CN118286467B - 整合应激反应抑制剂isrib在治疗肝癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明整合应激反应抑制剂ISRIB在治疗肝癌中的应用，首先发现OTUD3作为eIF2α的去泛素化酶，拮抗ISR并抑制肝癌；同时本申请还发现应用ISR抑制剂ISRIB来抑制ISR，发现ISRIB治疗限制了索拉非尼诱导的eIF2α的磷酸化和ATF4的表达，并显著增强了索拉非尼治疗肝癌的效果，为克服肝癌对索拉非尼的治疗抵抗提供了潜在策略。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白对于肿瘤治疗敏感性的影响，具体涉及肝癌的分子机理和治疗领域。
背景技术
整合应激反应（integrated stress response， ISR）是一个在细胞内受到各种内源性和外源性因素激活的、进化上保守的细胞信号网络，旨在促进细胞适应和存活。通过调节ISR，正常细胞可以在生长和自我更新过程中适应蛋白质稳态紊乱、氧化还原失衡、营养匮乏和病毒感染等各种应激情况。肿瘤细胞通过激活整合应激反应，在包括放疗、化疗以及靶向治疗等各种癌症治疗方法产生的持续应激下存活。
在ISR信号传导的各个组成部分中，真核起始因子eIF2α是一个关键的调节节点，也是癌症治疗的重要焦点，因为eIF2α的磷酸化通过调控mRNA翻译起始而控制全局蛋白质合成。在真核细胞中，AUG起始的mRNA翻译依赖于由真核翻译起始因子eIF2（α、β和γ亚基）、鸟苷三磷酸（GTP）和充电的甲硫氨酰起始转运RNA（Met-tRNAi）组成的三元复合物（TC）。TC中的GTP水解由AUG密码子识别触发，随后将Met-tRNAi释放到核糖体P位点。 eIF2-GDP的解离允许核糖体的组装，从而确保随后的蛋白质合成。负责催化eIF2结合的GDP到GTP的交换、将eIF2回收到其活性状态并对TC形成起限制性作用的是eIF2的专门的鸟苷核苷酸交换因子（GEF）eIF2B。有趣的是，eIF2的磷酸化将eIF2从eIF2B的底物转变为其抑制剂。在应激条件下，eIF2α的丝氨酸51位点的磷酸化导致了深刻的结构重排和一个疏水表面斑点的形成，该斑点对eIF2B的另一个结合位点具有很强的亲和力。因此，eIF2-P在eIF2B的催化结构域的正确定位中的空间干扰使得eIF2-P成为eIF2B的非竞争性抑制剂。
各种应激条件被四种专门的激酶所感知，即EIF2ΑK1（也称为HRI，应对血红素缺乏和低氧）、EIF2ΑK2（也称为PKR，应对病毒感染）、EIF2ΑK3（也称为PERK，应对ER应激）和EIF2ΑK4（也称为GCN2，应对氨基酸缺乏），它们磷酸化eIF2α的51位丝氨酸激活ISR。在整合应激后，ISR导致了一个中心性输出效应：抑制全局mRNA依赖帽的翻译，同时选择性地促进包含短上游开放阅读框的一部分mRNA的翻译。由ISR引导的这种翻译重编程使细胞能够调整其状态，并在各种刺激中改善细胞的干扰。然而，如果持续的应激情况持续存在，ISR将触发细胞凋亡以消除受损细胞。
尽管早期研究表明，抑制ISR的EIF2ΑK2/PKR分支或eIF2的磷酸化会增加免疫缺陷小鼠中的肿瘤形成，但最近的大量证据表明，ISR的激活对肿瘤的发生、发展以及对肿瘤治疗的抵抗都起着作用。基于ISR在控制促进生存和促进死亡机制方面的双重作用，利用ISR治疗肿瘤有两种不同的策略。一种是加重ISR的激活，超出肿瘤细胞能够缓解应激的限制，然后诱导肿瘤细胞的凋亡；另一种是通过抑制ISR来阻断癌细胞对药物治疗的适应性，特别是原本高ISR活性的癌症或者在治疗过程中进化激活ISR的肿瘤类型。上述调节ISR的策略通常针对指示的eIF2α激酶或磷酸酶的活性，其中一些已经在临床研究中进行了评估。值得注意的是，最近开发的ISR抑制剂ISRIB直接结合到eIF2B上，并增强其活性，通过促进eIF2B的装配来抑制ISR。
肝癌在全球发病率排名第六，死亡率排名第三。超过50%的肝癌患者被诊断为晚期。尽管在预防和治疗方面取得了显著进展，包括免疫检查点抑制剂，但肝癌仍然是所有恶性肿瘤中预后最差的之一，相对5年生存率约为18%。晚期肝细胞癌（HCC）患者接受系统性治疗，如多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）或免疫治疗。索拉非尼是FDA批准的用于HCC治疗的第一个TKI，已经证明对晚期HCC患者具有明显的临床益处，并且仍然是晚期HCC治疗的主要一线药物之一。然而，大多数接受索拉非尼治疗的患者逐渐出现药物耐受性，并在治疗后6个月内由于癌细胞对环境干扰的适应，如低氧、营养不足、内质网（ER）应激等，导致疾病进展。迫切需要阐明索拉非尼耐药机制，并改善基于索拉非尼的治疗的临床结果。有趣的是，ISR的激活在适应细胞内外环境干扰方面起着重要作用，促进肿瘤细胞在应激下的存活，并与抵抗治疗有关。然而，ISR在肝癌中的调节作用和机制大部分尚不清楚。
发明内容
为克服上述的缺陷，本发明的发明人提供如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供OTUD3相关生物制品在制备抑制eIF2α磷酸化的制剂中的应用；所述的抑制为OTUD3与eIF2α直接相互作用，所述的应用为体外应用，所述的OTUD3相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体。
本发明的第二个方面是提供OTUD3相关生物制品在制备使eIF2α去泛素化的制剂中的应用；所述的抑制为OTUD3与eIF2α直接相互作用，所述的应用为体外应用；所述的OTUD3相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体。
