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CN118272556B - 用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光pcr多重检测体系、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光pcr多重检测体系、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系，所述荧光PCR多重检测体系包括多个探针和多个引物组，进行荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测，实现单个通道中多种靶标检测分析。所述荧光探针扩增检测体系和荧光引物熔解曲线分析检测体系所包含的引物探针组中的上、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~22所示。本发明还公开了一种试剂、试剂盒或产品，包含上述的荧光PCR多重检测体系。本发明还公开了上述荧光PCR多重检测体系、试剂/试剂盒/产品在呼吸道细菌靶标核酸多联检中的应用，以及一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的检测方法。

Description

用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系、试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR体系、试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道感染（Respiratory Tract Infections）是指病原体从人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等部位侵入并进行繁殖，导致的有传染性的疾病，是一种常见的感染性疾病。据WHO报告，下呼吸道感染是世界上最致命的传染病，是引起死亡的第四大死因，2019年全球近260万人死亡。由此可见，呼吸道感染依然是全球面临的巨大挑战。能够感染呼吸道的细菌种类繁多，并且通过常规方法难以快速有效的鉴定其种类。
目前，检测感染呼吸道细菌的方法主要包括培养鉴定、免疫血清学分析和核酸检测。核酸检测相对于培养鉴定和免疫血清学分析而言，具备检测快速、操作简便、特异性好等显著优点。因此，国内外大量文献和专利均已报道，采用核酸检测方法来鉴定感染呼吸道的细菌的种类。在此基础上，大部分的核酸检测方法都会采用多重PCR扩增技术来提高检测方法的效率和灵敏度。实时PCR是用于检测核酸的一种常用方法，其操作简便，应用广泛。并且，通过利用多重实时PCR，可在单个反应管内同时检测多个靶序列，这不仅提高了检测效率，也降低了成本。然而，基于荧光探针检测的多重实时PCR也存在一些问题。首先，荧光探针的制备涉及复杂的化学修饰和纯化过程，其成本大大高于非标记探针。因此，多个荧光探针的使用会导致检测成本的增加。其次，在多重荧光PCR法中，多个荧光探针的共存会使反应体系的背景荧光增加，进而导致检测灵敏度的下降。因此，需要对多重实时PCR法进行改进，以期通过尽可能少的荧光探针来检测尽可能多的靶序列。此外，虽然荧光定量PCR在过去的几十年里得到了飞速的发展，已经渗透到生物技术开发的各行各业，但随着生物检测技术要求越来越高，该技术也暴露出了很多亟待解决的问题，如现有的常用荧光定量仪器检测通道为4个，单管检测的靶基因数量一般也为3-4个，这也成为多重荧光PCR检测的瓶颈。而对于更多的病原体检测往往需要更多管试剂，给临床检测带来更高的成本和不便性。因此需要开发一种容纳更多检测靶标，操作更方便，检测更快捷，且灵敏度和特异性更高的产品，用于呼吸道感染性疾病的快速诊断。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系及其应用的试剂盒，能够联合检测多种呼吸道细菌，所述荧光PCR多重检测体系及试剂盒包括多个探针、引物组及多重扩增反应体系，通过设计的探针和引物组分别实现荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测，特别是对于单个荧光检测通道，一个靶标采用荧光探针检测，其余靶标采用荧光引物熔解曲线检测，即可在同一通道中同时实现1、2或更多个靶标的荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线检测分析。
本发明体系构建过程中对各个靶标引物组之间的比例进行了优化，在70-200 nM范围内实现最优体系。当引物比例非最优比例时，即低于70 nM或高于200 nM，会导致非特异熔曲峰产生。例如图20，在鲍曼不动杆菌的熔曲峰前后出现CY5/FAM的非特异熔曲峰。本发明使用的程序，其熔解曲线Tm值从68℃-90℃，在此温度范围内，熔曲峰尖锐，峰底Tm跨度4-5℃。避免了同一通道不同靶标之间的熔曲峰产生交叠，同时也能实现在68℃-90℃范围内容纳至少2个靶标的检测。
本发明所述的用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系包括多个探针和多个引物组，进行荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测，实现单个通道中多种靶标检测分析；所述荧光PCR多重检测体系包括荧光探针扩增检测体系和荧光引物熔解曲线分析检测体系；
所述引物的长度为18-25bp，GC含量为40-70%，所述引物的Tm值为55-60℃；所述探针的长度为25-40bp，所述探针的Tm比所述引物的Tm值高5-10℃；优选地，所述探针的Tm比所述引物的Tm值高8-10℃。
所述探针的序列包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12；所述引物的序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20。
