CN118308295B - 一种促进细胞生产胶原的添加剂、培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种促进细胞生产胶原的添加剂、培养基及方法。所述添加剂包括：i）抗坏血酸或其衍生物，ii）谷氨酰胺或其衍生物，iii）TGF‑β超家族蛋白，以及选自如下iv）~v）中的一项：iv）前胶原肽酶抑制剂；v）大分子拥挤剂MMC。通过在培养基中添加该添加剂，能够明显增加细胞的胶原蛋白分泌量，且所得到的天然胶原蛋白具有全长三螺旋结构以及天然生物活性。同时，还能够特异性地保持胶原蛋白溶解在培养基中或者沉积在细胞表面，有利于提高胶原蛋白的生产及提取纯化效率。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种促进细胞生产胶原的添加剂、培养基及方法。
背景技术
胶原蛋白是人体内最主要的结构蛋白质，约占人体总蛋白质含量的30%，广泛分布在皮肤，骨骼，肌腱，软骨等组织中，承载许多重要的生物功能。例如，皮肤中的胶原蛋白可以保持皮肤的弹性和紧致，关节软骨中的胶原蛋白可以维持关节的灵活性，骨骼中的胶原蛋白能够维持骨密度，预防骨质酥松骨折等健康问题，此外胶原蛋白对于创面伤口也展现了独特的价值，提供了细胞迁移和修复所需的环境，能够促进创面愈合。
目前已发现28种胶原蛋白类型，在众多胶原蛋白种类中，超过90%是纤维状胶原蛋白，如Ⅰ型，Ⅲ型，Ⅴ型胶原蛋白。天然胶原蛋白分子具有典型的三螺旋结构，这种独特的分子结构来源于胶原蛋白一系列复杂的生物合成过程。以Ⅰ型胶原蛋白为例，胶原蛋白生物合成过程主要包括：胶原蛋白基因转录为mRNA，mRNA翻译成多肽链，即col1α1链以及col1α2链，经过羟基化以及糖基化的翻译后修饰，两条col1α1链及一条col1α2链会共同沿着C端进行组装并形成两端具有非螺旋球状区域及中间含有稳定三螺旋结构的前胶原蛋白分子。前胶原蛋白分子经由高尔基体从胞内分泌到胞外，在胞外特定的蛋白酶作用下，两端的非螺旋球状区域断裂形成含有端肽的三螺旋胶原蛋白分子，这些胶原蛋白分子可以在胞外环境下进一步组装形成纤维并交联沉积在细胞表面成为细胞外基质的主要成分。
天然胶原蛋白的三螺旋结构赋予了其独特的理化性质以及生物活性基础，使其具有极高的应用价值，目前胶原蛋白已被广泛应用于骨修复、眼角修复、创面敷料等严肃医疗领域以及注射填充等高端医美领域。
其中，将胶原蛋白应用于注射填充剂的独特优势在于：1、即时填充，不易吸水肿胀，能够增加真皮的厚度与张力；2、高黏弹性，不易位移；3、不产生丁达尔效应，填充效果自然；4、可以促进内源性胶原再生，恢复皮肤的平整与弹性。
采用胶原蛋白仿生矿化制备人工骨的独特优势在于：1、具有与天然骨骼相似的微观结构及主要成分，可实现多层次仿生；2、具有良好的生物相容性及生物可降解性；3、具有良好的骨传导能力，模拟天然成骨过程；4、具有一定的成骨诱导能力，有利于缺损部位的再生修复。
利用胶原蛋白仿生矿化技术开发可降解吸收口腔骨植入材料，更有利于种植牙最终形态的形成，恢复时间缩短，具有高度生物相容性与骨再生能力。
采用胶原蛋白制备创面敷料时具有如下独特优势：1、胶原蛋白敷料形式丰富，可制备成无定形水凝胶，胶原蛋白海绵，或不对称膜等结构，适用于各类伤口，操作便捷；2、含有完整三螺旋结构的胶原蛋白具有优越的生理性止血能力，与创面接触迅速吸附血液，引起血小板凝聚的同时激活凝血系统产生凝血因子和凝血酶，促进凝血过程；3、胶原蛋白敷料可以结合MMP，从而避免了过多MMP对于伤口愈合过程的干扰，能够对伤口起到保护作用，营造良好创面微环境，促进新胶原纤维沉积，支持肉芽组织形成，大大缩短伤口愈合时间，促进创面愈合。
利用胶原蛋白开发人工角膜，在临床试验中也表现出良好的治疗效果，其具有以下生物学特征：1、高透明度，可见光透过率高；2、具有屈光性，折射率与人角膜相似；3、三螺旋结构、交联结构赋予其一定的机械强度，可长时间保持稳定的形状和厚度；4、胶原蛋白是角膜的天然组成成分，具有良好的生物相容性，无需长时间免疫抑制治疗；5、胶原蛋白能够诱导上皮组织再生，成为供体角膜的有效替代。
以上的应用潜力使得胶原蛋白的市场需求越来越大，也在很大程度上驱动了对不同制备方法的探索和优化。
当前市场上主要有两种方法制备胶原蛋白，即动物提取以及发酵重组。通过酸法、碱法、酶解等方法从动物组织中提取制备胶原蛋白能够保持胶原蛋白完整三螺旋结构，具有天然生物活性。该方法工艺较为成熟，成本较低，制得的胶原蛋白产品在医疗与医美领域均得到广泛应用。例如广州创尔生物通过牛跟腱提取胶原蛋白，拥有大规模无菌提取制备技术，可解决病毒灭活和免疫原性控制，主要产品涉及胶原蛋白海绵，胶原贴辅料，以及胶原护肤品等。双美生物利用二代无特定病原猪的猪皮提取胶原蛋白，从提取源头降低动物源胶原蛋白的免疫原性，主要产品为面部注射填充剂。近年来，通过微生物发酵重组的方法制备胶原蛋白受到广泛关注，该方法将人体胶原蛋白基因进行特定序列设计、酶切和拼接、连接载体后转入工程细胞，通过发酵方式表达重组胶原蛋白。该方法可加工性好，可规模化生产，具有低免疫原性和动物源病毒风险，在功效护肤领域具有一定优势。例如陕西巨子生物利用大肠杆菌发酵技术，制备出human-like重组胶原蛋白，产品可用于皮肤修复。创健医疗利用毕赤酵母发酵技术制备出重组人源化胶原蛋白。南京东万生物通过对底盘CHO细胞进行模块化改造，实现了全长且具有稳定三螺旋结构的rhCOL1重组表达。
然而，当前的胶原蛋白制备技术仍存在一定的局限，通过动物提取胶原蛋白存在动物源病毒风险，用于人体可能导致免疫排斥和过敏反应，同时由于原料来源依赖于动物组织，可能存在产能受限以及批次间不稳定等问题。而发酵重组方法制备胶原蛋白通常得到的是胶原蛋白分子片段，无法验证其完整三螺旋结构及支撑性能，其生物活性与天然胶原蛋白可能存在一定差距。例如通过重组蛋白组装得到的纤维结构直径及长度较小，与天然胶原蛋白组装得到的含有周期性D带结构的胶原纤维存在差异。目前虽然已有报道通过CHO细胞或HEK293细胞可实现具有完整三螺旋结构胶原蛋白的重组表达，然而表达系统的产量不高，其得到的胶原成分与天然胶原蛋白有一定差异，尚未有成熟的可规模化与商业化的技术解决方案。
发明内容
本发明首先提供一种用于促进胶原蛋白分泌的添加剂，其包括：i）抗坏血酸或其衍生物，ii）谷氨酰胺或其衍生物，iii）TGF-β超家族蛋白，以及选自如下iv）~v）中的一项：iv）前胶原肽酶抑制剂；v）阴离子型大分子聚合物。
本发明还提供一种促分泌培养基，其用于促进胶原蛋白分泌，其含有：a）基础培养基，b）血清或血清替代物，c）抗生素，以及d）如前所述的添加剂。
本发明还提供一种培养基试剂盒，其通过一个或多个试剂的组合，提供如前所述的促分泌培养基。
本发明还提供一种生产胶原的试剂盒，其包含：如前所述的促分泌培养基或如前所述的培养基试剂盒中的试剂，以及选自盐析溶液、酶解溶液中的至少一种试剂，其中，所述盐析溶液中含有1.8~2.2M NaCl、0.05~0.15M HCl、以及水；所述酶解溶液中含有180~220μg/ml胃蛋白酶、0.4~0.6M乙酸以及水。
本发明还提供一种生产胶原的方法，其包括：使用如前所述的添加剂、或如前所述的促分泌培养基、或如前所述的培养基试剂盒、或如前所述的试剂盒，对胶原分泌细胞进行培养；从培养产物中收集胶原蛋白。
本发明还提供一种胶原蛋白，其通过如前所述的方法制得。
本发明还提供一种胶原蛋白纤维，其由如前所述的胶原蛋白组装得到；或通过如前所述的方法制得。
本发明还提供一种组合物，其含有如前所述的胶原蛋白、如前所述的胶原蛋白纤维中的至少一种。
本发明还提供一种培养器具，其包被有如前所述的胶原蛋白。
本发明还提供一种纺织品，其含有如前所述的胶原蛋白纤维。
本发明还提供如前所述的胶原蛋白在选自以下（1）~（2）中至少一方面的应用：（1）治疗或非治疗目的的应用；其中，所述应用包括以下至少一方面：1）提高细胞增殖能力；2）促进细胞迁移；3）促进细胞内源胶原蛋白再生；（2）制备药物或医疗材料中的应用；其中，所述药物或医疗材料被用于以下至少一方面：1）提高细胞增殖能力；2）促进细胞迁移；3）促进细胞内源胶原蛋白再生。
通过在培养基中添加本发明的添加剂，能够明显增加细胞的胶原蛋白分泌量，且所得到的天然胶原蛋白具有全长三螺旋结构以及天然生物活性，能够解决发酵重组胶原蛋白折叠不正确或不完全等问题。同时，还能够特异性地保持胶原蛋白溶解在培养基中或者沉积在细胞表面，有利于提高胶原蛋白的生产及提取纯化效率。此外，本发明还能够解决组织提取胶原蛋白的产能受限问题，提高批次间稳定性，降低动物源疾病传播等风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中通过培养上清获取胶原蛋白的方法流程示意图。
图2为本发明中通过细胞沉淀获取胶原蛋白的方法流程示意图。
图3为本发明实施例中对肌肉前体细胞（A）和脂肪前体细胞（B）的qRT-PCR表征结果。
图4为本发明实施例中对不同培养基的促胶原蛋白分泌效果的检测结果；其中，A为培养基组、培养基+抗坏血酸组、以及培养基+促分泌添加剂组的促分泌效果；B为培养基组、培养基+抗坏血酸组、以及培养基+不同促分泌添加剂组的促分泌效果。
图5为本发明实施例中对不同培养基的促胶原蛋白沉积效果的检测结果。
图6为本发明实施例中分离纯化的不同阶段样品的SDS-PAGE表征结果。
图7为本发明实施例中胶原蛋白纯化样品的CD表征结果。
图8为本发明实施例中胶原蛋白冻干海绵的SEM表征结果。
图9为本发明实施例中胶原蛋白纤维的TEM表征结果。
图10为本发明实施例中胶原蛋白冻干样品的FTIR表征结果。
图11为本发明实施例中对包被胶原前后的培养板的细胞增殖能力的检测结果。
图12为本发明实施例中对包被胶原前后的培养板的细胞迁移效果的检测结果。
图13为本发明实施例中对包被胶原前后的培养板的细胞的相对基因表达量检测结果。
图14为本发明实施例中对人间充质干细胞的促胶原蛋白分泌效果的检测结果。
图15为本发明实施例中纯化后的人源细胞基胶原蛋白的SDS-PAGE表征结果；该图中将人源细胞基胶原蛋白简称为人源胶原。
图16为本发明实施例中纯化后的人源细胞基胶原蛋白的CD表征结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
