CN118275664A - 基于拆分Cas蛋白的非核酸靶标检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于拆分cas蛋白的非核酸靶标检测方法及用途，具体地，本发明提供了检测非核酸靶标的检测体系，含有(a)第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白，(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和(c)向导RNA，本发明的体系可根据非核酸靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测，并且本发明首次采用拆分Cas蛋白检测非核酸靶标，具有灵敏度高、特异性强、耗时短的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及基于拆分Cas蛋白的非核酸靶标检测方法及应用。
背景技术
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。Cas12a蛋白又被称为Cpf1蛋白，属于第二大类CRISPR/Cas的Ⅴ型系统。在RNA的引导下，该蛋白能够特异性结合并切割外源DNA。
目前已有一批研究者成功建立了通过荧光、颜色、电化学等信号来表示核酸含量的CRISPR/Cas12a介导的生物传感器，但将现有的CRISPR/Cas12a生物传感系统转变为更广泛的、非核酸分析物检测仍然具有挑战性，特别是从简单性和普适性的角度来看，虽然成功整合了其他识别元件，如变构转录因子(atf)或功能DNA分子(DNA适配体和DNAzyme)，对多种生物物质，包括蛋白质、有机小分子、细菌、肿瘤细胞以及病毒颗粒等实现灵敏检测，极大地拓宽了CRISPR/Cas12a系统在生物传感中的应用范围。但是相比于在核酸检测领域的应用，CRISPR/Cas12a系统在非核酸检测中的应用主要是取代了传统商业ELISA试剂盒中最后一步显色反应，所以仍然具有体系非均相，实验周期长，操作复杂等缺点。
因此，本领域迫切需要开发一种可根据待检测的靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可根据待检测的靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测的新方法。
本发明的另一目的在于针对非核酸类的检测靶标，提供一种均相、灵敏度高(达到纳克级的检测)、特异性强、快速可视化(试纸条检测)的基于拆分CRISPR/Cas蛋白(splitCRISPR/Cas)的检测方法。
本发明的另一目的在于针对非核酸类的检测靶标，提供一种均相、灵敏度高、特异性强、快速可视化的基于拆分Cas蛋白的检测方法。
本发明第一方面提供了一种检测非核酸靶标的检测体系，包括：
(a1)第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
(a2)第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
在另一优选例中，
所述Cas蛋白顺式切割底物是所述Cas蛋白顺式切割报告分子的组成部分。
在另一优选例中，所述检测非核酸靶标的检测体系还包括：
(d)Cas蛋白反式切割报告分子，所述Cas蛋白反式切割报告分子具有不与所述Cas蛋白的向导RNA的导向序列杂交的单链核酸分子。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段构成全长的Cas蛋白。
在另一优选例中，所述检测体系还包括一段到或多段中间融合蛋白，所述中间融合蛋白的结构包括Cas蛋白的中间片段及位于所述Cas蛋白的中间片段两端的靶标受体，所述Cas蛋白的中间片段和所述靶标受体之间还可以包括连接肽；所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段及一段或多段Cas蛋白的中间片段构成全长的Cas蛋白。
在另一优选例中，所述检测体系包括第一检测体系和第二检测体系，所述第一检测体系包括组分(a1)和组分(a2)，所述第二检测体系包括组分(b)和(c)，优选地，所述第二检测体系还包括组分(d)。
在另一优选例中，所述第一检测体系还包括非核酸靶标。
在另一优选例中，所述Cas蛋白为II型Cas蛋白、V型Cas蛋白、VI型Cas蛋白或其组合；或者所述Cas蛋白是具有RuvC结构或HEPN结构的Cas蛋白。
在另一优选例中，所述II型Cas蛋白是Cas9；所述V型Cas蛋白是Cas12；所述VI型Cas蛋白是Cas13，或者
所述具有RuvC结构或HEPN结构的的Cas蛋白是Cas9、Cas12、Cas13。
在另一优选例中，所述II型Cas蛋白是Cas9。
在另一优选例中，所述II型Cas蛋白选自下组：II-A型Cas蛋白、II-B型Cas蛋白、II-C型Cas蛋白、II-C变体型Cas蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述Cas9选自下组：spCas9、FnCas9、SaCas9、NmCas9、St1Cas9、St3Cas9、CjCas9或其组合。
在另一优选例中，所述Cas9来源于以下种：化脓性链球菌(SpCas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)(St1Cas9、St3Cas9)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、新泽西弗朗西斯菌(Francisella novicida)(FnCas9)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)(NmCas9)或其组合。
在另一优选例中，所述V型Cas蛋白选自下组：V-A型、V-B型、V-C型、V-D型、V-E型、V-F型、V-G型、V-H型、V-I型、V-J型、V-K型Cas蛋白、V-L型Cas蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述V型Cas蛋白选自下组：Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas12l或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12a选自以下组：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a、CeCas12a、PrCas12a、CsbCas12a、BhCas12a、SsCas12a、Lb3Cas12a、BpCas12a、PdCas12a、BfCas12a、PcCas12a、cMtCas12a、PeCas12a、LiCas12a、Lb2Cas12a、PmCas12a、MbCas12a、EeCas12a、CsbCas12a、ErCas12a、ArCas12a、BsCas12a、AbCas12a或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12a的来源选自下组：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属、毛螺菌属、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12a的来源选自下组：图拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)(FnCas12a)、氨基酸球菌属BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)(AsCas12a)、毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)(LbCas12a)、毛螺菌科细菌NC2008(Lachnospiraceae bacterium NC2008)(Lb5Cas12a)、孔氏创伤球菌(Helcococcussp kunzii)(HkCas12a)、Oribacteriumsp.NK2B42(OsCas12a)、Thiomicrospira sp.XS5(TsCas12a)、拟杆菌KA00251(Bacteroidales bacterium KA00251)(BbCas12a)、口腔拟杆菌(Bacteroidetes oral taxon 274)(BoCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceaebacterium MC2017)(Lb4Cas12a)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)(CeCas12a)、栖瘤胃普氏菌(Prevotella ruminicola strain BPI-34)(PrCas12a)、CandidatusSaccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungateistrain MB2003)(BhCas12a)、史密斯氏菌SC_K08D17(Smithella sp.SC_K08D17)(SsCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)(Lb3Cas12a)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Bytyrivibrio proteoclasticus)(BpCas12a)、普氏杆菌(Prevotelladisens)(PdCas12a)、溶纤维丁酸弧菌MD2001(Butyrivibrio fibrisolvens MD2001)(BfCas12a)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)PcCas12a、CandidatusMethanoplasma termitum(CMtCas12a)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)(PeCas12a)、Leptospira inadaiserovar