本发明的第三个方面是提供OTUD3相关生物制品在制备抑制整合应激反应（ISR）的制剂中的应用；所述的OTUD3相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体。
在一个具体的实施方式中，所述的ISR为肝癌细胞中的ISR。
在另外一个具体的实施方式中，所述的应用为体外应用。
本发明的第四个方面是提供ISR抑制剂在制备提高肿瘤治疗的敏感性制剂中的应用；
所述的ISR抑制剂包括OTUD3相关生物制品或ISRIB，其中OTUD3的相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体。
在一个具体的实施方式中，所述的肿瘤为肝癌。
本发明的第五个方面是提供ISR抑制剂在制备提高肿瘤对化疗小分子药物的敏感性制剂中的应用，所述的ISR抑制剂为ISRIR或OTUD3相关生物制品，其中OTUD3相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体。
在一个具体的实施方式中，所述的化疗小分子药物为索拉非尼。
在另外一个具体的实施方式中，所述的肿瘤为肝癌。
本发明有益效果包括：
1）发现在肝癌组织阵列中发现OTUD3的下调，伴随着eIF2α磷酸化的上调，并且OTUD3表达的减少预示着不良预后。
2）OTUD3敲除小鼠更容易发生DEN诱导的急性肝损伤和癌症；
3）OTUD3下调导致ISR激活，并赋予肝癌细胞对索拉非尼的耐药性；OTUD3的异位表达通过抑制ISR信号重新塑造了肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。
即，本发明的发现和应用为肝癌的治疗提供了潜在的新策略。
附图说明
图1 OTUD3缺乏加重了DEN诱导的小鼠肝癌：(A) 实验方案示意图，描述了给予25mg/kg DEN后，两种基因型小鼠慢性DEN的实验概要； (B) 指示基因型小鼠出生后进行DEN注射，在小鼠40周获取肝脏，图示为代表性肝脏整体病灶图片（比例尺，1厘米）； (C)定量检测指定基因型小鼠血清ALT水平（每组5只小鼠）； (D) Otud3+/+和Otud3-/-小鼠40周（DEN注射后）每只小鼠肝脏中按大小分类的肿瘤数量（每组5只）；(E和F) DEN注射小鼠的代表性肝脏切片，经H.E.，AFP（E）或Ki67（F）染色（比例尺，100μm或50μm），以及AFP或Ki67的阳性染色面积百分比（每组5只）； (G) 实验方案示意图，描述了给予100 mg/kg DEN后，两种基因型小鼠急性DEN的实验概要（每组3只）； (H) DEN挑战前后48小时的血清ALT水平定量（每组3只）； (I) DEN注射后0、6、48、72小时的肝脏切片的代表性H.E.染色（比例尺，100μm）；(J)损伤区域百分比的定量（每组3只）。
图2 OTUD3缺乏加重了DEN诱导的小鼠肝癌和急性肝损伤：(A) 肝重体重（LW/BW）比率（每组5只）；(B) DEN注射后40周肝组织中Otud3的相对mRNA表达水平（每组5只）； (C)DEN注射后0、6、48、72小时肝组织中Otud3的相对mRNA表达水平（每组3只）； (D和E) DEN急性肝损伤小鼠的指示基因型的代表性肝脏切片，经过p-H2A.X（S139）和Ki67染色（比例尺，100 μm），以及p-H2A.X（S139）和Ki67阳性染色面积百分比（每组3只）。数据显示为平均值± 标准误差。使用未配对的双侧t检验。
图3 OTUD3缺乏增强的ISR信号通路促进了HCC的发展：(A) 在未注射DEN和注射DEN的肝组织中对GRP78、PTEN、β-actin和GAPDH进行免疫印迹分析；(B) 来自DEN注射小鼠的指示基因型的代表性肝脏切片，经eIF2α染色（比例尺，100μm），以及eIF2α阳性染色面积百分比（每组5只）；(C) 在DEN挑战后0、6、48、72小时的肝组织中对p-eIF2α（S51）、eIF2α、ATF4、ASNS、GRP78、PTEN、β-actin和GAPDH进行免疫印迹分析； (D-F) 来自DEN注射小鼠的指示基因型的代表性肝脏切片，经eIF2α、p-eIF2α（S51）和ASNS染色（比例尺，100μm），以及eIF2α、p-eIF2α（S51）和ASNS阳性染色面积百分比（每组3只）； (G和H) RT-PCR验证了Hep3B和HepG2细胞中OTUD3的沉默（G）和SK-Hep1和HepG2细胞中OTUD3的过表达（H）；数据显示为平均值 ± 标准误差。使用未配对的双侧t检验（B，D-F）和非参数的Mann-Whitney检验。
图4 OTUD3缺失激活ISR信号促进肝癌进展：(A) 在DEN处理前后肝组织中对指示蛋白进行免疫印迹分析；(B和C) DEN注射小鼠的指示基因型的代表性肝脏切片，经p-eIF2α（S51）和ASNS染色（比例尺，100μm），以及p-eIF2α（S51）和ASNS阳性染色面积百分比（每组5只）的计算；(D和E) 在shControl和shOTUD3 HepG2和Huh7细胞（D）以及Control和OTUD3过表达SKHep1和HepG2细胞（E）中对p-eIF2α（S51），eIF2α，OTUD3和β-actin进行免疫印迹分析；(F) 在HepG2细胞中使用BtdCpu（10 μM），Poly(I:C)（2 μg/mL），DTT（5 μM）或Histidinol（2 mM）处理4小时后对指示蛋白进行免疫印迹分析；(G) 不同病理学分级病例中肿瘤和匹配的邻近组织中OTUD3的免疫组化染色的代表性图像，左侧图像中的轮廓区域在右侧放大。A，邻近组织；C，癌组织。比例尺，50 μm；(H和I) 肝癌患者的总生存率Kaplan-Meier图（根据OTUD3表达水平中位数分成两组，n = 81），使用log-rank检验显示组间差异。(J) 不同病理学分级病例中肿瘤和匹配的邻近组织中p-eIF2α（S51）的免疫组化染色的代表性图像，左侧图像中的轮廓区域在右侧放大；(K和L) 肝癌患者的总生存率Kaplan-Meier图（根据p-eIF2α（S51）表达水平中位数分成两组，n = 81）；使用log-rank检验显示组间差异；(M) OTUD3与p-eIF2α（S51）蛋白水平的阳性相关性。