术语解释
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“任选地”、“任选的”、“任选”、“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“任选”或“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“任选”或“可选”各自独立。
本发明中，术语“胶原”是指任何一种已知的胶原类型，包括I型至XXVIII型胶原。该术语还涵盖前胶原和包含基序(Gly-X-Y)n的任何胶原性蛋白，其中n是整数。它涵盖胶原分子、胶原分子的三聚体、胶原的原纤维和胶原原纤维的纤维。
本发明中，术语“胶原蛋白”是指从产生胶原的细胞分泌到细胞培养基中的任何类型的胶原。根据某些实施方案，胶原蛋白包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的前胶原。如本文使用的，术语“前胶原”是指包含球状氨基(N)-和/或羧基(C)-末端前肽结构域的胶原三螺旋单体。
胶原的亚家族包括：
形成原纤维的胶原(I、II、II、V、XI、XXIV和XXVII型胶原)；
具有中断的三螺旋的原纤维缔合的胶原(FACIT)(IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI、XXII型胶原)。FACIT本身不形成原纤维，但它们与胶原原纤维的表面缔合；
形成网络的胶原(IV、VIII、X型胶原)；以及
膜胶原(XIII、XVII、XXIII、XXV型胶原)。
本发明中，术语“胶原蛋白纤维”是指包含是指包含胶原蛋白的纤维。在一些实施方式中，所述胶原蛋白纤维的直径可以从大于等于1nm至大于等于10μm变化，例如1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm(1μm)的>1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm或更大。
本发明中，术语“多潜能干细胞”是指一类具有多种分化潜能的干细胞，其能够分化成多种不同类型的细胞。该术语明确包括原始多能干细胞和始发(primed)多能干细胞两者。在一些实施方式中，所述多潜能干细胞包括胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。其中，术语“胚胎干细胞（ESC）”指的是来源于囊胚的多能干细胞类型，术语“诱导多能干细胞（iPSC）”指的是可以直接从体细胞产生的多能干细胞类型。
本发明中，涉及“一种或多种用于……的……抑制剂”、“……抑制剂”的描述时，其可以通过多种不同的试剂来分别抑制所提及的一种或多种蛋白/通路，也可以通过一种试剂来抑制多种所提及的蛋白/通路。
添加剂
本发明首先提供一种用于促进胶原蛋白分泌的添加剂，其包括：i）抗坏血酸或其衍生物，ii）谷氨酰胺或其衍生物，iii）TGF-β超家族蛋白，以及选自如下iv）~v）中的一项：iv）前胶原肽酶抑制剂；v）大分子拥挤剂MMC。
本发明发现，上述添加剂组合能够明显改善胶原蛋白的分泌效果，且其分泌得到的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构和天然活性。其中，与前胶原肽酶抑制剂组合后能够明显提升胶原蛋白在培养基上清液中的含量，维持胶原蛋白以可溶状态分散在培养基中，并有利于通过定期更新促分泌培养基持续收集胶原蛋白。与大分子拥挤剂MMC组合后能够明显提升胶原蛋白在细胞表面的沉积量。本领域人员在实施时，可以结合实际情况添加不同的添加剂，从而提高胶原蛋白的生产及提取纯化效率。
在一些实施方式中，所述抗坏血酸或其衍生物选自抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、AA2P（L-抗坏血酸-2-磷酸镁）、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠（Sodium AscorbylPhosphate）、抗坏血酸-2-磷酸丙二钠（Sodium Ascorbyl Phosphate Magnesium）、Ester-C、Ascorbyl Palmitate中的至少一种；优选为AA2P。
在一些实施方式中，所述谷氨酰胺或其衍生物选自谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酰胺、Glutamax中的至少一种；优选为Glutamax。
在一些实施方式中，所述TGF-β超家族蛋白选自转化生长因子TGF-β、骨形态发生蛋白BMP家族，激活素activin家族中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述TGF-β超家族蛋白选自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-7、Activin A、Activin B、Activin AB中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述前胶原肽酶抑制剂选自前胶原蛋白酶的N端或C端前肽断链抑制剂中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述前胶原肽酶抑制剂选自UK383367、dorsomophin、LDN193189、DMH-1、K02288、ilomastat、Batimastat、Timp、放线酰胺素中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述前胶原肽酶抑制剂为BMP1抑制剂。
在一些优选的实施方式中，所述BMP1抑制剂选自UK383367、dorsomophin、LDN193189、DMH-1和K02288中的至少一种；优选为UK383367。
在一些实施方式中，所述大分子拥挤剂MMC选自阴离子型大分子聚合物中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述大分子拥挤剂MMC选自聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、卡拉胶、褐藻糖胶、透明质酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸钠中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述大分子拥挤剂MMC选自葡聚糖、聚苯乙烯磺酸钠中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述大分子拥挤剂MMC为质量比为1：0.5~2的葡聚糖和聚苯乙烯磺酸钠的混合物。
大分子拥挤剂MMC（macromolecular crowding agent）通常指的是具有较大分子量的高聚物或蛋白质，用于模拟细胞内的高密度环境。这些大分子拥挤剂的分子大小可以相对确定，因为它们通常由已知的生物大分子构成。然而，要注意的是，不同的研究可能会使用不同类型、不同分子量的拥挤剂来模拟不同细胞环境，因此其具体分子大小可能会有所不同。但在特定的研究条件下，研究人员能够结合常识选择相对大小确定的拥挤剂，以确保模拟的细胞环境与实际情况尽可能接近。
在一些具体的实施方式中，所述葡聚糖的大小为400~600 kDa。作为示例，所述葡聚糖的大小可以为400 kDa、450 kDa、500 kDa、550 kDa、或600 kDa等。
在一些具体的实施方式中，所述聚苯乙烯磺酸钠的大小为100~300 kDa。作为示例，所述聚苯乙烯磺酸钠的大小可以为100 kDa、150 kDa、200 kDa、25 kDa、或300 kDa等。
在具体实施方式中，可以结合常识并依据所述前胶原肽酶抑制剂的使用效果而确定其具体用量。
在一些具体实施方式中，所述添加剂包括AA2P、Glutamax、TGF-β1以及UK383367。
在一些具体实施方式中，所述添加剂包括所述添加剂包括AA2P、Glutamax、TGF-β1以及选自大小为400~600 kDa的葡聚糖和大小为100~300 kDa的聚苯乙烯磺酸钠中的至少一种大分子拥挤剂MMC。
在具体实施时，本领域人员还可以对上述所提及的具体实施方式进行组合，得到有关本发明添加剂的更多实施例。
促分泌培养基
本发明还提供一种促分泌培养基，其用于促进胶原蛋白分泌，其含有：a）基础培养基，b）血清或血清替代物，c）抗生素，以及d）如前所述的添加剂。
在一些实施方式中，所述基础培养基为DMEM高糖。其中，DMEM高糖也称为DMEM-高葡萄糖，是一种已知的培养基，它是基于原始的DMEM培养基改良而来的，其中含有较高浓度的葡萄糖（通常为4500毫克/升）。
在一些实施方式中，所述血清或血清替代物选自胎牛血清、胎儿牛血清、血清替代物中的至少一种；
在一些实施方式中，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B中的至少一种，优选为PSA（Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B）。
在一些实施方式中，所述促分泌培养基含有：基础培养基、1~5 %v/v血清或血清替代物、0.5~1.5 wt%抗生素、70~90 μg/ml抗坏血酸或其衍生物、0.5~2 wt%谷氨酰胺或其衍生物、5~20 ng/ml TGF-β超家族蛋白、以及1.0~1.5 μM BMP1抑制剂。
在一些优选的实施方式中，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、1~5 %v/v胎牛血清、0.5~1.5 wt% PSA、70~90 μg/ml AA2P、0.5~2 wt% Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及1.0~1.5 μM UK383367。