Lyme(LiCas12a)、毛螺菌科细菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020)(Lb2Cas12a)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacaca)(PmCas12a)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovoculi 237)(MbCas12a)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)(EeCas12a)、Candidatus Saccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、直肠真杆菌(Eubacte riumrectale)(ErCas12a)、直肠酵母菌(Agathobacterrectalisstrain)(ArCas12a)、丁酸弧菌NC3005(Butyrivibrio sp.NC3005)(BsCas12a)、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)(AbCas12a)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12b的来源选自下组：卡克氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)、芽孢杆菌属V3-13种、外村尚芽孢杆菌(Bacillushisashii)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeria bacterium)、沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis)、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12b选自下组：AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AapCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b、或其组合。
在另一优选例中，所述VI型Cas蛋白是Cas13。
在另一优选例中，所述VI型Cas蛋白选自下组：VI-A型Cas蛋白、VI-B型Cas蛋白、VI-D型Cas蛋白、VI-X型Cas蛋白、VI-Y型Cas蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述VI型Cas蛋白选自下组：Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas13e、Cas13f、Cas13x、Cas13y或其组合。
在一些实施方式中，所述Cas13蛋白是或源于以下的种：别样杆菌属(Alistipes)、厌氧唾液杆菌(Anaerosalibacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、伯杰菌属(Bergeyella)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、绿曲挠丝状菌属(Chloroflexus)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、梭菌属(Clostridium)、Demequina、优杆菌科(Eubacteriaceae)、优杆菌属(Eubacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Herbinix、Insolitispirillum、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特氏菌属(Listeria)、香味菌属(Myroides)、杆状杆菌(Paludibacter)、细菌杆菌(Phaeodactylibacter)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、冷弯菌属(Psychroflexus)、赖兴氏杆菌(Reichenbachiella)、红杆菌属(Rhodobacter)、里氏杆菌属(Riemerella)、Sinomicrobium、海旋菌属(Thalassospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)；优选地，沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)、斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)、毛螺科菌细菌(Lachnospiraceaebacterium)(如Lb MA2020、Lb NK4A179、Lb NK4A144)、Clostridiumaminophilum(如CaDSM 10710)、鸡肉杆菌(Carnobacterium gallinarum)(如Cg DSM4847)、丙酸杆菌(Paludibacter propionicigenes)(如Pp WB4)、魏斯特斯蒂芬氏李斯特氏菌(Listeriaweihenstephanensis)(如Lw FSL R9-0317)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceaebacterium)(如Lb FSL M6-0635)、瓦氏细单胞菌(Leptotrichia wadei)(如Lw F0279)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)(如Rc SB1003、Rc R121、Rc DE442)、口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)(如Lb C-1013-b)、Herbinix hemicellulosilytica、优杆菌科细菌(Eubacteriaceae bacterium)(如Eb CHKCI004)、布劳特氏菌属种(Blautiasp.)Marseille-P2398、纤毛菌属种(Leptotrichiasp.)口腔分类单元879str.F0557、聚集绿屈扰菌(Chloroflexus aggregans)、Demequina aurantiaca、海旋菌种(Thalassospirasp.)TSL5-1、假丁酸弧菌属种(Pseudobutyrivibrio sp.)OR37、丁酸弧菌属种(Butyrivibrio sp.)YAB3001、纤毛菌属种(Leptotrichia sp.)Marseille-P3007、Bacteroides ihuae、紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)(如PbKH3CP3RA)、Listeria riparia、Insolitispirillum peregrinum、别样杆菌属种(Alistipes sp.)ZOR0009、酿脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)(如Bp F0041)、拟杆菌属细菌(Bacteroidetes bacterium)(如Bb GWA2_31_9)、动物溃疡伯格菌(Bergeyellazoohelcum)(如Bz ATCC 43767)、犬咬二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)、希诺地米碳酸噬胞菌(Capnocytophaga cynodegmi)、Chryseobacterium carnipullorum、济州岛金黄杆菌(Chryseobacterium jejuense)、嗜鳃黄杆菌(Chryseobacteriumureilyticum)、嗜分支黄杆菌(Flavobacterium branchiophilum)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、黄杆菌属种(Flavobacterium sp.)316、Myroidesodoratimimus(如Mo CCUG 10230、MoCCUG 12901、Mo CCUG 3837)、Paludibacterpropionicigenes、Phaeodactylibacterxiamenensis、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(如Pg F0185、Pg F0568、PgJCVI SC001、Pg W4087)、马铃薯红单胞菌(Porphyromonas gulae)、卟啉单胞菌属种(Porphyromonas sp.)COT-052OH4946、树蛙普雷沃菌(Prevotella aurantiaca)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)(如Pb ATCC 33574)、Prevotella falsenii、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)(如Pi 17、Pi ZT)、Prevotella pallens(如Pp ATCC 700821)、Prevotella pleuritidis、解糖普雷沃菌(Prevotella saccharolytica)(如Ps F0055)、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MA2016、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MSX73、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P4-76、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-119、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-125、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-60、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)、Reichenbachiellaagariperforans、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、Sinomicrobium