Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN118307682A - 免疫调节性融合蛋白 - Google Patents

免疫调节性融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN118307682A
CN118307682A CN202410281185.1A CN202410281185A CN118307682A CN 118307682 A CN118307682 A CN 118307682A CN 202410281185 A CN202410281185 A CN 202410281185A CN 118307682 A CN118307682 A CN 118307682A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
fusion protein
cancer
expression vector
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410281185.1A
Other languages
English (en)
Inventor
克里斯托弗·拉森
托尼·雷德
布莱恩·T·奥兰斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epicentrx Inc
Original Assignee
Epicentrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epicentrx Inc filed Critical Epicentrx Inc
Publication of CN118307682A publication Critical patent/CN118307682A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/461Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515Animal cells
    • A61K2039/5158Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522CH1 domain
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524CH2 domain
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53Hinge
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10333Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10371Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

提供了一种融合蛋白例如细胞因子受体融合蛋白如TGFβtrap,其具有新的接头序列以允许所述融合蛋白在功能上最优,例如允许细胞因子受体融合蛋白的细胞因子受体部分最优地结合到它的靶细胞因子。所述融合蛋白或编码所述融合蛋白的表达载体例如溶瘤腺病毒表达载体,可用于治疗细胞增殖性疾病和紊乱,包括某些形式的癌症和炎症紊乱。

Description

免疫调节性融合蛋白
本申请是申请号为201780073371.4、申请日为2017年9月27日、发明名称为“免疫调节性融合蛋白”的中国发明专利申请的分案申请。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月27日提交的美国临时专利申请系列号62/400,338和2017年4月12日提交的美国临时专利申请系列号62/484,841的利益和优先权,每个所述临时申请整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明的领域是分子生物学,具体来说是免疫学和融合蛋白,例如细胞因子受体融合蛋白。
背景技术
细胞因子是一种小的、分泌的细胞信号传导蛋白,其具有广泛的活性,包括细胞生长和分化的调控以及免疫功能的调节。细胞因子、细胞因子受体和某些其他免疫调节蛋白已被用作治疗剂来治疗各种不同的医学病症。然而,这些蛋白的施用例如通过皮下或血管途径的施用,可能引起不适当的细胞和细胞外定位,由此限制了治疗活性和/或增加了毒性的风险。
转化生长因子-β(TGFβ)是一种多效性细胞因子,其具有免疫调控性质,例如炎性和过敏性免疫应答的限制和终止(Taylor(2009)J.Leukoc.Biol.85(1):29-33)。TGFβ与炎性、恶性、感染性和自体免疫疾病以及骨质疏松症和纤维化包括肝硬化和系统性硬化症具有一定联系。具体来说,肿瘤中持续高水平的TGFβ与免疫耐受、血管发生、转移和肿瘤细胞外基质沉积的增加相关,所有这些都可能驱动癌症发展和对疗法的抗性。
已开发了几种治疗剂来捕获或螯合TGFβ并因此减低或调节TGFβ活性。实例包括针对TGFβ的单克隆抗体例如fresolimumab,其已在几项临床试验中施用用于治疗癌症和系统性硬化症(Connolly等,(2012)INT.J.BIOL.SCI.8(7):964-78)。
单克隆抗体的一种可替选方法包括使用含有TGFβII型受体(TβRII)或TGFβIII型受体(TβRIII或β聚糖)的细胞外结构域的可溶性部分的重组Fc-融合蛋白(Connolly等,(2012),同上)。这些被称为TGFβ阱(TGFβtrap)的分子通常含有二聚TGFβ受体复合物的两条链的细胞外结构域。可溶性TβRII-Fc融合蛋白的表达已被偶联到溶瘤腺病毒,并显示出引起原发肿瘤生长和溶骨性骨破坏的显著降低(Hu等,(2010)HUM.GENE THER.21(11):1623-9)。
尽管到目前为止已进行许多尝试,但对改进的融合蛋白例如细胞因子受体融合蛋白,特别是中和人类TGFβ的生物活性以在人类患者中治疗由TGFβ介导的障碍的改进的TGFβ受体融合蛋白,仍存在着需求。
发明内容
本发明部分是基于改进融合蛋白例如细胞因子受体融合蛋白例如TGFβII型(TβRII)受体融合蛋白如TGFβ阱的功能的接头序列的发现。所述接头序列可以允许融合蛋白的配体结合部分(例如细胞因子受体)最优地结合到配体(例如细胞因子),提供融合蛋白的两个以上个组分(例如二聚细胞因子的两个亚基)的时空共定位,优化从表达载体(例如病毒载体)的表达,降低免疫原性,或提供切割位点以允许释放所述融合蛋白的组分。例如,所述接头序列可以提供足够的柔性,以允许细胞因子受体的配体结合结构域在融合蛋白的背景中采取本源构象,并最小化所述融合蛋白作为治疗剂使用的潜在免疫原性。
一方面,本发明提供了一种分离的融合蛋白,其以N-端到C-端的方向包含例如:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第一部分;氨基酸接头;以及下述至少一种:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第二部分;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域。在某些实施方式中,所述接头包含约5至约40个氨基酸残基。
另一方面,本发明提供了一种分离的融合蛋白,其以N-端到C-端的方向包含:细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分;氨基酸接头;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域;其中所述接头包含约5至约40个氨基酸残基。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述氨基酸接头可以包含例如约5至约15个、约5至约20个、约5至约30个、约10至约15个、约10至约20个、约10至约30个、约10至约40个、约15至约20个、约15至约30个或约15至约40个氨基酸残基。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述氨基酸接头序列源自于内源人类蛋白,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、白蛋白或酪蛋白。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含免疫球蛋白(Ig)CH1结构域例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1结构域的C-端部分。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:60和SEQID NO:61的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含IgG1 CH1结构域的C-端部分,例如所述氨基酸接头包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列,例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述氨基酸接头包含源自于细胞因子、信号传导分子、免疫调节蛋白或肽或生物活性肽的序列。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述氨基酸接头包含切割位点例如蛋白水解切割位点,例如被存在于真核细胞的内质网或高尔基体中的蛋白酶切割的蛋白水解切割位点。在某些实施方式中,所述蛋白水解切割位点是弗林蛋白酶切割位点例如包含序列RX1X2R(SEQ ID NO:50)的弗林蛋白酶切割位点,其中X1是任何氨基酸并且X2是Lys或Arg,例如包含序列RAKR(SEQ ID NO:51)的弗林蛋白酶切割位点。在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述氨基酸接头在哺乳动物或植物中是蛋白水解稳定的。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分是人类TβRII受体的细胞外结构域的可溶性部分。例如,在某些实施方式中,所述细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或SEQ IDNO:12的23-159位氨基酸残基。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述融合蛋白包含下述一者以上:TGF-β、CD80、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12B/p40、IL-23A/p19、IL27A/p28、IL-27B/EBI3、CD154、CD86、CD137、CD137L、IFN-α、IFN-β、BORIS/CTCFL、FGF、ICAM、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、血管抑素、内皮抑素、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链和抗PD-L1抗体重链或轻链、或其功能性片段。例如,在某些实施方式中,融合蛋白可能包含:CD80和CD137L;IL-23A/p19和IL-12B/p40;或IL-27A/p28和IL-27B/EBI3。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述Ig铰链区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM铰链区,并且所述Ig Fc结构域选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。在某些实施方式中,所述Ig铰链区和Fc结构域一起包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述IgFc、Ig铰链区和Ig CH1结构域源自于单一免疫球蛋白。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述融合蛋白包含选自SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述融合蛋白包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在任何上述融合蛋白的某些实施方式中,所述融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63的序列具有高于80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
另一方面,本发明提供了一种二聚细胞因子结合蛋白,其包含共价连接在一起的任何上述融合蛋白中的两个,其中每个融合蛋白包含细胞因子受体的细胞外结构域,并且其中所述两个细胞外结构域一起定义了用于细胞因子的结合位点。
另一方面,本发明提供了一种核酸,其包含编码任何上述融合蛋白的核苷酸序列。
另一方面,本发明提供了一种表达载体,其包含任何上述核酸。所述表达载体可以是溶瘤病毒,例如所述病毒可能选择性地在过度增殖性细胞中复制和/或选择性地在过度增殖性细胞中表达所述融合蛋白。在某些实施方式中,所述溶瘤病毒是溶瘤腺病毒,例如溶瘤2型或5型腺病毒。
在任何上述表达载体的某些实施方式中,编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间的E1b-19K插入位点中。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点包含与E1b-19K的起始位点相邻的约200个核苷酸例如203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点包含对应于Ad5基因组(SEQID NO:52)的1714-1916位核苷酸的缺失,或者编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:5)的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中,编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO:53)与TCACCAGG(SEQ ID NO:54)之间,例如所述腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO:53)、编码所述融合蛋白的核苷酸序列和TCACCAGG(SEQ ID NO:54)。
在任何上述表达载体的某些实施方式中,所述腺病毒可以包含至少一个Pea3结合位点或其功能性部分的缺失,例如,所述腺病毒可以包含对应于E1a的起始位点上游约-300至约-250位的核苷酸的缺失,或对应于E1a的起始位点上游-305至-255位的核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述腺病毒可以包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的195-244位的核苷酸的缺失,和/或所述重组腺病毒可以包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:55)。在某些实施方式中,所述重组溶瘤腺病毒可以包含至少一个Pea3结合位点或其功能性部分的缺失,并且不包含E2F结合位点的缺失。在某些实施方式中,所述腺病毒可以包含至少一个E2F结合位点或其功能性部分的缺失。在某些实施方式中,所述腺病毒可以包含至少一个E2F结合位点或其功能性部分的缺失,并且不包含Pea3结合位点的缺失。
在任何上述表达载体的某些实施方式中,所述腺病毒可以包含E3缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含约500至约3185个、约500至约3000个、约500至约2500个、约500至约2000个、约500至约1500个、约500至约1000个、约1000至约3185个、约1000至约3000个、约1000至约2500个、约1000至约2000个、约1000至约1500个、约1500至约3185个、约1500至约3000个、约1500至约2000个、约2000至约3185个、约2000至约3000个、约2000至约2500个、约2500至约3185个、约2500至约3000个或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。在某些实施方式中,所述E3缺失位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点相邻的约500至约1551个、约500至约1500个、约500至约1000个、约1000至约1551个、约1000至约1500个或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点相邻的约1050个核苷酸的缺失,例如,所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点相邻的1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的29773-30836位核苷酸的缺失。
在某些实施方式中,编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到所述E3缺失中,例如所述核苷酸序列被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO:56)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)之间,例如所述腺病毒以5’至3’方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO:56)、编码所述融合蛋白的核苷酸序列和TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)。
在某些实施方式中,所述溶瘤腺病毒包含插入到E1b-19K插入位点中的编码融合蛋白的核苷酸序列,其中所述插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间,和/或修饰的E1a调控序列,其中至少一个Pea3结合位点或其功能性部分被缺失。
另一方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含任何上述表达载体。另一方面,本发明提供了一种生产融合蛋白的方法,所述方法包括将宿主细胞在一定条件下生长以表达所述融合蛋白,和纯化所述融合蛋白。另一方面,本发明提供了一种在靶细胞中表达融合蛋白的方法,所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的任何上述表达载体。在某些实施方式中,所述融合蛋白在翻译后被切割成两条多肽链。
另一方面,任何上述融合蛋白或表达载体可用于例如在受试者中降低细胞因子活性,由此治疗由细胞因子例如TGFβ介导的各种不同的医学指征。另一方面,任何上述融合蛋白或表达载体可用于在体外和/或体内抑制肿瘤细胞的增殖,在需要的受试者中抑制肿瘤生长,或在需要的受试者中治疗癌症。所述受试者可以是例如动物例如哺乳动物,例如人类如人类幼儿。例如,当施用到患有癌症的人类受试者时,所述融合蛋白或表达载体在所述受试者中抑制或降低肿瘤生长或减轻肿瘤负荷。
在某些实施方式中,所述癌症可以选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、脑和中枢神经系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌(例如甲状旁腺上皮癌)、子宫内膜癌、神经内分泌癌、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金)、白血病、梅克尔细胞癌、胃肠道间质肿瘤、多发性骨髓瘤、子宫癌、肉瘤、肾癌、眼癌、胰腺癌和生殖细胞癌(例如卵巢生殖细胞癌)。在某些实施方式中,所述癌症可以选自白血病、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌和白血病。
在某些实施方式中,所述融合蛋白或表达载体与选自手术、辐射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种以上疗法联合施用。在某些实施方式中,所述融合蛋白或表达载体与淋巴细胞例如T-细胞如CAR T-细胞联合施用。
任何上述融合蛋白或表达载体也可用于在需要的受试者中治疗炎性病症或感染。
本发明的这些和其他方面和优点通过下面的附图、详细描述和权利要求书进行说明。
附图说明
参考下述附图,本发明可以被更充分地理解。
图1A示出细胞表面上的二聚细胞因子受体(左)、抗体(中)和最优地结合靶细胞因子的受体-Fc融合体(右)的示意图。
图1B示出受体-Fc融合体例如细胞因子阱,其被空间约束而不能最优地结合到靶细胞因子(左)或采取最优结合构型(右)。
图2示出人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM CH1结构域(上)和CH2结构域(下)的氨基酸序列的序列比对。从上至下结构域序列的SEQ ID NO依次为64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80和81。
图3示出在按照指示用TGFβ和/或TGFβII型受体融合蛋白hTGFβR-IgG-1和hTGFβR-Fc处理报告细胞后磷酸化的Smad2的Western印迹。总Smad2和Smad3被用作载样对照。与hTGFβR-Fc相比,TGFβ活性被hTGFβR-IgG-1显著降低。
图4示出在按照指示用TGFβ和/或TGFβII型受体融合蛋白hTGFβR-IgG1-1(1)、hTGFβR-IgG1-2(2)、hTGFβR-IgG1-3(3)和hTGFβR-IgG1-4(4)处理报告细胞后磷酸化的Smad2的Western印迹。β-肌动蛋白被用作载样对照。
图5A-5C示出在用所指示的病毒治疗后小鼠中的肿瘤体积。每条线代表一只小鼠的肿瘤体积。
图6A-6B示出在用TGFβ和/或所指示的病毒处理所指示的细胞系后磷酸化的Smad2的Western印迹。总Smad2和Smad3被用作载样对照。
详细描述
本发明提供了一种分离的融合蛋白,其用于在受试者中治疗各种不同的医学病症,例如用于抑制肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤生长、治疗癌症、治疗炎性病症或治疗感染。示例性的融合蛋白包含:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第一部分;氨基酸接头;以及下述至少一种:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第二部分;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域。在某些实施方式中,所述接头包含约5至约40个氨基酸残基。本发明的示例性融合蛋白包括细胞因子阱。
细胞因子阱例如TGFβ阱是一种含有细胞因子受体例如TGFβ受体例如TGFβII型受体(TβRII)的细胞外结构域的可溶性部分的分子,其被设计用于结合或以其他方式螯合靶细胞因子。在细胞因子阱中,可以将细胞因子受体的细胞外结构域融合到免疫球蛋白(Ig)铰链区和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域,以可以允许例如提高稳定性、Fc效应功能和/或多聚体化例如二聚体化。由融合到Ig铰链区和Ig Fc结构域产生的二聚化对于作为二聚受体复合物存在于细胞表面上的细胞因子受体例如TβRII来说是特别有利的。
常规的细胞因子阱例如TGFβ阱包含两条多肽链,每条多肽链包含融合到Ig铰链区和Ig Fc结构域的细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分。所述细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分通常被直接融合到Ig铰链区,没有任何插入序列。所述两条多肽链通过每个所述Ig铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。每条多肽链提供细胞因子受体例如TβRII的细胞外结构域的可溶性部分,并且所述两个细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分一起定义了用于细胞因子的结合位点。图1A中示出二聚细胞因子受体、免疫球蛋白(抗体)分子和包含两个共价连接的融合蛋白的二聚蛋白的示意图,每个所述融合蛋白包含融合到Ig铰链区和Ig Fc结构域的细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分。