在一些具体的实施方式中，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、2±1 %v/v胎牛血清、1±0.2 wt% PSA、82±5 μg/ml AA2P、1.5±0.2 wt% Glutamax、10±2 ng/ml TGF-β1、以及1.25±0.05 μM UK383367。
在一些实施方式中，所述促分泌培养基含有：基础培养基、1~5 %v/v血清或血清替代物、0.5~1.5 wt%抗生素、70~90 μg/ml抗坏血酸或其衍生物、0.5~2 wt%谷氨酰胺或其衍生物、5~20 ng/ml TGF-β超家族蛋白、以及80~120 μg/ml大分子拥挤剂MMC。
在一些优选的实施方式中，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、1~5 %v/v胎牛血清、0.5~1.5 wt% PSA、70~90 μg/ml AA2P、0.5~2 wt% Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及80~120 μg/ml大分子拥挤剂MMC；其中，所述大分子拥挤剂MMC为质量比为1:0.5~2的葡聚糖和聚苯乙烯磺酸钠的混合物。
在一些具体的实施方式中，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、2±1 %v/v胎牛血清、1±0.2 wt% PSA、82±5 μg/ml AA2P、1.5±0.2 wt% Glutamax、10±2 ng/ml TGF-β1、以及100±10 μg/ml大分子拥挤剂MMC；其中，所述大分子拥挤剂MMC为500±50 kDa葡聚糖和200±50 kDa聚苯乙烯磺酸钠的混合物。
在具体实施时，本领域人员还可以对上述所提及的具体实施方式进行组合，在上述所提到的数值范围内选择任意数值，得到有关本发明促分泌培养基的更多实施例。
试剂盒
本发明还提供一种培养基试剂盒，其通过一个或多个试剂的组合，提供如前所述的促分泌培养基。
在本发明所提及的培养基试剂盒中，可以通过一个试剂直接提供所述的培养基，也可以通过多个试剂分别提供培养基中的组分（如分别提供基础培养基、添加剂、血清或血清替代物、抗生素等），并提供配套的说明书，使得使用者可以结合说明来组合得到所述的培养基。
在一些实施方式中，所述培养基试剂盒通过多个试剂的组合，还提供完全培养基；所述完全培养基含有基础培养基、血清或血清替代物、以及抗生素。所述完全培养基主要用于在细胞增殖阶段使用。
在一些实施方式中，所述完全培养基含有：DMEM高糖、0.5~1.5 %v/v Pen strep溶液、以及8~15 %v/v胎牛血清。
在一些具体实施方式（如针对MSC细胞的增殖培养）中，也可将所述完全培养基中的DMEM高糖替换为DMEM低糖。
在一些实施方式中，所述培养基试剂盒通过多个试剂的组合，还提供选自神经外胚层细胞分化培养基、脂肪前体细胞分化培养基中的至少一种培养基；其中，所述神经外胚层细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制GSK-3α、GSK-3β、TGF-β I型受体和ALK5 的第一抑制剂；所述脂肪前体细胞分化培养基为MSC无血清培养基。这样的试剂盒主要用于将多潜能干细胞逐步诱导分化为脂肪前体细胞，而后将脂肪前体细胞用于分泌胶原。
在一些优选的实施方式中，所述第一抑制剂包含所述组分a（GSK-3α/β 抑制剂）和组分b（TGF-β I型受体/ALK5 抑制剂），所述组分a选自LiCl、SB-216763、CHIR99021、TWS119、BIO（6-Bromoindirubin-3’-oxime）、CHIR-98014、SB415286、LY2090314中的至少一种；所述组分b选自SB-431542、RepSox、SB-525334、LY-364947、SD-208、EW-7203中的至少一种。
在一些更优选的实施方式中，所述神经外胚层细胞分化培养基包含：体积比为1：0.8~1.2的DMEM/F-12和Neurobasal；以及0.8~1.2 %v/v N-2，1.8~1.2 %v/v B-27，2~4 μMCHIR99021 和8~12 μM SB-431542。
在一些具体的实施方式中，所述神经外胚层细胞分化培养基包含：体积比为1：1的DMEM/F-12和Neurobasal；以及1 % v/v N-2，1 % v/v B-27，3 μM CHIR99021 和10 μM SB-431542。
在一些实施方式中，所述脂肪前体细胞分化培养基包含MSC seruM-free mediμM(S101-500/S102-025)、StemPro® MSC SFM、Xeno-Free MSC Expansion Media中的一种；更优选为MSC seruM-free mediμM (S101-500/S102-025)。
在一些实施方式中，所述培养基试剂盒通过多个试剂的组合，还提供选自中胚层细胞分化培养基、肌肉前体细胞分化培养基、肌肉前体细胞扩增培养基中的至少一种培养基；其中，所述中胚层细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制GSK-3α和GSK-3β的第二抑制剂；所述肌肉前体细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制组蛋白去乙酰化酶的第三抑制剂。所述肌肉前体细胞扩增培养基可基于常识配置。这样的试剂盒主要用于将多潜能干细胞逐步分化为肌肉前体细胞，而后将所述肌肉前体细胞用于分泌胶原。
在一些优选的实施方式中，所述第二抑制剂选自LiCl、SB-216763、CHIR99021、TWS119、BIO（6-Bromoindirubin-3’-oxime）、CHIR-98014、SB415286、LY2090314中的至少一种，更优选为CHIR99021。
在一些更优选的实施方式中，所述中胚层细胞分化培养基包含：E6（Essential 6）培养基，以及8~12 μM CHIR99021。
在一些具体的实施方式中，所述中胚层细胞分化培养基包含：E6培养基，以及10 μM CHIR99021。
在一些优选的实施方式中，所述第三抑制剂选自Givinostat、Trichostatin A(TSA)、Vorinostat (SAHA)、Entinostat (MS-275)、Panobinostat (LBH589)、Romidepsin(FK228)、Belinostat (PXD101)中的至少一种，更优选为Givinostat。
在一些更优选的实施方式中，所述肌肉前体细胞分化培养基包含：E6培养基，以及80~120 nM Givinostat。
在一些具体的实施方式中，所述肌肉前体细胞分化培养基包含：E6培养基，以及100 nM Givinostat。
在一些优选的实施方式中，所述肌肉前体细胞扩增培养基选自Skeletal MuscleCell Growth Medium-2 (SKGM, CC-3245) 、Skeletal Muscle Cell Basal Medium、Myogenic Medium、DMEM、Ham’s F-10 Nutrient Mixture、Medium 199 (M199)、RPMI 1640Medium中的一种。
在一些具体的实施方式中，所述肌肉前体细胞扩增培养基为Skeletal MuscleCell Growth Medium-2 (SKGM, CC-3245)。
本领域人员可以结合常识对上述具体实施方式中所提到的试剂进行组合，得到有关本发明培养基试剂盒的更多实施例。
本发明还提供一种生产胶原的试剂盒，其包含：如前所述的促分泌培养基或如前所述的培养基试剂盒中的试剂，以及选自盐析溶液、酶解溶液中的至少一种试剂，其中，所述盐析溶液中含有1.8~2.2M NaCl、0.05~0.15M HCl、以及水；所述酶解溶液中含有180~220μg/ml胃蛋白酶、0.4~0.6M乙酸以及水。这样的试剂盒可以用于对制备得到的胶原蛋白进行分离纯化。
在一些具体实施方式中，所述盐析溶液中含有2.0M NaCl、0.1M HCl、以及水。
在一些具体实施方式中，所述酶解溶液中含有200μg/ml胃蛋白酶、0.5M乙酸以及水。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含以下一个或多个试剂：0.05~0.15M乙酸溶液、含有1.8~2.2M NaCl和0.05~0.15M乙酸的水溶液、磷酸氢二钠、以及0.05~0.15M NaOH溶液。这样的试剂盒可以用于进一步对胶原蛋白进行组装，以得到胶原蛋白纤维。
在一些具体实施方式中，所述试剂盒还包含以下一个或多个试剂：0.1M乙酸溶液、含有2M NaCl和0.1M乙酸的水溶液、磷酸氢二钠、以及0.1M NaOH溶液。
在具体实施方式时，本领域人员可以对上述所提到的试剂进行组合，得到有关本发明试剂盒的更多实施例。
方法
本发明还提供一种生产胶原的方法，其包括：使用如前所述的添加剂、或如前所述的促分泌培养基、或如前所述的培养基试剂盒、或如前所述的试剂盒，对胶原分泌细胞进行培养；从培养产物中收集胶原蛋白。
在一些实施方式中，所述胶原分泌细胞选自成纤维细胞、间充质干细胞、脂肪前体细胞、肌肉前体细胞中的至少一种。
在一些实施方式中，所述胶原分泌细胞源自人类和/或非人类动物，所述非人类动物选自有蹄类动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组中的一种或几种；更优选所述非人类动物选自牛、水牛、羊、马、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛中的一种或几种。
在一些具体的实施方式中，所述胶原分泌细胞源自已有的人类细胞系。
在一些具体的实施方式中，所述胶原分泌细胞源自已有的非人类动物细胞系或者非人类动物组织。
在一些实施方式中，当所述胶原分泌细胞为成纤维细胞或间充质干细胞时，所述方法包括：使用前述的培养基试剂盒（其通过多个试剂的组合，还提供完全培养基），将细胞在所述完全培养基中进行增殖培养；将增殖培养后的细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；从培养产物中收集胶原蛋白。