在本发明扩增阶段，引物探针之间Tm的差值尤为重要，直接影响到检测灵敏度。本发明中，引物探针之间Tm差值≥8℃，扩增效率较高。对于同一靶标：当模板浓度高时两组引物之间Ct值差距不大，引物探针Tm差值≥8℃的Ct值更小（图21）；当模板浓度较低时（5*10^3 copies/mL），引物探针Tm差值≥8℃的能检出靶标，引物探针Tm差值<8℃的检不出靶标（图22）。因此，为了达到更低的检测灵敏度，引物探针之间Tm差值≥8℃最优。当引物探针差值>10℃时，一般能获得较好的扩增效率，图23中的上下游引物与探针的Tm差值为11℃，其灵敏度高，最低可检出4*10^3 copies/mL的质粒。
具体地，
所述荧光探针扩增检测体系包括如下修饰探针、非修饰引物对，所述荧光探针扩增检测体系中的探针序列两端进行基团修饰，5’端修饰标记荧光报告基团，3’端修饰标记荧光淬灭基团：
肺炎克雷伯菌：
上游引物：5'- CCGTTCCAATACCTTTGTGG -3'；（SEQ ID NO.1）
下游引物：5'- GCGACAGTAAAGGCAGAAT -3'；（SEQ ID NO.2）
探针：5'- CCGGTCATTGGTGGTCACTCC -3'；（SEQ ID NO.3）
肺炎链球菌：
上游引物：5'- CAGAGCGTCCTTTGGTCTATA -3'；（SEQ ID NO.4）
下游引物：5'- AGCAGCCTCTACTTCATCAC -3'；（SEQ ID NO.5）
探针：5'- ACTTGGCGCCCATAAGCAACACTCGA -3'；（SEQ ID NO.6）
流感嗜血杆菌：
上游引物：5'- GTTATGCAGGTGAAAAAGTTGGAA -3'；（SEQ ID NO.7）
下游引物：5'- AGACCCAAACACAGCAAATTGAGTA -3'；（SEQ ID NO.8）
探针：5'- TCCCGTACCTGTCATTTCTTGTGGACATG -3'；（SEQ ID NO.9）
铜绿假单胞菌：
上游引物：5'- CTTCCGGTGAAGGTGCCAAT -3'；（SEQ ID NO.10）
下游引物：5'- TAGAAGGTGGTGATCGCACG -3'；（SEQ ID NO.11）
探针：5'- ACGGCAGCCTGAGCGACGAAGCC -3'；（SEQ ID NO.12）
肺炎克雷伯菌检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，肺炎链球菌检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为HEX和BHQ1、流感嗜血杆菌检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为ROX和BHQ2，铜绿假单胞菌检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为CY5和BHQ2；
相应的，所述荧光引物熔解曲线分析体系包括如下修饰引物对，所述荧光引物熔解曲线分析检测体系中对上游引物或下游引物的序列进行基团修饰，其中5’端标记荧光淬灭基团，在靠近3’端的T碱基标记荧光报告基团；为了实现最佳的灵敏度与特异性，所述荧光报告基团和所述荧光淬灭基团之间的间距为15-25nt（优选地，为15-18nt）：
金黄色葡萄球菌：
上游引物：5'- TGCCTTTACAGATAGCATGCCA -3'；（SEQ ID NO.13）
下游引物：5'- AGTAAGTAAGCAAGCTGCAATGACC -3'；（SEQ ID NO.14）
鲍曼不动杆菌：
上游引物：5'- GCGCTTCAAAATCTGATGTAA -3'；（SEQ ID NO.15）
下游引物：5'- TTTGGCCTTGTTGGATAACTAA -3'；（SEQ ID NO.16）
嗜麦芽窄食单胞菌：
上游引物：5'- CCGACAACAACTGGTGCTT -3'；（SEQ ID NO.17）
下游引物：5'- TCGTACGCCTGCAGCATG -3'；（SEQ ID NO.18）
耐药基因mecA：
上游引物：5'- GATCCTTTCAATCTATAGCGCATTA -3'；（SEQ ID NO.19）
下游引物：5'- GACTTGTTGCATACCATCAGTTAA -3'；（SEQ ID NO.20）
所述耐药基因mecA扩增引物组中的下游引物连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第17位T碱基修饰荧光报告基团FAM；所述嗜麦芽窄食单胞菌扩增引物组中的上游引物连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第15位T碱基修饰荧光报告基团FAM；所述金黄色葡萄球菌扩增引物组中的上游引物连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为ROX和BHQ2，5’端修饰荧光淬灭基团BHQ2，5’端第18位T碱基修饰荧光报告基团ROX；所述鲍曼不动杆菌扩增引物组中的下游引物连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为CY5和BHQ2，5’端修饰荧光淬灭基团BHQ2，5’端第16位T碱基修饰荧光报告基团CY5。
所述荧光引物熔解曲线分析法检测的靶标，其产物应当具备合适的Tm值，使得同一通道的2个靶标的熔解曲线峰无重叠部分，产物长度越长、GC含量越高，产物的Tm值越大。
本发明中的荧光PCR多重检测体系还包括内参GAPDH引物对，所述内参GAPDH用于监测待测样本的提取和PCR扩增过程：
内参GAPDH：
上游引物：5'- ATCAATGGAAATCCCATCACCA -3'；（SEQ ID NO.21）
下游引物：5'- AAAGCACATTTCTTCCATTCTGTC -3'；（SEQ ID NO.22）
所述内参GAPDH的下游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第18位T碱基修饰荧光报告基团HEX。
在具体实施方式中，所述荧光探针扩增检测体系中所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的一种；所述荧光引物熔解曲线分析检测体系中所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的一种。
具体地，上述所述荧光探针扩增检测体系和荧光引物熔解曲线分析检测体系所包含的引物探针组中的上、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~22所示。
所述的肺炎克雷伯菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的肺炎克雷伯菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的肺炎克雷伯菌的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的肺炎链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的肺炎链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的肺炎链球菌的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的流感嗜血杆菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的流感嗜血杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的流感嗜血杆菌的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的铜绿假单胞菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述的铜绿假单胞菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述的铜绿假单胞菌的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述的金黄色葡萄球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
所述的金黄色葡萄球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述的鲍曼不动杆菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述的鲍曼不动杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
所述的嗜麦芽窄食单胞菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
所述的嗜麦芽窄食单胞菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
所述的耐药基因mecA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
所述的耐药基因mecA的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述的内参GAPDH的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
所述的内参GAPDH的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
本发明所述的一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检试剂、试剂盒或产品，应用本发明的荧光PCR多重检测体系，能够在一轮反应中同时检测多种呼吸道细菌在样品中的存在。
在其中一个实施例中，本发明所述用于呼吸道细菌靶标核酸多联检试剂盒还包括核酸提取纯化试剂、合适的PCR反应缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶中的至少一种。
所述PCR反应缓冲液的使用浓度为1×；所述Mg2+试剂的使用终浓度为1-4 mM；所述dNTPs的使用浓度为0.2-0.4 mM；所述Taq DNA聚合酶的使用浓度为4-5 U/20μL；优选地，合适的PCR反应缓冲液的使用浓度为1×；Mg2+试剂如MgCl2试剂等，Mg2+的使用终浓度为4mM；dNTPs的使用浓度为0.2 mM；Taq DNA聚合酶的使用浓度为5 U/20μL。
在其中一个实施例中，所述核酸提取试剂包括前处理液（包括SDS等）、裂解液（包括N-十二烷酰基-N-甲基甘氨酸钠、异硫氰酸胍等）、洗涤液I（包括十二烷基六甘醇和氯化钠）、洗涤液II（包括Tris-HCl和氯化钠）、磁珠悬液、蛋白酶K溶液和洗脱液（包括Tris-HCl和EDTA）。
本发明还提出了上述荧光PCR多重检测体系，上述试剂、试剂盒或产品在呼吸道细菌靶标核酸多联检中的应用。
本发明还提供了一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的检测方法，使用上述所述的用于多种呼吸道细菌的荧光PCR多重检测体系，或试剂、试剂盒或产品，所述检测方法包括如下步骤：
1、样品核酸（DNA）提取纯化，所述样品包括但不限于痰液或灌洗液等；
2、以步骤1提取的纯化核酸为模板，以所述荧光探针扩增检测体系和所述荧光引物熔解曲线分析检测体系所包含的非修饰/修饰引物组、探针进行实时荧光PCR扩增；
3、采用荧光PCR多重检测体系，所述试剂、试剂盒或产品经过多重实时荧光定量PCR进行检测，结合FAM、HEX、ROX和CY5通道的Ct值和熔解曲线特征峰Tm值进行结果判定，以人GAPDH基因为内参，得到样本检测结果。
在其中一个实施例中，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针，以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于等于39时为阳性，Ct值大于39时为阴性；另一个靶点的检测采用熔解曲线的方式，以熔解曲线在特定Tm时有无特征峰作为阴阳性判定标准，在特定的Tm温度下，有特征峰，则为阳性，若无，则为阴性。
在其中一个实施例中，所述检测方法实时荧光PCR程序分为两个部分，扩增阶段和熔解曲线阶段。其中扩增阶段采用在变性阶段采集荧光，实现了荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测两种判别方法的兼容，有效的消除了由于多种引物探针的相互作用所产生的非特异扩增，更能够保证检测的特异性。