oceani、坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)(如Fn subsp.funduliforme ATCC 51357、FnDJ-2、Fn BFTR-1、Fnsubsp.Funduliforme)、坏疽梭杆菌(Fusobacterium perfoetens)(如Fp ATCC 29250)、溃疡梭杆菌(Fusobacterium ulcerans)(如Fu ATCC 49185)、厌氧唾液杆菌属种(Anaerosalibactersp.)ND1、产亚硝酸真杆菌(Eubacterium siraeum)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)(如Rfx XPD3002)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13a蛋白选自下组：LwaCas13a,LbaCas13a,LshCas13a,PprCas13a,EreCas13a,LneCa13a,CamCa s13a,RcaCas13a,HheCas13a,LbuCas13a,LseCas13a,LbmCas13a,LbnCas13a,RcsCa s13a,RcrCas13a,RcdCas13a,CgCas13a,Cg2Cas13a,LweCas13a,LbfCas13a,Lba4Ca s13a,Lba9Cas13a,LneCas13a,HheCas13a、RcaCas13a或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13a蛋白选自以下的种：拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、绿曲挠丝状菌属(Chloroflexus)、梭菌属(Clostridium)、Demequina、优杆菌属(Eubacterium)、Herbinix、Insolitispirillum、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特氏菌属(Listeria)、杆状杆菌(Paludibacter)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、红杆菌属(Rhodobacter)或海旋菌属(Thalassospira)；优选地，沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)、斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)、毛螺科菌细菌(Lachnospiraceaebacterium)(如Lb MA2020、Lb NK4A179、LbNK4A144)、Clostridium aminophilum(如CaDSM 10710)、鸡肉杆菌(Carnobacteriumgallinarum)(如Cg DSM 4847)、丙酸杆菌(Paludibacter propionicigenes)(如Pp WB4)、魏斯特斯蒂芬氏李斯特氏菌(Listeriaweihenstephanensis)(如Lw FSL R9-0317)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceaebacterium)(如Lb FSL M6-0635)、瓦氏细单胞菌(Leptotrichiawadei)(如Lw F0279)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)(如Rc SB 1003、Rc R121、RcDE442)、口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)(如Lb C-1013-b)、Herbinixhemicellulosilytica、优杆菌科细菌(Eubacteriaceae bacterium)(如Eb CHKCI004)、布劳特氏菌属种(Blautia sp.)Marseille-P2398、纤毛菌属种(Leptotrichia sp.)口腔分类单元879str.F0557、聚集绿屈扰菌(Chloroflexus aggregans)、Demequina aurantiaca、海旋菌种(Thalassospirasp.)TSL5-1、假丁酸弧菌属种(Pseudobutyrivibrio sp.)OR37、丁酸弧菌属种(Butyrivibrio sp.)YAB3001、纤毛菌属种(Leptotrichiasp.)Marseille-P3007、Bacteroides ihuae、紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)(如PbKH3CP3RA)、Listeria riparia、Insolitispirillum peregrinum或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b选自下组：Cas13b-t1、Cas13b-t2、Cas13b-t3、Cas13b-t4、Cas13b-t5、Cas13b-t6或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b选自下组：BzCas13b,PbCas13b,PspCas13b,RanCas13b,PguCas13b,PsmCas13b,CcaCas13b,AspCas13b,PauCas13b,Pin2Cas13b,或Pin3Cas13b或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b是或源于以下的种：别样杆菌属(Alistipes)、拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、伯杰菌属(Bergeyella)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、香味菌属(Myroides)、杆状杆菌(Paludibacter)、细菌杆菌(Phaeodactylibacter)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、冷弯菌属(Psychroflexus)、赖兴氏杆菌(Reichenbachiella)、里氏杆菌属(Riemerella)或Sinomicrobium；优选地，别样杆菌属种(Alistipes sp.)ZOR0009、酿脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)(如Bp F0041)、拟杆菌属细菌(Bacteroidetes bacterium)(如BbGWA2_31_9)、动物溃疡伯格菌(Bergeyellazoohelcum)(如Bz ATCC 43767)、犬咬二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)、希诺地米碳酸噬胞菌(Capnocytophagacynodegmi)、Chryseobacterium carnipullorum、济州岛金黄杆菌(Chryseobacteriumjejuense)、嗜鳃黄杆菌(Chryseobacteriumureilyticum)、嗜分支黄杆菌(Flavobacterium branchiophilum)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、黄杆菌属种(Flavobacterium sp.)316、Myroidesodoratimimus(如Mo CCUG 10230、Mo CCUG12901、Mo CCUG 3837)、丙酸杆菌(Paludibacterpropionicigenes)、Phaeodactylibacterxiamenensis、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(如Pg F0185、Pg F0568、PgJCVI SC001、Pg W4087)、马铃薯红单胞菌(Porphyromonas gulae)、卟啉单胞菌属种(Porphyromonas sp.)COT-052OH4946、树蛙普雷沃菌(Prevotella aurantiaca)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)(如Pb ATCC 33574)、Prevotella falsenii、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)(如Pi 17,Pi ZT)、Prevotella pallens(如Pp ATCC 700821)、Prevotella pleuritidis、解糖普雷沃菌(Prevotella saccharolytica)(如Ps F0055)、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MA2016、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MSX73、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P4-76、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-119、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-125、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-60、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)、Reichenbachiellaagariperforans、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、Sinomicrobium