在一些实施方式中，所述增殖培养的方式为3D培养。通过3D培养，能够实现细胞规模化培养。
在一些具体的实施方式中，在所述3D培养中，可以采用分批补料或者灌流等方式培养细胞。
在一些具体实施方式中，也可以采用细胞工厂进行所述增殖培养。
在一些实施方式中，当所述胶原分泌细胞为脂肪前体细胞时，所述方法包括：使用前述的培养基试剂盒（其通过多个试剂的组合，还提供选自神经外胚层细胞分化培养基、脂肪前体细胞分化培养基中的至少一种培养基）中的试剂，将多潜能干细胞在所述神经外胚层细胞分化培养基诱导分化为神经外胚层细胞；将所述神经外胚层细胞在所述脂肪前体细胞分化培养基中诱导分化为脂肪前体细胞；将所述脂肪前体细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；从培养产物中收集胶原蛋白。
在一些实施方式中，当所述胶原分泌细胞为肌肉前体细胞时，所述方法包括：使用前述的培养基试剂盒（其通过多个试剂的组合，还提供选自中胚层细胞分化培养基、肌肉前体细胞分化培养基、肌肉前体细胞扩增培养基中的至少一种培养基）中的试剂，将多潜能干细胞在所述中胚层细胞分化培养基中诱导分化为中胚层细胞；将所述中胚层细胞在所述肌肉前体细胞分化培养基中诱导分化为肌肉前体细胞；将所述肌肉前体细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；从培养产物中收集胶原蛋白。
在一些实施方式中，对所述胶原分泌细胞进行增殖培养后，再更换促分泌培养基进行培养。
在一些具体实施方式中，在将所述胶原分泌细胞增殖培养至其覆盖培养载体50%以上（或60%以上、或70%以上、80%以上、或90%以上、或95%以上、或长满）后，再更换促分泌培养基进行培养。
在一些实施方式中，当所述促分泌培养基中含有BMP1抑制剂时，从培养基上清液中收集胶原蛋白；当所述促分泌培养基中含有大分子拥挤剂MMC时，从细胞沉淀中收集胶原蛋白。
在一些实施方式中，所述从培养产物中收集胶原蛋白具体包括：将培养产物与含有1.8~2.2M NaCl、0.05~0.15M HCl和水的盐析溶液混合后，分离得到沉淀；将所述沉淀溶解后，与含有180~220μg/ml胃蛋白酶、0.4~0.6M乙酸和水的酶解溶液混合进行酶解消化；将酶解消化后的溶液装入80~120KDa透析袋中进行透析，以得到胶原蛋白溶液。这样能够明显提升所得产物中胶原蛋白的纯度。
在一些具体实施方式中，当所述促分泌培养基中含有BMP1抑制剂时，从培养基上清液中收集胶原蛋白，所述方法流程如图1所示。
在一些具体实施方式中，当所述促分泌培养基中含有大分子拥挤剂MMC时，从细胞沉淀中收集胶原蛋白，所述方法的流程如图2所示。
在一些优选的实施方式中，使用0.05~0.15M乙酸溶液溶解所述沉淀。
在一些优选的实施方式中，将所述透析袋放入0.05~0.15M乙酸溶液中进行透析。
在一些实施方式中，所述方法还包括：将收集到的胶原蛋白溶液与含有1.8~2.2MNaCl和0.05~0.15M乙酸的水溶液混合，而后向其中加入磷酸氢二钠至终浓度为140~160μM，而后使用0.05~0.15M NaOH溶液调节溶液pH至7.0±0.5，并在2~6℃下进行胶原蛋白纤维组装。这样能够改善胶原蛋白纤维的制备效果，有利于得到具有支撑性的胶原蛋白纤维产品。
在一些具体实施方式中，可以对所述胶原蛋白溶液进行干燥，以得到固体的胶原蛋白产品。
在一些具体实施方式中，当选择将固体的胶原蛋白用于胶原蛋白纤维组装时，可以先使用0.05~0.15M乙酸溶液溶解，以得到胶原蛋白溶液，并与其他溶液混合，以进行胶原蛋白纤维组装。
在一些具体实施方式中，本领域人员还可以结合所述胶原蛋白或胶原蛋白的后续应用需求而对其进行进一步修饰。
本发明在所述方法中所提及的对试剂盒的使用也可以替换为直接对试剂盒中相应试剂的使用，而不必然通过试剂盒这一载体，这对本领域人员是容易想到的替换，也属于本发明的保护范围。
在具体实施时，本领域人员还可以对上述所提到的具体实施方案进行组合，以得到有关于本发明制备方法的较优实施例。
相关产品及应用
本发明还提供一种胶原蛋白，其通过如前任一所述的方法（不含胶原蛋白组装的步骤）制得。
在一些实施方式中，本发明胶原蛋白的三螺旋结构圆二色谱（CD）表征存在197nm最大负峰以及221nm最大正峰，且正负峰比值(RPN)显示存在三螺旋结构。
在一些实施方式中，本发明胶原蛋白在冻干后的扫描电镜（SEM）表征具有纤维状结构。
在一些实施方式中，本发明胶原蛋白的红外光谱（FTIR）表征在1645cm-1处出现酰胺Ⅰ带，在1544cm-1、1454cm-1、1240cm-1处出现酰胺Ⅲ带，同时在3283cm-1处出现N-H伸缩振动，在2960cm-1的处出现O-H弯曲振动。
本发明还提供一种胶原蛋白纤维，其由如前所述的胶原蛋白组装得到；或通过如前所述的方法（含胶原蛋白组装的步骤）制得。
本发明胶原蛋白纤维的透射电镜（TEM）表征存在典型的67nm周期性D带，这样的微观结构将有助于提高胶原蛋白产品的力学性能，拓展胶原蛋白在高端医美、严肃医疗等方向的应用范围。
本发明还提供一种组合物，其含有如前所述的胶原蛋白、如前所述的胶原蛋白纤维中的至少一种。
在一些实施方式中，所述组合物为培养基、食品、化妆品、药品或医疗材料。
在一些具体的实施方式中，所述组合物还含有以下一种或多种组分：-维生素和矿物质：如维生素C、维生素E、锌等，有助于进一步促进胶原蛋白的合成和维持健康的皮肤、关节和骨骼；-氨基酸：作为胶原蛋白合成的基本组成单元，提供细胞合成胶原蛋白所需的氨基酸；-抗氧化剂：如多酚类、类胡萝卜素等，有助于保护胶原蛋白免受氧化损伤；-保湿成分：如透明质酸、甘油等，有助于保持皮肤水分，维持皮肤弹性；-植物提取物：如绿茶提取物、葡萄籽提取物等，具有保护皮肤、抗炎、抗氧化等作用；-胶原蛋白活性因子：如胶原三肽、弹性蛋白等，可以促进皮肤弹性和紧致度；-防腐剂和稳定剂：用于保持产品的质量和稳定性。这些成分的组合可以根据不同的产品类型和用途的需要而有所不同，但通常都是为了促进胶原蛋白或胶原蛋白纤维的合成、维护和增强其功能，同时能够提供皮肤、关节或骨骼所需的营养和保护。
本发明还提供一种培养器具，其包被有如前所述的胶原蛋白。这样能够明显促进细胞增殖、迁移、及内源胶原蛋白再生。
在一些具体实施方式中，所述的培养器具为培养皿。
本发明还提供一种纺织品，其含有如前所述的胶原蛋白纤维。这样的纺织品具有一定的特殊性能和功能，如柔软、吸湿透气、抗菌等。
在一些实施方式中，所述纺织品还含有以下的一种或多种组分，以达到特定的性能要求，比如强度、弹性、舒适度等：-天然纤维：如棉纤维、麻纤维等，用于增加纺织品的舒适度和吸湿性；-合成纤维：如聚酯纤维、尼龙纤维等，用于提高纺织品的耐久性和弹性；-抗菌材料：如银纳米颗粒等，用于提高纺织品的抗菌性能；-防晒剂：如紫外线吸收剂，用于提高纺织品的防晒性能；-柔软剂：用于提高纺织品的手感柔软度。这些成分的添加可以使含有胶原蛋白纤维的纺织品具有更广泛的应用领域和更多的功能特性，如医疗保健、功能性服装、护肤品等。不同的组合和配比可以满足不同场合和需求下的使用要求。
本发明还提供如前所述的胶原蛋白在以下至少一方面的应用：1）提高细胞增殖能力；2）促进细胞迁移；3）促进细胞内源胶原蛋白再生。
在一些实施方式中，本发明提供如前所述的胶原蛋白在选自以下（1）~（2）中至少一方面的应用：（1）治疗或非治疗目的的应用；其中，所述应用包括以下至少一方面：1）提高细胞增殖能力；2）促进细胞迁移；3）促进细胞内源胶原蛋白再生；（2）制备药物或医疗材料中的应用；其中，所述药物或医疗材料被用于以下至少一方面：1）提高细胞增殖能力；2）促进细胞迁移；3）促进细胞内源胶原蛋白再生
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1 胶原分泌细胞的原代分离获取及培养
一、分离提取牛成纤维细胞
1.牛耳样本从收集场所收集，并且在具有冷的PBS( Ca/ Mg)+1％Pen Strep的50ml管中转移到实验室。组织的处理在从收集起小于24小时内开始。
2.将组织放置在生物安全柜中的50mL含75％酒精的离心管中浸泡5分钟, 期间可vortex振荡；
3.用PBS( Ca/ Mg)+1 wt％ Pen Strep清洗2遍；
4.将牛耳转移至含PBS( Ca/ Mg)+1 wt％ Pen Strep的10cm培养皿中剔除可能暴露在环境中的部分及毛发；
5.把组织剪成约1mm3-2mm3的小块，避免将组织剪成糊状；
6.剪完的组织使用基础培养基湿润，均匀的接种至处理好的6孔板底部；
7.37℃二氧化碳培养箱中放置12小时，待组织贴壁后，每孔加入2ml完全培养基（包括：DMEM高糖、Pen strep溶液1％vol、胎牛血清10％vol），然后将培养物在38.5℃孵育持续2~3天，以允许组织块的黏附；
8.培养后第三天进行半换液，至后每三天换一次液，并在显微镜下观察细胞生长状态；
9.7~12天左右可对长出来的细胞使用胰蛋白酶以80％汇合扩增；在P1-P3代进行冻存，以便需要时复苏；
10.在1~2次传代之后，将细胞汇集并重悬于具有10％vol DMSO的生长培养基中，并且以1.0*106个细胞/低温管(冷冻管)的浓度作为细胞库进行冷冻。
二、复苏及细胞扩增
细胞复苏：
1.打开生物安全柜，用10ml移液管取9ml配制好的完全培养基至15ml离心管中备用；
2.从液氮罐中取一支牛成纤维细胞或商用来源的人脂肪间充质干细胞(1millioncells/ml)，快速在37℃水浴锅中融化；
3.用酒精消毒，放进生物安全柜，将冻存管中的细胞悬液加进准备好培养基的离心管中，330g，离心3min；
4.离心结束后，弃去上清，用完全培养基重悬，接种在10cm dish中，放置在二氧化碳培养箱中。
细胞传代：
1.将细胞从二氧化碳培养箱中取出，在倒置显微镜中观察融合度在85％-95％，且细胞状态良好；
2.将细胞放置在生物安全柜中，弃去上清，加2ml PBS清洗，弃去上清，加1mL胰蛋白酶，培养箱放置2min；取出细胞，显微镜下观察细胞变圆；
3.加2mL完全培养基，终止消化，用移液器吹打培养皿表面，收集液体，330g，离心3min；