本发明部分是基于下述发现,即包含细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分与Ig铰链区和Ig Fc结构域的融合蛋白的常规的细胞因子阱例如TGFβ阱,不最优地结合它们的靶细胞因子。例如,常规的TGFβ阱不在两个TβRII配体结合结构域之间提供足够的柔性以允许所述两个TβRII配体结合结构域一起集合成定义TGFβ结合位点的最优构型。
因此,一方面,本发明提供了一种分离的融合蛋白,其以N-端到C-端的方向包含:细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分;氨基酸接头;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域;其中所述接头包含约5至约40个氨基酸残基。所述接头序列允许例如所述细胞因子受体的细胞外结构域的结合结构域最优地结合到它的靶细胞因子。这在所述细胞因子结合蛋白是包含合在一起定义结合位点以结合所述靶细胞因子的两个上述融合蛋白的二聚体时,是特别重要的。没有所述接头时,所述两个结合结构域可能在空间上受到约束而不能形成最优结合位点(图1B)。本发明的各种不同特点和方面将在下文中更详细讨论。
I.融合蛋白
示例性的融合蛋白可以包含:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第一部分;氨基酸接头;以及下述至少一种:细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第二部分;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域。设想了所述细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第一部分可以相同或不同于所述细胞因子、细胞因子受体或免疫调节蛋白的细胞外结构域、跨膜结构域或细胞内结构域的第二部分。
例如,所公开的融合蛋白可以以N-端到C-端的方向包含:细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分;氨基酸接头;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域;其中所述接头包含约5至约40个氨基酸残基。
示例性的细胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-4、IL-9、IL-13、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、G-CSF、LIF、OSM、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、TNF-β、4-1BBL APRIL、CD153、CD178、LIGHT、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Epo、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF和MSP。
当在本文中使用时,“免疫调节”蛋白是指调节受试者的免疫系统的功能的蛋白质。免疫调节蛋白可以例如调节例如B-细胞、T细胞的功能和/或抗体的生产。示例性的免疫调节蛋白包括检查点抑制剂。示例性的免疫调节蛋白可以包括例如PD-1或PD-L1或调节其活性的任何蛋白质。其他示例性的免疫调节蛋白可以包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
当在本文中使用时,“细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分”是指细胞因子受体的任何细胞外结构域或细胞因子受体的细胞外结构域的片段,其能够结合到靶细胞因子。应该理解,细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分也设想了所述细胞外结构域的包含结合结构域的部分,所述结合结构域单独地或与第二个结合结构域(例如在二聚融合蛋白的情况下)联合能够结合到靶细胞因子。
示例性的细胞因子受体包括I型细胞因子受体(例如GM-CSF受体、G-CSF受体、I型IL受体、Epo受体、LIF受体、CNTF受体、或TPO受体)、II型细胞因子受体(例如IFN-α受体(例如IFNAR1或IFNAR2)、IFN-β受体、IFN-γ受体(例如IFNGR1或IFNGR2)、趋化因子受体(例如CC趋化因子受体、CXC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体或XC趋化因子受体)、肿瘤坏死因子超家族受体(TNFR;例如TNFRSF5/CD40、TNFRSF8/CD30、TNFRSF7/CD27、TNFRSF1A/TNFR1/CD120a或TNFRSF1B/TNFR2/CD120b)、TGFβ超家族受体(例如TGFβI型受体或TGFβII型受体)或免疫球蛋白(Ig)超家族受体(例如白介素-1受体、CSF-1R、PDGFR(例如PDGFRA或PDGFRB)或SCFR)。优选的细胞因子受体包括二聚细胞因子受体例如TGFβ超家族受体例如人类TGFβII型受体(TβRII)。在某些实施方式中,所述细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分是人类TGFβII型受体(TβRII)的细胞外结构域的可溶性部分,例如包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有高于85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列,和/或其包含结合到TGFβ的结合结构域的片段。
所述细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分保留了它结合其本源配体的能力。在某些实施方式中,所述细胞外结构域的可溶性部分当与全长细胞因子受体相比时,保留了至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的对其本源配体的结合能力。
在某些实施方式中,所述融合蛋白可以包含下述一者以上:TβRII、TGF-β、CD80、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12B/p40、IL-23A/p19、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、CD154、CD86、CD137、CD137L、IFN-α、IFN-β、BORIS/CTCFL、FGF、ICAM、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、血管抑素、内皮抑素、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链,或其功能性片段。例如,融合蛋白可以包含:CD80和CD137L;IL-23A/p19和IL-12B/p40;或IL-27A/p28和IL-27B/EBI3。
当在本文中使用时,术语“免疫球蛋白(Ig)铰链区”是指通常连接免疫球蛋白重链恒定区的CH1和CH2结构域的氨基酸序列。Ig铰链区可能包括例如能够与另一个蛋白链中的半胱氨酸残基形成二硫键的一个以上半胱氨酸残基。当在本文中使用时,术语“免疫球蛋白(Ig)Fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的能够结合到Fc受体的片段。Ig Fc结构域可能包括例如免疫球蛋白(Ig)CH2和CH3结构域。Ig CH1、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的,并且可以在例如PROSITE数据库(可以在万维网上prosite.expasy.org网站处获得)中找到。为清楚起见,在图2中提供了人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM CH1和CH2结构域的氨基酸序列的比对。
在某些实施方式中,所述Ig铰链区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM铰链区,并且所述Ig Fc结构域选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。在某些实施方式中,所述Ig铰链区和Fc结构域一起包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述Ig铰链区和Fc结构域一起包含与选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的序列具有大于85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
所述氨基酸接头可以允许融合蛋白的配体结合部分(例如细胞因子受体)最优地结合到配体(例如细胞因子),提供融合蛋白的两种以上种组分(例如二聚细胞因子的两个亚基)的时空共定位,优化从表达载体(例如病毒载体)的表达,降低免疫原性,或提供切割位点以允许释放出所述融合蛋白的组分。
所述氨基酸接头可以包含例如约5至约15个、约5至约20个、约5至约25个、约5至约30个、约5至约35个、约5至约40个、约10至约15个、约10至约20个、约10至约25个、约10至约30个、约10至约35个、约10至约40个、约15至约20个、约15至约25个、约15至约30个、约15至约35个、或约15至约40个氨基酸残基。所述接头中的氨基酸可以是天然存在的氨基酸或修饰的氨基酸。
在某些实施方式中,所述氨基酸接头序列源自于内源人类蛋白例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、白蛋白或酪蛋白。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含免疫球蛋白(Ig)CH1结构域例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMCH1结构域的C-端部分,例如约5至约40个氨基酸。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9.SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述氨基酸接头包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9.SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有高于80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。
蛋白质或多肽如果包含与参比蛋白质或多肽的野生型氨基酸序列的全部或相应部分基本上相似的氨基酸序列,则“源自于”所述参比蛋白质或多肽。在某些实施方式中,源自于野生型蛋白质或多肽的蛋白质或多肽相对于所述野生型蛋白质或多肽可能具有一个以上氨基酸替换。例如,设想了源自于野生型蛋白质或多肽的蛋白质或多肽可能与所述野生型蛋白质或多肽具有高于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。此外,设想了源自于野生型蛋白质或多肽的蛋白质或多肽相对于所述野生型蛋白质或多肽可能含有一个以上保守替换。当在本文中使用时,术语“保守替换”是指结构相似的氨基酸的替换。例如,保守替换可以包括在下述组内的替换:Ser和Cys;Leu、Ile和Val;Glu和Asp;Lys和Arg;Phe、Tyr和Trp;和Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守替换也可以通过BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法、BLOSUM替换矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM替换:p矩阵(例如PAM 250矩阵)来确定。
在某些实施方式中,所述氨基酸接头序列源自于细胞因子、信号传导分子、免疫调节蛋白或肽或生物活性肽。
还设想的接头序列包括富含甘氨酸和丝氨酸的接头例如(G4S)3(SEQ ID NO:49)。其他示例性的接头序列描述在例如George等,(2003)蛋白质工程15:871–879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
在某些实施方式中,所述氨基酸接头可以包含切割位点例如蛋白水解或非蛋白水解切割位点。在某些实施方式中,所述蛋白水解切割位点被存在于特定组织、细胞器或细胞内区室中的蛋白酶切割。在某些实施方式中,所述接头包含蛋白水解切割位点和两个半胱氨酸残基,其在蛋白水解切割后产生二硫键连接。在某些实施方式中,所述蛋白水解切割位点被选自基质金属蛋白酶(MMP)、弗林蛋白酶、PC1、PC2、PC3、组织蛋白酶B、蛋白酶3和半胱天冬酶3的蛋白酶切割。在某些实施方式中,所述切割位点是被存在于真核细胞的内质网或高尔基体中的蛋白酶切割的蛋白水解切割位点。在某些实施方式中,所述蛋白水解切割位点是弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶是一种遍在表达并集中到高尔基体的蛋白酶,它识别共有序列RX1X2R(SEQ ID NO:50),其中X1是任何氨基酸并且X2是Lys或Arg,并在最后一个Arg之后切割。弗林蛋白酶在切割通过高尔基体运输的蛋白质的前肽中发挥生物学作用。因此,在某些实施方式中,所述蛋白水解切割位点是包含序列RX1X2R(SEQ ID NO:50)的弗林蛋白酶切割位点,其中X1是任何氨基酸并且X2是Lys或Arg,例如包含序列RAKR(SEQ ID NO:51)的弗林蛋白酶切割位点。
在某些实施方式中,所述Ig Fc、Ig铰链区和Ig CH1结构域源自于单一免疫球蛋白。
在某些实施方式中,所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方式中,所公开的融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:63的序列具有高于80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列。
序列同一性可以以本领域技术范围之内的各种不同方式来确定,例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析(Karlin等,(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:2264-2268;Altschul,(1993)J.MOL.EVOL.36,290-300;Altschul等,(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402,通过参考并入),被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论,参见Altschul等,(1994)NATUREGENETICS 6:119-129,其全部通过参考并入。本领域技术人员可以为测量比对,包括为了在待比较的序列的全长上获得最大对齐所需的任何算法,确定适合的参数。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于针对数据库序列报告匹配的统计学显著性阈值)、截止值、矩阵和筛选器的搜索参数在缺省设置处。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等,(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89:10915-10919,全部通过参考并入)。四个blastn参数可以如下调整:Q=10(空隙生成罚分);R=10(空隙扩展罚分);wink=1(在沿着查询的每个wink.sup.th位置处产生词命中率);和gapw=16(设置在其中产生带有空隙的比对的窗口宽度)。等效的Blastp参数设置可以是Q=9;R=2;wink=1;和gapw=32。搜索也可以使用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)BLAST高级选项参数来进行(例如:-G,开启空隙的成本[Integer]:default=5(对于核苷酸来说)/11(对于蛋白质来说);-E,扩展空隙的成本[Integer]:default=2(对于核苷酸来说)/1(对于蛋白质来说);-q,核苷酸错配的罚分[Integer]:default=-3;-r,核苷酸匹配的奖励[Integer]:default=1;-e,期望值[Real]:default=10;-W,词长[Integer]:default=11(对于核苷酸来说)/28(对于megablast来说)/3(对于蛋白质来说);-y,以比特为单位的blast延长的衰减(X):default=20(对于blastn来说)/7(对于其他来说);-X,带有空隙的比对(以比特为单位)的X衰减值:default=15(对于所有程序来说),不适用于blastn;和–Z,带有空隙的比对(以比特为单位)的最终X衰减值:50(对于blastn来说),25(对于其他来说))。也可以使用用于成对蛋白质比对的ClustalW(缺省参数可以包括例如Blosum62矩阵和空隙开启罚分=10和空隙扩展罚分=0.1)。可以在GCG软件包10.0版中获得的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP=50(空隙生成罚分)和LEN=3(空隙扩展罚分),并且在蛋白质比较中的等效设置是GAP=8和LEN=2。
一方面,本发明提供了一种包含两个融合蛋白的细胞因子结合蛋白,其中每个融合蛋白以N-端到C-端的方向包含:细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分;氨基酸接头;免疫球蛋白(Ig)铰链区;和免疫球蛋白(Ig)Fc结构域;其中所述接头包含约5至约40个氨基酸残基,其中所述两个融合蛋白共价连接在一起,并且其中所述两个细胞外结构域一起定义用于细胞因子的结合位点。
所述细胞因子结合蛋白可以包含共价连接在一起的两个上述融合蛋白,其中每个融合蛋白包含细胞因子受体的细胞外结构域,并且其中所述两个细胞外结构域一起定义用于细胞因子的结合位点。所述融合蛋白可以例如通过每个融合蛋白的Ig铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。在某些实施方式中,所述单体或多聚(例如二聚)融合蛋白当与本源的全长细胞因子受体相比时,保留至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的靶配体结合能力。
在某些实施方式中,本发明的细胞因子结合蛋白以200nM、100nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、50pM、25pM或更低的KD结合细胞因子。在某些实施方式中,本发明的细胞因子结合蛋白以200nM至100nM、200nM至20nM、200nM至10nM、200nM至5nM、200nM至1nM、200nM至50pM、200nM至25pM、100nM至20nM、100nM至10nM、100nM至5nM、100nM至1nM、100nM至50pM、100nM至25pM、20nM至10nM、20nM至5nM、20nM至1nM、20nM至50pM、20nM至25pM、10nM至5nM、10nM至1nM、10nM至50pM、10nM至25pM、5nM至1nM、5nM至50pM、5nM至25pM、1nM至50pM、1nM至25pM或50pM至25pM的KD结合细胞因子。在某些实施方式中,本发明的细胞因子结合蛋白以200nM、100nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、50pM、25pM或更低的KD结合TGFβ。在某些实施方式中,本发明的细胞因子结合蛋白以200nM至100nM、200nM至20nM、200nM至10nM、200nM至5nM、200nM至1nM、200nM至50pM、200nM至25pM、100nM至20nM、100nM至10nM、100nM至5nM、100nM至1nM、100nM至50pM、100nM至25pM、20nM至10nM、20nM至5nM、20nM至1nM、20nM至50pM、20nM至25pM、10nM至5nM、10nM至1nM、10nM至50pM、10nM至25pM、5nM至1nM、5nM至50pM、5nM至25pM、1nM至50pM、1nM至25pM或50pM至25pM的KD结合TGFβ。KD值可以通过本领域中公知的方法包括表面等离子体共振或生物层干涉测量方法来确定。
本发明的示例性融合蛋白包括包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列的蛋白。为清楚起见,这些蛋白质的各个元件的序列和所述各个元件包括细胞因子受体的细胞外结构域的可溶性部分、氨基酸接头、Ig铰链区和Ig Fc结构域的序列所源自的蛋白质,阐述在表1中。
表1
表2
蛋白质序列 核酸序列
SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:37
SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:39
SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:41
SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:43
SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:45
SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:47
II.融合蛋白生产
用于生产本发明的融合蛋白的方法在本领域中是公知的。例如,编码所公开的融合蛋白的DNA分子可以使用本文中提供的序列信息化学合成。合成的DNA分子可以被连接到其他适合的核苷酸序列,包括例如表达控制序列,以产生编码所需融合蛋白的常规基因表达构建物。确定基因构建物的生产在本领域的常规技术范围之内。编码SEQ ID NO:22-32的融合蛋白的示例性核酸序列SEQ ID NO:37-47,可以在表2中找到。
编码所需融合蛋白的核酸可以被并入(连接)到表达载体中,其可以通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。转化的宿主细胞可以在允许所述宿主细胞表达编码所需融合蛋白的基因的条件下生长。
具体的表达和纯化条件将随着所使用的表达系统而变。例如,如果基因将在大肠杆菌中表达,首先通过将所述工程化的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游,将它克隆在表达载体中。所述表达的分泌蛋白积累在折射或包含体中,并且可以在通过弗氏压碎器或超声处理破碎细胞后收获。然后通过本领域中公知的方法将所述折射体溶解,并将蛋白质重新折叠并切开。
如果所述工程化基因将在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达,首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、多聚A序列和终止密码子的表达载体中,并且任选地可以含有增强子和各种不同的内含子。所述基因构建物可以使用常规技术引入到真核宿主细胞中。
包含所公开的融合蛋白的多肽可以通过将用编码这些蛋白的表达载体转染的宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后,所述多肽可以使用本领域中公知的技术收获并纯化或分离,例如亲和标签如蛋白A、蛋白G、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸标签。
III.病毒载体