本发明的有益效果包括：本发明中用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系、试剂/试剂盒/产品及检测方法基于Taq酶水解荧光探针产生荧光信号及荧光引物扩增后产物杂交产生荧光信号的两种技术原理，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针，其余靶点的检测采用荧光引物对直接扩增的荧光引物熔解曲线的方式，实现了在单色的荧光通道中同时进行2-3个靶点的检测和分析，因而能够进行呼吸道多种细菌的联合检测，并将现有的荧光PCR检测通量增加一倍及以上，可一次性检测多种病原菌，有利于解决目前市场上病原菌试剂盒检测靶标单一，无法同时获得多个靶标信息的问题。并且，上述荧光PCR检测体系、试剂盒及检测方法在实时多重PCR检测平台开发时，在考虑不更改现行市面上已有的普通定量PCR仪的硬件设施前提下，进行单色单通道多靶点检测的开发，可直接在传统荧光PCR仪器上进行单通道多靶点检测，从而达到解决现有荧光定量PCR仪器多重检测通道瓶颈问题，进而实现多重实时定量PCR检测的目的，具有高通量、低成本、少耗时的特点。
进一步地，上述荧光PCR多重检测体系、试剂盒及检测方法可在一管试剂中同时检测多种病原菌，极大地提高了检测效率，为量少、珍贵的核酸样品提供更多的靶点检测信息，并且该检测方法使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染，能对反应过程进行实时监测。更进一步地，为更大程度上避免PCR产物造成气溶胶污染，本发明探究了扩增反应体系加矿物油仍然不影响扩增效果，这为避免气溶胶污染又增加了一重保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为FAM通道肺炎克雷伯菌的检测结果。
图2为HEX通道肺炎链球菌的检测结果。
图3为ROX通道流感嗜血杆菌的检测结果。
图4为CY5通道铜绿假单胞菌的检测结果。
图5为FAM通道耐药基因mecA的检测结果。
图6为FAM通道嗜麦芽窄食单胞菌的检测结果。
图7为ROX通道金黄色葡萄球菌的检测结果。
图8为CY5通道鲍曼不动杆菌的检测结果。
图9为HEX通道内参GAPDH的检测结果。
图10为所有通道中阴性对照的检测结果，其中，图10（a）为熔解曲线，图10（b）为扩增曲线。
图11为FAM通道肺炎克雷伯菌的最低检测限检测结果。
图12为HEX通道肺炎链球菌的最低检测限检测结果。
图13为ROX通道流感嗜血杆菌的最低检测限检测结果。
图14为CY5通道铜绿假单胞菌的最低检测限检测结果。
图15为FAM通道耐药基因mecA的最低检测限检测结果。
图16为FAM通道嗜麦芽窄食单胞菌的最低检测限检测结果。
图17为ROX通道金黄色葡萄球菌的最低检测限检测结果。
图18为CY5通道鲍曼不动杆菌的最低检测限检测结果。
图19为FAM通道肺炎克雷伯菌检测1 copies/μL质粒的结果。
图20为CY5/FAM通道的非特异熔曲峰。
图21为引物探针不同Tm差值检测高浓度模板结果。
图22为引物探针不同Tm差值检测低浓度模板结果。
图23为引物探针Tm差值＞10℃检测结果。
图24（a）-图24（k）为特异性检测的结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
实施例中的所用的试验材料，若无特殊说明，均为常规生化试剂。
本发明提出了一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测体系，所述荧光PCR多重检测体系包括多个探针和多个引物组，进行荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测，实现单个通道中多种靶标检测分析。所述荧光探针扩增检测体系和荧光引物熔解曲线分析检测体系所包含的引物探针组中的上、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~22所示。本发明还提出了一种试剂、试剂盒或产品，包含上述的荧光PCR多重检测体系。本发明中的荧光PCR多重检测体系、试剂/试剂盒/产品等在使用上快速简便、灵敏特异、稳定可靠且通量高，能够用于联合检测多种呼吸道细菌。本发明还提出了上述PCR多重检测体系、试剂/试剂盒/产品在呼吸道细菌靶标核酸多联检中的应用，以及一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的检测方法。
本发明有效利用引物、探针设计及修饰方法，既确保同一通道两个或三个靶标能够同时高灵敏检出，又保证互不干扰判断（主要是荧光干扰及非特异扩增）。特别是解决了当检测重数增加时，非特异扩增的有效消除。本发明所用方法在变性阶段采集荧光，实现了荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测两种判别方法的兼容，有效的消除了由于多种引物探针的相互作用所产生的非特异扩增，更能够保证检测的特异性。
实施例1
一、非修饰/修饰引物和探针组合物的设计
本实施例针对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和耐药基因mecA分别设计正向（F）和反向（R）引物。选择一端引物（F或R）在5’端标记淬灭基团，在靠近3’端的T碱基标记荧光基团，荧光基团与淬灭基团之间优选的间距为15-25 nt，另一端引物则不做修饰。针对肺炎克雷伯、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌分别设计正向（F）和反向（R）引物和TaqMan探针，并在探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。同时选择管家基因GAPDH基因作为内参，设计正向（F）和反向（R）引物，在R引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第18位T碱基修饰荧光报告基团HEX。按照上述设计原则设计11组引物和探针，具体如表1所示。
表1病原微生物扩增引物/探针名称及序列