图5 OTUD3与eIF2α相互作用并去除eIF2α的泛素化：(A)转染了指示构建的HEK293T细胞裂解物经抗-Myc抗体免疫沉淀，然后用Flag-HRP和抗-Myc抗体进行印迹；(B)纯化的His-eIF2α与纯化的GST或GST-OTUD3孵育。混合物经GST拉陷和印迹；(C) 转染了指示构建的HepG2细胞进行定位分析，比例尺，10 μm； (D和E) 使用指示抗体对Hep3B细胞内源蛋白进行共免疫沉淀分析；(F) 在HepG2细胞中进行OTUD3和eIF2α的免疫荧光共染色以检测共定位；比例尺，上面板，10 μm，下面板，5 μm；(G) OTUD3和eIF2α结构的概述；(H和I)转染了指示构建的HEK293T细胞经抗-Myc（H）和抗-Flag（I）抗体免疫沉淀；然后用印迹法对裂解物和免疫沉淀物进行印迹；(J) 转染了指示构建的HEK293T细胞在收集前用MG132处理8小时。全细胞裂解物经NTA珠拉陷，洗脱物用抗-Myc和抗-His抗体进行印迹以检测泛素化的eIF2α；(K和L) Hep3B细胞稳定沉默OTUD3（K）或过表达OTUD3/OTUD3（C76A）（L）在收集前用MG132处理8小时；然后，全细胞裂解物经抗-eIF2α免疫沉淀，并用抗-泛素和抗-eIF2α抗体进行印迹以检测泛素化的eIF2α。
图6 OTUD3与eIF2α相互作用并去泛素化eIF2α：(A) 转染了指示构建的HEK293T细胞裂解物经抗-myc抗体免疫沉淀，然后用抗-Flag和抗-Myc抗体进行印迹；(B)转染了指示构建的HEK293T细胞在收集前用MG132处理8小时，全细胞裂解物经NTA珠拉陷，并用抗-Myc和抗-His抗体进行印迹以检测泛素化的eIF2α；(C) 转染了指示质粒的HEK293T细胞在收集前用环己亚胺（10 μg/mL）处理，并在指定的时间收集进行西方印迹；(D) 将不同数量的OTUD3转染到HEK293T细胞中，检测eIF2α的表达；(E) 转染了指示构建的HEK293T细胞在收集前用MG132处理8小时，eIF2α被抗-Myc免疫沉淀，并用抗-HA免疫印迹。然后用抗-Myc和抗-HA抗体进行西方印迹以检测泛素化的eIF2α。
图7 TRAF6介导的eIF2α泛素化修饰促进其被EIF2AK3磷酸化：(A) eIF2α的STRING蛋白相互作用网络（https://string-db.org/）；(B和C) 使用指示抗体对Hep3B细胞内源eIF2α和TRAF6进行共免疫沉淀分析；(D和E) 转染了指示构建的HEK293T细胞在收集前用MG132处理8小时；全细胞裂解物经NTA珠拉陷，并用抗-Myc和抗-His抗体进行印迹以检测泛素化的eIF2α；(F) EIF2AKs的结构域组织；(G和H) 转染了指示构建的HEK293T细胞经抗-Myc（G）和抗-Flag（H）抗体免疫沉淀；然后用印迹法对裂解物和免疫沉淀物进行印迹；(I)使用抗-GFP对稳定过表达GFP标记的野生型或突变型eIF2α的HepG2细胞中的eIF2α（WT）或eIF2α（K0）（赖氨酸无突变体）和EIF2ΑKs进行共免疫沉淀分析。
图8 OTUD3降低EIF2AK3与eIF2α之间的亲和力：(A) 转染了指示质粒的Hep3B细胞在收集前用环己亚胺（10 μg/mL）处理，并在指定的时间收集进行西方印迹；(B)将不同数量的TRAF6转染到HEK293细胞中，检测eIF2α的表达；(C)转染了指示构建的HEK293T细胞在收集前用MG132处理8小时。eIF2α被抗-Myc免疫沉淀，并用抗-HA进行印迹。然后用抗-Myc和抗-HA抗体进行西方印迹以检测泛素化的eIF2α；(D)转染了指示质粒的HEK293T细胞在收集前用环己亚胺（10 μg/mL）处理，并在指定的时间收集进行西方印迹；(E)将不同数量的TRAF6转染到HEK293细胞中，检测EIF2AK1、EIF2AK2、EIF2AK3、EIF2AK4、PPP1R15A、PPP1R15B和eIF2α的表达；(F-J) 对转染了表达Flag-eIF2α、Myc-EIF2AKs/PPP1R15A/PPP1R15B和不同量的GFP-TRAF6的HEK293T细胞进行共免疫沉淀和免疫印迹分析；(K) 转染了指示质粒的HEK293T细胞在收集前用环己亚胺（10 μg/mL）处理，并在指定的时间收集进行西方印迹；(L) 将不同数量的OTUD3转染到HEK293T细胞中，检测EIF2AK1、EIF2AK2、EIF2AK3、EIF2AK4、PPP1R15A、PPP1R15B和eIF2α的表达；(M-Q) 对转染了表达Flag-eIF2α、Myc-EIF2AKs/PPP1R15A/PPP1R15B和不同量的GFP-OTUD3的HEK293T细胞进行共免疫沉淀和免疫印迹分析。