在某些实施方式中,所公开的表达载体是病毒载体。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换使用,是指没有蛋白质合成或能量产生机制的任何专性细胞内寄生物。病毒基因组可以是RNA或DNA。可用于本发明的实践的病毒包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒,优选地选自杆状病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科或腺病毒科。所述病毒可以通过重组DNA技术修饰以包含外源转入基因的表达,并且可以被工程化改造成复制缺陷型、条件复制型或复制型。利用每个母体载体性质的有利要素的嵌合病毒载体(参见例如Feng等,(1997)NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870)也可能在本发明的实践中有用。尽管利用来自于待治疗物种的病毒通常是有利的,但在某些情况下使用源自于具有有利的致病特点的不同物种的病毒可能是有利的。例如,用于人类基因疗法的马疱疹病毒载体描述在PCT公开号WO 98/27216中。所述载体被描述为可用于治疗人类,因为所述马病毒对于人类不致病。同样地,绵羊腺病毒载体可用于人类基因疗法,因为它们据宣称避免了针对人类腺病毒载体的抗体。这些载体描述在PCT公开号WO 97/06826中。
在某些实施方式中,所述病毒载体是溶瘤病毒,例如表现出肿瘤选择性复制和/或病毒介导的裂解的病毒。在某些实施方式中,所述溶瘤病毒允许选择性表达所公开的融合蛋白,例如所述病毒允许在赘生物细胞中表达所述融合蛋白,但在正常细胞中弱化表达。在某些实施方式中,所述融合蛋白在非过度增殖性细胞中的表达为在过度增殖性细胞中的表达的约90%、约80%、约70%、约60%、约50%、约40%、约30%、约20%、约10%或约5%。在某些实施方式中,所述病毒在非过度增殖性细胞中不表现出所述融合蛋白的可检测的表达。融合蛋白表达可以通过本领域中公知的任何适合的方法例如Western印迹或ELISA来确定。所述过度增殖性细胞可以是癌细胞,例如上皮癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、胃肠道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤、肝癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌或脑癌细胞。
优选地,所述病毒载体是腺病毒。腺病毒是中等大小(90-100nm)、无包膜(裸露)、二十面体病毒,由核衣壳和双链线性DNA基因组构成。腺病毒在哺乳动物细胞的核中使用宿主的复制机器来复制。术语“腺病毒”是指腺病毒属中的任何病毒,包括但不限于人类、牛、绵羊、马、狗、猪、鼠和猿猴腺病毒亚属。具体来说,人类腺病毒包括A-F亚属及其个体血清型,所述个体血清型和A-F亚属包括但不限于人类腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11a和Ad11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。优选的是源自于人类腺病毒2和5型的载体。除非另有陈述,否则所有腺病毒5型的核苷酸编号是相对于在本文中在SEQ ID NO:52中描绘的NCBI参比序列AC_000008.1。
腺病毒复制周期具有两个阶段:早期阶段,在此期间4个转录单位(E1、E2、E3和E4)表达;以及晚期阶段,其在病毒DNA合成开始之后发生,并且在此期间晚期转录本主要从主要晚期启动子(MLP)表达。所述晚期信息编码大多数病毒的结构蛋白。E1、E2和E4的基因产物负责转录激活、细胞转化、病毒DNA复制以及其他病毒功能,并且是病毒生长必需的。
术语“可操作连接”是指多核苷酸元件以有功能的关系连接。当核酸序列被放置成与另一个核酸序列功能上相关时,它被“可操作连接”。例如,如果启动子或增强子影响基因的转录,则它被可操作连接到所述基因。可操作连接的核苷酸序列通常是邻近的的。然而,由于增强子通常在与启动子相隔几千碱基时起作用并且内含子序列可能具有可变的长度,因此某些多核苷酸元件可能是可操作连接的但不直接位于侧翼,并且甚至可能从不同的等位基因或染色体反式起作用。
在某些实施方式中,所述病毒具有对调控序列或启动子的一个以上修饰。对调控序列或启动子的修饰包括与所述调控序列或启动子的野生型序列相比一个以上核苷酸的缺失、替换或添加。
在某些实施方式中,所述调控序列或启动子的修饰包含转录因子结合位点的序列的修饰以降低所述转录因子的亲和性,例如通过缺失其一部分或通过在所述结合位点中插入单一点突变。在某些实施方式中,另外的修饰的调控序列增强在赘生物细胞中的表达,但在正常细胞中弱化表达。
在某些实施方式中,所述修饰的调控序列被可操作连接到编码蛋白质的序列。在某些实施方式中,腺病毒E1a和E1b基因(编码区)中的至少一种被可操作连接到修饰的调控序列。在某些实施方式中,所述E1a基因被可操作连接到所述修饰的调控序列。
所述E1a调控序列含有5个用于转录因子Pea3的结合位点,被称为Pea3 I、Pea3II、Pea3 III、Pea3 IV和Pea3 V,其中Pea3 I是最接近于E1a起始位点的Pea3结合位点,Pea3 V是最远离的。所述E1a调控序列还含有用于转录因子E2F的结合位点,因此被称为E2FI和E2FII,其中E2F I是最接近于E1a起始位点的E2F结合位点,E2F II是最远离的。从E1a起始位点开始,所述结合位点如下排列:Pea3 I,E2FI,Pea3 II,E2F II,Pea3 III,Pea3 IV和Pea3 V。
在某些实施方式中,这7个结合位点中的至少一种或其功能性部分被缺失。“功能性部分”是所述结合位点的在被缺失时降低或甚至消除所述结合位点的功能的部分,例如将所述结合位点与其相应的转录因子(Pea3或E2F)的结合亲和性相对于完整序列降低例如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%。在某些实施方式中,一个以上完整的结合位点被缺失。在某些实施方式中,一个以上结合位点的功能性部分被缺失。“缺失的结合位点”涵盖了完整结合位点的缺失和其功能性部分的缺失两者。当两个以上个结合位点被缺失时,可以使用完整结合位点缺失和功能性部分缺失的任何组合。
在某些实施方式中,至少一个Pea3结合位点或其功能性部分被缺失。所述缺失的Pea3结合位点可以是Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中,所述缺失的Pea3结合位点是Pea3II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中,所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中,所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和/或Pea3 III。在某些实施方式中,所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和Pea3 III两者。在某些实施方式中,所述Pea3 I结合位点或其功能性部分被保留。
在某些实施方式中,至少一个E2F结合位点或其功能性部分被缺失。在某些实施方式中,至少一个E2F结合位点或其功能性部分被保留。在某些实施方式中,所述保留的E2F结合位点是E2F I和/或E2FII。在某些实施方式中,所述保留的E2F结合位点是E2F II。在某些实施方式中,所述全部缺失基本上由Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3V中的一种以上或其功能性部分构成。
在某些实施方式中,所述病毒具有位于所述E1a起始位点上游-305至-255、例如对应于的Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的195-244位的50个碱基对的区域的缺失,在后文中被称为TAV-255缺失。在某些实施方式中,所述TAV-255缺失产生包含序列GGTGTTTTGG(SEQ IDNO:55)的E1a启动子。
腺病毒E1b-19k基因主要起到抗凋亡基因的作用,并且是细胞抗凋亡基因BCL-2的同源物。由于在子代病毒粒子成熟之前的宿主细胞死亡将限制病毒复制,因此将E1b-19k作为El表达盒的一部分表达以防止过早的细胞死亡,从而允许感染进行并产生成熟的病毒粒子。因此,在某些实施方式中,提供了一种包含E1b-19K插入位点的重组病毒,例如所述腺病毒具有插入到E1b-19K插入位点中的编码所公开的融合蛋白的外源核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的2019-2021位核苷酸)。在整个本说明书和权利要求书中,两个位点之间的插入,例如在(i)第一基因(例如E1b-19k)的起始位点与第二基因(例如E1b-55K)的起始位点、(ii)第一基因的起始位点与第二基因的终止位点、(iii)第一基因的终止位点与第二基因的起始位点或(iv)第一基因的终止位点与第二基因的终止位点之间的插入,被理解为意味着在所述插入周围构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸可能存在或不存在于最终的病毒中。同样地,在两个核苷酸之间的插入被理解为意味着在所述插入周围的所述核苷酸可能存在或不存在于最终的病毒中。
在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的1714-1716位核苷酸)与E1b-19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点包含与E1b-19K的起始位点相邻的约100至约305个、约100至约300个、约100至约250个、约100至约200个、约100至约150个、约150至约305个、约150至约300个、约150至约250个、或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点包含与所述E1b-19K的起始位点相邻的约200个核苷酸例如203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E1b-19K插入位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的1714-1916位核苷酸的缺失,或所述外源核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中,所述外源核苷酸序列被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO:53)与TCACCAGG(SEQ ID NO:54)之间,例如所述重组腺病毒以5’至3’方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO:53)、所述外源核苷酸序列和TCACCAGG(SEQ ID NO:54)。CTGACCTC(SEQ ID NO:53)和TCACCAGG(SEQ ID NO:54)为Ad5基因组(SEQ ID NO:52)内的E1b-19K插入位点定义了独特的边界序列。在整个本说明书和权利要求书中,与位点相邻的缺失,例如与基因的起始位点相邻的缺失或与基因的终止位点相邻的缺失,被理解为意味着所述缺失可能包括构成给定起始位点或终止位点的全部、一部分核苷酸或不包括所述核苷酸。
在某些实施方式中,所述重组腺病毒包含E3缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含约500至约3185个、约500至约3000个、约500至约2500个、约500至约2000个、约500至约1500个、约500至约1000个、约1000至约3185个、约1000至约3000个、约1000至约2500个、约1000至约2000个、约1000至约1500个、约1500至约3185个、约1500至约3000个、约1500至约2000个、约2000至约3185个、约2000至约3000个、约2000至约2500个、约2500至约3185个、约2500至约3000个或约3000至约3185个核苷酸的缺失。
在某些实施方式中,所述E3缺失包含位于pVIII的终止位点(即编码pVIII的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的27855-27857位核苷酸)与Fiber的起始位点(即编码Fiber的起始密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的31042-31044位核苷酸)之间的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含位于E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的29770-29772位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的30837-30839位核苷酸)之间的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点相邻的约500至约1551个、约500至约1500个、约500至约1000个、约1000至约1551个、约1000至约1500个或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的29770-29772位核苷酸)相邻的约1050个核苷酸的缺失,例如所述E3缺失包含与E3-10.5K的终止位点相邻的1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的29773-30836位核苷酸的缺失。
在某些实施方式中,所述E3缺失包含位于E3-gp19K的终止位点(即编码E3-gp19K的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的29215-29217位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列,例如对应于SEQ ID NO:52的30837-30839位核苷酸)之间的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与E3-gp19K的终止位点相邻的约500至约1824个、约500至约1500个、约500至约1000个、约1000至约1824个、约1000至约1500个或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含与所述E3-gp19K的终止位点相邻的约1600个核苷酸的缺失。例如,所述E3插入位点包含与所述E3-gp19K的终止位点相邻的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中,所述E3缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的29218-30839位核苷酸的缺失。
在某些实施方式中,所述重组腺病毒包含E3插入位点,例如所述腺病毒具有插入到所述E3缺失中的编码所公开的融合蛋白的外源核苷酸序列。例如,在某些实施方式中,将外源核苷酸序列插入到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的29773和30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中,所述外源核苷酸序列被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO:56)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)之间,例如所述重组腺病毒以5’至3’方向包含CAGTATGA(SEQID NO:56)、所述外源核苷酸序列和TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)。CAGTATGA(SEQ ID NO:56)和TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)为Ad5基因组(SEQ ID NO:52)内的E3插入位点定义了独特的边界序列。
在某些实施方式中,所述外源核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO:52)的29218和30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中,所述外源核苷酸序列被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO:58)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO:59)之间,例如所述重组腺病毒以5’至3’方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO:58)、所述外源核苷酸序列和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO:59)。TGCCTTAA(SEQ ID NO:58)和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO:59)为Ad5基因组(SEQ ID NO:52)内的E3插入位点定义了独特的边界序列。
可用于本发明的这一方面的实践的其他示例性腺病毒载体,描述在美国专利号9,073,980中。
IV.融合蛋白修饰
当用作治疗剂时,融合蛋白可以被优化(例如亲和成熟)以改善生物化学特性包括亲和性和/或特异性,改善生物物理性质包括聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用,和/或降低免疫原性。亲和成熟程序在本领域的常规技术范围之内。例如,可以通过DNA穿梭、链穿梭、CDR穿梭、随机突变和/或定点突变,将多样性引入到所公开的融合蛋白中。
通常,优化的融合蛋白具有与它所源自的未优化的(或亲本)融合蛋白至少相同或基本上相同(例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的对配体的亲和性。优选地,优化的融合蛋白与亲本融合蛋白相比时具有更高的对配体的亲和性。
融合蛋白(例如亲本和优化的变体)可以被工程化改造以含有某些具有特定效应功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的恒定(即Fc)区。人类恒定区在本领域中是公知的。
此外,如果所述融合蛋白被用作治疗剂,可以使用标准的体外偶联化学将它偶联到效应剂例如小分子毒素或放射性核素。如果所述效应剂是多肽,则所述抗体可以被化学偶联到所述效应物或作为融合蛋白联结到所述效应物。融合蛋白的构建在本领域的常规技术范围之内。
V.治疗方法
上述融合蛋白或表达载体可用于治疗各种不同的医学指征。在某些实施方式中,上述融合蛋白或表达载体可用于治疗由细胞因子例如TGFβ介导的医学指征。例如,所述融合蛋白和表达载体可用于治疗各种不同的癌症或炎性疾病。
当在本文中使用时,“治疗”、“治疗中”意味着在受试者中,例如在哺乳动物中,例如在人类中治疗疾病。这包括:(a)抑制所述疾病,即制止它的发展;和(b)减轻所述疾病,即引起所述疾病状态的减退。当在本文中使用时,术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿猴、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等),更优选地包括人类。
在某些实施方式中,本文中公开的融合蛋白和表达载体可用于治疗各种不同的癌症。将癌细胞暴露于治疗有效量的所述融合蛋白或表达载体,以便抑制或减少所述癌细胞的增殖。在某些实施方式中,向癌细胞施用治疗有效量的融合蛋白或表达载体,将所述细胞中的TGFβ减少至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。TGFβ活性可以通过实施例2中所描述的Western印迹来测定。在某些实施方式中,所公开的融合蛋白或表达载体可用于在受试者(例如人类患者,也被称为人类受试者)中抑制肿瘤生长,这可以通过向所述受试者施用有效量的所述融合蛋白或表达载体来实现。在某些实施方式中,向受试者施用有效量的融合蛋白或表达载体将该受试者中的肿瘤负荷降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤和转移病变。造血系肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或莱特尔综合征(莱特尔转化)。实体肿瘤的实例包括各种不同器官系统的恶性肿瘤例如肉瘤、腺癌和上皮癌,例如影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴、胃肠(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、尿道上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤)的恶性肿瘤。
在某些实施方式中,所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、脑和中枢神经系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌(例如甲状旁腺上皮癌)、子宫内膜癌、神经内分泌癌、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金)、白血病、梅克尔细胞癌、胃肠道间质肿瘤、多发性骨髓瘤、子宫癌、肉瘤、肾癌、眼癌、胰腺癌和生殖细胞癌(例如卵巢生殖细胞癌)。在某些实施方式中,所述癌症可以选自白血病、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌和白血病。在某些实施方式中,所述癌症选自白血病、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、头颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌。
在某些实施方式中,本公开的融合蛋白或表达载体在需要的受试者(例如具有炎性病症的受试者)中施用以降低一种以上细胞因子的水平。在某些实施方式中,所公开的融合蛋白或表达载体可用于在受试者(例如人类受试者)中治疗炎性病症,这可以通过向所述受试者施用有效量的所述融合蛋白或表达载体来实现。
当在本文中使用时,炎性病症是完全或部分地以患者中的炎症或炎性反应为特征的疾病或病症。可以使用本发明的融合蛋白或表达载体治疗的炎性病症可以例如根据受影响的原发组织、所述病症隐含的作用机制或免疫系统的调控错误或过度活跃的部分来表征。在某些实施方式中,可以治疗的炎性病症的实例包括肺的炎症(例如哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺部炎症、肺纤维化和囊性纤维化)、关节的炎症(例如类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎和其他关节炎病症)、结缔组织的炎症、眼的炎症(例如葡萄膜炎(包括虹膜炎)、结膜炎、巩膜炎和干燥性角膜结膜炎)、鼻的炎症、肠的炎症(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、炎性肠综合征和远端直肠炎)、肾的炎症(例如肾小球肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎、韦格纳氏病继发的肾炎、急性肾炎继发的急性肾衰竭、肺出血肾炎综合征、阻塞后综合征和肾小管缺血)、肝的炎症(例如肝炎(由病毒感染、自体免疫反应、药物治疗、毒素、环境因子引起或作为原发性障碍的继发结果)、肥胖症、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎)、皮肤的炎症(例如银屑病、湿疹和皮炎例如湿疹性皮炎、特应性和溢脂性皮炎、过敏性或刺激性接触性皮炎、干裂性湿疹、光过敏性皮炎、光毒性皮炎、植物日光性皮炎、辐射性皮炎、和瘀滞性皮炎)、中枢神经系统的炎症(例如多发性硬化症和神经变性疾病例如阿兹海默氏病、帕金森氏症或与HIV感染相关的痴呆症)、血管系统的炎症(例如冠状动脉梗塞损伤、外周血管疾病、心肌炎、脉管炎、狭窄血管再生、动脉粥样硬化和与II型糖尿病相关的血管疾病)、内分泌系统的炎症(例如自体免疫性甲状腺炎(桥本氏病)、I型糖尿病、与II型糖尿病相关的肝脏和脂肪组织中的炎症和肾上腺皮质的急性和慢性炎症)、心脏的炎症或脂肪组织的炎症。本公开设想了某些炎性病症涉及多种组织中的炎症。此外,本公开设想了某些炎性病症可能落于多个类别中。在某些实施方式中,所述炎性病症是自体免疫疾病。示例性的自体免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病(包括斑块型银屑病)、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、狼疮、秃头症、自体免疫性胰腺炎、乳糜泻、白塞病、库欣综合征和格雷夫病。在某些实施方式中,所述炎性病症是类风湿性障碍。示例性的类风湿性障碍包括但不限于类风湿性关节炎、青少年关节炎、滑囊炎、脊椎炎、痛风、硬皮病、斯提耳氏病和脉管炎。应该指出,病症的某些类别交叠。例如,类风湿性关节炎是炎性类风湿性障碍、炎性关节障碍和自体免疫障碍。