oceani或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13c蛋白是或源于以下的种：梭杆菌属(Fusobacterium)或厌氧唾液杆菌(Anaerosalibacter)；优选地，坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)(如Fn subsp.funduliforme ATCC 51357、Fn DJ-2、FnBFTR-1、Fn subsp.Funduliforme)、坏疽梭杆菌(Fusobacterium perfoetens)(如Fp ATCC29250)、溃疡梭杆菌(Fusobacteriumulcerans)(如Fu ATCC 49185)、厌氧唾液杆菌属种(Anaerosalibacter sp.)ND1或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13d选自下组：RspCas13d、RfxCas13d、EsCas13d、AdmCas13d或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13d源于以下的种：优杆菌属(Eubacterium)或瘤胃球菌属(Ruminococcus)，优选地，产亚硝酸真杆菌(Eubacteriumsiraeum)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)(如Rfx XPD3002)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白包括野生型和突变型；优选地，突变型Cas蛋白是中国发明专利申请CN202210508434.7中公开的Cas12a突变体。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的N端片段包括Cas1-730片段。
在另一优选例中，所述Cas1-730片段对应于LbCas蛋白的1-730片段。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的N端片段为基于SEQ ID NO.:1的第1-730位的N端片段。
在另一优选例中，所述L1和L2的长度各自独立地为0-1000aa，较佳地1-80aa，更佳地，5-60aa，又更佳地，10-50aa。
在另一优选例中，所述L1和L2各自独立地选自下组：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:2或3所示的多肽；
(2)将SEQ ID NO.:2或3所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:2或3所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的C端片段包括Cas731-1228片段。
在另一优选例中，所述Cas731-1228片段对应于LbCas蛋白的731-1228片段。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的C端片段为基于SEQ ID NO.:1的第731-1228位的C端片段。
在另一优选例中，所述cas蛋白的N端片段和cas蛋白的C端片段共同构成具有顺式和反式切割活性的cas蛋白。
在另一优选例中，所述第一靶标受体和第二靶标受体各自独立地与非核酸靶标特异性结合。
在另一优选例中，所述第一靶标受体和第二靶标受体各自独立地选自下组：氨基酸受体、非氨基酸受体、或其组合。
在另一优选例中，所述第一靶标受体和第二靶标受体各自独立地选自下组：多肽受体、核酸适配体、或其组合；优选地，所述第一靶标受体和第二靶标受体是多肽受体，优选的，所述第一靶标受体和第二靶标受体是抗体。
在另一优选例中，所述非核酸靶标选自下组：雷帕霉素、脱落酸或其组合。
在另一优选例中，所述非核酸靶标选自下组：药物残留、杀虫剂残留物、有机污染物、临床标志物或其组合。
在另一优选例中，所述药物残留选自下组：氨苄青霉素(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)、土霉素(Oxytetracycline)、青霉素G(Penicillin G)、恩诺沙星(Enrofloxacin)、双氯芬酸(Diclofenac)、磺胺地索辛(Sulfadimethoxine)、多巴胺(Dopamine)、林可霉素(Lincomycin)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、克仑特罗/瘦肉精(Clenbuterol)、孔雀绿(Malachite green)或其组合。
在另一优选例中，所述杀虫剂残留物选自下组：啶虫脒(Acetamiprid)、阿特拉津(Atrazine)、马拉息昂(Malathion)、克瘟散(Edifenphos)、异稻瘟净(Iprobenfos)、甲拌磷(Phorate)、氧化乐果(omethoate)、水胺硫磷(Isocarbophos)或其组合。
在另一优选例中，所述有机污染物选自下组：BPA、PCB72、PCB106、PCB77或其组合。
在另一优选例中，所述临床标志物选自下组：睾酮(Testosterone)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、胰岛素(insulin)、肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、维生素D(vitamin D)、维生素B12(vitamin B12)、维生素B2(vitamin B2)、葡萄糖(glucose)。
在另一优选例中，所述非核酸靶标为雷帕霉素，所述第一融合蛋白具有SEQIDNO.:4所示的氨基酸序列，所述第二融合蛋白具有SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述非核素靶标为脱落酸，所述第一融合蛋白具有SEQ IDNO.:6所示的氨基酸序列，所述第二融合蛋白具有SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白组合形成含有第一融合蛋白和第二融合蛋白的复合物。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割底物选自下组：dsDNA、ssDNA、RNA、单链核酸类似物、双链核酸类似物或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割底物是含有PAM的dsDNA。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割报告分子选自下组：基于金纳米颗粒的报告分子、基于荧光团的报告分子、基于荧光偏振的报告分子、基于胶体相变/分散的报告分子、基于电化学信号的报告分子、基于半导体信号的报告分子、基于颜色的报告分子。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割报告分子带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记包括荧光基团、淬灭基团。
在另一优选例中,所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、VIC、JOE、TET、Texas Red、FITC、LC RED640、RB200或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：TAMARA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABSYL、Dabcyl、eclipse或其组合。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述Cas蛋白顺式切割底物的5'端、3'端和中部。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子的长度为18-300nt，较佳地18-100nt，更佳地18-50nt，最佳地18-25nt。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割报告分子包括单链DNA。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割报告分子包括带有可检测标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光和生物素标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述Cas蛋白反式切割报告分子选自下组：单链核酸报告分子、单链核酸类似物报告分子或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白反式切割报告分子选自下组：基于金纳米颗粒的报告分子、基于荧光团的报告分子、基于荧光偏振的报告分子、基于胶体转变/分散的报告分子、基于电化学信号的报告分子、基于半导体信号的报告分子、基于颜色的报告分子、或其组合。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白反式切割报告分子的长度为3-300nt，较佳地5-100nt，更佳地6-50nt，最佳地8-20nt。
在另一优选例中，所述Cas蛋白反式切割报告分子是核酸探针。
在另一优选例中，所述的核酸探针带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记包括荧光基团、淬灭基团。
在另一优选例中,所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、VIC、JOE、TET、Texas Red、FITC、LC RED640、RB200、或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：TAMARA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABSYL、Dabcyl、eclipse、或其组合。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