图9 ISR抑制增强了肝癌细胞对索拉非尼的治疗敏感性：(A和B)在Sorafenib指定浓度（A）或指定时间（10 μM）（B）处理后，HepG2细胞中磷酸化-eIF2α、总eIF2α和ATF4的免疫印迹分析；(C) HepG2细胞在处理/未处理Sorafenib（20 μM）12小时后的磷酸化-eIF2α的免疫荧光；(D) 过表达野生型或突变的eIF2α在丝氨酸51位点（丝氨酸至丙氨酸，S51A）的HepG2细胞被培养与Sorafenib（20 μM）12小时后通过免疫印迹分析；(E和F)过表达野生型或突变型eIF2α（S51A）的HepG2细胞在Sorafenib（20 μM）孵育条件下的相对生长曲线（E）和克隆形成（F）；(G) 用shRNA敲除指示的eIF2α激酶的HepG2细胞受Sorafenib（20 μM）刺激12小时后，蛋白质裂解物通过免疫印迹分析检测指示的蛋白；(H) HepG2 shControl细胞和HepG2 shEIF2ΑK3细胞的剂量反应；(I) 来自人类LIHC样本的TCGA数据库的EIF2ΑK3mRNA表达水平分析；(J) HepG2细胞在指示的时间内用ISRIB（0.5 μM）或/和Sorafenib（20μM）孵育后，通过免疫印迹分析检测指示的蛋白质裂解物；(K 和 L) HepG2细胞在ISRIB（0.5 μM）或/和Sorafenib（20 μM）存在下的生长曲线（K）和克隆形成（L）。
图10 封闭eIF2α的泛素化修饰增强了肝癌细胞对索拉非尼的敏感性：(A) HepG2细胞稳定过表达GFP标记的eIF2α野生型或eIF2α K0（赖氨酸无突变体），然后用Sorafenib（20 μM）处理48小时，显示相对细胞存活率；(B) 在Sorafenib存在（20 μM）或不存在的情况下，HepG2细胞稳定过表达GFP标记的野生型eIF2α或eIF2α K0的克隆形成。
图11 OTUD3过表达增强了肝癌细胞对索拉非尼的敏感性拉非尼的敏感性：(A) 不同肝细胞癌细胞系中OTUD3的免疫印迹；(B) 在索拉非尼（25μM）处理的Hep3B和HepG2细胞中的OTUD3的免疫印迹，显示了不同时间点；(C和D) 表达OTUD3的HepG2细胞（C）或敲低OTUD3的细胞（D）被处理不同浓度的索拉非尼（0.25μM，2.5μM，25μM），并且通过免疫印迹分析所示蛋白质；(E) HepG2细胞（shControl和shOTUD3）在处理/未处理索拉非尼（20μM）12小时后的磷酸化eIF2α的免疫荧光；(F) 表达OTUD3的SK-Hep1和HepG2细胞在索拉非尼（20μM）处理12小时后的相对细胞存活率；(G) 在存在索拉非尼（20μM）或不存在情况下表达OTUD3的SK-Hep1和HepG2细胞的克隆形成；(H) 显示了动物实验的时间线和程序的示意图；(I)在指定的时间点测量肿瘤体积；(J-L) 来自每个组的表达mCherry（红色）的肿瘤通过活体成像可视化（J），然后剥离肿瘤（K），并且称重（L）；(M) 肿瘤组织中所示蛋白质的免疫印迹。
图12 肝癌细胞中OTUD3的表达水平与其对索拉非尼的治疗敏感性正相关：(A)Hep3B、Huh7、SK-Hep1、PLC/PRF/5、MHCC97H和HepG2细胞在索拉非尼（5μM）存在与否条件下的生长曲线；(B) 在不同浓度索拉非尼存在下，Hep3B、Huh7、SK-Hep1、PLC/PRF/5、MHCC97H和HepG2细胞的克隆形成；(C) 在索拉非尼（20μM）处理后，Hep3B和HepG2细胞中OTUD3的相对mRNA表达水平；(D) 敲低OTUD3的Hep3B和Huh7细胞在索拉非尼（20μM）处理24小时后，相对细胞存活率；(E) 在存在索拉非尼（20μM）或不存在情况下，Hep3B和Huh7细胞敲低OTUD3后的克隆形成。使用未配对的双侧t检验（C和D）。
图13 OTUD3通过抑制整合应激通路增强了索拉非尼的化疗敏感性：(A) HepG2shControl和shOTUD3细胞稳定表达GFP标记的野生型或突变型eIF2α（S51A），经过索拉非尼（20μM）处理12小时后，通过免疫印迹分析了所示蛋白；(B) 每个细胞系在索拉非尼（20μM）处理24小时后的相对细胞存活率。数据表示为均值±标准误差，n=4个生物学独立样本；(C)在存在索拉非尼（20μM）或不存在情况下，每个细胞系的克隆形成；(D) HepG2 shControl和shOTUD3细胞被分别培养与ISRIB（0.5μM）或/和索拉非尼（20μM）处理12小时，通过免疫印迹分析所示蛋白；(E) HepG2 shControl和shOTUD3细胞在ISRIB（0.5μM）或/和索拉非尼（20μM）处理24小时后的相对细胞存活率；数据表示为均值±标准误差，n=4个生物学独立样本；使用未配对的双侧t检验（B和E）。
图14 裸鼠体重波动曲线：经索拉非尼治疗的裸鼠体重波动曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
一、实施例中采用的实验材料和处理方法
1、动物模型 Otud3-/-小鼠是根据之前的描述（Du等人，2019年）生成和基因分型的。Otud3-/-小鼠和同窝的野生型（WT）C57BL/6小鼠在特定病原体无菌条件下繁殖和饲养于动物实验设施中。所有实验均在北京生命组学研究所的动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行。
2、细胞系 HEK293T、Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC-LM3、SK-Hep1、PLC/PRF/5 和HepG2 细胞系均来源于美国类型培养物集合（ATCC），在含有 10% FBS（PAN）和100U/ml 青霉素-链霉素（Cellworld）的 DMEM（Gibco）培养基中培养，并在 37 ℃、5% CO2 培养箱中维持。