当在本文中使用时,术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性组分的量(例如本发明的融合蛋白或表达载体的量)。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用,并且不打算限于特定配方或施用途径。
在某些实施方式中,融合蛋白的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg的范围内,例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、10mg/kg、7.5mg/kg、5mg/kg或2.5mg/kg。在某些实施方式中,表达载体例如重组病毒的治疗有效量在102至1015噬斑形成单位(pfu)的范围内,例如102至1010、102至105、105至1015、105至1010或1010至1015噬斑形成单位。施用的量取决于多种变量,例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、所述融合蛋白或表达载体的体内效能、药物配方和施用途径。初始剂量可以提高到超过上限水平,以便快速获得所需的血液水平或组织水平。或者,初始剂量可以低于最适值,并且可以在治疗过程中逐步提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计从0.5mg/kg运行到20mg/kg的常规I期剂量递增研究中进行优化。施用频率可以随着多种因素而变,例如施用途径、剂量、抗体的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的施用频率是每日一次、每周一次和每两周一次。优选的施用途径是肠胃外,例如静脉内输注。基于融合蛋白或表达载体的药物的配方在本领域的常规技术范围之内。在某些实施方式中,将融合蛋白或表达载体冷冻干燥,然后在施用时在缓冲盐水中复原。
对于治疗使用来说,优选地将融合蛋白或表达载体与可药用载体组合。当在本文中使用时,“可药用载体”意味着适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症,与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。所述载体在与配方的其他成分相容并且对接受者无害的意义上是“可接受的”。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于制药活性物质的用途,在本领域中是公知的。
含有本文公开的融合蛋白或表达载体的药物组合物可以以剂量单元形式存在,并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与它计划的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、眼内、鼻内、透皮、表面、透粘膜和直肠施用。
融合蛋白的优选施用途径是是IV输注。有用的配方可以通过制药领域中公知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences),第18版(Mack Publishing Company,1990)。适合于肠胃外施用的配方组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂,抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯,抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠,螯合剂例如EDTA,缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,以及用于调节渗涨度的药剂例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内施用来说,适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体应该在制造和储存的条件下稳定,并且应该被防腐以对抗微生物。所述载体可以是溶剂或分散介质,其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物。
药物配方优选是无菌的。灭菌可以通过任何适合的方法来实现,例如通过无菌过滤膜过滤。在所述组合物被冷冻干燥的情况下,过滤除菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。在某些实施方式中,本发明的递送介质(例如重组病毒)和/或治疗剂与检查点抑制剂例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合施用。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(Bristol-Myers Squibb Co.)、pembrolizumab(MerckSharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011,CureTech)。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(Genentech)、duvalumab(AstraZeneca)、MEDI4736、avelumab(EMD Serono)和BMS 936559(BristolMyers Squibb Co.)。
当在本文中使用时,术语“联合(in combination)”施用被理解为意味着在受试者被所述障碍困扰的过程中将两种(以上种)不同治疗递送到所述受试者,使得在某个时间点所述治疗对所述受试者的效果重叠。在某些实施方式中,一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍在进行,使得在施用方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中,一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中,治疗由于联合施用而更加有效。例如,所述第二种治疗更加有效,例如使用更少的第二种治疗观察到等同的效果,或者与第二种治疗在不存在第一种治疗的情况下施用的情形中看到的相比,所述第二种治疗以更大的程度减轻症状,或者在使用所述第一种治疗时观察到类似的情况。在某些实施方式中,递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的降低超过在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下所观察到的。所述两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或高于累加的。所述递送可以使得当第二种治疗被递送时所递送的第一种治疗的效果仍然可检测。
在整个本说明书中,在组合物、装置和系统被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下,或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下,设想了此外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物、装置和系统,并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
在本申请中,在要素或组分被称为是包含在所叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单的情况下,应该理解所述要素或组分可以是所叙述的要素或组分中的任一种,或者所述要素或组分可以选自所叙述的要素或组分中的两种以上。
此外,应该理解,本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以以各种不同的方式组合而不背离本发明的精神和范围,不论在本文中是明确说明还是暗示的。例如,在指称特定病毒的情况下,该病毒可用于本发明的组合物的各种不同实施方式和/或本发明的方法中,除非从上下文另有理解。换句话说,在本申请中,实施方式以能够书写并绘制出清楚且简明的申请的方式进行描述和描绘,但计划并且应该认识到实施方式可以进行各种不同的组合或拆分,而不背离本文的教授和发明。例如,应该认识到本文描述和描绘的所有特点可以适用于本文描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解,表述“至少一种”各个地包括在所述表述后叙述的每个物体和所叙述的物体中的两者以上者的各种不同组合,除非从上下文和使用中另有理解。与三个以上个叙述物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的意义,除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”、包括其语法等同语的使用,通常应该被理解为开放式和非限制性的,例如不排除另外的未叙述的要素或步骤,除非从上下文另有具体陈述或理解。
当在数量值之前使用术语“约”时,本发明还包括所述特定数量值本身,除非另有具体陈述。当在本文中使用时,术语“约”是指距标称值±10%的变动,除非另有指示或推断。
应该理解,步骤的顺序或执行某些行动的顺序是不重要的,只要本发明仍然可行即可。此外,两个以上个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用,仅仅旨在更好地说明本发明,并且除非声明,否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的所有语言都不应该被解释为指示任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的,并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1:TGFβR融合蛋白质粒和腺病毒构建
本实施例描述了编码TGFβR融合蛋白的质粒和病毒表达载体的产生,
为了构建编码小鼠TGFβR-IgG1融合蛋白(mTGFβR-IgG1)的核苷酸序列,从Invivogen购买质粒pORF9-mIL10RA、pUNO1-mTGFBR2和pFUSEss-CHIg-mG1。将所述pUNO1-mTGFBR2质粒用KasI和NheI切开,释放出带有小鼠TGFβ2型受体的编码区的1.7kb片段。将所述pORF9-mIL10RA质粒用KasI和NheI切开,释放出含有载体骨架的3kb片段。将这两个片段连接,产生质粒pORF9-TGFBR2。
将质粒pORF9-TGFBR2进行扩增,所述扩增使用所述编码区的KasI位点5'侧翼的引物和对应于细胞外结构域的3'末端并且后面跟有NheI位点的引物(以只产生所述细胞外结构域)或对应于细胞外结构域的3'末端并且后面跟有一部分小鼠IgG1(mIgG1)CH1结构域的引物(以产生融合基因的5'一半)。将质粒pFUSEss-CHIg-mG1使用对应于mIgG1基因的3'末端并且后面跟有NheI位点的引物和对应于mTGFβR的细胞外结构域的3'末端并且后面跟有一部分mIgG1 CH1结构域的引物进行扩增。融合基因通过将这些PCR产物在第二轮PCR反应中合并来产生。然后将PCR产物用KasI和NheI切开并连接到用相同的酶切开的pORF9骨架中,产生带有所述细胞外结构域或mIgG1融合基因的pORF9质粒。所述得到的核苷酸序列编码融合蛋白(mTGFβR-IgG,SEQ ID NO:33),其包含mTGFβR序列的1-159位残基(结束于TSSPD(SEQ ID NO:82)),随后紧跟mIgG1序列的90-324位残基,始于第二个免疫球蛋白折叠的最后β链的开始处(始于STKVD(SEQ ID NO:83))。
为了构建编码人类TGFβR-IgG1融合蛋白的核苷酸序列,从Thermo Scientific购买带有人类IgG1(hIgG1,登记号BC072419,在pCMV-SPORT6中)和人类TGFβ受体2型(登记号BC040499,在pBluescriptR中)的cDNA的质粒。如对小鼠基因所描述的进行PCR扩增,使用带有SalI位点的5'引物、带有XhoI位点的3'引物和带有来自于hTGFβR的3’末端和hIgG1的5’末端的序列的连接引物。
产生了编码一系列融合蛋白的核苷酸序列。第一种融合蛋白hTGFβR-IgG1-1(SEQID NO:22)包含hTGFβR的1-159位残基(结束于TSNPD(SEQ ID NO:84)),后面紧跟hIgG1的88-330位残基,始于第二个免疫球蛋白折叠的最后β链的开始处(始于KPSNT(SEQ ID NO:85))。第二种融合蛋白hTGFβR-IgG1-2(SEQ ID NO:62)包含hTGFβR的1-159位残基(结束于TSNPD(SEQ ID NO:84)),后面紧跟hIgG1的90-330位残基(始于SNTKV(SEQ ID NO:86))。第三种融合蛋白hTGFβR-IgG1-3(SEQ ID NO:63)包含hTGFβR的1-159位残基(结束于TSNPD(SEQ ID NO:84)),后面紧跟hIgG1的92-330位残基(始于TKVDK(SEQ ID NO:87))。第四种融合蛋白hTGFβR-IgG1-4包含hTGFβR的1-159位残基(结束于TSNPD(SEQ ID NO:84)),后面紧跟hIgG1的94-330位残基(始于VDKRV(SEQ ID NO:88))。第五种融合蛋白hTGFβR-Fc(SEQ IDNO:48)包含TGFβR的1-159位残基(结束于TSNPD(SEQ ID NO:84)),后面紧跟hIgG1的100-330位残基(始于PKSCD(SEQ ID NO:89))。所述第五种融合蛋白被称为hTGFβR-Fc,因为它只包含免疫球蛋白的Fc结构域和铰链区,这与hTGFβR-IgG-1、hTGFβR-IgG-2、hTGFβR-IgG-3和hTGFβR-IgG-4相反,后四者包含来自于hIgG1的6至12个另外的氨基酸。所述融合蛋白的详细情况示出在表3中。
表3
视情况而定,将编码所述融合蛋白的核苷酸序列克隆到用于下游应用的质粒中。对于腺病毒构建来说,将核苷酸序列克隆到pXC1(其带有腺病毒基因组的5'部分)的衍生质粒中,所述衍生质粒被修饰以在E1B-19k区的起始位点处带有SalI位点并在SalI位点的3'端200个碱基对处带有XhoI位点。在指明时,将pXC1在E1A启动子区进一步修饰以产生质粒pXC1-TAV-255,其提供了癌症选择性的E1A表达(正如以前在美国专利号9,073,980中描述的)。使用InFusion(Clontech),按照制造商的说明书将PCR产物克隆到pXC1(或pXC1-TAV)骨架中。
在指明时,将所述pXC1质粒与质粒pJM17共转染到HEK-293A细胞中以允许同源重组来挽救重组病毒。收集病毒,使其经历两轮噬斑纯化并测序,以确认融合基因的存在并根据需要测试TAV-255缺失的存在。将带有小鼠同种型的病毒在293细胞中生长,并在293细胞中进行初始病毒挽救后将带有人类同种型的病毒进行噬斑纯化,并在A549细胞中专门生长。将要在动物实验中使用的病毒使用Fast-Trap腺病毒纯化试剂盒(Millipore)进行纯化,在病毒储存缓冲液(25mM NaCl,10mM Tris pH 8,5%甘油)中透析,并储存在-80℃下直至使用。所述测试的病毒的详细情况示出在表4中。
表4
病毒 E1A启动子 E1B-19k修饰
野生型 野生型 野生型
Ad-对照 野生型 缺失
Ad-mTGFβR-IgG1 野生型 缺失并用mTGFβR-IgG1代替
Ad-hTGFβR-IgG1-1 TAV-255 缺失并用hTGFβR-IgG1-1代替
实施例2:TGFβ信号传导的抑制
本实施例描述了所公开的hTGFβR-IgG1融合蛋白与常规的hTGFβR-IgG1融合蛋白之间的比较。
如实施例1中所述,产生了编码一系列人类TGFβ阱融合蛋白的质粒:hTGFβR-IgG1-1、hTGFβR-IgG1-2、hTGFβR-IgG1-3、hTGFβR-IgG1-4、和hTGFβR-Fc。
hTGFβR-Fc(SEQ ID NO:48)含有人类TGFβII型受体的氨基酸Thr23至Asp159和人类IgG1的氨基酸Pro100至Lys330。这个序列与在可商购的TGFβ阱融合蛋白(R&D Systems)中使用的一致。
与常规的TGFβ阱融合蛋白相反,hTGFβR-IgG1-1(SEQ ID NO:22)、hTGFβR-IgG-2(SEQ ID NO:62)、hTGFβR-IgG-3(SEQ ID NO:63)和hTGFβR-IgG-4分别含有来自于IgG1的CH1结构域的12、10、8或6个氨基酸,充当TGFβII型受体与IgG1的铰链和Fc区之间的柔性、非免疫原性接头。
将HEK-293细胞用带有hTGFβR-IgG1-1、hTGFβR-IgG1-2、hTGFβR-IgG1-3、hTGFβR-IgG1-4或hTGFβR-Fc基因的pXC1质粒转染,或保持为非转染的对照,并温浴5天以允许蛋白质表达并分泌到培养基中。收集调制过的培养基,在指明的情况下以500pg/mL向所述培养基添加TGFβ,然后将所述培养基覆盖在新鲜的报告细胞上并温浴1小时。游离的TGFβ将在报告细胞中诱导Smad2磷酸化,然而,如果所述TGFβ阱融合蛋白阻断TGFβ,则它不引起Smad2磷酸化。通过Western印迹探测所述报告细胞的蛋白质提取物的磷酸化的Smad2。使用β-肌动蛋白作为载样对照,或者随后将所述印迹剥离并重新探测总Smad2和Smad3,以充当载样对照。
hTGFβR-IgG1-1与hTGFβR-Fc之间的比较示出在图3中。正如在图3中看到的,来自于用常规hTGFβR-Fc融合基因转染的细胞的调制过的培养基具有轻度TGFβ抑制,而hTGFβR-IgG-1更有效地阻断TGFβ信号传导。Western印迹的强度的定量显示,与对照相比,hTGFβR-Fc引起TGFβ活性降低21%,并且hTGFβR-IgG引起TGFβ活性降低92%。
hTGFβR-IgG1-1、hTGFβR-IgG1-2、hTGFβR-IgG1-3和hTGFβR-IgG1-4之间的比较示出在图4中。正如在图4中看到的,来自于用hTGFβR-IgG1-1和hTGFβR-IgG1-2融合基因转染的细胞的调制过的培养基有效地阻断TGFβ信号传导。
合在一起,这些结果证实了与常规的hTGFβR-IgG1融合蛋白例如hTGFβR-Fc相比,TGFβ活性被所公开的hTGFβR-IgG1融合蛋白例如hTGFβR-IgG1-1和hTGFβR-IgG1-2显著降低。
实施例3:肿瘤生长的抑制
使用Ad-mTGFβR-IgG1这种带有mTGFβR-IgG1融合基因的病毒进行了在小鼠中的实验,以便防止不想要地诱导针对人类TGFβR同种型的鼠类抗体。也试验了Ad-对照,这是一种其中用于携带转入基因的E1B-19k位点被缺失的对照病毒。所述Ad-mTGFβR-IgG1和Ad-对照病毒不带有充当弱化机制以减少正常细胞中的病毒复制的50bp的TAV-255缺失。病毒如实施例1中所述来制备,并且所述病毒的关键特点示意显示在上面的表4中。
许多小鼠细胞可以被具有一定程度的病毒基因表达的人类腺病毒感染,但大多数小鼠细胞系不容许人类腺病毒5型复制。ADS-12是一种小鼠肺癌细胞系,其最近被描述为第一个(和目前仅有的)鉴定到的以与人类细胞可比的水平支持人类腺病毒复制的小鼠癌细胞系,并因此被选为模型系统(Zhang等,(2015)CANCER GENE THER.22(1):17-22)。
将带有皮下ADS-12肿瘤的小鼠用肿瘤内注射进行治疗,每四天提供一剂共三剂介质、Ad-对照或Ad-mTGFβR-IgG1,109PFU/剂。
如图5A-5C中所示,用单独缓冲液的肿瘤内注射治疗的所有肿瘤继续发展。用“未武装的”Ad-对照病毒治疗的10个肿瘤中的4个完全消退,指示了在不存在肿瘤特异性TGFβ阱转入基因表达的情况下的溶瘤活性。相比较而言,用Ad-mTGFβR-IgG1病毒治疗的10个肿瘤中的8个完全消退,证实了使用所述转入基因的提高的肿瘤杀死。
概括来说,表达本文公开的新的TGFβ阱的溶瘤病毒显示出明显提高的抗肿瘤效果。
实施例4:癌细胞系中TGFβ信号传导的抑制
使用Ad-hTGFβR-IgG1-1、Ad-mTGFβR-IgG1和Ad-对照病毒,在人类细胞系中进行了TGFβ抑制的测定。所述病毒如实施例1中所述来制备,并且所述病毒的关键特点示意显示在上面的表4中。在正常(WI-38和MRC5)和癌性(ADS-12、A549和MCF7)细胞中试验了病毒的效果。如实施例2中所述将来自于用所指示的病毒感染的细胞的调制过的培养基覆盖在新鲜的报告细胞上并添加TGFβ。正如在图
6A-6B中看到的,在来自于用Ad-hTGFβR-IgG1-1感染的所有细胞系的调制过的培养基中,Smad2磷酸化的TGFβ诱导降低。概括来说,Ad-
hTGFβR-IgG1-1在癌细胞中诱导TGFβ的鲁棒阻断,并且甚至在被感
染的正常细胞中钝化TGFβ活性。
通过参考并入
本文中提高的每个专利文献和科学论文的全部公开内容,为所有
目的通过参考并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因
此,上述实施方式在所有情况下被认为是对本文描述的发明的说明而
不是限制。因此,本发明的范围由随附的权利要求书而不是上述描述来
指明,并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有改
变都涵盖在其中。
SEQ ID NO:52
catcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttccgggtcaaagttggcgttttattattatagtcagctgacgtgtagtgtatttatacccggtgagttcctcaagaggccactcttgagtgccagcgagtagagttttctcctccgagccgctccgacaccgggactgaaaatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcacttggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattgaggtactgaaatgtgtgggcgtggcttaagggtgggaaagaatatataaggtgggggtcttatgtagttttgtatctgttttgcagcagccgccgccgccatgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctcccaatgcggtttaaaacataaataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtctttatttaggggttttgcgcgcgcggtaggcccgggaccagcggtctcggtcgttgagggtcctgtgtattttttccaggacgtggtaaaggtgactctggatgttcagatacatgggcataagcccgtctctggggtggaggtagcaccactgcagagcttcatgctgcggggtggtgttgtagatgatccagtcgtagcaggagcgctgggcgtggtgcctaaaaatgtctttcagtagcaagctgattgccaggggcaggcccttggtgtaagtgtttacaaagcggttaagctgggatgggtgcatacgtggggatatgagatgcatcttggactgtatttttaggttggctatgttcccagccatatccctccggggattcatgttgtgcagaaccaccagcacagtgtatccggtgcacttgggaaatttgtcatgtagcttagaaggaaatgcgtggaagaacttggagacgcccttgtgacctccaagattttccatgcattcgtccataatgatggcaatgggcccacgggcggcggcctgggcgaagatatttctgggatcactaacgtcatagttgtgttccaggatgagatcgtcataggccatttttacaaagcgcgggcggagggtgccagactgcggtataatggttccatccggcccaggggcgtagttaccctcacagatttgcatttcccacgctttgagttcagatggggggatcatgtctacctgcggggcgatgaagaaaacggtttccggggtaggggagatcagctgggaagaaagcaggttcctgagcagctgcgacttaccgcagccggtgggcccgtaaatcacacctattaccgggtgcaactggtagttaagagagctgcagctgccgtcatccctgagcaggggggccacttcgttaagcatgtccctgactcgcatgttttccctgaccaaatccgccagaaggcgctcgccgcccagcgatagcagttcttgcaaggaagcaaagtttttcaacggtttgagaccgtccgccgtaggcatgcttttgagcgtttgaccaagcagttccaggcggtcccacagctcggtcacctgctctacggcatctcgatccagcatatctcctcgtttcgcgggttggggcggctttcgctgtacggcagtagtcggtgctcgtccagacgggccagggtcatgtctttccacgggcgcagggtcctcgtcagcgtagtctgggtcacggtgaaggggtgcgctccgggctgcgcgctggccagggtgcgcttgaggctggtcctgctggtgctgaagcgctgccggtcttcgccctgcgcgtcggccaggtagcatttgaccatggtgtcatagtccagcccctccgcggcgtggcccttggcgcgcagcttgcccttggaggaggcgccgcacgaggggcagtgcagacttttgagggcgtagagcttgggcgcgagaaataccgattccggggagtaggcatccgcgccgcaggccccgcagacggtctcgcattccacgagccaggtgagctctggccgttcggggtcaaaaaccaggtttcccccatgctttttgatgcgtttcttacctctggtttccatgagccggtgtccacgctcggtgacgaaaaggctgtccgtgtccccgtatacagacttgagaggcctgtcctcgagcggtgttccgcggtcctcctcgtatagaaactcggaccactctgagacaaaggctcgcgtccaggccagcacgaaggaggctaagtgggaggggtagcggtcgttgtccactagggggtccactcgctccagggtgtgaagacacatgtcgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctgaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcatccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttggtggcaaacgacccgtagagggcgttggacagcaacttggcgatggagcgcagggtttggtttttgtcgcgatcggcgcgctccttggccgcgatgtttagctgcacgtattcgcgcgcaacgcaccgccattcgggaaagacggtggtgcgctcgtcgggcaccaggtgcacgcgccaaccgcggttgtgcagggtgacaaggtcaacgctggtggctacctctccgcgtaggcgctcgttggtccagcagaggcggccgcccttgcgcgagcagaatggcggtagggggtctagctgcgtctcgtccggggggtctgcgtccacggtaaagaccccgggcagcaggcgcgcgtcgaagtagtctatcttgcatccttgcaagtctagcgcctgctgccatgcgcgggcggcaagcgcgcgctcgtatgggttgagtgggggaccccatggcatggggtgggtgagcgcggaggcgtacatgccgcaaatgtcgtaaacgtagaggggctctctgagtattccaagatatgtagggtagcatcttccaccgcggatgctggcgcgcacgtaatcgtatagttcgtgcgagggagcgaggaggtcgggaccgaggttgctacgggcgggctgctctgctcggaagactatctgcctgaagatggcatgtgagttggatgatatggttggacgctggaagacgttgaagctggcgtctgtgagacctaccgcgtcacgcacgaaggaggcgtaggagtcgcgcagcttgttgaccagctcggcggtgacctgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtaagagcctagcatgtagaactggttgacggcctggtaggcgcagcatcccttttctacgggtagcgcgtatgcctgcgcggccttccggagcgaggtgtgggtgagcgcaaaggtgtccctgaccatgactttgaggtactggtatttgaagtcagtgtcgtcgcatccgccctgctcccagagcaaaaagtccgtgcgctttttggaacgcggatttggcagggcgaaggtgacatcgttgaagagtatctttcccgcgcgaggcataaagttgcgtgtgatgcggaagggtcccggcacctcggaacggttgttaattacctgggcggcgagcacgatctcgtcaaagccgttgatgttgtggcccacaatgtaaagttccaagaagcgcgggatgcccttgatggaaggcaattttttaagttcctcgtaggtgagctcttcaggggagctgagcccgtgctctgaaagggcccagtctgcaagatgagggttggaagcgacgaatgagctccacaggtcacgggccattagcatttgcaggtggtcgcgaaaggtcctaaactggcgacctatggccattttttctggggtgatgcagtagaaggtaagcgggtcttgttcccagcggtcccatccaaggttcgcggctaggtctcgcgcggcagtcactagaggctcatctccgccgaacttcatgaccagcatgaagggcacgagctgcttcccaaaggcccccatccaagtataggtctctacatcgtaggtgacaaagagacgctcggtgcgaggatgcgagccgatcgggaagaactggatctcccgccaccaattggaggagtggctattgatgtggtgaaagtagaagtccctgcgacgggccgaacactcgtgctggcttttgtaaaaacgtgcgcagtactggcagcggtgcacgggctgtacatcctgcacgaggttgacctgacgaccgcgcacaaggaagcagagtgggaatttgagcccctcgcctggcgggtttggctggtggtcttctacttcggctgcttgtccttgaccgtctggctgctcgaggggagttacggtggatcggaccaccacgccgcgcgagcccaaagtccagatgtccgcgcgcggcggtcggagcttgatgacaacatcgcgcagatgggagctgtccatggtctggagctcccgcggcgtcaggtcaggcgggagctcctgcaggtttacctcgcatagacgggtcagggcgcgggctagatccaggtgatacctaatttccaggggctggttggtggcggcgtcgatggcttgcaagaggccgcatccccgcggcgcgactacggtaccgcgcggcgggcggtgggccgcgggggtgtccttggatgatgcatctaaaagcggtgacgcgggcgagcccccggaggtagggggggctccggacccgccgggagagggggcaggggcacgtcggcgccgcgcgcgggcaggagctggtgctgcgcgcgtaggttgctggcgaacgcgacgacgcggcggttgatctcctgaatctggcgcctctgcgtgaagacgacgggcccggtgagcttgagcctgaaagagagttcgacagaatcaatttcggtgtcgttgacggcggcctggcgcaaaatctcctgcacgtctcctgagttgtcttgataggcgatctcggccatgaactgctcgatctcttcctcctggagatctccgcgtccggctcgctccacggtggcggcgaggtcgttggaaatgcgggccatgagctgcgagaaggcgttgaggcctccctcgttccagacgcggctgtagaccacgcccccttcggcatcgcgggcgcgcatgaccacctgcgcgagattgagctccacgtgccgggcgaagacggcgtagtttcgcaggcgctgaaagaggtagttgagggtggtggcggtgtgttctgccacgaagaagtacataacccagcgtcgcaacgtggattcgttgatatcccccaaggcctcaaggcgctccatggcctcgtagaagtccacggcgaagttgaaaaactgggagttgcgcgccgacacggttaactcctcctccagaagacggatgagctcggcgacagtgtcgcgcacctcgcgctcaaaggctacaggggcctcttcttcttcttcaatctcctcttccataagggcctccccttcttcttcttctggcggcggtgggggaggggggacacggcggcgacgacggcgcaccgggaggcggtcgacaaagcgctcgatcatctccccgcggcgacggcgcatggtctcggtgacggcgcggccgttctcgcgggggcgcagttggaagacgccgcccgtcatgtcccggttatgggttggcggggggctgccatgcggcagggatacggcgctaacgatgcatctcaacaattgttgtgtaggtactccgccgccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggcggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgacagaagcaccatgtccttgggtccggcctgctgaatgcgcaggcggtcggccatgccccaggcttcgttttgacatcggcgcaggtctttgtagtagtcttgcatgagcctttctaccggcacttcttcttctccttcctcttgtcctgcatctcttgcatctatcgctgcggcggcggcggagtttggccgtaggtggcgccctcttcctcccatgcgtgtgaccccgaagcccctcatcggctgaagcagggctaggtcggcgacaacgcgctcggctaatatggcctgctgcacctgcgtgagggtagactggaagtcatccatgtccacaaagcggtggtatgcgcccgtgttgatggtgtaagtgcagttggccataacggaccagttaacggtctggtgacccggctgcgagagctcggtgtacctgagacgcgagtaagccctcgagtcaaatacgtagtcgttgcaagtccgcaccaggtactggtatcccaccaaaaagtgcggcggcggctggcggtagaggggccagcgtagggtggccggggctccgggggcgagatcttccaacataaggcgatgatatccgtagatgtacctggacatccaggtgatgccggcggcggtggtggaggcgcgcggaaagtcgcggacgcggttccagatgttgcgcagcggcaaaaagtgctccatggtcgggacgctctggccggtcaggcgcgcgcaatcgttgacgctctagaccgtgcaaaaggagagcctgtaagcgggcactcttccgtggtctggtggataaattcgcaagggtatcatggcggacgaccggggttcgagccccgtatccggccgtccgccgtgatccatgcggttaccgcccgcgtgtcgaacccaggtgtgcgacgtcagacaacgggggagtgctccttttggcttccttccaggcgcggcggctgctgcgctagcttttttggccactggccgcgcgcagcgtaagcggttaggctggaaagcgaaagcattaagtggctcgctccctgtagccggagggttattttccaagggttgagtcgcgggacccccggttcgagtctcggaccggccggactgcggcgaacgggggtttgcctccccgtcatgcaagaccccgcttgcaaattcctccggaaacagggacgagccccttttttgcttttcccagatgcatccggtgctgcggcagatgcgcccccctcctcagcagcggcaagagcaagagcagcggcagacatgcagggcaccctcccctcctcctaccgcgtcaggaggggcgacatccgcggttgacgcggcagcagatggtgattacgaacccccgcggcgccgggcccggcactacctggacttggaggagggcgagggcctggcgcggctaggagcgccctctcctgagcggtacccaagggtgcagctgaagcgtgatacgcgtgaggcgtacgtgccgcggcagaacctgtttcgcgaccgcgagggagaggagcccgaggagatgcgggatcgaaagttccacgcagggcgcgagctgcggcatggcctgaatcgcgagcggttgctgcgcgaggaggactttgagcccgacgcgcgaaccgggattagtcccgcgcgcgcacacgtggcggccgccgacctggtaaccgcatacgagcagacggtgaaccaggagattaactttcaaaaaagctttaacaaccacgtgcgtacgcttgtggcgcgcgaggaggtggctataggactgatgcatctgtgggactttgtaagcgcgctggagcaaaacccaaatagcaagccgctcatggcgcagctgttccttatagtgcagcacagcagggacaacgaggcattcagggatgcgctgctaaacatagtagagcccgagggccgctggctgctcgatttgataaacatcctgcagagcatagtggtgcaggagcgcagcttgagcctggctgacaaggtggccgccatcaactattccatgcttagcctgggcaagttttacgcccgcaagatataccataccccttacgttcccatagacaaggaggtaaagatcgaggggttctacatgcgcatggcgctgaaggtgcttaccttgagcgacgacctgggcgtttatcgcaacgagcgcatccacaaggccgtgagcgtgagccggcggcgcgagctcagcgaccgcgagctgatgcacagcctgcaaagggccctggctggcacgggcagcggcgatagagaggccgagtcctactttgacgcgggcgctgacctgcgctgggccccaagccgacgcgccctggaggcagctggggccggacctgggctggcggtggcacccgcgcgcgctggcaacgtcggcggcgtggaggaatatgacgaggacgatgagtacgagccagaggacggcgagtactaagcggtgatgtttctgatcagatgatgcaagacgcaacggacccggcggtgcgggcggcgctgcagagccagccgtccggccttaactccacggacgactggcgccaggtcatggaccgcatcatgtcgctgactgcgcgcaatcctgacgcgttccggcagcagccgcaggccaaccggctctccgcaattctggaagcggtggtcccggcgcgcgcaaaccccacgcacgagaaggtgctggcgatcgtaaacgcgctggccgaaaacagggccatccggcccgacgaggccggcctggtctacgacgcgctgcttcagcgcgtggctcgttacaacagcggcaacgtgcagaccaacctggaccggctggtgggggatgtgcgcgaggccgtggcgcagcgtgagcgcgcgcagcagcagggcaacctgggctccatggttgcactaaacgccttcctgagtacacagcccgccaacgtgccgcggggacaggaggactacaccaactttgtgagcgcactgcggctaatggtgactgagacaccgcaaagtgaggtgtaccagtctgggccagactattttttccagaccagtagacaaggcctgcagaccgtaaacctgagccaggctttcaaaaacttgcaggggctgtggggggtgcgggctcccacaggcgaccgcgcgaccgtgtctagcttgctgacgcccaactcgcgcctgttgctgctgctaatagcgcccttcacggacagtggcagcgtgtcccgggacacatacctaggtcacttgctgacactgtaccgcgaggccataggtcaggcgcatgtggacgagcatactttccaggagattacaagtgtcagccgcgcgctggggcaggaggacacgggcagcctggaggcaaccctaaactacctgctgaccaaccggcggcagaagatcccctcgttgcacagtttaaacagcgaggaggagcgcattttgcgctacgtgcagcagagcgtgagccttaacctgatgcgcgacggggtaacgcccagcgtggcgctggacatgaccgcgcgcaacatggaaccgggcatgtatgcctcaaaccggccgtttatcaaccgcctaatggactacttgcatcgcgcggccgccgtgaaccccgagtatttcaccaatgccatcttgaacccgcactggctaccgccccctggtttctacaccgggggattcgaggtgcccgagggtaacgatggattcctctgggacgacatagacgacagcgtgttttccccgcaaccgcagaccctgctagagttgcaacagcgcgagcaggcagaggcggcgctgcgaaaggaaagcttccgcaggccaagcagcttgtccgatctaggcgctgcggccccgcggtcagatgctagtagcccatttccaagcttgatagggtctcttaccagcactcgcaccacccgcccgcgcctgctgggcgaggaggagtacctaaacaactcgctgctgcagccgcagcgcgaaaaaaacctgcctccggcatttcccaacaacgggatagagagcctagtggacaagatgagtagatggaagacgtacgcgcaggagcacagggacgtgccaggcccgcgcccgcccacccgtcgtcaaaggcacgaccgtcagcggggtctggtgtgggaggacgatgactcggcagacgacagcagcgtcctggatttgggagggagtggcaacccgtttgcgcaccttcgccccaggctggggagaatgttttaaaaaaaaaaaagcatgatgcaaaataaaaaactcaccaaggccatggcaccgagcgttggttttcttgtattccccttagtatgcggcgcgcggcgatgtatgaggaaggtcctcctccctcctacgagagtgtggtgagcgcggcgccagtggcggcggcgctgggttctcccttcgatgctcccctggacccgccgtttgtgcctccgcggtacctgcggcctaccggggggagaaacagcatccgttactctgagttggcacccctattcgacaccacccgtgtgtacctggtggacaacaagtcaacggatgtggcatccctgaactaccagaacgaccacagcaactttctgaccacggtcattcaaaacaatgactacagcccgggggaggcaagcacacagaccatcaatcttgacgaccggtcgcactggggcggcgacctgaaaaccatcctgcataccaacatgccaaatgtgaacgagttcatgtttaccaataagtttaaggcgcgggtgatggtgtcgcgcttgcctactaaggacaatcaggtggagctgaaatacgagtgggtggagttcacgctgcccgagggcaactactccgagaccatgaccatagaccttatgaacaacgcgatcgtggagcactacttgaaagtgggcagacagaacggggttctggaaagcgacatcggggtaaagtttgacacccgcaacttcagactggggtttgaccccgtcactggtcttgtcatgcctggggtatatacaaacgaagccttccatccagacatcattttgctgccaggatgcggggtggacttcacccacagccgcctgagcaacttgttgggcatccgcaagcggcaacccttccaggagggctttaggatcacctacgatgatctggagggtggtaacattcccgcactgttggatgtggacgcctaccaggcgagcttgaaagatgacaccgaacagggcgggggtggcgcaggcggcagcaacagcagtggcagcggcgcggaagagaactccaacgcggcagccgcggcaatgcagccggtggaggacatgaacgatcatgccattcgcggcgacacctttgccacacgggctgaggagaagcgcgctgaggccgaagcagcggccgaagctgccgcccccgctgcgcaacccgaggtcgagaagcctcagaagaaaccggtgatcaaacccctgacagaggacagcaagaaacgcagttacaacctaataagcaatgacagcaccttcacccagtaccgcagctggtaccttgcatacaactacggcgaccctcagaccggaatccgctcatggaccctgctttgcactcctgacgtaacctgcggctcggagcaggtctactggtcgttgccagacatgatgcaagaccccgtgaccttccgctccacgcgccagatcagcaactttccggtggtgggcgccgagctgttgcccgtgcactccaagagcttctacaacgaccaggccgtctactcccaactcatccgccagtttacctctctgacccacgtgttcaatcgctttcccgagaaccagattttggcgcgcccgccagcccccaccatcaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggacgctaccgctgcgcaacagcatcggaggagtccagcgagtgaccattactgacgccagacgccgcacctgcccctacgtttacaaggccctgggcatagtctcgccgcgcgtcctatcgagccgcactttttgagcaagcatgtccatccttatatcgcccagcaataacacaggctggggcctgcgcttcccaagcaagatgtttggcggggccaagaagcgctccgaccaacacccagtgcgcgtgcgcgggcactaccgcgcgccctggggcgcgcacaaacgcggccgcactgggcgcaccaccgtcgatgacgccatcgacgcggtggtggaggaggcgcgcaactacacgcccacgccgccaccagtgtccacagtggacgcggccattcagaccgtggtgcgcggagcccggcgctatgctaaaatgaagagacggcggaggcgcgtagcacgtcgccaccgccgccgacccggcactgccgcccaacgcgcggcggcggccctgcttaaccgcgcacgtcgcaccggccgacgggcggccatgcgggccgctcgaaggctggccgcgggtattgtcactgtgccccccaggtccaggcgacgagcggccgccgcagcagccgcggccattagtgctatgactcagggtcgcaggggcaacgtgtattgggtgcgcgactcggttagcggcctgcgcgtgcccgtgcgcacccgccccccgcgcaactagattgcaagaaaaaactacttagactcgtactgttgtatgtatccagcggcggcggcgcgcaacgaagctatgtccaagcgcaaaatcaaagaagagatgctccaggtcatcgcgccggagatctatggccccccgaagaaggaagagcaggattacaagccccgaaagctaaagcgggtcaaaaagaaaaagaaagatgatgatgatgaacttgacgacgaggtggaactgctgcacgctaccgcgcccaggcgacgggtacagtggaaaggtcgacgcgtaaaacgtgttttgcgacccggcaccaccgtagtctttacgcccggtgagcgctccacccgcacctacaagcgcgtgtatgatgaggtgtacggcgacgaggacctgcttgagcaggccaacgagcgcctcggggagtttgcctacggaaagcggcataaggacatgctggcgttgccgctggacgagggcaacccaacacctagcctaaagcccgtaacactgcagcaggtgctgcccgcgcttgcaccgtccgaagaaaagcgcggcctaaagcgcgagtctggtgacttggcacccaccgtgcagctgatggtacccaagcgccagcgactggaagatgtcttggaaaaaatgaccgtggaacctgggctggagcccgaggtccgcgtgcggccaatcaagcaggtggcgccgggactgggcgtgcagaccgtggacgttcagatacccactaccagtagcaccagtattgccaccgccacagagggcatggagacacaaacgtccccggttgcctcagcggtggcggatgccgcggtgcaggcggtcgctgcggccgcgtccaagacctctacggaggtgcaaacggacccgtggatgtttcgcgtttcagccccccggcgcccgcgcggttcgaggaagtacggcgccgccagcgcgctactgcccgaatatgccctacatccttccattgcgcctacccccggctatcgtggctacacctaccgccccagaagacgagcaactacccgacgccgaaccaccactggaacccgccgccgccgtcgccgtcgccagcccgtgctggccccgatttccgtgcgcagggtggctcgcgaaggaggcaggaccctggtgctgccaacagcgcgctaccaccccagcatcgtttaaaagccggtctttgtggttcttgcagatatggccctcacctgccgcctccgtttcccggtgccgggattccgaggaagaatgcaccgtaggaggggcatggccggccacggcctgacgggcggcatgcgtcgtgcgcaccaccggcggcggcgcgcgtcgcaccgtcgcatgcgcggcggtatcctgcccctccttattccactgatcgccgcggcgattggcgccgtgcccggaattgcatccgtggccttgcaggcgcagagacactgattaaaaacaagttgcatgtggaaaaatcaaaataaaaagtctggactctcacgctcgcttggtcctgtaactattttgtagaatggaagacatcaactttgcgtctctggccccgcgacacggctcgcgcccgttcatgggaaactggcaagatatcggcaccagcaatatgagcggtggcgccttcagctggggctcgctgtggagcggcattaaaaatttcggttccaccgttaagaactatggcagcaaggcctggaacagcagcacaggccagatgctgagggataagttgaaagagcaaaatttccaacaaaaggtggtagatggcctggcctctggcattagcggggtggtggacctggccaaccaggcagtgcaaaataagattaacagtaagcttgatccccgccctcccgtagaggagcctccaccggccgtggagacagtgtctccagaggggcgtggcgaaaagcgtccgcgccccgacagggaagaaactctggtgacgcaaatagacgagcctccctcgtacgaggaggcactaaagcaaggcctgcccaccacccgtcccatcgcgcccatggctaccggagtgctgggccagcacacacccgtaacgctggacctgcctccccccgccgacacccagcagaaacctgtgctgccaggcccgaccgccgttgttgtaacccgtcctagccgcgcgtccctgcgccgcgccgccagcggtccgcgatcgttgcggcccgtagccagtggcaactggcaaagcacactgaacagcatcgtgggtctgggggtgcaatccctgaagcgccgacgatgcttctgaatagctaacgtgtcgtatgtgtgtcatgtatgcgtccatgtcgccgccagaggagctgctgagccgccgcgcgcccgctttccaagatggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccggccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataaagaagcaagcaacatcaacaacagctgccgccatgggctccagtgagcaggaactgaaagccattgtcaaagatcttggttgtgggccatattttttgggcacctatgacaagcgctttccaggctttgtttctccacacaagctcgcctgcgccatagtcaatacggccggtcgcgagactgggggcgtacactggatggcctttgcctggaacccgcactcaaaaacatgctacctctttgagccctttggcttttctgaccagcgactcaagcaggtttaccagtttgagtacgagtcactcctgcgccgtagcgccattgcttcttcccccgaccgctgtataacgctggaaaagtccacccaaagcgtacaggggcccaactcggccgcctgtggactattctgctgcatgtttctccacgcctttgccaactggccccaaactcccatggatcacaaccccaccatgaaccttattaccggggtacccaactccatgctcaacagtccccaggtacagcccaccctgcgtcgcaaccaggaacagctctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgcagccacagtgcgcagattaggagcgccacttctttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaataatgtactagagacactttcaataaaggcaaatgcttttatttgtacactctcgggtgattatttacccccacccttgccgtctgcgccgtttaaaaatcaaaggggttctgccgcgcatcgctatgcgccactggcagggacacgttgcgatactggtgtttagtgctccacttaaactcaggcacaaccatccgcggcagctcggtgaagttttcactccacaggctgcgcaccatcaccaacgcgtttagcaggtcgggcgccgatatcttgaagtcgcagttggggcctccgccctgcgcgcgcgagttgcgatacacagggttgcagcactggaacactatcagcgccgggtggtgcacgctggccagcacgctcttgtcggagatcagatccgcgtccaggtcctccgcgttgctcagggcgaacggagtcaactttggtagctgccttcccaaaaagggcgcgtgcccaggctttgagttgcactcgcaccgtagtggcatcaaaaggtgaccgtgcccggtctgggcgttaggatacagcgcctgcataaaagccttgatctgcttaaaagccacctgagcctttgcgccttcagagaagaacatgccgcaagacttgccggaaaactgattggccggacaggccgcgtcgtgcacgcagcaccttgcgtcggtgttggagatctgcaccacatttcggccccaccggttcttcacgatcttggccttgctagactgctccttcagcgcgcgctgcccgttttcgctcgtcacatccatttcaatcacgtgctccttatttatcataatgcttccgtgtagacacttaagctcgccttcgatctcagcgcagcggtgcagccacaacgcgcagcccgtgggctcgtgatgcttgtaggtcacctctgcaaacgactgcaggtacgcctgcaggaatcgccccatcatcgtcacaaaggtcttgttgctggtgaaggtcagctgcaacccgcggtgctcctcgttcagccaggtcttgcatacggccgccagagcttccacttggtcaggcagtagtttgaagttcgcctttagatcgttatccacgtggtacttgtccatcagcgcgcgcgcagcctccatgcccttctcccacgcagacacgatcggcacactcagcgggttcatcaccgtaatttcactttccgcttcgctgggctcttcctcttcctcttgcgtccgcataccacgcgccactgggtcgtcttcattcagccgccgcactgtgcgcttacctcctttgccatgcttgattagcaccggtgggttgctgaaacccaccatttgtagcgccacatcttctctttcttcctcgctgtccacgattacctctggtgatggcgggcgctcgggcttgggagaagggcgcttctttttcttcttgggcgcaatggccaaatccgccgccgaggtcgatggccgcgggctgggtgtgcgcggcaccagcgcgtcttgtgatgagtcttcctcgtcctcggactcgatacgccgcctcatccgcttttttgggggcgcccggggaggcggcggcgacggggacggggacgacacgtcctccatggttgggggacgtcgcgccgcaccgcgtccgcgctcgggggtggtttcgcgctgctcctcttcccgactggccatttccttctcctataggcagaaaaagatcatggagtcagtcgagaagaaggacagcctaaccgccccctctgagttcgccaccaccgcctccaccgatgccgccaacgcgcctaccaccttccccgtcgaggcacccccgcttgaggaggaggaagtgattatcgagcaggacccaggttttgtaagcgaagacgacgaggaccgctcagtaccaacagaggataaaaagcaagaccaggacaacgcagaggcaaacgaggaacaagtcgggcggggggacgaaaggcatggcgactacctagatgtgggagacgacgtgctgttgaagcatctgcagcgccagtgcgccattatctgcgacgcgttgcaagagcgcagcgatgtgcccctcgccatagcggatgtcagccttgcctacgaacgccacctattctcaccgcgcgtaccccccaaacgccaagaaaacggcacatgcgagcccaacccgcgcctcaacttctaccccgtatttgccgtgccagaggtgcttgccacctatcacatctttttccaaaactgcaagatacccctatcctgccgtgccaaccgcagccgagcggacaagcagctggccttgcggcagggcgctgtcatacctgatatcgcctcgctcaacgaagtgccaaaaatctttgagggtcttggacgcgacgagaagcgcgcggcaaacgctctgcaacaggaaaacagcgaaaatgaaagtcactctggagtgttggtggaactcgagggtgacaacgcgcgcctagccgtactaaaacgcagcatcgaggtcacccactttgcctacccggcacttaacctaccccccaaggtcatgagcacagtcatgagtgagctgatcgtgcgccgtgcgcagcccctggagagggatgcaaatttgcaagaacaaacagaggagggcctacccgcagttggcgacgagcagctagcgcgctggcttcaaacgcgcgagcctgccgacttggaggagcgacgcaaactaatgatggccgcagtgctcgttaccgtggagcttgagtgcatgcagcggttctttgctgacccggagatgcagcgcaagctagaggaaacattgcactacacctttcgacagggctacgtacgccaggcctgcaagatctccaacgtggagctctgcaacctggtctcctaccttggaattttgcacgaaaaccgccttgggcaaaacgtgcttcattccacgctcaagggcgaggcgcgccgcgactacgtccgcgactgcgtttacttatttctatgctacacctggcagacggccatgggcgtttggcagcagtgcttggaggagtgcaacctcaaggagctgcagaaactgctaaagcaaaacttgaaggacctatggacggccttcaacgagcgctccgtggccgcgcacctggcggacatcattttccccgaacgcctgcttaaaaccctgcaacagggtctgccagacttcaccagtcaaagcatgttgcagaactttaggaactttatcctagagcgctcaggaatcttgcccgccacctgctgtgcacttcctagcgactttgtgcccattaagtaccgcgaatgccctccgccgctttggggccactgctaccttctgcagctagccaactaccttgcctaccactctgacataatggaagacgtgagcggtgacggtctactggagtgtcactgtcgctgcaacctatgcaccccgcaccgctccctggtttgcaattcgcagctgcttaacgaaagtcaaattatcggtacctttgagctgcagggtccctcgcctgacgaaaagtccgcggctccggggttgaaactcactccggggctgtggacgtcggcttaccttcgcaaatttgtacctgaggactaccacgcccacgagattaggttctacgaagaccaatcccgcccgccaaatgcggagcttaccgcctgcgtcattacccagggccacattcttggccaattgcaagccatcaacaaagcccgccaagagtttctgctacgaaagggacggggggtttacttggacccccagtccggcgaggagctcaacccaatccccccgccgccgcagccctatcagcagcagccgcgggcccttgcttcccaggatggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatagcaagactctgacaaagcccaagaaatccacagcggcggcagcagcaggaggaggagcgctgcgtctggcgcccaacgaacccgtatcgacccgcgagcttagaaacaggatttttcccactctgtatgctatatttcaacagagcaggggccaagaacaagagctgaaaataaaaaacaggtctctgcgatccctcacccgcagctgcctgtatcacaaaagcgaagatcagcttcggcgcacgctggaagacgcggaggctctcttcagtaaatactgcgcgctgactcttaaggactagtttcgcgccctttctcaaatttaagcgcgaaaactacgtcatctccagcggccacacccggcgccagcacctgtcgtcagcgccattatgagcaaggaaattcccacgccctacatgtggagttaccagccacaaatgggacttgcggctggagctgcccaagactactcaacccgaataaactacatgagcgcgggaccccacatgatatcccgggtcaacggaatccgcgcccaccgaaaccgaattctcttggaacaggcggctattaccaccacacctcgtaataaccttaatccccgtagttggcccgctgccctggtgtaccaggaaagtcccgctcccaccactgtggtacttcccagagacgcccaggccgaagttcagatgactaactcaggggcgcagcttgcgggcggctttcgtcacagggtgcggtcgcccgggcagggtataactcacctgacaatcagagggcgaggtattcagctcaacgacgagtcggtgagctcctcgcttggtctccgtccggacgggacatttcagatcggcggcgccggccgtccttcattcacgcctcgtcaggcaatcctaactctgcagacctcgtcctctgagccgcgctctggaggcattggaactctgcaatttattgaggagtttgtgccatcggtctactttaaccccttctcgggacctcccggccactatccggatcaatttattcctaactttgacgcggtaaaggactcggcggacggctacgactgaatgttaagtggagaggcagagcaactgcgcctgaaacacctggtccactgtcgccgccacaagtgctttgcccgcgactccggtgagttttgctactttgaattgcccgaggatcatatcgagggcccggcgcacggcgtccggcttaccgcccagggagagcttgcccgtagcctgattcgggagtttacccagcgccccctgctagttgagcgggacaggggaccctgtgttctcactgtgatttgcaactgtcctaaccttggattacatcaagatctttgttgccatctctgtgctgagtataataaatacagaaattaaaatatactggggctcctatcgccatcctgtaaacgccaccgtcttcacccgcccaagcaaaccaaggcgaaccttacctggtacttttaacatctctccctctgtgatttacaacagtttcaacccagacggagtgagtctacgagagaacctctccgagctcagctactccatcagaaaaaacaccaccctccttacctgccgggaacgtacgagtgcgtcaccggccgctgcaccacacctaccgcctgaccgtaaaccagactttttccggacagacctcaataactctgtttaccagaacaggaggtgagcttagaaaacccttagggtattaggccaaaggcgcagctactgtggggtttatgaacaattcaagcaactctacgggctattctaattcaggtttctctagaatcggggttggggttattctctgtcttgtgattctctttattcttatactaacgcttctctgcctaaggctcgccgcctgctgtgtgcacatttgcatttattgtcagctttttaaacgctggggtcgccacccaagatgattaggtacataatcctaggtttactcacccttgcgtcagcccacggtaccacccaaaaggtggattttaaggagccagcctgtaatgttacattcgcagctgaagctaatgagtgcaccactcttataaaatgcaccacagaacatgaaaagctgcttattcgccacaaaaacaaaattggcaagtatgctgtttatgctatttggcagccaggtgacactacagagtataatgttacagttttccagggtaaaagtcataaaacttttatgtatacttttccattttatgaaatgtgcgacattaccatgtacatgagcaaacagtataagttgtggcccccacaaaattgtgtggaaaacactggcactttctgctgcactgctatgctaattacagtgctcgctttggtctgtaccctactctatattaaatacaaaagcagacgcagctttattgaggaaaagaaaatgccttaatttactaagttacaaagctaatgtcaccactaactgctttactcgctgcttgcaaaacaaattcaaaaagttagcattataattagaataggatttaaaccccccggtcatttcctgctcaataccattcccctgaacaattgactctatgtgggatatgctccagcgctacaaccttgaagtcaggcttcctggatgtcagcatctgactttggccagcacctgtcccgcggatttgttccagtccaactacagcgacccaccctaacagagatgaccaacacaaccaacgcggccgccgctaccggacttacatctaccacaaatacaccccaagtttctgcctttgtcaataactgggataacttgggcatgtggtggttctccatagcgcttatgtttgtatgccttattattatgtggctcatctgctgcctaaagcgcaaacgcgcccgaccacccatctatagtcccatcattgtgctacacccaaacaatgatggaatccatagattggacggactgaaacacatgttcttttctcttacagtatgattaaatgagacatgattcctcgagtttttatattactgacccttgttgcgcttttttgtgcgtgctccacattggctgcggtttctcacatcgaagtagactgcattccagccttcacagtctatttgctttacggatttgtcaccctcacgctcatctgcagcctcatcactgtggtcatcgcctttatccagtgcattgactgggtctgtgtgcgctttgcatatctcagacaccatccccagtacagggacaggactatagctgagcttcttagaattctttaattatgaaatttactgtgacttttctgctgattatttgcaccctatctgcgttttgttccccgacctccaagcctcaaagacatatatcatgcagattcactcgtatatggaatattccaagttgctacaatgaaaaaagcgatctttccgaagcctggttatatgcaatcatctctgttatggtgttctgcagtaccatcttagccctagctatatatccctaccttgacattggctggaaacgaatagatgccatgaaccacccaactttccccgcgcccgctatgcttccactgcaacaagttgttgccggcggctttgtcccagccaatcagcctcgccccacttctcccacccccactgaaatcagctactttaatctaacaggaggagatgactgacaccctagatctagaaatggacggaattattacagagcagcgcctgctagaaagacgcagggcagcggccgagcaacagcgcatgaatcaagagctccaagacatggttaacttgcaccagtgcaaaaggggtatcttttgtctggtaaagcaggccaaagtcacctacgacagtaataccaccggacaccgccttagctacaagttgccaaccaagcgtcagaaattggtggtcatggtgggagaaaagcccattaccataactcagcactcggtagaaaccgaaggctgcattcactcaccttgtcaaggacctgaggatctctgcacccttattaagaccctgtgcggtctcaaagatcttattccctttaactaataaaaaaaaataataaagcatcacttacttaaaatcagttagcaaatttctgtccagtttattcagcagcacctccttgccctcctcccagctctggtattgcagcttcctcctggctgcaaactttctccacaatctaaatggaatgtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactatcttcatgttgttgcagatgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctctagttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggccggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtcaaacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggctgccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacactcaccatgcaatcacaggccccgctaaccgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaaggaaagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatcactgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagcccatttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagacgacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttgcaaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgtagcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccgtttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactcagcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaattccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagccatagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaatcccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcctaaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaataatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgcagagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctacagtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgctcatcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggacccagaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgttggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaacattgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattacactaaacggtacacaggaaacaggagacacaactccaagtgcatactctatgtcattttcatgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacatcctcttacactttttcatacattgcccaagaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatttttcaattgcagaaaatttcaagtcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatagcttatacagatcaccgtaccttaatcaaactcacagaaccctagtattcaacctgccacctccctcccaacacacagagtacacagtcctttctccccggctggccttaaaaagcatcatatcatgggtaacagacatattcttaggtgttatattccacacggtttcctgtcgagccaaacgctcatcagtgatattaataaactccccgggcagctcacttaagttcatgtcgctgtccagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgcttaacgggcggcgaaggagaagtccacgcctacatgggggtagagtcataatcgtgcatcaggatagggcggtggtgctgcagcagcgcgcgaataaactgctgccgccgccgctccgtcctgcaggaatacaacatggcagtggtctcctcagcgatgattcgcaccgcccgcagcataaggcgccttgtcctccgggcacagcagcgcaccctgatctcacttaaatcagcacagtaactgcagcacagcaccacaatattgttcaaaatcccacagtgcaaggcgctgtatccaaagctcatggcggggaccacagaacccacgtggccatcataccacaagcgcaggtagattaagtggcgacccctcataaacacgctggacataaacattacctcttttggcatgttgtaattcaccacctcccggtaccatataaacctctgattaaacatggcgccatccaccaccatcctaaaccagctggccaaaacctgcccgccggctatacactgcagggaaccgggactggaacaatgacagtggagagcccaggactcgtaaccatggatcatcatgctcgtcatgatatcaatgttggcacaacacaggcacacgtgcatacacttcctcaggattacaagctcctcccgcgttagaaccatatcccagggaacaacccattcctgaatcagcgtaaatcccacactgcagggaagacctcgcacgtaactcacgttgtgcattgtcaaagtgttacattcgggcagcagcggatgatcctccagtatggtagcgcgggtttctgtctcaaaaggaggtagacgatccctactgtacggagtgcgccgagacaaccgagatcgtgttggtcgtagtgtcatgccaaatggaacgccggacgtagtcatatttcctgaagcaaaaccaggtgcgggcgtgacaaacagatctgcgtctccggtctcgccgcttagatcgctctgtgtagtagttgtagtatatccactctctcaaagcatccaggcgccccctggcttcgggttctatgtaaactccttcatgcgccgctgccctgataacatccaccaccgcagaataagccacacccagccaacctacacattcgttctgcgagtcacacacgggaggagcgggaagagctggaagaaccatgtttttttttttattccaaaagattatccaaaacctcaaaatgaagatctattaagtgaacgcgctcccctccggtggcgtggtcaaactctacagccaaagaacagataatggcatttgtaagatgttgcacaatggcttccaaaaggcaaacggccctcacgtccaagtggacgtaaaggctaaacccttcagggtgaatctcctctataaacattccagcaccttcaaccatgcccaaataattctcatctcgccaccttctcaatatatctctaagcaaatcccgaatattaagtccggccattgtaaaaatctgctccagagcgccctccaccttcagcctcaagcagcgaatcatgattgcaaaaattcaggttcctcacagacctgtataagattcaaaagcggaacattaacaaaaataccgcgatcccgtaggtcccttcgcagggccagctgaacataatcgtgcaggtctgcacggaccagcgcggccacttccccgccaggaaccatgacaaaagaacccacactgattatgacacgcatactcggagctatgctaaccagcgtagccccgatgtaagcttgttgcatgggcggcgatataaaatgcaaggtgctgctcaaaaaatcaggcaaagcctcgcgcaaaaaagaaagcacatcgtagtcatgctcatgcagataaaggcaggtaagctccggaaccaccacagaaaaagacaccatttttctctcaaacatgtctgcgggtttctgcataaacacaaaataaaataacaaaaaaacatttaaacattagaagcctgtcttacaacaggaaaaacaacccttataagcataagacggactacggccatgccggcgtgaccgtaaaaaaactggtcaccgtgattaaaaagcaccaccgacagctcctcggtcatgtccggagtcataatgtaagactcggtaaacacatcaggttgattcacatcggtcagtgctaaaaagcgaccgaaatagcccgggggaatacatacccgcaggcgtagagacaacattacagcccccataggaggtataacaaaattaataggagagaaaaacacataaacacctgaaaaaccctcctgcctaggcaaaatagcaccctcccgctccagaacaacatacagcgcttccacagcggcagccataacagtcagccttaccagtaaaaaagaaaacctattaaaaaaacaccactcgacacggcaccagctcaatcagtcacagtgtaaaaaagggccaagtgcagagcgagtatatataggactaaaaaatgacgtaacggttaaagtccacaaaaaacacccagaaaaccgcacgcgaacctacgcccagaaacgaaagccaaaaaacccacaacttcctcaaatcgtcacttccgttttcccacgttacgtaacttcccattttaagaaaactacaattcccaacacatacaagttactccgccctaaaacctacgtcacccgccccgttcccacgccccgcgccacgtcacaaactccaccccctcattatcatattggcttcaatccaaaataaggtatattattgatgatg

Claims (73)

1.一种分离的融合蛋白,其以N-端到C-端的方向包含:
(i)人类TGFβII型受体的细胞外结构域的可溶性部分,其中所述人类TGFβII型受体的细胞外结构域的可溶性部分与SEQ ID NO:12的23-159位氨基酸残基具有大于95%的序列同一性;
(ii)氨基酸接头;
(iii)免疫球蛋白(Ig)铰链区;和
(iv)免疫球蛋白(Ig)Fc结构域,其中所述Ig铰链区和所述Ig Fc结构域一起与SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中的一者具有大于95%的同一性;
其中所述接头由10至40个氨基酸残基组成;并且
其中所述接头包括源自于内源人类蛋白的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述接头由10至30个氨基酸残基组成。
3.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述接头由10至20个氨基酸残基组成。
4.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述接头由10至15个氨基酸残基组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的融合蛋白,其中所述接头包含源自于免疫球蛋白(Ig)CH1结构域的C-端部分的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的分离的融合蛋白,其中所述免疫球蛋白CH1结构域选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM CH1结构域。
7.如权利要求6所述的分离的融合蛋白,其中所述免疫球蛋白(Ig)CH1结构域与选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
8.如权利要求6所述的分离的融合蛋白,其中所述免疫球蛋白(Ig)CH1结构域具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
9.如权利要求7或8所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig CH1结构域是IgG1 CH1结构域。
10.如权利要求9所述的分离的融合蛋白,其中所述免疫球蛋白(Ig)CH1结构域具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
11.如权利要求9所述的分离的融合蛋白,其中所述接头具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
12.如权利要求1-4中任一项所述的分离的融合蛋白,其中所述接头包含源自于选自白蛋白和酪蛋白的人类蛋白的序列。
13.如权利要求12所述的分离的融合蛋白,其中所述接头包含选自SEQ ID NO:10和SEQID NO:11的氨基酸序列。
14.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述人类TGFβII型受体的细胞外结构域的可溶性部分具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述人类TGFβII型受体的细胞外结构域的可溶性部分具有SEQ ID NO:12的23-159位氨基酸残基。
16.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig Fc结构域和铰链区选自人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域和铰链区。
17.如权利要求16所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig Fc结构域和铰链区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig Fc结构域和铰链区是人类IgG1Fc结构域和铰链区。
19.如权利要求18所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig Fc结构域和铰链区包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列。
20.如权利要求1所述的分离的融合蛋白,其中所述Ig Fc、Ig铰链区和Ig CH1结构域源自于单一免疫球蛋白。
21.如权利要求1-20中任一项所述的分离的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有选自SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
22.如权利要求1-20中任一项所述的分离的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有选自SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
23.如权利要求1-20中任一项所述的分离的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
24.如权利要求21所述的分离的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
25.一种人类TGFβ结合蛋白,其包含两个如权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白,其中所述两个融合蛋白被共价连接在一起,并且其中所述两个细胞外结构域一起定义用于结合人类TGFβ的结合位点。
26.一种分离的核酸,其包含编码如权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
27.一种表达载体,其包含如权利要求26所述的核酸。
28.如权利要求27所述的表达载体,其中所述表达载体是溶瘤病毒。
29.如权利要求28所述的表达载体,其中所述溶瘤病毒是腺病毒。
30.如权利要求29所述的表达载体,其中所述腺病毒是2型或5型腺病毒。
31.如权利要求30所述的表达载体,其中所述腺病毒是5型腺病毒。
32.如权利要求29所述的表达载体,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间的E1b-19K插入位点中,其中所述E1b-19K插入位点包含对应于如SEQ ID NO:52所示的Ad5基因组的1714-1916位核苷酸的缺失,并且其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到对应于如SEQ ID NO:52所示的Ad5基因组的1714位与1916位的核苷酸之间。
33.如权利要求32所述的表达载体,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO:53)与TCACCAGG(SEQ ID NO:54)之间。
34.如权利要求32所述的表达载体,其中所述腺病毒以5’至3’方向包含CTGACCTC(SEQID NO:53)、编码所述融合蛋白的核苷酸序列和TCACCAGG(SEQ ID NO:54)。
35.如权利要29所述的表达载体,其中所述腺病毒包含Pea3结合位点或其功能性片段的缺失,其中所述缺失包含对应于E1a的起始位点上游-305至-255位的核苷酸的缺失或对应于如SEQ ID NO:52所示的Ad5基因组的195-244位的核苷酸的缺失。
36.如权利要求35所述的表达载体,其中所述腺病毒包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO:55)。
37.如权利要求29所述的表达载体,其中所述腺病毒包含E3缺失,其中所述E3缺失位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间,其中所述E3缺失包含:(i)E3-10.5K的终止位点附近1064个核苷酸的缺失;(ii)对应于Ad5 dl309 E3缺失的缺失;或(iii)对应于如SEQ IDNO:52所示的Ad5基因组的29773-30836位核苷酸的缺失。
38.如权利要求37所述的表达载体,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到所述E3缺失中。
39.如权利要求38所述的表达载体,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到对应于如SEQ ID NO:52所示的Ad5基因组的29773和30836位的核苷酸之间。
40.如权利要求38所述的表达载体,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO:56)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)之间。
41.如权利要求38所述的表达载体,其中所述腺病毒以5’至3’方向包含CAGTATGA(SEQID NO:56)、编码所述融合蛋白的核苷酸序列和TAATAAAAAA(SEQ ID NO:57)。
42.如权利要求28所述的表达载体,其中所述溶瘤病毒选择性地在过度增殖性细胞中复制。
43.如权利要求28所述的表达载体,其中所述溶瘤病毒选择性地在过度增殖性细胞中表达所述融合蛋白。
44.一种宿主细胞,其包含如权利要求27-43中任一项所述的表达载体。
45.一种生产融合蛋白的方法,所述方法包括:
(a)将权利要求44所述的宿主细胞在一定条件下生长以表达所述融合蛋白;和
(b)纯化所述融合蛋白。
46.一种药物组合物,其包含:(i)权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白或权利要求27-43中任一项所述的表达载体;和(ii)至少一种可药用载体或稀释剂。
47.一种在靶细胞中表达融合蛋白的方法,所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求27-43中任一项所述的表达载体,以表达所述融合蛋白。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述融合蛋白在翻译后被切割成两条多肽链。
49.权利要求25所述的人类TGFβ结合蛋白在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
50.权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
51.权利要求25所述的人类TGFβ结合蛋白在制备在有需要的受试者中抑制肿瘤生长的药物中的用途。
52.权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白在制备在有需要的受试者中抑制肿瘤生长的药物中的用途。
53.权利要求25所述的人类TGFβ结合蛋白在制备在有需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途。
54.权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白在制备在有需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途。
55.权利要求25所述的人类TGFβ结合蛋白在制备在细胞中降低TGFβ活性的药物中的用途。
56.权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白在制备在细胞中降低TGFβ活性的药物中的用途。
57.权利要求25所述的人类TGFβ结合蛋白在制备在有需要的受试者中治疗炎性病症的药物中的用途。
58.权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白在制备在有需要的受试者中治疗炎性病症的药物中的用途。
59.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
60.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备在有需要的受试者中抑制肿瘤生长的药物中的用途。
61.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备在有需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途。
62.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备在细胞中降低TGFβ活性的药物中的用途。