在另一优选例中，所述的核酸探针的长度为3-300nt，较佳地5-100nt，更佳地6-50nt，最佳地8-20nt。
在另一优选例中，所述核酸探针包括单链DNA。
在另一优选例中，所述的核酸探针包括带有可检测标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光和生物素标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光标记的单链DNA。
在另一优选例中，所述的单链DNA为在5'端标记荧光基团6-FAM并在3'端标记淬灭基团BHQ1的荧光探针。
在另一优选例中，所述的向导RNA的长度为20-28nt，较佳地20-25nt，更佳地20-23nt。
在另一优选例中，所述的检测包括：定性检测或定量检测。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有(e)缓冲液。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的非核酸靶标。
在另一优选例中，所述的待检测的非核酸靶标在所述检测体系中的浓度为0.1pM-100mM；较佳地，0.1nM-500nM；更佳地，0.5nM-500nM；又更佳地，1nM-500nM。
在另一优选例中，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白在所述检测体系中的浓度为0.01uM-1uM。
在另一优选例中，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白在所述检测体系中的浓度为0.01uM-1uM。
在另一优选例中，所述向导RNA在所述检测体系中的浓度为0.005uM-0.5uM。
在另一优选例中，所述顺式切割底物或顺式切割报告分子在所述检测体系中的浓度为0.05uM-0.5uM。
在另一优选例中，所述反式切割报告分子的0.25uM-2.5uM。
在另一优选例中，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述向导RNA，所述顺式切割底物或顺式切割报告分子，所述反式切割报告分子的摩尔数比为0.5-2：0.5-2：0.25-1：2.5-10：12.5-50。
本发明第二方面提供了一种检测非核酸靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白；所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；
iii)任选的第三容器以及位于第三容器内的Cas蛋白反式切割报告分子；
iv)第四容器以及位于第四容器内的向导RNA；
v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液。
在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器中的任何二个、三个、或四个或五个(或全部)可以是相同(或同一)或不同容器。
在另一优选例中，所述第二容器中为Cas蛋白顺式切割报告分子时，所述第一容器、第二容器和第四容器为相同或同一容器。
在另一优选例中，所述第二容器中为Cas蛋白顺式切割底物时，所述第一容器、第二容器、第三容器和第四容器为相同或同一容器。
在另一优选例中，所述第一容器、第二容器和第四容器、第五容器为相同或同一容器。
在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器为相同或同一容器。
本发明第三方面提供了一种检测非核酸靶标的方法，包括以下步骤：
提供本发明第一方面所述的检测非核酸靶标的检测体系，并且所述的检测体系还含有待检测的样本，并对检测体系发出的信号进行检测，
其中，如果检测到检测体系发出的信号，则表示所述样本中存在非核酸靶标；而如果检测不到检测体系发出的信号，则表示所述样本中不存在非核酸靶标。
在另一优选例中，所述方法包括将第一检测体系和第二检测体系混合，对检测体系发出的信号进行检测的步骤；所述第一检测体系包括第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白，以及待检测的样本；所述第二检测体系包括Cas蛋白顺式切割底物、Cas蛋白反式切割报告分子和向导RNA，或者所述第二检测体系包括Cas蛋白顺式切割报告分子和向导RNA；所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
在另一优选例中，所述Cas蛋白顺式切割报告分子或所述Cas蛋白反式切割报告分子的信号选自下组：基于金纳米颗粒的检测信号、基于荧光团的检测信号、基于荧光偏振的检测信号、基于胶体相变/分散的检测信号、基于电化学的检测信号、基于半导体的检测信号或其组合。
在另一优选例中，所述检测包括荧光检测法、胶体金检测法。
在另一优选例中，所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。
本发明第四方面提供了一种组合物或产品组合，其特征在于，包括：
(a1)第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
(a2)第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
本发明第五方面提供了一种组合物或产品组合的用途，所述组合如本发明第四方面所述，其特征在于，所述组合物或产品组合的用途是用于制备检测非核酸靶标的试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。
本发明第六方面提供了一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒或检测非核酸靶标的体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得第一融合蛋白或第一结合蛋白；
获得第二融合蛋白或第二结合蛋白；
获得Cas蛋白顺式切割底物；
获得向导RNA；
所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
在另一优选例中，还包括如下步骤：获得中间一段或多段融合蛋白或结合蛋白。
在另一优选例中，所述获得第一或第二融合蛋白包括以下步骤：
a1、构建所述第一或第二融合蛋白的表达质粒、构建所述第一或第二融合蛋白的病毒表达载体、构建整合有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的染色体、构建含有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的转座子或构建基因组中整合有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的噬菌体；或者构建所述第一或第二融合蛋白的DNA或者mRNA；
a2、将所述表达质粒、所述病毒表达载体、所述染色体、所述转座子或所述噬菌体转化进宿主；或者将所述第一或第二融合蛋白的DNA或者mRNA置于无细胞蛋白质合成系统；
a3、表达产生所述第一或第二融合蛋白；
a4、提取所述第一或第二融合蛋白；
a5、纯化所述第一或第二融合蛋白。
在另一优选例中，所述获得中间一段或多段融合蛋白包括以下步骤：
a1、构建所述中间一段或多段融合蛋白各自的表达质粒、构建所述中间一段或多段融合蛋白各自的病毒表达载体、构建整合有所述中间一段或多段融合蛋白的基因序列各自的染色体、构建含有所述中间一段或多段融合蛋白的基因序列各自的转座子或构建基因组中整合有所述中间一段或多段融合蛋白的基因序列各自的噬菌体；或者构建所述中间一段或多段融合蛋白各自的DNA或者mRNA；
a2、将所述各自的表达质粒、所述各自的病毒表达载体、所述各自的染色体、所述各自的转座子或所述噬菌体转化进各自的宿主；或者将所述中间一段或多段融合蛋白各自的DNA或者mRNA置于无细胞蛋白质合成系统；
a3、各自表达产生所述中间一段或多段融合蛋白；
a4、各自提取所述中间一段或多段融合蛋白；
a5、各自纯化所述中间一段或多段融合蛋白。
在另一优选例中，所述宿主选自以下组：原核细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述宿主为：大肠杆菌。
在另一优选例中，所述获得Cas蛋白顺式切割底物的方法是化学合成。
在另一优选例中，所述获得向导RNA的方法是化学合成。
在另一优选例中，还包括以下步骤：获得Cas蛋白反式切割报告分子；优选地，所述获得Cas蛋白反式切割报告分子的方法是化学合成。
在另一优选例中，还包括以下步骤：获得缓冲液。
本发明第七方面提供了一种Cas蛋白的拆分蛋白、Cas蛋白顺式切割底物、Cas蛋白顺式切割报告分子、向导RNA、Cas蛋白反式切割报告分子或缓冲液的用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。
在另一优选例中，所述非核酸靶标选自以下组：药物残留、杀虫剂残留物、有机污染物、临床标志物或其组合；所述药物残留选自下组：氨苄青霉素(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)、土霉素(Oxytetracycline)、青霉素G(Penicillin G)、恩诺沙星(Enrofloxacin)、双氯芬酸(Diclofenac)、磺胺地索辛(Sulfadimethoxine)、多巴胺(Dopamine)、林可霉素(Lincomycin)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、克仑特罗/瘦肉精(Clenbuterol)、孔雀绿(Malachite green)或其组合；
所述杀虫剂残留物选自下组：啶虫脒(Acetamiprid)、阿特拉津(Atrazine)、马拉息昂(Malathion)、克瘟散(Edifenphos)、异稻瘟净(Iprobenfos)、甲拌磷(Phorate)、氧化乐果(omethoate)、水胺硫磷(Isocarbophos)或其组合；