3、小鼠处理
通过尾部基因组DNA的PCR（聚合酶链反应）鉴定了所有小鼠。从尾部提取了基因组DNA。对于动物实验，相同基因型的小鼠被随机分配到实验组并加工处理。通过给予出生后15天的Otud3-/-和同胞WT雄性小鼠单次腹腔注射肝癌诱导剂二乙基亚硝胺（DEN，N0258，Sigma-Aldrich）（溶解在0.9%生理盐水中的25 mg/kg DEN），诱导了肝细胞癌。小鼠在注射后40周被安乐死。在DEN诱导的急性肝损伤模型中，DEN（100 mg/kg）被腹腔注射到8周龄的雄性小鼠体内。在指定的时间点处置小鼠。
4、病毒包装和细胞系构建。
pLKO-puro载体被用作敲除特定基因的骨架。pCDH-puro载体或pQCXIH载体被用于过表达基因。携带目标基因的载体、pSPAX.2和pMD.2G被共转染到HEK293T细胞中24小时，然后收集细胞培养基。在存在聚苯乙烯磺酸盐的情况下，使用病毒感染细胞2天。病毒感染的细胞在含有波莱霉素或海霉素B的培养基中培养，以选择稳定细胞系。通过Westernblotting验证稳定敲除或过表达。
5、RT-qPCR 使用TriZol试剂（Invitrogen, 15596026）按照制造商的说明书提取总细胞RNA。将5微克总RNA反转录为cDNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit（TOYOBO，FSQ-201）。使用SYBR Green qPCR Master Mix（GenStar，A301-05）进行qPCR。
6、细胞存活率检测
细胞增殖通过96孔板的细胞生长曲线分析（每孔2000个细胞）和6孔板的克隆形成分析（每孔500个细胞）进行检测。对于细胞生长曲线分析，细胞在指定时间内培养，将细胞计数试剂盒-8（LABLEAD, CK001-500T）加入孔中1小时，然后在450 nm处测量细胞数。对于克隆形成分析，培养的细胞用PBS中含有4%的对甲醛固定15分钟，然后用结晶紫溶液（25%甲醇中的0.5%结晶紫）染色5分钟。
7、细胞系来源的异种移植小鼠模型（CDX）
从Vital River（中国北京）购买了BALB/c裸鼠（5-6周龄，体重18-19克，全部为雄性）。将稳定表达mCherry或mCherry-OTUD3的HepG2细胞（每只小鼠4×106个细胞）悬浮在含有50%基质胶（BD Biosciences）的无血清培养基中，皮下注射到BALB/c裸鼠的腹侧。将带瘤的小鼠分为四组（n = 6），并按照指示时间进行索拉非尼处理。使用数字卡尺每日测量肿瘤大小，按照公式0.52 × (L × W2)计算，其中L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度。在研究结束时，使用IVIS Spectrum（PerkinElmer）可视化肿瘤，然后处置小鼠并取出肿瘤进行称重。
8、组织学和免疫组化
肝组织用4%对甲醛固定24小时，并使用标准程序包埋在石蜡中。切片（厚度4μm）切割并用苏木精和伊红染色进行标准显微镜检查。从上海OUTDO Biotech公司购买的肝组织微阵列（HLivH180Su10-T-019），包含81对肝癌瘤样本和相匹配的邻近正常肝组织。对于免疫组化，将切片脱脂，用EDTA（pH 8.0）（OriGene，ZLI-9066，1:50）在微波中进行12分钟的抗原修复，用PBS漂洗，用3% H2O2孵育20分钟，然后在37℃下用5%正常山羊血清（Solarbio，SL038，1:20）阻断30分钟，然后在4℃过夜孵育anti-eIF2α（CST，#5324，1:3000）、anti-pSer51-eIF2α（CST，#3398，1:50）、anti-ASNS（CST，#92479，1:500）、anti-Ki67（CST，#12202，1:500）和anti-Phospho-Histone H2A.X（Ser139）（CST，#9718，1:500）抗体。根据制造商的说明书，使用二氨基苯酚系统（ZSGB-BIO，ZLI-9018）进行信号增强和检测。采用德国半定量评分系统，该系统广泛接受，考虑了染色的强度和区域范围。根据核、胞质和/或膜染色的强度为每个标本分配一个分数（无染色D 0；轻染色D 1，中度染色D 2，强染色D 3）以及染色细胞的程度（0% D 0，1-24% D 1，25-49% D 2，50-74% D 3，75-100% D 4）。最终的免疫反应评分通过将强度分数与染色细胞的程度分数相乘来确定，范围从0（最小）到12（最大）。
9、免疫荧光
在玻璃片上培养的细胞用冷PBS洗涤，并用PBS中含有4%对甲醛固定15分钟。细胞用PBS洗涤3次后，在室温下用PBS中含有0.2% Triton X-100处理10分钟，然后细胞在阻断缓冲液中（PBS中含有5%山羊血清）阻断1小时。之后，细胞在4℃过夜孵育于稀释在阻断缓冲液中的一抗抗体。随后，细胞用PBS洗涤3次，并在含有二抗抗体和2μg/ml DAPI（Sigma）的阻断缓冲液中孵育1小时。最后，细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后用尼康A1共聚焦显微镜成像。
10、免疫沉淀和免疫印迹
根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）试剂转染指定的质粒到细胞中。对于免疫沉淀实验，细胞用含有蛋白酶抑制剂混合物（Biotool）的NP40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1% NP40，0.5% deoxycholate）裂解。使用指定的一抗抗体和蛋白A/G琼脂糖珠（Santa Cruz，SC-2003）在4℃下进行免疫沉淀。然后用1000 μl NP40裂解缓冲液洗涤免疫复合物四次。使用指定的一抗抗体检查裂解液和免疫沉淀物，然后使用相关的二抗抗体和SuperSignal西部Pico化学发光底物（ThermoScientific）进行检测。