63.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备在有需要的受试者中治疗炎性病症的药物中的用途。
64.权利要求27-43中任一项所述的表达载体在制备在有需要的受试者中治疗感染的药物中的用途。
65.如权利要求53-54和61中任一项所述的用途,其中所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、脑和中枢神经系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、淋巴瘤、白血病、梅克尔细胞癌、胃肠道间质肿瘤、多发性骨髓瘤、子宫癌、肉瘤、肾癌、眼癌、胰腺癌和生殖细胞癌。
66.如权利要求53-54和61中任一项所述的用途,其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌和白血病。
67.如权利要求53-54和61中任一项所述的用途,其中所述癌症选自皮肤癌、头颈癌和肺癌。
68.如权利要求61所述的用途,其中所述表达载体与选自手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种以上疗法联合施用。
69.如权利要求61所述的用途,其中所述表达载体与淋巴细胞联合施用。
70.如权利要求69所述的用途,其中所述淋巴细胞是T-细胞。
71.如权利要求70所述的用途,其中所述T-细胞是CAR T-细胞。
72.如权利要求51-54、57-58、60-61和63-64中任一项所述的用途,其中所述受试者是人类或动物。
73.如权利要求72所述的用途,其中所述受试者是人类幼儿。
CN202410281185.1A 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白 Pending CN118307682A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662400338P 2016-09-27 2016-09-27
US62/400,338 2016-09-27
US201762484841P 2017-04-12 2017-04-12
US62/484,841 2017-04-12
CN201780073371.4A CN110546168B (zh) 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白
PCT/US2017/053765 WO2018064190A1 (en) 2016-09-27 2017-09-27 Immunomodulatory fusion proteins

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780073371.4A Division CN110546168B (zh) 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118307682A true CN118307682A (zh) 2024-07-09

Family

ID=61763625

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410281185.1A Pending CN118307682A (zh) 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白
CN201780073371.4A Active CN110546168B (zh) 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780073371.4A Active CN110546168B (zh) 2016-09-27 2017-09-27 免疫调节性融合蛋白

Country Status (11)

Country Link
US (2) US10906957B2 (zh)
EP (1) EP3519442A4 (zh)
JP (2) JP7421338B2 (zh)
KR (2) KR20240014617A (zh)
CN (2) CN118307682A (zh)
AU (1) AU2017336546A1 (zh)
BR (1) BR112019005964A2 (zh)
CA (1) CA3038526A1 (zh)
IL (1) IL265657A (zh)
MX (1) MX2019003445A (zh)
WO (1) WO2018064190A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105658672A (zh) 2013-08-22 2016-06-08 阿塞勒隆制药公司 TGF-β受体II型变体及其用途
AU2016301380B2 (en) 2015-08-04 2021-07-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating myeloproliferative disorders
US10273281B2 (en) 2015-11-02 2019-04-30 Five Prime Therapeutics, Inc. CD80 extracellular domain polypeptides and their use in cancer treatment
CN118307682A (zh) 2016-09-27 2024-07-09 埃皮辛特瑞柯斯公司 免疫调节性融合蛋白
KR20200006528A (ko) 2017-04-21 2020-01-20 킨드레드 바이오사이언시스, 인코포레이티드 수의학 용도를 위한 il4/il13 수용체 분자
EP3628070B1 (en) 2017-04-28 2021-09-08 Five Prime Therapeutics, Inc. Cd80 extracellular domain polypeptides for use in increasing central memory t cells
RS64315B1 (sr) 2017-05-04 2023-08-31 Acceleron Pharma Inc Fuzioni proteini tgf-beta receptora tipa ii i njihove upotrebe
KR102697329B1 (ko) * 2017-09-19 2024-08-23 폴 슈레 앙스띠뛰 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션 방법 및 링커
US11834492B2 (en) 2017-09-27 2023-12-05 Epicentrx, Inc. Human IL-10 receptor alpha fusion proteins
CA3103975A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Shattuck Labs, Inc. Heterodimeric proteins and uses thereof
JP2021528399A (ja) * 2018-06-22 2021-10-21 メルク パテント ゲーエムベーハー 胆道癌を治療する際に使用するための標的TGF−β阻害のための投薬計画
CA3105750A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Precigen, Inc. Fusion constructs and methods of using thereof
US20210395340A1 (en) * 2018-10-25 2021-12-23 Kindred Biosciences, Inc. IL4/IL13 Receptor Molecule for Veterinary Use
JP2022532430A (ja) * 2019-05-16 2022-07-14 シャタック ラボ,インコーポレイテッド Nk細胞指向性キメラタンパク質
MX2022000991A (es) * 2019-07-25 2022-05-24 Univ Chicago Composiciones y metodos que comprenden agentes terapeuticos activados por proteasa.
CN112574314A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 和铂医药(苏州)有限公司 一种融合蛋白及其应用
CN111000982A (zh) * 2019-12-25 2020-04-14 沣潮医药科技(上海)有限公司 Amhr2重组蛋白或融合蛋白在制备amh信号轴异常活化相关疾病治疗药物中的用途
CN111154806A (zh) * 2020-01-08 2020-05-15 深圳普菲科生命科技有限公司 一种嵌合外源超级细胞因子的溶瘤病毒载体系统及其在药物中的应用
CN115529826A (zh) * 2020-03-23 2022-12-27 酵活生物制药有限公司 经掩蔽的il12融合蛋白及其使用方法
CN111690070A (zh) * 2020-05-13 2020-09-22 深圳市众循精准医学研究院 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用
CA3177843A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 John Thomas MULLIGAN Compositions of protein complexes and methods of use thereof
US20230257706A1 (en) * 2020-07-07 2023-08-17 Fapon Biotherapy Inc. T lymphocyte and use thereof
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
MX2023004606A (es) 2020-10-25 2023-05-08 Araris Biotech Ag Medios y metodos para producir conjugados de ligador-anticuerpo.
CN112375149B (zh) * 2020-10-30 2023-04-18 沣潮医药科技(上海)有限公司 Ace2免疫融合蛋白及其应用
WO2022105751A1 (zh) * 2020-11-19 2022-05-27 信达生物制药(苏州)有限公司 TGFβRII融合蛋白以及其用途
WO2024158813A2 (en) * 2023-01-24 2024-08-02 Providence Health & Services - Oregon Pet tracer for detection of transforming growth factor beta
WO2024179553A1 (zh) * 2023-03-01 2024-09-06 广东菲鹏制药股份有限公司 靶向TGFβ的融合蛋白及其应用

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
AU3830895A (en) 1994-10-07 1996-05-02 Amgen Boulder Inc. Dimeric il-4 inhibitors
AUPN477695A0 (en) 1995-08-14 1995-09-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene therapy
US5672508A (en) 1996-01-23 1997-09-30 Mitotix, Inc. Inhibitors of cell-cycle progression, and uses related thereto
GB9626029D0 (en) 1996-12-14 1997-01-29 Univ Leeds EVH-1 vectors
US5998598A (en) 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
DK0975771T3 (da) 1997-04-18 2007-10-22 Biogen Idec Inc Fusionsproteiner af TGF-beta-receptortype II og immunoglobulins konstante region
WO1999065948A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Biogen, Inc. Variant type ii tgf-beta receptor fusion proteins and methods
US7083950B2 (en) * 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
WO2001003737A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Bolder Biotechnology Inc. Immunoglobulin fusion proteins
KR100827757B1 (ko) 1999-08-09 2008-05-07 메르크 파텐트 게엠베하 복수의 시토킨-항체 복합체
US7638604B2 (en) 2001-02-23 2009-12-29 Genetics Institute, Llc Monoclonal antibodies against interleukin-22
US20030125251A1 (en) 2001-06-21 2003-07-03 Wakefield Lalage M. Transforming growth factor beta (TGF-beta) antagonist selectively neutralizes "pathological" TGF-beta
AU2003215136A1 (en) 2002-02-08 2003-09-02 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Ifn-a/b-independent mechanism of antiviral protection
US20070184052A1 (en) 2003-05-09 2007-08-09 Lin Herbert Y Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins
WO2005024027A1 (ja) 2003-09-02 2005-03-17 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 抗体医薬
CA2610360A1 (en) 2004-12-31 2006-07-06 Per Sonne Holm E1-minus adenoviruses and use thereof
US20090155267A1 (en) 2005-02-09 2009-06-18 Apollo Life Sciences Limited Molecule and chimeric molecules thereof
WO2006084337A1 (en) 2005-02-14 2006-08-17 Apollo Life Sciences Limited A molecule and chimeric molecules thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090175819A1 (en) 2005-11-15 2009-07-09 Apollo Life Sciences Limited Molecule and chimeric molecules thereof
ES2415604T3 (es) 2007-05-30 2013-07-26 Postech Academy-Industry- Foundation Proteínas de fusión de inmunoglobulina
EP2171062A1 (en) 2007-06-15 2010-04-07 Genzyme Corporation Fusion proteins containing two tgf-beta binding domains of tgf-beta type ii receptor
US8658135B2 (en) 2008-03-19 2014-02-25 National Research Council Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
WO2009154995A2 (en) 2008-05-27 2009-12-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Interleukin 10 receptor (il-10r) antibodies and methods of use
NZ590667A (en) 2008-07-02 2013-01-25 Emergent Product Dev Seattle Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
EP2403951B1 (en) 2009-03-02 2015-09-30 The Regents of The University of California Tumor-selective adenovirus e1a and e1b mutants
ES2638521T5 (es) 2010-03-05 2021-03-02 Univ Johns Hopkins Composiciones y métodos para anticuerpos y proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos contra dianas
CN104334573A (zh) 2012-04-30 2015-02-04 比奥孔有限公司 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
EP2970512B1 (en) 2013-03-12 2018-10-10 Biocon Limited Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
CN105658672A (zh) 2013-08-22 2016-06-08 阿塞勒隆制药公司 TGF-β受体II型变体及其用途
JP6640083B2 (ja) 2013-11-21 2020-02-05 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドThe Brigham and Women’s Hospital, Inc. 肺高血圧症を治療するための組成物および方法
WO2015118175A2 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Merck Patent Gmbh TARGETED TGFβ INHIBITION
US20160175458A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
JP2018518945A (ja) 2015-04-29 2018-07-19 メディオラヌム・ファルマチェウティチ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ 可溶性キメラインターロイキン−10受容体およびその療法使用
CA2996996A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 National Research Council Of Canada Tgf-.beta.-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
CN118307682A (zh) 2016-09-27 2024-07-09 埃皮辛特瑞柯斯公司 免疫调节性融合蛋白
US10232053B2 (en) 2016-12-30 2019-03-19 Trieza Therapeutics, Inc. Immunomodulatory oncolytic adenoviral vectors, and methods of production and use thereof for treatment of cancer
US11834492B2 (en) 2017-09-27 2023-12-05 Epicentrx, Inc. Human IL-10 receptor alpha fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US20210139560A1 (en) 2021-05-13
EP3519442A4 (en) 2020-06-17
BR112019005964A2 (pt) 2019-06-18
US20180134766A1 (en) 2018-05-17
WO2018064190A1 (en) 2018-04-05
CN110546168A (zh) 2019-12-06
IL265657A (en) 2019-05-30
AU2017336546A1 (en) 2019-05-02
US12054530B2 (en) 2024-08-06
EP3519442A1 (en) 2019-08-07
CA3038526A1 (en) 2018-04-05
US10906957B2 (en) 2021-02-02
MX2019003445A (es) 2019-09-26
KR20240014617A (ko) 2024-02-01
JP2024026738A (ja) 2024-02-28
CN110546168B (zh) 2024-03-15
JP2019531728A (ja) 2019-11-07
JP7421338B2 (ja) 2024-01-24
KR20190128618A (ko) 2019-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12054530B2 (en) Immunomodulatory fusion proteins
US20240052016A1 (en) Human il-10 receptor alpha fusion proteins
CN112368015A (zh) 细胞因子融合蛋白及其用途
US12036247B2 (en) Multiple transgene recombinant adenovirus
US20190352616A1 (en) Multiple transgene recombinant adenovirus
JP2003501043A (ja) 腫瘍壊死因子(tnf)関連障害において、tnfのレベルを低下させるための方法および組成物
JP6759188B2 (ja) 生物活性カーゴの経口送達のためのコリックス毒素由来融合分子
CA3064892A1 (en) Anti-angiogenic adenovirus
CA3052086A1 (en) Tumor selective tata-box and caat-box mutants
KR20190017869A (ko) 엔테로바이러스 71에 대한 인간화 항체
JP2022522817A (ja) がんを治療するための腫瘍溶解性ウイルスの使用
JP2019527036A (ja) 改変糖タンパク質dを有するヘルペスウイルス
CN112574315B (zh) 改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白
EA045432B1 (ru) Иммуномодулирующие слитые белки
EA043690B1 (ru) Иммуномодулирующие слитые белки
BR122024009021A2 (pt) Proteínas de fusão imunomoduladoras, seu uso e seu método de produção, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e método para expressar uma proteína de fusão em uma célula-alvo

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination