动子的转化体的制作
i)用于在cg1835启动子区域导入tu启动子的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号108和109)扩增cg1835基因区域的5’侧上游区域(序列号107)，并且用2种DNA引物(序列号111和112)扩增cg1835基因ORF中的5’侧区域(序列号110)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号101和102)扩增包含tu启动子的DNA片段(序列号100)，得到DNA片段。另外，以pHKPsacB1为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的4种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_Ptu-aroE3。
ii)在cg1835启动子区域导入了tu启动子的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_Ptu-aroE3导入1)中所得到的KC265株，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC282sr株。通过使用序列号108和113的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC282sr株进行解析，确认了KC282sr株为质粒pHKPsacB_Ptu-aroE3导入了cg1835的启动子区域的1次交叉型同源重组体。
将KC282sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC282株。通过使用序列号113和114的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC282株为如预想那样在cg1835(aroE3)启动子区域导入了tu启动子的2次交叉型同源重组体。
3)在cg1827(aroB)启动子区域导入了tu启动子的转化体的制作
i)用于在cg1827启动子区域导入tu启动子的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号116和117)扩增cg1827基因区域的5’侧上游区域(序列号115)，并且用2种DNA引物(序列号119和120)扩增cg1827基因ORF中的5’侧区域(序列号118)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号101和102)扩增包含tu启动子的DNA片段(序列号100)，得到DNA片段。另外，以pHKPsacB1为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的4种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_Ptu-aroB。
ii)在cg1827启动子区域导入了tu启动子的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_Ptu-aroB导入2)中所得到的KC282株，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC300sr株。通过使用序列号116和121的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC300sr株进行解析，确认了KC300sr株为质粒pHKPsacB_Ptu-aroB导入了cg1827的启动子区域的1次交叉型同源重组体。
将KC300sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC300株。通过使用序列号121和122的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC300株为如预想那样在cg1827(aroB)启动子区域导入了tu启动子的2次交叉型同源重组体。
4)在cg0873(aroA)启动子区域导入了tu启动子的转化体的制作
i)用于在cg0873启动子区域导入tu启动子的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号124和125)扩增cg0873基因区域的5’侧上游区域(序列号123)，并且用2种DNA引物(序列号127和128)扩增cg0873基因ORF中的5’侧区域(序列号126)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号101和102)扩增包含tu启动子的DNA片段(序列号100)，得到DNA片段。另外，以pHKPsacB1为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的4种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_Ptu-aroA。
ii)在cg0873启动子区域导入了tu启动子的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_Ptu-aroA导入3)中所得到的KC300株，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC314sr株。通过使用序列号124和129的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC314sr株进行解析，确认了KC314sr株为质粒pHKPsacB_Ptu-aroA导入了cg0873的启动子区域的1次交叉型同源重组体。
将KC314sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC314株。通过使用序列号129和130的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC314株为如预想那样在cg0873(aroA)启动子区域导入了tu启动子的2次交叉型同源重组体。
5)在cg1226(pobA)启动子区域导入了与tu启动子结合的cg0503(qsuC)基因的转化体的制作
i)用于在cg1226基因区域导入与tu启动子结合的cg0503基因的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号132和133)扩增cg1226基因区域的5’侧上游区域(序列号131)，并且用2种DNA引物(序列号135和136)扩增cg1226基因区域的3’侧区域(序列号134)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号101和102)扩增包含tu启动子的DNA片段(序列号100)，得到DNA片段。另外，以ATCC13032株的基因组为模板，用2种DNA引物(序列号138和139)扩增cg0503基因的DNA片段(序列号137)，得到DNA片段。另外，以pHKPsacB1为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的5种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCRClean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_ΔpobA：：Ptu-qsuC。
ii)在cg1226基因区域导入了与tu启动子结合的cg0503基因的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_ΔpobA：：Ptu-qsuC导入4)中所得到的KC314株，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC315sr株。通过使用序列号132和140的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC315sr株进行解析，确认了KC315sr株为质粒pHKPsacB_ΔpobA：：Ptu-qsuC导入了cg1226的启动子区域的1次交叉型同源重组体。
KC315sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC315株。通过使用序列号140和141的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC315株为如预想那样在cg1226(pobA)基因区域导入了与tu启动子结合的cg0503(qsuC)基因的2次交叉型同源重组体。
6)在cg0620基因的3’下游区域导入了与tu启动子结合的来自大肠杆菌的aroG突变体基因的转化体的制作
i)用于在cg0620基因的3’下游区域导入与tu启动子结合的来自大肠杆菌的aroG突变体基因的质粒的构建
用2种DNA引物(序列号143和144)扩增cg0620基因ORF区域和5’侧上游区域(序列号142)，并且用2种DNA引物(序列号146和147)扩增cg0620基因的3’侧下游区域(序列号145)，得到DNA片段。另外，通过人工基因合成制作包含tu启动子的DNA片段(序列号148)，用2种DNA引物(序列号149和150)进行扩增，得到DNA片段。通过人工基因合成制作包大肠杆菌的aroG突变体(将146位的天冬氨酸突变为天冬酰胺的突变)基因的DNA片段，将其作为模板，用2种DNA引物(序列号151和152)进行扩增，得到DNA片段(序列号153)。另外，以pHKPsacB1为模板，用2种DNA引物(序列号103和104)进行扩增，对所得到的PCR产物进行DpnI(TAKARA BIO)处理。对所得到的5种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO)精制各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)进行连结，由此制作质粒pHKPsacB_cg0620_Ptu-aroG_D146N。
ii)在cg0620基因的3’下游区域导入了与tu启动子结合的来自大肠杆菌的aroG突变体基因的菌株的制作
使用利用电穿孔的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_cg0620_Ptu-aroG_D146N导入5)中所得到的KC315株，利用卡那霉素耐性进行选择，由此获得KC341sr株。通过使用序列号143和154的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))对KC341sr株进行解析，确认了KC341sr株为质粒pHKPsacB_cg0620_Ptu-aroG_D146N导入了cg0620基因3’下游区域的1次交叉型同源重组体。
将KC341sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含20％蔗糖的LB琼脂培养基上涂抹培养，由此，得到KC341株。通过使用序列号154和155的引物的PCR法(Sapphire Amp(TAKARA BIO))，确认了KC341株为如预想那样在cg0620基因的3’下游区域导入了与tu启动子结合的来自大肠杆菌的aroG突变体基因的2次交叉型同源重组体。
通过以上的步骤，得到谷氨酸棒状杆菌KC341株。
将上述所使用的引物示于表11。
[表11]
Claims (15)
1.一种DNA，其中，
所述DNA由选自下述(a)～(c)的核苷酸序列构成，并且具有启动子活性，
(a)编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列；
(b)与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(c)对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F。
2.如权利要求1所述的DNA，其中，
所述DNA由选自下述(d)～(f)的核苷酸序列构成：
(d)序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列；
(e)与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f)对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的DNA，其中，
所述DNA由选自下述(d’)～(f’)的核苷酸序列构成：
(d’)序列号23的核苷酸序列；
(e’)与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f’)对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的DNA，其中，
所述DNA包含：选自下述(d”)～(f”)的核苷酸序列：
(d”)序列号21的核苷酸序列；
(e”)与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列；和
(f”)对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。
5.一种启动子，其中，
所述启动子由选自下述(g)～(i)的DNA构成：
(g)由编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列构成的DNA；
(h)由与编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(i)由对编码由下述氨基酸序列构成的多肽的基因的上游的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA，
MX1X2X3FX1IX4QX5IFX1GX6X1X1LX7X1SX8X1X1GAQX9VFX10X1X11X1X1X12SS
其中，X1为任意的氨基酸残基，X2为S或A，X3为V或I，X4为F或I，X5为S或A，X6为V或I，X7为V或I，X8为V或I，X9为G或N，X10为D或T，X11为I或V，X12为A或F。
6.如权利要求5所述的启动子，其中，
所述启动子由选自下述(j)～(l)的DNA构成：
(j)由序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列构成的DNA；
(k)由与序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l)由对序列号1、21～23和26～41中的任一个核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
7.如权利要求5或6所述的启动子，其中，
所述启动子由选自下述(j’)～(l’)的DNA构成：
(j’)由序列号23的核苷酸序列构成的DNA；
(k’)由与序列号23的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l’)由对序列号23的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
8.如权利要求7所述的启动子，其中，
所述启动子包含：选自下述(j”)～(l”)的DNA：
(j”)由序列号21的核苷酸序列构成的DNA；
(k”)由与序列号21的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA；和
(l”)由对序列号21的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入1个或数个核苷酸而成的核苷酸序列构成并且具有启动子活性的DNA。
9.一种表达载体，其中，
所述表达载体包含：权利要求1～4中任一项所述的DNA或权利要求5～8中任一项所述的启动子。
10.如权利要求9所述的表达载体，其中，
所述表达载体包含：编码目标物质或其合成相关的酶的基因；和与该基因的上游连结的所述DNA或启动子。
11.一种DNA表达盒，其中，
所述DNA表达盒包含：权利要求1～4中任一项所述的DNA；或权利要求5～8中任一项所述的启动子。
12.如权利要求11所述的DNA表达盒，其中，
所述DNA表达盒包含：编码目标物质或其合成相关的酶的基因；和与该基因的上游连结的所述DNA或启动子。
13.一种棒状杆菌，其中，
所述棒状杆菌包含：权利要求9或10所述的表达载体；或权利要求11或12所述的DNA表达盒。
14.如权利要求13所述的棒状杆菌，其中，
所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌。
15.一种目标物质的制造方法，其中，
包括：
培养权利要求13或14所述的棒状杆菌的步骤；和
从通过该培养得到的培养物回收目标物质的步骤。
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