可理解，在其他实施例中，该试剂盒中的荧光探针扩增检测体系所含引物探针组包括肺炎克雷伯菌扩增引物探针对、肺炎链球菌扩增引物探针对、流感嗜血杆菌扩增引物探针对以及铜绿假单胞菌扩增引物探针对；并且熔解曲线分析检测体系所含非修饰/修饰引物组包括耐药基因mecA、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌扩增引物对；还包括了内参GAPDH基因的引物对用于监测待测样本的提取和PCR扩增过程。
二、实验步骤
1、样本核酸提取
本实施例检测样本来源可以是痰液、肺泡灌洗液等，使用磁珠法核酸提取试剂盒（上海美吉逾华生物医药科技有限公司，货号：T07-100）进行核酸提取：
（1）若样本已加入NaOH液化处理，取1 mL 液体至1.5 mL 离心管中，15000 rpm 离心5 min，留取400 μL 弃其余上清。重悬沉淀后转移至研磨管中。
（2）向已加入样本的研磨管中依次加入400 μL消化液和20 μL蛋白酶K，将研磨管置于涡旋仪上并以最大转速涡旋10 min。涡旋结束后13000 rpm离心3 min，取上清进行后续实验。
（3）取300 μL上清加入到1.5mL管中，加入600 μL裂解液和10 μL磁珠震荡混匀，80℃孵育10 min。
（4）室温静置3 min，待恢复至室温，短暂离心将管盖及管壁上的溶液收集至管底，然后将离心管置于磁力架上3 min，待磁珠完全吸附后吸弃溶液（不要吸到磁珠）。
（5）向离心管中加入500 μL洗涤液I，涡旋混匀后短暂离心将管盖及管壁上的溶液收集至管底，然后将离心管置于磁力架上1 min，待磁珠完全吸附后吸弃溶液。
（6）向离心管中加入500 μL洗涤液II，涡旋混匀后短暂离心将管盖及管壁上的溶液收集至管底，然后将离心管置于磁力架上1 min，待磁珠完全吸附后吸弃溶液。
（7）重复步骤（6）。
（8）短暂离心将管盖及管壁上的溶液收集至管底，将离心管置于磁力架上1 min，待磁珠完全吸附后吸弃溶液，打开离心管管盖，室温下晾干3-5 min。
（9）向离心管中加入50-100μL洗脱液（推荐使用100 μL洗脱液）涡旋混匀后65℃孵育3 min，短暂离心将管盖及管壁上的溶液收集至管底，然后将离心管置于磁力架上3-5min，待磁珠完全吸附后将溶液转移至新的1.5 mL离心管中并于适当条件保存。
2、多重实时荧光PCR方法建立及扩增
2.1 建立多重实时荧光PCR扩增体系
吸取反应液17.5 μL到0.2 mL PCR反应管中，加入2.5 μL样本DNA，盖上管盖，涡旋混匀后简短离心，转移到扩增区。
本实施例所提供的实时荧光PCR扩增的反应体系如下表2所示。
表2实时荧光PCR扩增体系
组分 每个反应中的体积/终浓度
（5×）PCR buffer 4 μL
Taq酶（5U/μL） 1 μL
dNTP/dUTP（10mM） 0.4 μL
Mg2+（25mM） 4 mM
SEQ ID NO:1-3/10-12 140 nM
SEQ ID NO:4-9 100 nM
SEQ ID NO:13-16 200 nM
SEQ ID NO:17-22 70 nM
模板 2.5 μL
水 补足至20 μL
反应程序如下表3所示。与常规实时荧光定量PCR程序不同的是，扩增阶段的荧光信号是在每个循环的95℃变性阶段采集的。在此温度下，所有未裂解的TaqMan探针其荧光基团和淬灭基团通过荧光共振能量转移作用，形成一个相对低强度的背景信号。当DNA聚合酶将探针裂解后，脱离淬灭基团控制的荧光基团发出较强的荧光信号，在实时检测中不断积累，从而实现实时监测靶标的扩增。在熔曲阶段，带有荧光的扩增产物在温度低于其Tm值时呈双链结构，此时荧光信号较强。当温度高于产物Tm值时，呈单链结构，此时荧光基团与淬灭基团的空间位置相近，荧光信号较弱。因此通过监测熔曲阶段荧光信号的强弱变化，判断靶标是否扩增。
表3 反应程序
三、检测结果及分析
本实施例的技术原理即是一个通道的其中一个靶点利用TaqMan探针法，通过Ct值来判读检测阴阳性，而同一通道中的另外一个或两个及以上靶点利用的是熔解曲线分析法，通过是否有熔解曲线特征峰来判读检测阴阳性。
1 .分析流程
（1）目的检测信号为FAM、HEX(或VIC)、ROX和CY5。
（2）Baseline的设置：Baseline一般设置为3～15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1～2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，一般取扩增斜率1/3～1/2处。
（3）先分析内参在HEX通道是否检测到Tm(77～80℃)特征峰，若有，表示本次结果有效，可继续进行后续分析：
A)若FAM通道检测到扩增曲线，且Ct≤39，表示肺炎克雷伯菌检测结果为阳性；
若FAM通道检测到Tm(73～76℃)特征峰，表示耐药基因mecA检测结果为阳性；
若FAM通道检测到Tm(83～86℃)特征峰，表示嗜麦芽窄食单胞菌检测结果为阳性；
B)若HEX通道检测到扩增曲线，且Ct≤39，表示肺炎链球菌检测结果为阳性；
C)若ROX通道检测到扩增曲线，且Ct≤39，表示流感嗜血杆菌检测结果为阳性；
若ROX通道检测到Tm(73～76℃)特征峰，表示金黄色葡萄球菌检测结果为阳性；
D)若CY5通道检测到扩增曲线，且Ct≤39，表示铜绿假单胞菌检测结果为阳性；
若CY5通道检测到Tm(74～77℃)特征峰，表示鲍曼不动杆菌检测结果为阳性；
若内参在HEX通道没有检测到Tm(77～80℃)特征峰，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
2、模拟实验样本检测结果
以各个靶标的阳性质粒作为模板，模拟实验样本在宏石荧光定量PCR仪器(型号：SLAN-96P，SLAN-96S)上进行多重实时荧光PCR检测，结果如图1～图10所示。依据扩增曲线Ct值判断的靶标，结果展示在图1~图4中。图1中，FAM通道的Ct为30.69，为肺炎克雷伯菌的阳性检测结果；图2中，HEX通道的Ct为32.36，为肺炎链球菌的阳性检测结果；图3中，ROX通道的Ct为32.90，为流感嗜血杆菌的阳性检测结果；图4中，CY5通道的Ct为35.19，为铜绿假单胞菌的阳性检测结果。依据熔解曲线Tm值判断的靶标，结果展示在图5~图9中。图5和图6中，FAM通道的Tm值分别为73.87和83.72，分别为耐药基因mecA和嗜麦芽窄食单胞菌的阳性检测结果；图7中，ROX 通道的Tm值为74.24，为金黄色葡萄球菌的阳性检测结果；图8中，CY5通道的Tm值为75.25，为鲍曼不动杆菌的阳性检测结果；图9中，HEX通道的Tm值为78.03，为内参GAPDH的阳性检测结果。图10为所有通道中阴性对照的结果，没有熔解曲线或扩增曲线被检出，图10（a）为熔解曲线，图10（b）为扩增曲线。
3、所述试剂盒性能研究
3.1灵敏度检测
将各个靶标的阳性质粒梯度稀释作为模板，质粒浓度为10-1000 copies/μL，分别进行检测，结果展示在图11～图19中。图11中，肺炎克雷伯菌的质粒浓度分别为1000/100/10 copies/μL，其Ct分别为27.64、30.77、34.06；图12中，肺炎链球菌的质粒浓度分别为1000/100/10 copies/μL，其Ct分别为29.69、32.69、36.64；图13中，流感嗜血杆菌的质粒浓度分别为1000/100/10 copies/μL，其Ct分别为30.02、33.26、36.69；图14中，铜绿假单胞菌的质粒浓度分别为1000/100/10 copies/μL，其Ct分别为31.46、34.80、38.69；图15中，耐药基因mecA的质粒浓度分别为1000/100/30 copies/μL，其Tm分别为73.68、73.72、73.69；图16中，嗜麦芽窄食单胞菌的质粒浓度分别为1000/100/10 copies/μL，其Tm分别为83.60、83.75、83.76；图17中，金黄色葡萄球菌的质粒浓度分别为1000/100/30 copies/μL，其Tm分别为74.19、74.22、74.21；图18中，鲍曼不动杆菌的质粒浓度分别为1000/100/20 copies/μL，其Tm分别为75.33、75.26、75.19。其中图11~14和图16分别为FAM通道肺炎克雷伯菌、HEX通道肺炎链球菌、ROX通道流感嗜血杆菌、CY5通道铜绿假单胞菌和FAM通道嗜麦芽窄食单胞菌的最低检测限，可达10 copies/μL。图15和图17分别为FAM通道耐药基因mecA和金黄色葡萄球菌的最低检测限，可达30 copies/μL。图18为CY5通道鲍曼不动杆菌的最低检测限，可达20 copies/μL。图19中，对于肺炎克雷伯菌，甚至可检测到1 copies/μL的质粒，其ct在35.02-38.05之间。
3.2特异性检测
对所述试剂盒检测范围之外，采样部位易感病原体或正常寄生的微生物进行交叉反应检测，包括脑膜炎奈瑟菌、嗜肺军团菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、琼氏不动杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、卡他莫拉菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、路邓葡萄球菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、黄曲霉、黑曲霉。
如图24（a）-图24（k）所示，本发明制备的试剂盒对试剂盒检测范围外的上述21种微生物均无交叉反应，即本发明试剂盒的特异性强。
4、痰液和灌洗液临床标本的检测
1）提取样本DNA
使用磁珠法核酸提取试剂盒（上海美吉逾华生物医药科技有限公司，货号：T07-100）提取样本DNA。
2）收集24例痰液、灌洗液样本，提取样本DNA后用本发明所述试剂盒进行检测，并与细菌培养结果、多重PCR细菌鉴定结果进行比较，检测结果如下表4。培养结果为阳性的样本，本发明所述试剂盒均能检出；多重PCR细菌鉴定结果为阳性的样本，本发明所述试剂盒均能检出；本发明所述试剂盒检出阳性率高于细菌培养或多重PCR细菌鉴定。此外，与培养结果相比，本发明所述试剂盒多检出的靶标经一代Sanger测序验证，结果均为真，检测结果如下表5，说明本发明方法的检测结果准确度高，未出现假阳性或假阴性的情况。
表4 所述试剂盒与临床细菌培养结果、多重PCR细菌鉴定结果比较分析
检测样本 荧光PCR多重检测结果 细菌培养结果 多重PCR细菌鉴定结果
样本-1 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌 阴性 流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌
样本-2 肺炎链球菌 阴性 阴性
样本-3 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌 阴性 流感嗜血杆菌
样本-4 阴性 阴性 阴性
样本-5 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-6 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-7 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-8 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-9 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-10 肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌 阴性 肺炎克雷伯菌
样本-11 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐药基因mecA 阴性 肺炎链球菌
样本-12 肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌 阴性 阴性
样本-13 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐药基因mecA、肺炎克雷伯菌 阴性 肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌
样本-14 肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
样本-15 铜绿假单胞菌 阴性 铜绿假单胞菌
样本-16 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌 阴性 阴性
样本-17 肺炎链球菌 阴性 肺炎链球菌