4.离心结束，弃去上清，加10mL完全培养基，用移液枪将细胞混匀；
5.取10μl细胞悬液和10μl Trypan Blue，1：1混合，取10uL混合液至血球计数板槽内，显微镜下数细胞；
6.根据15000 cells/cm2接种至15cm dish中或不同规格的细胞工厂中,放置在二氧化碳培养箱中培养。
三、细胞的收获和3D接种：
培养三天后取出培养皿或细胞工厂在倒置显微镜下观察细胞融合度在85%-90%且细胞状态良好，就可消化细胞并准备接种至反应器中。
1.将细胞放置在生物安全柜中，弃去上清，加PBS清洗，弃去上清，加1mL胰蛋白酶，培养箱放置2min；取出细胞，显微镜下观察细胞变圆；
2.加等量完全培养基（包括：DMEM高糖、Pen strep溶液1％vol、胎牛血清10％vol），终止消化，用移液器吹打培养皿表面，收集液体，330g，离心3min；
3.离心结束，弃去上清，加10mL完全培养基，用移液枪将细胞混匀；
4.取10μl细胞悬液和10μl Trypan Blue，1：1混合，取10uL混合液至血球计数板槽内，显微镜下数细胞,以20000/cm2个细胞接种至3D反应器/摇瓶中，微载体密度5g/L；
5.培养第三天将摇瓶中的液体转入反应器中，将工作体积提高到1L，开启反应器灌流，按照0.5-1VVD灌流速度进行培养(总增殖培养时间大约1周)，每天更换泵入储液瓶中的完全培养基，清理泵出储液瓶中的培养基废液；
6.若为摇瓶换液，则将摇瓶取出并置于生物安全柜中静置沉降，待微载体沉降后，利用移液枪将上清液吸出，并更换完全培养基（包括：DMEM高糖、Pen strep溶液1％vol、胎牛血清10％vol）。
四、待细胞长满微载体表面后准备更换促分泌培养基
1.反应器暂停搅拌；
2.100%运行泵出完全培养基；
3.100%运行泵入促分泌培养基（所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、2 %v/v胎牛血清、1 wt% PSA、82 μg/ml AA2P、1.5 wt% Glutamax、10 ng/ml TGF-β1、以及1.25 μMUK383367）；
4.关闭泵入泵出管路；
5.打开搅拌，根据反应器状况可适当提高转速保持微载体的悬浮；
6.持续培养3天后，将反应器中液体泵出收集含胶原培养基，-20℃保存；
7.收取后向反应器中补充足量促分泌培养基继续培养3天并再次收集；
8.此过程可持续至少5个循环；
9.若为摇瓶体系，将摇瓶取出并置于生物安全柜中静置沉降，待微载体沉降后，将上清液吸出更换促分泌培养基，培养3天后收集备用，-20℃保存。
实施例2 胶原分泌细胞的多潜能干细胞分化获取及培养
一、牛胚胎干细胞（bESC）向脂肪前体细胞（APC）的分化:
1. 收获无饲养层培养的牛胚胎干细胞，并以每平方厘米100,000个细胞的密度接种在基质包被的6孔板中。
2. 初始条件是：牛胚胎干细胞在生长培养基NBFR中。
3. 在接种之后四天，替换培养基为神经外胚层细胞分化培养基（包含：体积比为1：1的DMEM/F-12和Neurobasal；以及1 % v/v N-2，1 % v/v B-27，3 μM CHIR99021 和10 μM SB-431542）。
4. 使细胞分化五天，替换培养基为脂肪前体细胞分化培养基（MSC seruM-freemediμM (S101-500/S102-025)，购买于Baidi Biotechnology）。
5. 使细胞继续分化四天，之后收集培养基，并且使用重组胰蛋白酶对细胞进行解聚。
6. 将细胞沉淀用于提取RNA并且进行qPCR，用于Col1A1，Col3A1，Elastin和β-Actin基因表达。
二、牛胚胎干细胞（bESC）向肌肉前体细胞（MPC）的分化:
1. 收获无饲养层培养的牛胚胎干细胞，并接种在基质包被的6孔板中。
2. 初始条件是：牛胚胎干细胞在生长培养基NBFR中。
3. 在接种之后四天，替换培养基为补充有10 μM CHIR99021的E6培养基。
4. 使细胞分化二天，替换培养基为补充有100 nM Givinostat的E6培养基。
5. 使细胞继续分化五天，替换培养基为E6培养基。
6. 使细胞继续分化七天，使用重组胰蛋白酶对细胞进行解聚，收获细胞，并接种在胶原蛋白包被的6孔板中，将牛肌肉前体细胞在Skeletal Muscle Cell Growth Medium-2中培养。
7. 之后收集培养基，并且使用重组胰蛋白酶对细胞进行解聚。
8. 将细胞沉淀用于提取RNA并且进行qPCR，于Col1A1，Col3A1，Elastin和β-Actin基因表达。
三、qRT-PCR表征
根据制造商的说明，使用HiPure Total RNA Mini Kit提取和纯化RNA。使用Thermo Scientific NanoDrop Microvolume Spectrophotometers评估RNA的浓度和纯度。随后，使用cDNA SuperMix和Thermal Cycler T100按照制造商的说明合成cDNA。使用基因表达分析的引物、SYBR FAST Universal 2× qPCR Master Mix和LightCycler® 480Instrument II配置qPCR反应体系。使用ΔΔCt方法确定基因的转录水平，并将其归一化到GAPDH。
其中，对牛1型胶原、3型胶原和弹性蛋白的表达水平进行检测的具体引物序列如下：
Col1A1: F: GGACACAGAGGTTTCAGTG (SEQ ID NO:1)；R：TCTCTCACCAGGCAGAC (SEQID NO:2)。
Col3A1: F: CCTGAAATCCCGTTTGGAGA (SEQ ID NO:3)；R:CCTTGAGGTCCTTGACCATTAG (SEQ ID NO:4)。
Elastin: F: TGCAGTGGTGCCTCAACTT (SEQ ID NO:5)；R: TGCGCCTGGAAGCACTC(SEQ ID NO:6)。
ß-Actin: F: CACCACACCTTCTACAACG (SEQ ID NO:7)；R:TGTTGAAGGTCTCGAACATGA (SEQ ID NO:8)。
结果见图3，其中，ß-Actin作为内源性对照，比较样品的RNA量。由qPCR结果可知，分化后的肌肉前体细胞在P6代、p7代对比于牛胚胎干细胞胶原蛋白相关基因显著上调（图3中的A），表明通过分化方案后得到了胶原分泌的肌肉前体细胞。与未分化的牛胚胎干细胞相比，分化后的脂肪前体细胞在p7代，1型胶原和3型胶原以及弹性蛋白的表达水平均显著增加（图3中的B），表明通过分化方案后得到了具有胶原分泌能力的脂肪前体细胞。
实施例3 促可溶性胶原蛋白分泌培养基配方
胶原蛋白在生物体内的合成经过从可溶到不溶的一系列过程，包括胶原蛋白基因的转录，翻译，翻译后的羟基化及糖基化修饰，前胶原分子N端或C端前肽断裂，胶原蛋白三螺旋分子的进一步组装交联并作为细胞外基质的主要成分沉积在细胞表面等等。基于胶原蛋白的生物合成过程，本发明发现，若能够保持前肽不断裂则前胶原分子能够保持溶解在培养基中，而随着前肽断裂，胶原蛋白分子则可以进行组装并最终沉积在细胞表面。基于此原理，本发明开发了促可溶性胶原蛋白分泌培养基配方，此配方可以在促进胶原蛋白生物合成的同时抑制胶原蛋白前肽断链，从而使得胶原蛋白分子在培养基中能够保持可溶状态，以实现细胞培养上清液中的胶原蛋白富集。
此配方包含培养基以及促分泌添加剂组合物两部分，其中培养基中仅包含DMEM高糖，FBS，PSA三种成分，所述促分泌添加剂组合物包括：AA2P, TGF-β1，Glutamax，BMP1抑制剂。通过实验设计对各组分浓度以及各组分配比进行优化，开发出优化的促分泌培养基配方（medium+secretory additive）如下表1所示：
表1
将该配方（培养基+促分泌添加剂组）与培养基组（培养基中仅含DMEM高糖，以及表1中相同含量的FBS，PSA三种成分），以及培养基添加抗坏血酸配方（培养基+抗坏血酸组的配方仅含DMEM高糖，以及表1中相同含量的FBS，PSA，AA2P四种成分）用于对牛成纤维细胞进行培养，在培养3天后收集培养产物，并对其促胶原蛋白分泌效果进行天狼星红染色对比，实验操作详见实施例6，结果如图4中的A所示。
由该结果可知，在使用本发明的添加剂前，培养基中胶原蛋白分泌含量有限，加入AA2P后胶原分泌量有所增加，而利用本发明中的促分泌培养基的促分泌效果约为添加AA2P的3倍，可进一步提高胶原蛋白产量，降低成本。
此外，本实施例还尝试在培养基和促分泌添加剂中其他组分及浓度与表1均一致的情况下，使用不同浓度的TGF-β1和Glutamax，对胶原蛋白的分泌进行了诱导培养，具体设置了同前所述的培养基组、培养基+抗坏血酸组、培养基+促分泌添加剂I组（其中含有10ng/mL TGF-β1和0.5 wt% Glutamax）、培养基+促分泌添加剂II组（其中含有10ng/mL TGF-β1和1.5 wt% Glutamax）、培养基+促分泌添加剂III组（其中含有20ng/mL TGF-β1和0.5 wt%Glutamax）、培养基+促分泌添加剂IV组（其中含有20ng/mL TGF-β1和1.5 wt% Glutamax），在培养4天后收集培养产物，并对其促胶原蛋白分泌效果进行天狼星红染色对比，实验操作详见实施例6，结果如图4中的B所示。由该结果可知，加入不同浓度的谷氨酰胺和TGF-β，均能够协同提升胶原蛋白分泌产量，而在谷氨酰胺和TGFβ含量适当增高时，能够进一步显著增高胶原蛋白分泌产量。
实施例4 促胶原沉积细胞表面培养基配方
基于胶原蛋白生物合成过程，本发明还发现，在培养基中添加大分子聚合物能够促进胶原蛋白分子的组装以及沉积，因此本实施例将促分泌培养基中的BMP1抑制剂替换为阴离子型大分子聚合物MMC，开发了促进胶原蛋白合成并沉积在细胞表面的促沉积培养基配方，以实现在细胞沉淀中富集胶原蛋白，所述促沉积培养基配方组分如下表2所示：
表2
在不同大分子聚合物中，带负电的大分子聚合物促胶原沉积效率较高，本发明分别选取两种大分子聚合物500kDa葡聚糖（DxS），200kDa聚苯乙烯磺酸钠（PSS），以及质量比为1:1的两者共混物（D+P）进行促胶原沉积实验，并与未添加大分子聚合物的培养基（-MMC）进行对比。