11、谷胱甘肽S-转移酶（GST）-pulldown实验
为了确认eIF2α与OTUD3的相互作用，进行了GST拉陷实验。分别在大肠杆菌（BL21）中表达带有His标签的eIF2α蛋白、带有GST标签的OTUD3蛋白和GST标签蛋白。细菌表达的GST或GST-OTUD3蛋白被固定在谷胱甘肽琼脂糖4B珠（GE Healthcare，英国）上并洗涤，然后，珠子与His-eIF2α蛋白孵育，该蛋白已经通过Ni-NTA琼脂糖珠（QIAGEN，德国）纯化，孵育3小时于4°C，并用His洗脱缓冲液[20 mM磷酸钠，500 mM NaCl和500 mM咪唑酮（pH 7.3）]洗脱。珠子用GST结合缓冲液（100 mM NaCl，50 mM NaF，2 mM EDTA，1% NP-40和蛋白酶抑制剂混合物）洗脱以去除未结合的蛋白质。相互作用的蛋白质通过50 μL的GST洗脱缓冲液[10mM谷胱甘肽（pH 8.0）]洗脱，并且洗脱的溶液经过免疫印迹分析。
12、体内修饰实验
细胞在改良的裂解缓冲液中溶解（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，10% 甘油，1mM EDTA，1 mM EGTA，1% SDS，1 mM Na3VO4，1 mM DTT和10 mM NaF），并加入蛋白酶抑制剂混合物。在向细胞裂解液中加入指定的抗体之前，在4℃孵育4小时，然后加入蛋白A/G-plus琼脂糖珠（Santa Cruz, sc-2003）。然后，裂解液在4℃轻轻旋转8小时。用洗涤缓冲液（50mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，10% 甘油，1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.1% SDS，1 mM DTT和10mM NaF）至少洗涤三次。使用指定的抗体进行Western blot分析蛋白质。
13、通过Ni-NTA柱His-pulldown实验
将细胞收集并悬浮于结合缓冲液（缓冲液A：6 M盐酸胍，0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4，0.01 M Tris（pH 8.0），10 mM β-巯基乙醇，5 mM NEM，5 mM 咪唑酮）中，并与Ni2+-NTA超流动柱（QIAGEN，17-5318-02）在4°C孵育8小时。His拉陷产物在缓冲液A中顺序洗涤一次，缓冲液A/TI混合物中洗涤两次（缓冲液A：缓冲液TI = 1:3），并在缓冲液TI中洗涤一次[25 mMTris-HCl和20 mM 咪唑酮（pH 6.8）]。聚泛泛素化蛋白通过SDS-PAGE分离进行Westernblot分析。
14、数据分析
统计分析使用GraphPad Prism V.7.00软件（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行。对于两组之间的比较，使用参数的Student's t检验或非参数的Mann-Whitney检验。当比较两组以上时，使用一元方差分析结合Tukey's事后检验或Kruskal-Wallis检验结合Dunn's多重比较检验。对于相关性分析，使用非参数的Spearman's相关性检验。在图中以*, **, ***, ****表示显著性差异，对应P值小于0.05、小于0.01、小于0.001和小于0.0001。
二、实验结果
实施例1 OTUD3缺陷加速DEN诱导的肝癌进展
1、为了更好地理解OTUD3在体内的生理和病理功能，引入了DEN诱导的HCC模型来研究OTUD3在肝癌中的功能（图1A）。
1）在DEN诱导后40周的时间点，收集肿瘤组织，并发现OTUD3的表达明显下调（图2A）。
2）与Otud3+/+小鼠相比，OTUD3敲除小鼠在9个月时发展出更严重的肿瘤，并显示出增加的肝体重比、血清ALT水平和总肝肿瘤计数（图1B-D和图2B）。
3）OTUD3缺陷导致HCC携带小鼠中肿瘤细胞增殖增强，如AFP和Ki67染色所示（图1E，F）。这些结果表明OTUD3在体内是肝癌的抑制因子。
2、为了探究OTUD3对DEN诱导的急性肝损伤的易感性和保护作用，在雄性Otud3-/-小鼠及其同胞中进行了6至72小时DEN诱导的急性肝损伤的时间序列研究（图1G）。
1）在DEN诱导的急性肝损伤期间，OTUD3的表达逐渐下调，这是HCC形成的早期过程（图2C）。此外，OTUD3敲除小鼠出现了更严重的肝损伤，伴随着更高的ALT水平（图1H）和更多的肝损伤面积（图1I），而在指定的时间点，Otud3-/-和Otud3+/+小鼠的DNA损伤（p-H2A.X(S139)-阳性细胞）或细胞增殖（Ki67-阳性细胞）之间没有显著差异（图2D，E）。这些结果表明OTUD3保护肝脏免受DEN后急性损伤，但其调节机制尚不清楚。
实施例2 OTUD3缺陷增强的ISR信号传导促进了HCC的进展
1、为探究OTUD3缺陷如何危及肝组织受伤和肿瘤发生，首先评估了PTEN和GRP78的表达，在之前的研究中已确定它们是OTUD3的底物，并参与了肿瘤发生。
1）在Otud3-/-和Otud3+/+小鼠的DEN诱导HCC组织中，PTEN和GRP78的表达略高，并且它们的表达似乎与DEN处理无关（图3A）。