样本-18 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌
样本-19 肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 阴性 肺炎克雷伯菌
样本-20 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、耐药基因mecA 阴性 肺炎克雷伯菌、耐药基因mecA
样本-21 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌 肺炎克雷伯菌 肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌
样本-22 肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌 阴性 阴性
样本-23 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
样本-24 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
表5所述试剂盒检测结果与一代Sanger测序结果对比分析
检测样本 荧光PCR多重检测结果 细菌培养结果 荧光PCR多重检测结果与Sanger测序结果对比
样本-1 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌 阴性 一致
样本-2 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-3 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌 阴性 一致
样本-5 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-6 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-7 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-8 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-9 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-10 肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌 阴性 一致
样本-11 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐药基因mecA 阴性 一致
样本-12 肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌 阴性 一致
样本-13 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐药基因mecA、肺炎克雷伯菌 阴性 一致
样本-15 铜绿假单胞菌 阴性 一致
样本-16 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌 阴性 一致
样本-17 肺炎链球菌 阴性 一致
样本-19 肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 阴性 一致
样本-20 嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、耐药基因mecA 阴性 一致
样本-22 肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌 阴性 一致
由上表可知，本发明所述的针对呼吸道8种细菌的多重实时荧光PCR检测试剂盒能快速准确的检测痰液、灌洗液样本，并且与现有的细菌培养结果或多重PCR细菌鉴定结果相比灵敏度更高，与一代Sanger测序结果完全一致，具有极高的准确率。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
如本发明所用，术语“包括”、“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但不排除其他方面的内容。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (9)

1.一种用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR多重检测试剂盒包括多个探针和多个引物组，进行荧光PCR多重检测，所述荧光PCR多重检测包括荧光探针扩增检测和荧光引物熔解曲线分析检测，实现单个通道中多种靶标检测分析；所述荧光PCR多重检测试剂盒包括荧光PCR多重检测体系，所述荧光PCR多重检测体系包括荧光探针扩增检测体系和荧光引物熔解曲线分析检测体系；
所述引物长度为18-25bp，GC含量为40-70%，所述引物的Tm值为55-60℃；所述探针长度为25-40bp，所述探针的Tm比所述引物Tm值高5-10℃；
所述荧光探针扩增检测体系中，所述探针的序列包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQID NO.9、SEQ ID NO.12；所述引物的序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；在所述荧光探针扩增检测的变性阶段采集荧光；
所述荧光引物熔解曲线分析检测体系中，所述引物的序列包括SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20；所述荧光引物熔解曲线分析检测体系中对上游引物或下游引物的序列进行基团修饰，其中5’端标记荧光淬灭基团，在靠近3’端的T碱基标记荧光报告基团；所述荧光报告基团和所述荧光淬灭基团之间的间距为15-25nt。
2.如权利要求1所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针扩增检测体系包括以下修饰探针、非修饰引物对：
肺炎克雷伯菌：