所述有机污染物选自下组：BPA、PCB72、PCB106、PCB77或其组合；
所述临床标志物选自下组：睾酮(Testosterone)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、胰岛素(insulin)、肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、维生素D(vitamin D)、维生素B12(vitamin B12)、维生素B2(vitamin B2)、葡萄糖(glucose)。
本发明第八方面提供了一种试剂，包括：
第一融合蛋白或第一结合蛋白；
第二融合蛋白或第二结合蛋白；
Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；
向导RNA，所述向导RNA可引导Cas蛋白与所述Cas蛋白顺式切割底物结合；以及缓冲液；
所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的N端片段和所述Cas蛋白的C端片段构成全长的Cas蛋白。
在另一优选例中，所述试剂还包括：
一段到或多段中间融合蛋白，所述中间融合蛋白的结构包括Cas蛋白的中间片段及位于所述Cas蛋白的中间片段两端的靶标受体，所述Cas蛋白的中间片段和所述靶标受体之间还可以包括连接肽；所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段及一段或多段Cas蛋白的中间片段构成全长的Cas蛋白。。
在另一优选例中，所述试剂还包括：Cas蛋白反式切割报告分子。
在另一优选例中，所述试剂还包括：缓冲液。
本发明第九方面提供了一种试剂的用途，所述试剂如本发明第八方面所述，用于制备检测非核酸靶标的试剂或试剂盒，或者用于检测非核酸靶标。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是基于拆分CRISPR/LbCas12a的均相非核酸靶标检测方法示意图。
图2是基于拆分CRISPR/LbCas12a检测雷帕霉素(Rapamycin)及其类似物特异性。
图3是基于拆分CRISPR/LbCas12a检测雷帕霉素浓度梯度荧光曲线图。
图4是基于拆分CRISPR/LbCas12a检测雷帕霉素荧光法灵敏度。
图5是基于拆分CRISPR/LbCas12a检测雷帕霉素胶体金法灵敏度。
图6是基于拆分CRISPR/LbCas12a检测脱落酸特异性。
图7是基于拆分CRISPR/Cas12a检测脱落酸浓度梯度荧光曲线图。
图8是基于拆分CRISPR/Cas12a检测脱落酸荧光法灵敏度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可检测非核酸靶标的检测体系，该检测体系含有(a)第一融合蛋白(当受体为氨基酸受体，尤其是多肽时)或第一结合蛋白(当受体为非氨基酸受体时)，第二融合蛋白(当受体为氨基酸受体，尤其是多肽时)或第二结合蛋白(当受体为非氨基酸受体时)；(b)Cas蛋白顺式切割底物(采用凝胶电泳显示结果或采用反式切割进行信号报告时选用)或Cas蛋白顺式切割报告分子(采用顺式切割进行信号报告时选用)；(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和(d)任选的Cas蛋白反式切割报告分子(采用反式切割进行信号报告时选用)。本发明人首次发现，拆分Cas蛋白在N末端和C末端被拉近后仍然具有顺式切割活性和非特异性ssDNA或ssRNA的反式切割活性，本具体实施方式的体系可根据非核酸靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测，并且本具体实施方式首次采用拆分Cas蛋白检测非核酸靶标，具有灵敏度高、特异性强、耗时短的特点。在此基础上，本发明人完成了本具体实施方式。
术语
CRISPR-Cas：一种独特的源自细菌和古细菌的基因组元件，作为一种适应性免疫防御系统，以抵御入侵的噬菌体或外来核酸。该系统由成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(简称Cas蛋白、Cas)组成。
检测限(LOD)：样本中被分析物的最低浓度，可以以典型的95％的确定性概率一致地检测到。
术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语“II型Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)中II型家族的效应蛋白，其中最著名的是Cas9。Cas9是具有两个核酸酶结构域(RuvC和HNH)的蛋白质，在两条RNA的介导下顺式切割底物DNA产生带有平末端的双链断裂(DSB)。这两条RNA分子分别是crRNA和tracrRNA。可以将这两种RNA分子进行生物工程改造，组合成一个具备crRNA和tracrRNA功能的向导RNA分子(gRNA)。
术语“V型Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)中V型家族的效应蛋白，在N端具有多样性，但在C端保留一个统一的RuvC样内切酶(RuvC)结构域，源自由自主或非自主转座子编码的TnpB蛋白质(Shmakov,S.,Smargon,A.,Scott,D.,Cox,D.,Pyzocha,N.,Yan,W.,et al.(2017).Diversity and evolution of class 2CRISPR-Cassystems.Nat.Rev.Microbiol.15,169–182.doi:10.1038/nrmicro.2016.184)。根据不同的CRISPR效应蛋白，V型系统进一步细分为许多亚型。
术语“VI型Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)中VI型家族的效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性。
术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。
术语“Cas12b”、“C2c1”可互换使用，是指sgRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-B型的酶。
术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是与CRISPR效应蛋白靶向的DNA序列直接相邻的短DNA序列，是Cas12a或Cas12b切割双链DNA所必须，比如，Cas12a的PAM为TTTV，AacCas12b的PAM为TTN序列。
Cas蛋白
本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(有些文献翻译为CRISPR-Cas效应蛋白、CRISPR/Cas效应蛋白、CRISPR-Cas效应子、CRISPR/Cas效应子)，可以为II型Cas蛋白、V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白。本具体实施方式所述的Cas蛋白为具有顺式切割活性的蛋白，还可以为同时具有顺式切割活性及反式切割活性的蛋白，例如V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白，其一旦在向导RNA引导下与顺式切割底物结合形成Cas蛋白-向导RNA-顺式切割底物的三元复合物，就可以诱发其反式切割活性，即随机切割单链及其等同物(核酸等同物如核酸类似物)。
所述II型Cas蛋白选自以下组：II-A型Cas蛋白、II-B型Cas蛋白、II-C型Cas蛋白、II-C变体型Cas蛋白或其组合。
本具体实施方式所述的所述II型Cas蛋白包括Cas9，例如spCas9、FnCas9、SaCas9、NmCas9、St1Cas9、St3Cas9、CjCas9或其组合。
所述Cas9来源于以下种：化脓性链球菌(SpCas9)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)(St1Cas9、St3Cas9)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、新泽西弗朗西斯菌(Francisella novicida)(FnCas9)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)(NmCas9)或其组合。
所述VI型Cas蛋白是Cas13。
所述VI型Cas蛋白选自下组：VI-A型Cas蛋白、VI-B型Cas蛋白、VI-D型Cas蛋白、VI-X型Cas蛋白、VI-Y型Cas蛋白或其组合。
所述VI型Cas蛋白选自下组：Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas13e、Cas13f、Cas13x、Cas13y或其组合。