2）为了确定OTUD3是否参与DEN诱导的ISR激活，收集并分析来自Otud3-/-和Otud3+/+小鼠的DEN诱导HCC组织。结果显示，OTUD3缺陷进一步增强了eIF2α的磷酸化（图4A、B和图3B），以及肿瘤组织中下游的ATF4和ASNS的表达（图4A、C）。值得注意的是，OTUD3缺陷在DEN后急性肝损伤期间一直导致ISR的过度激活（图3C-F）。这些结果表明OTUD3抑制了ISR，这可能有助于抑制肝癌的发展。
3）为了探究OTUD3和ISR之间的功能联系，使用肝癌细胞系进行验证。通过shRNA敲低OTUD3引起了eIF2α的磷酸化增加（图4D和图3G），而OTUD3的过表达在各种刺激下显著降低了ISR的激活（图4E、F和图3H），这表明OTUD3是ISR的上游调节因子。
4）为进一步确认OTUD3与ISR在肝癌中的相关性，利用了一个包含81个晚期HCC样本的组织微阵列队列。肿瘤组织阵列的免疫组化分析显示，与相邻组织相比，OTUD3表达下调，而p-eIF2α(Ser51)水平在癌症中上调（图4G、H、J、K）。此外，患有OTUD3水平相对较低的肿瘤的患者的总体生存率较患有高OTUD3水平的肿瘤的患者更差（图4I），而p-eIF2α(Ser51)水平高的患者显示出更差的总体生存率（图4L）。此外，连续组织切片的分析还显示OTUD3与p-eIF2α(Ser51)的表达呈负相关（图4M）。
实施例3 OTUD3与eIF2α相互作用并去除其K27链型的多聚泛素化
1）揭示OTUD3抑制ISR的分子机制。在先前的研究中利用质谱分析发现，eIF2α、eIF2β和eIF2γ被鉴定为OTUD3的潜在直接或间接相互作用蛋。为了确认OTUD3与eIF2三个亚基的物理相互作用，在培养细胞中进行了外源共免疫沉淀（Co-IP）实验，结果显示OTUD3特异性地与eIF2α相互作用（图5A）。
2）纯化的GST-OTUD3蛋白，能够在无细胞条件下与His-eIF2α相互作用（图5B），表明eIF2α与OTUD3之间存在直接相互作用。
3）从Hep3B细胞裂解液中共免疫沉淀了内源性OTUD3和eIF2α（图5D，E）。
4）通过共定位分析进一步确认了eIF2α与OTUD3的相互作用（图5C，F）。在检测的12种OTU去泛素化酶中，OTUD3和OTUD7B可以与eIF2α相互作用（图6A）。然而，只有OTUD3而不是OTUD7B能够去泛素化eIF2α（图6B）。
5）与OTUD3结合的eIF2α区域进行了映射，发现eIF2α的C末端区域（aa 86-315）对与OTUD3的相互作用至关重要（图3G，H）。类似地，OTUD3的N末端OTU区域（aa 1-183）介导了与eIF2α的物理相互作用（图5G，I）。这些结果表明eIF2α是OTUD3的真正相互作用蛋白。
6）为了确定OTUD3对eIF2α可能的调节作用，在Hep3B细胞中过表达了野生型（WT）OTUD3或催化活性失活的C76A突变体。发现WT OTUD3，能够减少eIF2α的泛素化（图5J），表明OTUD3以酶活性依赖的方式去除eIF2α的泛素化。通过比较对照和OTUD3缺乏细胞，验证OTUD3能够去除内源性eIF2α的泛素化（图5K）。相反，OTUD3的敲低增加了eIF2α的泛素化（图5L）。尽管先前的研究表明OTUD3稳定其底物，发现OTUD3无法调节eIF2α蛋白的稳定性（图6C，D）。
7）为了进一步了解OTUD3去泛素化eIF2α的细节，对一系列泛素突变体进行了OTUD3去泛素化eIF2α的彻底分析。结果显示，OTUD3特异性地去除了K27链联的泛素链（图6E），提示OTUD3可能通过去除eIF2α的非降解泛素链来调节ISR。
实施例4 OTUD3介导的eIF2α去泛素化抑制了它被EIF2AK3磷酸化
1）利用蛋白质相互作用数据库发现，在www.ebi.ac.uk/intact中，属于RING指环型E3连接酶家族的E3连接酶TNF受体相关因子6（TRAF6）被预测为eIF2α的相互作用蛋白。利用STRING展示了eIF2α的蛋白质相互作用网络（图7A）。
2）为了验证TRAF6与eIF2α之间的相互作用，转染了指示性质粒体到HEK293T细胞中，并进行了共免疫沉淀实验。显然，TRAF6和eIF2α蛋白彼此之间相互共免疫沉淀（图7B，C），泛素化实验显示TRAF6 WT，而不是丧失E3连接酶活性的TRAF6 C70A突变体，促进了eIF2α的泛素化（图7D）。
3）实验发现TRAF6不调节eIF2α的蛋白稳定性（图8A，B），而是催化eIF2α的K27链连接泛素化（图8C）。值得注意的是，OTUD3拮抗了TRAF6催化的eIF2α的泛素化（图7E）。
4）检查TRAF6和OTUD3是否影响了eIF2α的激酶或磷酸酶的招募。结果发现，TRAF6显著增强了（图7F），而OTUD3抑制了（图7G）EIF2ΑK3和eIF2α之间的结合，共免疫沉淀实验显示，eIF2α可以比eIF2α赖氨酸突变体结合更多的EIF2ΑK3（图7H）。TRAF6（图8D，E）和OTUD3（图8K，L）不影响EIF2ΑKs，PPP1R15A和PPP1R15B的蛋白水平(图8F-J,M-Q)。综上所述，实验证明了OTUD3介导的eIF2α去泛素化抑制了它被EIF2ΑK3磷酸化。
实施例5 ISR抑制增强索拉非尼治疗敏感性
1）探讨索拉非尼(sora)治疗与ISR之间的相关性。索拉非尼治疗以一种时间和浓度依赖的方式引起了肝癌细胞中eIF2α的磷酸化和ATF4蛋白水平的增加（图9A，B），这通过p-eIF2α的免疫荧光进一步得到证实（图9C）。