实验步骤具体如下：
1. 常规培养成纤维细胞达到70%-90%汇合度，并更换促沉积培养基；
2. 促沉积培养4天后去除培养基，并用PBS清洗细胞；
3. 收集细胞装入离心管中300g，5min离心去除上清液，保留细胞沉淀；
4. 向离心管中加入1% Triton X-100和0.5%SDS以及10mM EDTA，对细胞进行脱细胞处理；
5. 4℃过夜后将离心管以4000rpm，20min离心，收集上清液；
6. 对脱细胞液进行SDS-PAGE表征验证胶原蛋白分子是否存在；
结果如图5所示，由该结果可知，在培养基中添加MMC可以促进胶原蛋白沉积在细胞表面，而培养基中未添加MMC在同样条件下细胞表面未发现胶原蛋白沉积。在两种大分子聚合物中DxS的促沉积效率比PSS更高，且二者共混的促沉积效果比单独使用效果更佳。
实施例5 胶原蛋白分离纯化
一、试剂准备：
1. 盐析溶液配制：12M浓盐酸稀释120倍得到0.1N HCl溶液(1ml 12M HCl+119ml超纯水)，操作在通风橱中完成，称取适量NaCl固体溶解于0.1N HCl中配制2M NaCl的0.1NHCl溶液备用(如11.7g NaCl 溶解于100ml 0.1N HCl中)；
2. 酶解溶液配制：配制0.5M乙酸溶液(质量分数约为3%，即3ml乙酸加入97ml超纯水中)，操作在通风橱中完成，称取适量pepsin固体溶解于0.5M乙酸溶液中配制200μg/ml的pepsin乙酸溶液备用(如20mg pepsin+100ml 0.5M 乙酸)。
二、操作步骤：
1. 将收取的促可溶性胶原蛋白分泌细胞培养基上清装入离心管中，330g，3min(4℃~25℃)，去除细胞碎片，取上清；
2. 将2M NaCl的0.1N HCl溶液与浓缩后培养基按照体积比1:1共混，并将共混液体置于4℃下至少3h，可过夜放置；
3. 将盐析后混合液体装入超速离心管中进行超离，去除上清，收取沉淀；
4. 向沉淀中加入0.1M 乙酸溶液至能够完全溶解即可；
5. 将200μg/ml pepsin 0.1M乙酸溶液与胶原溶液按照体积比1:1混合酶解消化，4℃；
6. 将酶解消化后的胶原蛋白溶液装入100KDa透析袋中放入0.1M乙酸进行透析，4℃，72h，每天至少换一次液；
7. 将透析后胶原蛋白溶液装入离心管中置于-20℃冷冻；
8. 冷冻后放置在冷冻干燥机中进行冻干3天；
9. 冻干后得到胶原蛋白冻干纤维，干燥储存。
为跟踪分离纯化过程中胶原蛋白纯度的变化情况，将过程中的三个阶段分别取样，并进行SDS-PAGE表征，取样阶段包括：收取的促分泌培养基（Medium），盐析后溶解的胶原蛋白溶液（Extraction），以及透析后的胶原蛋白溶液（Purification），如图6所示，在刚收获的培养上清以及盐析后的胶原蛋白溶液中均存在较多的杂蛋白，而透析后的溶液中得到高纯度胶原蛋白。
实施例6 细胞基胶原蛋白表征鉴定方法
一、凝胶电泳（SDS-PAGE）表征
（一）试剂准备：
1. 5×Loading Buffer：于10ml离心管内，分别量取1M Tris-HCl(预先配制1MTris溶液，然后使用HCl调节pH6.8)、SDS(Adamas life E8034-100g)、甘油(Adamas life66258P)、纯水一定量，使Tris-HCl终浓度为250mM，SDS w/v为10%，甘油v/v为50%；混匀，使用前37℃水浴助溶，澄清状态代表溶解充分。
2. 1×Loading Buffer：5×Loading Buffer纯水稀释5倍。
3. 电泳缓冲液配置：使用量筒取1L纯水，在通风橱内溶解金斯瑞预制胶配套电泳缓冲液，澄清状态代表溶解充分。
（二）操作步骤：
1. 将待测样品与5×Loading Buffer按照4：1体积比加入EP管中（蛋白Marker与1×Loading Buffer按照1：4体积比加入EP管后混匀，无需加热变性），进行吹打混匀，然后使用5N氢氧化钠溶液或5N盐酸溶液对其进行pH调整，使终pH为7；
2. 将上步所得混合液于95-100℃金属浴下加热变性10-15min（此步骤注意EP管不要在加热过程中意外打开，可以使用重物对EP管进行压制）；
3. 加热过程结束后，待样品自然恢复至室温后，瞬离，混匀；
4. 按照预先设计的顺序，缓慢上样（上样量约25ul每孔，上样过程防止溢出）；
5. 120-150V恒压电泳60min左右，直到Marker最小条带到达预制胶底部；
6. 关闭电源，取出预制胶，使用纯水清洗预制胶表面，并取出内部预制胶本体，平整地放在15cm dish中，包铝箔纸避光；
7. 倒入20ml左右快速胶染液，摇床上50rpm左右避光过夜染色；
8. 弃去染色液，使用纯水清洗预制胶1遍，后将预制胶浸泡在纯水中直至脱去背景色；
9. 于白色背景板上拍照。
SDS-PAGE可以用于快速的确认蛋白质组分，其原理为消除蛋白质原有的电荷差别，使蛋白的迁移率仅取决于其本身的分子量，如实施例4、5所示。
二、胶原蛋白含量表征
（一）试剂准备：
1. 鼠尾胶原标准品溶液配制：取胶原蛋白1mL(1mg/ml),按比例稀释成50μg/mL,100μg/mL,150μg/mL, 200μg/mL, 250μg/mL, 300μg/mL；
2. 乙酸溶液的配制:将实验室的1M(6% w/v)的乙酸溶液稀释至0.3M；
3. 天狼星红检测溶液的配制：称取278mg,加入2mL 0.3M的乙酸溶液，配制成139mg/mL的原液，将原液稀释成25X的检测溶液，备用。
（二）操作步骤：
1. 取100uL待测样品及0, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL, 200μg/mL, 250μg/mL, 300μg/mL标准品至1.5mL tube中，加入1mL天狼星红检测溶液，混匀，静置30 min；
2. 12000 rpm离心，4℃，30min，弃上清；
3. 用移液枪加1mL配制好的乙酸溶液，12000rpm离心，4℃，30min，弃上清；
4. 沉淀加入1mL 0.1M NaOH溶解；
5. 将溶解液混匀，取100uL至96孔板中，于540nm处测吸光度，利用标准品绘制标准曲线，根据样品OD值计算胶原浓度。同批次不同样品根据OD值的大小也可定性表征胶原蛋白含量的高低。
三、胶原蛋白三螺旋结构圆二色谱（CD）表征
将样品用0.1%乙酸溶解至1mg/ml，测样品的CD谱。仪器参数设为室温条件 20℃，波长范围190-260 nm，间隔1 nm测定。在远紫外区域，胶原蛋白的CD光谱中，在 222 nm 附近具有最大正峰值，在 196nm 附近具有最大负峰值。正峰与负峰的比率（Rpn）是三螺旋结构构象所独有的，有报道指出，具有三螺旋结构的胶原蛋白的 Rpn 范围为 0 .09~0 .15，可用于鉴定Ⅰ型胶原蛋白三螺旋结构的完整性。
测试样品为细胞培养胶原蛋白纯化样品，检测结果见图7。由CD表征结果可知细胞提取胶原蛋白样品存在197nm最大负峰以及221nm最大正峰，出峰位置与天然胶原蛋白一致，且正负峰比值(RPN)为0.11，表明样品存在三螺旋结构。
四、胶原蛋白冻干海绵扫描电镜（SEM）表征
1）将纯化后的1ml胶原蛋白溶液冷冻，并通过冷冻干燥机进行冻干。
2）将冻干后的胶原蛋白海绵取出置于样品台上，将其整体放置于真空喷金仪上，待其压力小于100 Pa时开始向硅片表面喷金，持续3 min。
3）将喷完金后的硅片连同样品台放置于扫描电镜中，打开电脑上的拍摄软件，选取合适的视野进行拍照。
结果如图8所示，本发明的胶原蛋白冻干海绵具有纤维状结构。
五、胶原蛋白纤维透射电镜（TEM）表征
1）用0 .1 M 乙酸配置4.0 mg/mL的胶原蛋白溶液，向其中加入等量的2M NaCl 的0.1M乙酸溶液，再向其中加入磷酸氢二钠至终浓度为150μM，再用0 .1 M NaOH 溶液调节胶原溶液pH至7 .0，放入4℃冰箱进行胶原蛋白纤维组装。
2）取100 μL混匀后的胶原样品在油纸上，形成小液滴，用镊子小心夹起一片铜网，将其倒扣在液体上，室温静置5 min。
3）5 min后将铜片取下放置于滤纸上，用钨丝灯烘烤20 min，使其水分完全蒸干。
4）向蒸干的铜片上滴加一滴磷钼酸，再次放入钨丝灯下蒸干。
5）将蒸干后的铜片放置于除尘后的样品槽中并固定，将整根样品槽送入透射电镜仪中准备拍照。
结果见图9，由该结果可知，在本发明的组装条件下，胶原蛋白分子可以组装成为胶原蛋白纤维，存在典型的67nm周期性D带，胶原蛋白纤维独特的微观结构将有助于提高胶原蛋白产品的力学性能，拓展胶原蛋白在高端医美，严肃医疗等方向的应用范围。
六、红外光谱（FTIR）表征
利用FTIR表征胶原蛋白分子的三螺旋结构，主要是表征C=O在1650cm-1附近的伸缩振动峰（酰胺Ⅰ带），以及由N-H在1540cm-1的弯曲振动、C-N在1300-1450cm-1附近伸缩振动、C-O在1250cm-1附近面内弯曲振动构成的酰胺Ⅲ带。取1-2mg胶原蛋白冻干样品进行FTIR检测，结果如图10所示。
由该结果可知，本发明的胶原蛋白冻干样品在1645cm-1处出现酰胺Ⅰ带，在1544cm-1、1454cm-1、1240cm-1处出现酰胺Ⅲ带。由于胶原蛋白分子由各种氨基酸聚合而成，同时在3283cm-1处出现N-H伸缩振动，在2960cm-1的处出现O-H弯曲振动。
七、细胞增殖
1）样品制备和实验分组
对照组：孔板包被DPBS。
实验组1：孔板包被0 .005 mg/mL胶原蛋白。
实验组2：孔板包被0 .01 mg/mL胶原蛋白。
实验组3：孔板包被0 .05 mg/mL胶原蛋白。
实验组4：孔板包被0 .5 mg/mL胶原蛋白。
实验组中所使用的胶原蛋白均为上述实施例中制得的胶原蛋白冻干样品。
2）孔板包被
用DPBS将各组胶原稀释至上述分组浓度，取96孔板，按照分组每孔加入100 μL对应的溶液，每组设置6个平行，置于37℃，5% CO2条件下培养4 h。后用移液枪吸取孔中液体，注意不要碰到底部包被的胶原，加入100 μL 1% BSA-PBS溶液用于封闭未包被区域，置于37℃，5% CO2条件下培养1 h。1 h用移液枪吸去孔中液体，再用DBPS清洗所有的包被孔，重复三次。洗涤后孔板即刻使用或用封口膜将孔板周围密封，4℃保存。
3）细胞培养