上游引物SEQ ID NO.1：5'- CCGTTCCAATACCTTTGTGG -3'；
下游引物SEQ ID NO.2：5'- GCGACAGTAAAGGCAGAAT -3'；
探针SEQ ID NO.3：5'- CCGGTCATTGGTGGTCACTCC -3'；
肺炎链球菌：
上游引物SEQ ID NO.4：5'- CAGAGCGTCCTTTGGTCTATA -3'；
下游引物SEQ ID NO.5：5'- AGCAGCCTCTACTTCATCAC -3'；
探针SEQ ID NO.6：5'- ACTTGGCGCCCATAAGCAACACTCGA -3'；
流感嗜血杆菌：
上游引物SEQ ID NO.7：5'- GTTATGCAGGTGAAAAAGTTGGAA -3'；
下游引物SEQ ID NO.8：5'- AGACCCAAACACAGCAAATTGAGTA -3'；
探针SEQ ID NO.9：5'- TCCCGTACCTGTCATTTCTTGTGGACATG -3'；
铜绿假单胞菌：
上游引物SEQ ID NO.10：5'- CTTCCGGTGAAGGTGCCAAT -3'；
下游引物SEQ ID NO.11：5'- TAGAAGGTGGTGATCGCACG -3'；
探针SEQ ID NO.12：5'- ACGGCAGCCTGAGCGACGAAGCC -3'。
3.如权利要求2所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针扩增检测体系中的探针序列两端进行基团修饰，5’端修饰标记荧光报告基团，3’端修饰标记荧光淬灭基团；所述肺炎克雷伯菌检测探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述肺炎链球菌检测探针的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1；所述流感嗜血杆菌检测探针的荧光报告基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2；所述铜绿假单胞菌检测探针的荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ2。
4.如权利要求1所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述荧光引物熔解曲线分析检测体系包括以下修饰引物对：
金黄色葡萄球菌：
上游引物SEQ ID NO.13：5'- TGCCTTTACAGATAGCATGCCA -3'；
下游引物SEQ ID NO.14：5'- AGTAAGTAAGCAAGCTGCAATGACC -3'；
鲍曼不动杆菌：
上游引物SEQ ID NO.15：5'- GCGCTTCAAAATCTGATGTAA -3'；
下游引物SEQ ID NO.16：5'- TTTGGCCTTGTTGGATAACTAA -3'；
嗜麦芽窄食单胞菌：
上游引物SEQ ID NO.17：5'- CCGACAACAACTGGTGCTT -3'；
下游引物SEQ ID NO.18：5'- TCGTACGCCTGCAGCATG -3'；
耐药基因mecA：
上游引物SEQ ID NO.19：5'- GATCCTTTCAATCTATAGCGCATTA -3'；
下游引物SEQ ID NO.20：5'- GACTTGTTGCATACCATCAGTTAA -3'。
5.如权利要求4所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌的上游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ2，5’端第18位T碱基修饰荧光报告基团ROX；所述鲍曼不动杆菌的下游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ2，5’端第16位T碱基修饰荧光报告基团CY5；所述嗜麦芽窄食单胞菌的上游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第15位T碱基修饰荧光报告基团FAM；所述耐药基因mecA的下游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第17位T碱基修饰荧光报告基团FAM。
6.如权利要求1所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR多重检测体系还包括内参GAPDH引物对，用于监测待测样本的提取和PCR扩增过程；所述内参GAPDH引物对如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示：
上游引物SEQ ID NO.21：5'- ATCAATGGAAATCCCATCACCA -3'；
下游引物SEQ ID NO.22：5'- AAAGCACATTTCTTCCATTCTGTC -3'；
所述内参GAPDH的下游引物的5’端修饰荧光淬灭基团BHQ1，5’端第18位T碱基修饰荧光报告基团HEX。
7.如权利要求1所述的荧光PCR多重检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取纯化试剂、PCR缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs、Taq DNA聚合酶中的至少一种；所述PCR缓冲液的使用浓度为1×；所述Mg2+试剂的使用终浓度为1-4 mM；所述dNTPs的使用浓度为0.2-0.4mM；所述Taq DNA聚合酶的使用浓度为4-5 U/20μL。
8.如权利要求1-7之任一项所述的荧光PCR多重检测试剂盒在不以疾病诊断为目的的呼吸道细菌靶标核酸多联检中的应用。
9.一种不以疾病诊断为目的的用于呼吸道细菌靶标核酸多联检的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括提取纯化样品核酸，以所述样品核酸为模板，利用如权利要求1-7之任一项所述的荧光PCR多重检测试剂盒进行荧光PCR扩增和检测，得到样本检测结果，所述荧光PCR扩增阶段在变性阶段采集荧光。
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