2）假设对抗ISR可能有助于克服肝癌对索拉非尼的抗性。为了研究ISR抑制对索拉非尼治疗后肝癌细胞的影响，采用eIF2α S51A突变体，这是一种竞争性突变体，与内源性eIF2α结合到激酶，然后抑制ISR，以检验ISR在HCC细胞对索拉非尼的响应中的作用。显然，在索拉非尼存在的情况下，外源性表达的eIF2α S51A抑制了索拉非尼诱导的ISR活化以及HepG2细胞的生长（图9D-F）。
3）四种专门的激酶（EIF2ΑK1，EIF2ΑK2，EIF2ΑK3和EIF2ΑK4）负责感知各种压力并汇聚于eIF2α的磷酸化以激活ISR。为了筛选特异性响应索拉非尼刺激并激活ISR的激酶，分别敲除了四个指示的激酶，然后检查细胞对索拉非尼治疗的响应。结果显示敲除EIF2ΑK3，而不是其他激酶，特异性地破坏了eIF2α的磷酸化和ATF4蛋白在索拉非尼刺激下的升高（图9G）。
3）敲除EIF2ΑK3增强了索拉疗的效果（图9H）。K27-链多泛素化的eIF2α作为连接物，将EIF2ΑK3带到eIF2α附近并激活ISR检测到赖氨酸突变体eIF2α-K0（所有赖氨酸突变为精氨酸）阻止了HepG2细胞对索拉非尼的抗性（图10A，B）。此外，通过TCGA数据库，发现EIF2ΑK3在晚期HCC患者中上调（图9I）。这些结果表明，对抗ISR可能有助于克服索拉非尼的抗性。
4）应用ISR抑制剂ISRIB来抑制ISR，发现ISRIB治疗限制了索拉非尼诱导的eIF2α的磷酸化和ATF4的表达（图9J），并显著增强了索拉非尼的效果（图9K，L）。综上所述，实验证明了肝癌细胞通过激活ISR来缓解索拉非尼的杀伤作用，而ISR抑制是增强索拉非尼治疗的潜在途径。
实施例6 OTUD3增加了人类肝细胞癌对索拉非尼的敏感性
探究OTUD3在索拉非尼治疗过程中的功能。
1）在比较了几种肝癌细胞系对索拉非尼的敏感性后，分析了OTUD3在其中的表达。OTUD3表达相对较高的Hep3B和Huh7细胞对索拉非尼更为敏感（图11A和图12A、B）。
2）索拉非尼治疗降低了Hep3B和HepG2细胞中OTUD3的表达（图11B和图12C），提示OTUD3是一种正调节因子，增强了肿瘤细胞对索拉非尼的敏感性。
3）为了验证，通过改变肝癌细胞中OTUD3的表达，并检查了它们对索拉非尼的敏感性。如预期，OTUD3的过表达显著抑制了HepG2细胞中索拉非尼诱导的eIF2α磷酸化和ATF4蛋白升高（图11D），而OTUD3的沉默促进了这一过程（图11C），这在p-eIF2α的免疫荧光中得到了进一步确认（图11E）。在功能上，沉默OTUD3使Hep3B和Huh7细胞对索拉非尼变得更为耐药（扩图12D），而过表达OTUD3使SK-Hep1和HepG2细胞对索拉非尼更为敏感（图11F）。
4）沉默OTUD3的Hep3B和Huh7细胞在索拉非尼的存在下更为活跃，并且在此情况下仍能形成更多的克隆体（图12E），而过表达OTUD3的SK-Hep1和HepG2细胞在索拉非尼治疗下几乎不形成克隆体（图11G）。
5）为了评估OTUD3是否通过调节ISR来增加索拉非尼的药物敏感性，通过在OTUD3下调的HepG2细胞中过表达eIF2α S51A突变体来阻断ISR，并观察到ISR的抑制减轻了OTUD3减少引起的索拉非尼耐药性（图13A-C）。还通过ISRIB在HepG2细胞中阻断ISR通路，并检测索拉非尼耐药性。如预期，ISRIB处理消除了OTUD3下调引起的索拉非尼耐药性（图13D、E），表明OTUD3通过抑制ISR信号传导来赋予肝癌细胞对索拉非尼的化疗敏感性。
6）评估OTUD3对细胞系来源的移植瘤（CDX）模型中索拉非尼治疗的影响（图11H）。OTUD3过表达联合索拉非尼治疗在这些CDX小鼠模型中没有明显的副作用，这表现在小鼠体重没有显著差异（图14）。OTUD3的过表达显著抑制了裸鼠异种移植瘤的生长，并且联合索拉非尼治疗进一步抑制了肿瘤生长（图11I-L）。
7）评估由OTUD3过表达引入的HepG2细胞的裸鼠中OTUD3与p-eIF2α/ATF4的相关性。如预期，OTUD3过表达的异位移植瘤中p-eIF2α的水平降低（图11M）。这些结果表明，OTUD3的表达增加了人类肝细胞癌对索拉非尼的化疗敏感性。
综上，索拉非尼治疗降低了OTUD3的表达水平，导致eIF2α的K27连接泛素化的累积和随后的ISR激活，最终促进了肝癌细胞对索拉非尼的耐药性。OTUD3-eIF2α轴介导了索拉非尼的耐药性，可能解释了OTUD3表达低或p-eIF2α水平高的肝癌患者预后不佳。此外，这里确定的联合治疗可能代表了一种有前景的索拉非尼耐药性策略。这项研究为随后的临床试验提供了理论基础。
Claims (1)
1.整合应激反应抑制剂在制备提高肿瘤治疗的敏感性制剂中的应用；
其中所述的整合应激反应抑制剂为OTUD3相关生物制品，其中，
所述的OTUD3相关生物制品为：
1）编码OTUD3的核酸分子；
2）OTUD3的蛋白分子；
3）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；
4）含有1）所述的编码OTUD3核酸分子或含有3）所述表达盒的载体；所述的肿瘤为肝癌；所述的肿瘤治疗为小分子药物索拉非尼的治疗。
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| PERK/ATF4-Dependent ZFAS1 Upregulation Is Associated with Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma Cells;Jiunn-Chang Lin等;《Int. J. Mol. Sci.》;20210529;2.4，图7 * |
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