将从-80℃冰箱中冻存的成纤维细胞或间充质干细胞细胞株取出并放入水浴锅中温育至液体融化。将细胞悬液转移至10 mL离心管中，并加入2 mL DMEM完全培养基，1200rpm/min离心3 min，弃去上清，再加入2 mL培养基，用移液枪缓慢吹打使细胞重悬。在T-25培养瓶中加入4 mL培养基，再将细胞悬液转移至培养瓶中，再次吹打使细胞分散均匀。以上操作皆在生物安全柜中进行。向培养瓶尾部喷洒75% 乙醇溶液，再将其放入培养箱中，在37°C，5% CO2条件下进行培养，每两天换一次液。
4）细胞计数：
选取细胞汇合度为90%-95%的培养瓶，洗涤，消化，重悬制备细胞悬液，取20 μL细胞悬液加入20 μL台盼蓝染色液吹打混匀，取混匀后的细胞悬液沿边缘加入血球计数板中，置于显微镜下记录四角的活细胞数，按下式计算细胞悬液的浓度：
式中：
C：细胞悬液的浓度（cells/mL）
n：血球计数板四角活细胞总数
5）MTT检测促细胞增殖能力
将已知浓度的细胞悬液用培养基稀释至1×105cells/ml，取包被后的孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，在孔板边缘加入等量DPBS，置于37℃，5% CO2条件下培养24-72 h。
培养24-72h后，按照MTT试剂盒说明书，每孔加入10 μL MTT溶液，继续培养2-4 h。吸去上清，每孔加入100 μL异丙醇，置于摇床上震荡混匀10 min。
用酶标仪测定各孔570 nm处的吸光度，吸光度越大，代表细胞增殖能力越强。
结果见图11，由该图结果可见，对比于未包被胶原的培养板，包被胶原蛋白的培养板上细胞增殖能力更强。
八、细胞迁移
1）实验分组
对照组：孔板包被DPBS。
实验组：孔板包被0 .005 mg/mL 胶原蛋白。
实验组中所使用的胶原蛋白均为上述实施例中制得的胶原蛋白冻干样品。
2）孔板包被
用DPBS将胶原稀释至上述分组浓度，取6孔板，按照分组每孔加入300 μL对应的溶液，每组设置6个平行，置于37℃，5% CO2条件下培养4 h。后用移液枪吸取孔中液体，注意不要碰到底部包被的胶原，加入100 μL 1% BSA-PBS溶液用于封闭未包被区域，置于37℃，5%CO2条件下培养1 h。1 h用移液枪吸去孔中液体，再用DBPS清洗所有的包被孔，重复三次。洗涤后孔板即刻使用或用封口膜将孔板周围密封，4℃保存。
3）细胞培养
将从-80℃冰箱中冻存的成纤维细胞取出并于DMEM完全培养基复苏培养，当细胞汇合度为90%-95%时进行传代操作。倒掉培养瓶中的培养基，向瓶中加入5 mL DPBS溶液，轻轻摇晃使其完全润洗培养瓶底部后倒掉，重复三次。再加入2 mL胰酶溶液，盖上瓶盖，轻晃瓶身使其完全浸润瓶底细胞。然后将培养瓶置于培养箱中消化约3 min，消化后置于显微镜下观察，制备细胞悬液时加入600 μL培养基吹打重悬细胞备用。
4）细胞计数
选取细胞汇合度为90%-95%的培养瓶，洗涤，消化，重悬制备细胞悬液，取20 μL细胞悬液加入20 μL台盼蓝染色液吹打混匀，取混匀后的细胞悬液沿边缘加入血球计数板中，置于显微镜下记录四角的活细胞数，按下式计算细胞悬液的浓度：
式中：
C：细胞悬液的浓度（cells/mL）
n：血球计数板四角活细胞总数
5）划痕实验
将已知浓度的细胞悬液用培养基稀释至5×105cells/ml，取包被后的6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液，每组平行三孔，置于37℃，5% CO2条件下培养12 h。
培养12 h后，观察细胞生长状况，以汇合度在90%-95%为宜，用10μL枪头在孔板中心划出“十”字型划痕，用DPBS洗涤三次，去除划下来的细胞。再按照分组加入空白培养基配置的样品。
将孔板置于显微镜下拍照，记录各组0 h，划痕交叉处的照片，将孔板置于37℃，5%CO2条件下培养12 h，再次拍摄划痕交叉处照片。
结果见图12，由该结果可知，在培养皿包被胶原蛋白后，经过12h培养，能够显著促进细胞迁移。
九、促细胞内源胶原再生
（一）试剂准备：
1）包被液配制：胶原蛋白粉末，用0.5M乙酸（无菌）溶解成1 mg/ml的溶液，用PBS稀释成 50μg/ml；
2）胶原包被：
a. 取等体积的不同浓度的胶原蛋白溶液（由上述实施例中制得的胶原蛋白冻干样品制得）用于包被12孔板，200μL/well，每组浓度3个复孔；
b. 37℃孵育60分钟；
c. 将包被液吸掉；
d. 将孔板在UV光下照射30分钟用于灭菌；
e. 用基础培养基（DMEM）水化12小时；
f. 将基础培养基吸掉，备用；
3）设置四个条件：（不包被，不包被；接种后在培养基中加入50μg/ml胶原蛋白；包被；包被，接种后在培养基中加入50μg/ml胶原蛋白）
（二）操作步骤：
细胞复苏：
1.打开生物安全柜，用10ml移液管取9ml配制好的完全培养基至15ml离心管中备用；
2.从液氮罐中取一支细胞，快速在37℃水浴锅中融化
3.用酒精消毒，放进生物安全柜，将冻存管中的细胞悬液加进准备好培养基的离心管中，330g，离心3min；
4.离心结束后，弃去上清，用完全培养基重悬，接种在10cm dish中，放置在二氧化碳培养箱中
细胞铺板：
1.将细胞从二氧化碳培养箱中取出，在倒置显微镜中观察融合度在85％-95％，且细胞状态良好；
2.将细胞放置在生物安全柜中，弃去上清，加2ml PBS清洗，弃去上清，加1mL胰蛋白酶，培养箱放置2min；
3.取出细胞，显微镜下观察细胞变圆加2mL完全培养基，终止消化，用移液器吹打培养皿表面，收集液体，330g，离心3min;
4.离心结束，弃去上清，加10mL完全培养基，用移液枪将细胞混匀；
5.取10ul细胞悬液和10uL Trypan Blue，1：1混合，取10uL混合液至血球计数板槽内，显微镜下数细胞；
6.按50000/cm2种至上述胶原包被好的12孔板，二氧化碳培养箱培养72H后，拿出细胞显微镜下观察融合度在85%-90%且细胞状态良好；
7.收集细胞，提取RNA,做qPCR检测（GAPDH, COL1A1, COL3A1）等Marker。
结果见图13，由该结果可知，包被胶原蛋白的培养板相比于未包被培养板能够显著促进内源胶原蛋白再生。
实施例7 对人间充质干细胞的胶原诱导分泌效果
采用实施例1中“二、复苏及细胞扩增”、“三、细胞的收获和3D接种”及“四、待细胞长满微载体表面后准备更换促分泌培养基”所提及的方法，对商用来源的人脂肪间充质干细胞进行扩增和促分泌，而后按照如下操作对分泌产物进行Western-blot（免疫印迹）检测：
1. 蛋白浓度的测定
1.1 配置工作液：将 BCA 试剂盒中的 A、B 液按 50:1 比例混合；
1.2 设定 8 个浓度的标准品，分别为：0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 和2（μg/μL）；
1.3 将样本 1:10 稀释 20μL 待用；
1.4 每 200μL 工作液中加入 20μL 标准品或样本，37°反应 30min；
1.5 使用酶标仪 562 nm 检测 OD 值；
1.6 绘制标准曲线并根据标准曲线计算样本蛋白浓度。
2. 准备 15 孔 Future PAGE 蛋白预制胶
3. 上样和电泳
3.1 根据测定的蛋白浓度，按照上样量计算上样体积；
3.2 吸取相应体积的样本转移到新的 EP 管中，并加入 5 × SDS LoadingBuffer，于 100℃金属浴 5-10min 后按顺序上样；
3.3 电泳：恒定 80V，持续 20min；转 120V，持续 60min。
4. 转膜
4.1 配制转膜液并预冷，将膜提前浸泡 20min；
4.2 按照顺序：负极（黑色）-海绵-三层滤纸-凝胶-PVDF 膜-三层滤纸-海绵-正极（红色）固定蛋白胶与 PVDF 膜（无气泡），制作膜三明治；
4.3 放入槽中设置电压和时间，恒定电流 400 mA，75min。
5. 封闭
5.1 转膜结束后，用镊子夹取膜，注意正反面，贴胶的一面放在上面，避免与容器底布刮擦；
5.2 根据样本的分子量大小裁剪膜，用 1×TBST 轻轻漂洗后置于 5%脱脂奶粉中，摇床上室温封闭 3 h。
6. 抗体孵育
6.1 封闭结束后用 1×TBST 轻轻漂洗立即取出；
6.2 放入加有一抗的盒子中，冰箱 4℃过夜孵育；
6.3 一抗孵育结束后加入 5% 脱脂奶粉，摇床上洗涤三次，10min/次；
6.4 倾去 5%脱脂奶粉，室温孵育二抗 1h；
6.5 二抗孵育结束后，加入 TBST，摇床上洗涤三次， 10min/次。
抗体信息见下表3：
表3
7. 加入显色液，采集数据。
结果见图14，由该结果可知，促分泌培养上清液中含有胶原蛋白Collagen，纤粘连蛋白Fibronectin，层粘连蛋白Laminin等的表达。
采用实施例5中的方法对人脂肪间充质干细胞分泌的胶原进行纯化，而后按照实施例6中所提及的凝胶电泳（SDS-PAGE）表征方法对纯化后的人源细胞基胶原蛋白（图中简称为人源胶原）进行检测，检测结果见图15。结果显示样品含有清晰的两条胶原蛋白α1及α2链条带，分子量与WB结果吻合，且无杂带，表明样品为高纯度人源细胞基胶原蛋白。
采用实施例6中的胶原蛋白三螺旋结构圆二色谱（CD）表征方法对纯化后的人源细胞基胶原蛋白进行表征，结果见图16。结果显示，样品在221nm处存在正峰，在197nm处存在负峰，出峰位置与天然胶原蛋白一致，且正负峰比值(RPN)约为0.12，表明样品具有典型三螺旋结构。
可见，本发明的促分泌方法对人源间充质干细胞具有较优的应用效果，对于脂肪前体细胞、肌肉前体细胞等具备胶原分泌能力的细胞均具有较大的应用潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (27)
1.一种用于促进胶原蛋白分泌的添加剂，其包括：
i）AA2P，
ii）Glutamax，
iii）TGF-β1，以及
选自如下iv）~v）中的一项：
iv）UK383367；
v）大分子拥挤剂MMC；所述大分子拥挤剂MMC为葡聚糖、聚苯乙烯磺酸钠、或质量比为1：0.5~2的葡聚糖和聚苯乙烯磺酸钠的混合物。
2.一种促分泌培养基，其用于促进胶原蛋白分泌，其含有：
a）基础培养基，
b）血清或血清替代物，
c）抗生素，以及
d）权利要求1所述的添加剂。
3.根据权利要求2所述的促分泌培养基，其中，所述基础培养基为DMEM高糖；
所述血清或血清替代物选自胎牛血清、血清替代物中的至少一种；
所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B中的至少一种。
4. 根据权利要求2或3所述的促分泌培养基，其中，所述促分泌培养基含有：基础培养基、1~5 %v/v血清或血清替代物、0.5~1.5 wt%抗生素、70~90 μg/ml AA2P、0.5~2 wt%Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及1.0~1.5 μM UK383367；或，所述促分泌培养基含有：基础培养基、1~5 %v/v血清或血清替代物、0.5~1.5 wt%抗生素、70~90 μg/mlAA2P、0.5~2 wt%Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及80~120 μg/ml大分子拥挤剂MMC。
5. 根据权利要求2或3所述的促分泌培养基，其中，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、1~5 %v/v胎牛血清、0.5~1.5 wt% PSA、70~90 μg/ml AA2P、0.5~2 wt% Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及1.0~1.5 μM UK383367；或，所述促分泌培养基含有：DMEM高糖、1~5 %v/v胎牛血清、0.5~1.5 wt% PSA、70~90 μg/ml AA2P、0.5~2 wt% Glutamax、5~20 ng/ml TGF-β1、以及80~120 μg/ml大分子拥挤剂MMC；其中，所述大分子拥挤剂MMC为质量比为1:0.5~2的葡聚糖和聚苯乙烯磺酸钠的混合物。
6.一种培养基试剂盒，其通过一个或多个试剂的组合，提供权利要求2~5中任一项所述的促分泌培养基。
7.根据权利要求6所述的培养基试剂盒，其通过多个试剂的组合，还提供完全培养基；
所述完全培养基含有：DMEM高糖、0.5~1.5 %v/v Pen strep溶液、以及8~15 %v/v胎牛血清。
8.根据权利要求6所述的培养基试剂盒，其通过多个试剂的组合，还提供选自神经外胚层细胞分化培养基、脂肪前体细胞分化培养基中的至少一种培养基；
其中，所述神经外胚层细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制GSK-3α、GSK-3β、TGF-β I型受体和ALK5 的第一抑制剂；
所述脂肪前体细胞分化培养基为MSC无血清培养基。
9. 根据权利要求8所述的培养基试剂盒，其中，所述神经外胚层细胞分化培养基包含：体积比为1：0.8~1.2的DMEM/F-12和Neurobasal；以及0.8~1.2 %v/v N-2，1.8~1.2 %v/v B-27，2~4 μM CHIR99021 和8~12 μM SB-431542；
所述脂肪前体细胞分化培养基包含MSC seruM-free mediμM 、StemPro® MSC SFM、Xeno-Free MSC Expansion Media中的一种。
10.根据权利要求6所述的培养基试剂盒，其通过多个试剂的组合，还提供选自中胚层细胞分化培养基、肌肉前体细胞分化培养基、肌肉前体细胞扩增培养基中的至少一种培养基；
其中，所述中胚层细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制GSK-3α和GSK-3β的第二抑制剂；
所述肌肉前体细胞分化培养基包含一种或多种用于抑制组蛋白去乙酰化酶的第三抑制剂。
11. 根据权利要求10所述的培养基试剂盒，其中，所述中胚层细胞分化培养基包含：E6培养基，以及8~12 μM CHIR99021；
所述肌肉前体细胞分化培养基包含：E6培养基，以及80~120 nM Givinostat；
所述肌肉前体细胞扩增培养基选自Skeletal Muscle Cell Growth Medium-2 、Skeletal Muscle Cell Basal Medium、Myogenic Medium、DMEM、Ham’s F-10 NutrientMixture、Medium 199、RPMI 1640 Medium中的一种。
12.一种用于生产胶原的试剂盒，其包含：权利要求2~5中任一项所述的促分泌培养基或权利要求6~11中任一项所述的培养基试剂盒中的试剂，以及选自盐析溶液、酶解溶液中的至少一种试剂，
其中，所述盐析溶液中含有1.8~2.2M NaCl、0.05~0.15M HCl、以及水；
所述酶解溶液中含有180~220μg/ml胃蛋白酶、0.4~0.6M乙酸以及水。
13. 根据权利要求12所述的试剂盒，其还包含以下一个或多个试剂：0.05~0.15M乙酸溶液、含有1.8~2.2M NaCl和0.05~0.15M乙酸的水溶液、磷酸氢二钠、以及0.05~0.15M NaOH溶液。
14.一种生产胶原的方法，其包括：
使用权利要求1所述的添加剂、或权利要求2~5中任一项所述的促分泌培养基、或权利要求6~11中任一项所述的培养基试剂盒、或权利要求12或13所述的试剂盒，对胶原分泌细胞进行培养；
从培养产物中收集胶原蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述胶原分泌细胞选自成纤维细胞、间充质干细胞、脂肪前体细胞、肌肉前体细胞中的至少一种。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述胶原分泌细胞源自人类、牛、羊、马、猪、骆驼或鹿中的一种或几种。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述胶原分泌细胞源自水牛、长颈鹿、河马或犀牛中的一种或几种。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，当所述胶原分泌细胞为成纤维细胞或间充质干细胞时，所述方法包括：
使用权利要求7所述的培养基试剂盒中的试剂，将细胞在所述完全培养基中进行增殖培养；
将增殖培养后的细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；
从培养产物中收集胶原蛋白。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述增殖培养的方式为3D培养。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，当所述胶原分泌细胞为脂肪前体细胞时，所述方法包括：
使用权利要求8或9所述的培养基试剂盒中的试剂，将多潜能干细胞在所述神经外胚层细胞分化培养基诱导分化为神经外胚层细胞；
将所述神经外胚层细胞在所述脂肪前体细胞分化培养基中诱导分化为脂肪前体细胞；
将所述脂肪前体细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；
从培养产物中收集胶原蛋白。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，当所述胶原分泌细胞为肌肉前体细胞时，所述方法包括：
使用权利要求10或11所述的培养基试剂盒，将多潜能干细胞在所述中胚层细胞分化培养基中诱导分化为中胚层细胞；
将所述中胚层细胞在所述肌肉前体细胞分化培养基中诱导分化为肌肉前体细胞；
将所述肌肉前体细胞在所述促分泌培养基中进行培养，以促进胶原蛋白分泌；
从培养产物中收集胶原蛋白。
22.根据权利要求14所述的方法，其中，当所述促分泌培养基中含有UK383367时，从培养基上清液中收集胶原蛋白；当所述促分泌培养基中含有大分子拥挤剂MMC时，从细胞沉淀中收集胶原蛋白。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，所述从培养产物中收集胶原蛋白具体包括：
将培养产物与含有1.8~2.2M NaCl、0.05~0.15M HCl和水的盐析溶液混合后，分离得到沉淀；
将所述沉淀溶解后，与含有180~220μg/ml胃蛋白酶、0.4~0.6M乙酸和水的酶解溶液混合进行酶解消化；
将酶解消化后的溶液装入80~120KDa透析袋中进行透析，以得到胶原蛋白溶液。
24.根据权利要求14所述的方法，其中，所述方法还包括：
将收集到的胶原蛋白溶液与含有1.8~2.2M NaCl和0.05~0.15M乙酸的水溶液混合，而后向其中加入磷酸氢二钠至终浓度为140~160μM，而后使用0.05~0.15M NaOH溶液调节溶液pH至7.0±0.5，并在2~6℃下进行胶原蛋白纤维组装。
25.一种组合物的制备方法，其中，所述组合物为培养基、食品、化妆品、药品或医疗材料，所述制备方法包括：
通过权利要求14~23中任一项所述的方法制得胶原蛋白后，和/或，通过权利要求24所述的方法制得胶原蛋白纤维后；
将所述胶原蛋白和/或所述胶原蛋白纤维用于制备所述组合物。
26.一种培养器具的制备方法，其中，所述制备方法包括：
通过权利要求14~23中任一项所述的方法制得胶原蛋白后，将所述胶原蛋白用于包被所述培养器具。
27.一种纺织品的制备方法，其中，所述制备方法包括：
通过权利要求24所述的方法制得胶原蛋白纤维后，将所述胶原蛋白纤维用于制备纺织品。
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| WO2019121768A1 (en) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Extracellular matrix and its use for regulating the differentiation of mesenchymal stem cells |
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