在一些实施方式中，所述Cas13蛋白是或源于以下的种：别样杆菌属(Alistipes)、厌氧唾液杆菌(Anaerosalibacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、伯杰菌属(Bergeyella)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、绿曲挠丝状菌属(Chloroflexus)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、梭菌属(Clostridium)、Demequina、优杆菌科(Eubacteriaceae)、优杆菌属(Eubacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Herbinix、Insolitispirillum、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特氏菌属(Listeria)、香味菌属(Myroides)、杆状杆菌(Paludibacter)、细菌杆菌(Phaeodactylibacter)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、冷弯菌属(Psychroflexus)、赖兴氏杆菌(Reichenbachiella)、红杆菌属(Rhodobacter)、里氏杆菌属(Riemerella)、Sinomicrobium、海旋菌属(Thalassospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)；优选地，沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)、斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)、毛螺科菌细菌(Lachnospiraceaebacterium)(如Lb MA2020、Lb NK4A179、Lb NK4A144)、Clostridiumaminophilum(如CaDSM 10710)、鸡肉杆菌(Carnobacterium gallinarum)(如Cg DSM4847)、丙酸杆菌(Paludibacter propionicigenes)(如Pp WB4)、魏斯特斯蒂芬氏李斯特氏菌(Listeriaweihenstephanensis)(如Lw FSL R9-0317)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceaebacterium)(如Lb FSL M6-0635)、瓦氏细单胞菌(Leptotrichia wadei)(如Lw F0279)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)(如Rc SB1003、Rc R121、Rc DE442)、口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)(如Lb C-1013-b)、Herbinix hemicellulosilytica、优杆菌科细菌(Eubacteriaceae bacterium)(如Eb CHKCI004)、布劳特氏菌属种(Blautiasp.)Marseille-P2398、纤毛菌属种(Leptotrichiasp.)口腔分类单元879str.F0557、聚集绿屈扰菌(Chloroflexus aggregans)、Demequina aurantiaca、海旋菌种(Thalassospirasp.)TSL5-1、假丁酸弧菌属种(Pseudobutyrivibrio sp.)OR37、丁酸弧菌属种(Butyrivibrio sp.)YAB3001、纤毛菌属种(Leptotrichia sp.)Marseille-P3007、Bacteroides ihuae、紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)(如PbKH3CP3RA)、Listeria riparia、Insolitispirillum peregrinum、别样杆菌属种(Alistipes sp.)ZOR0009、酿脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)(如Bp F0041)、拟杆菌属细菌(Bacteroidetes bacterium)(如Bb GWA2_31_9)、动物溃疡伯格菌(Bergeyellazoohelcum)(如Bz ATCC 43767)、犬咬二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)、希诺地米碳酸噬胞菌(Capnocytophaga cynodegmi)、Chryseobacterium carnipullorum、济州岛金黄杆菌(Chryseobacterium jejuense)、嗜鳃黄杆菌(Chryseobacteriumureilyticum)、嗜分支黄杆菌(Flavobacterium branchiophilum)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、黄杆菌属种(Flavobacterium sp.)316、Myroidesodoratimimus(如Mo CCUG 10230、MoCCUG 12901、Mo CCUG 3837)、Paludibacterpropionicigenes、Phaeodactylibacterxiamenensis、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(如Pg F0185、Pg F0568、PgJCVI SC001、Pg W4087)、马铃薯红单胞菌(Porphyromonas gulae)、卟啉单胞菌属种(Porphyromonas sp.)COT-052OH4946、树蛙普雷沃菌(Prevotella aurantiaca)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)(如Pb ATCC 33574)、Prevotella falsenii、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)(如Pi 17、Pi ZT)、Prevotella pallens(如Pp ATCC 700821)、Prevotella pleuritidis、解糖普雷沃菌(Prevotella saccharolytica)(如Ps F0055)、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MA2016、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MSX73、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P4-76、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-119、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-125、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-60、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)、Reichenbachiellaagariperforans、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、Sinomicrobium oceani、坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)(如Fn subsp.funduliforme ATCC 51357、FnDJ-2、Fn BFTR-1、Fnsubsp.Funduliforme)、坏疽梭杆菌(Fusobacterium perfoetens)(如Fp ATCC 29250)、溃疡梭杆菌(Fusobacterium ulcerans)(如Fu ATCC 49185)、厌氧唾液杆菌属种(Anaerosalibactersp.)ND1、产亚硝酸真杆菌(Eubacterium siraeum)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)(如Rfx XPD3002)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13a蛋白选自下组：LwaCas13a,LbaCas13a,LshCas13a,PprCas13a,EreCas13a,LneCa13a,CamCa s13a,RcaCas13a,HheCas13a,LbuCas13a,LseCas13a,LbmCas13a,LbnCas13a,RcsCa s13a,RcrCas13a,RcdCas13a,CgCas13a,Cg2Cas13a,LweCas13a,LbfCas13a,Lba4Ca s13a,Lba9Cas13a,LneCas13a,HheCas13a、RcaCas13a或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13a蛋白选自以下的种：拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、绿曲挠丝状菌属(Chloroflexus)、梭菌属(Clostridium)、Demequina、优杆菌属(Eubacterium)、Herbinix、Insolitispirillum、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特氏菌属(Listeria)、杆状杆菌(Paludibacter)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、红杆菌属(Rhodobacter)或海旋菌属(Thalassospira)；优选地，沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)、斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)、毛螺科菌细菌(Lachnospiraceaebacterium)(如Lb MA2020、Lb NK4A179、LbNK4A144)、Clostridium aminophilum(如CaDSM 10710)、鸡肉杆菌(Carnobacteriumgallinarum)(如Cg DSM 4847)、丙酸杆菌(Paludibacter propionicigenes)(如Pp WB4)、魏斯特斯蒂芬氏李斯特氏菌(Listeriaweihenstephanensis)(如Lw FSL R9-0317)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceaebacterium)(如Lb FSL M6-0635)、瓦氏细单胞菌(Leptotrichiawadei)(如Lw F0279)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)(如Rc SB 1003、Rc R121、RcDE442)、口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)(如Lb C-1013-b)、Herbinixhemicellulosilytica、优杆菌科细菌(Eubacteriaceae bacterium)(如Eb CHKCI004)、布劳特氏菌属种(Blautia sp.)Marseille-P2398、纤毛菌属种(Leptotrichia sp.)口腔分类单元879str.F0557、聚集绿屈扰菌(Chloroflexus aggregans)、Demequina aurantiaca、海旋菌种(Thalassospirasp.)TSL5-1、假丁酸弧菌属种(Pseudobutyrivibrio sp.)OR37、丁酸弧菌属种(Butyrivibrio sp.)YAB3001、纤毛菌属种(Leptotrichiasp.)Marseille-P3007、Bacteroides ihuae、紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)(如PbKH3CP3RA)、Listeria riparia、Insolitispirillum peregrinum或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b选自下组：Cas13b-t1、Cas13b-t2、Cas13b-t3、Cas13b-t4、Cas13b-t5、Cas13b-t6或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b选自下组：BzCas13b、PbCas13b、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、PsmCas13b、CcaCas13b、AspCas13b、PauCas13b、Pin2Cas13b,、Pin3Cas13b或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13b是或源于以下的种：别样杆菌属(Alistipes)、拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、伯杰菌属(Bergeyella)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、香味菌属(Myroides)、杆状杆菌(Paludibacter)、细菌杆菌(Phaeodactylibacter)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、冷弯菌属(Psychroflexus)、赖兴氏杆菌(Reichenbachiella)、里氏杆菌属(Riemerella)或Sinomicrobium；优选地，别样杆菌属种(Alistipes sp.)ZOR0009、酿脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)(如Bp F0041)、拟杆菌属细菌(Bacteroidetes bacterium)(如BbGWA2_31_9)、动物溃疡伯格菌(Bergeyellazoohelcum)(如Bz ATCC 43767)、犬咬二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga canimorsus)、希诺地米碳酸噬胞菌(Capnocytophagacynodegmi)、Chryseobacterium carnipullorum、济州岛金黄杆菌(Chryseobacteriumjejuense)、嗜鳃黄杆菌(Chryseobacteriumureilyticum)、嗜分支黄杆菌(Flavobacterium branchiophilum)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、黄杆菌属种(Flavobacterium sp.)316、Myroidesodoratimimus(如Mo CCUG 10230、Mo CCUG12901、Mo CCUG 3837)、丙酸杆菌(Paludibacterpropionicigenes)、Phaeodactylibacterxiamenensis、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(如Pg F0185、Pg F0568、PgJCVI SC001、Pg W4087)、马铃薯红单胞菌(Porphyromonas gulae)、卟啉单胞菌属种(Porphyromonas sp.)COT-052OH4946、树蛙普雷沃菌(Prevotella aurantiaca)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)(如Pb ATCC 33574)、Prevotella falsenii、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)(如Pi 17,Pi ZT)、Prevotella pallens(如Pp ATCC 700821)、Prevotella pleuritidis、解糖普雷沃菌(Prevotella saccharolytica)(如Ps F0055)、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MA2016、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)MSX73、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P4-76、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-119、普雷沃菌属种(Prevotella sp.)P5-125、普雷沃菌属种(Prevotellasp.)P5-60、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)、Reichenbachiellaagariperforans、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、Sinomicrobium oceani或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13c蛋白是或源于以下的种：梭杆菌属(Fusobacterium)或厌氧唾液杆菌(Anaerosalibacter)；优选地，坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)(如Fn subsp.funduliforme ATCC 51357、Fn DJ-2、FnBFTR-1、Fn subsp.Funduliforme)、坏疽梭杆菌(Fusobacterium perfoetens)(如Fp ATCC29250)、溃疡梭杆菌(Fusobacteriumulcerans)(如Fu ATCC 49185)、厌氧唾液杆菌属种(Anaerosalibacter sp.)ND1或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13d选自下组：RspCas13d、RfxCas13d、EsCas13d、AdmCas13d或其组合。
在另一优选例中，所述Cas13d源于以下的种：优杆菌属(Eubacterium)或瘤胃球菌属(Ruminococcus)，优选地，产亚硝酸真杆菌(Eubacteriumsiraeum)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)(如Rfx XPD3002)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)或其组合。
所述V型Cas蛋白是Cas12或者C端具有RuvC结构的Cas蛋白是Cas12。
在另一优选例中，所述V型Cas蛋白选自下组：V-A型Cas蛋白、V-B型Cas蛋白、V-C型Cas蛋白、V-D型Cas蛋白、V-E型Cas蛋白、V-F型Cas蛋白、V-G型Cas蛋白、V-H型Cas蛋白、V-I型Cas蛋白、V-J型Cas蛋白、V-K型Cas蛋白、V-L型Cas蛋白或其组合；
或者，所述V型Cas蛋白选自下组：Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas12l或其组合；
另一优选例中，所述Cas12a选自下组：FnCas12a、LbCas12a、ErCas12a、Evcas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a、CeCas12a、PrCas12a、CsbCas12a、BhCas12a、SsCas12a、Lb3Cas12a、BpCas12a、PdCas12a、BfCas12a、PcCas12a、cMtCas12a、PeCas12a、LiCas12a、Lb2Cas12a、PmCas12a、MbCas12a、EeCas12a、CsbCas12a、ArCas12a、BsCas12a、AbCas12a、AsCas12a、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12a的来源选自下组：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属、毛螺菌属、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12a的来源选自下组：图拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)(FnCas12a)、氨基酸球菌属BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)(AsCas12a)、毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)(LbCas12a)、毛螺菌科细菌NC2008(Lachnospiraceae bacterium NC2008)(Lb5Cas12a)、孔氏创伤球菌(Helcococcussp kunzii)(HkCas12a)、Oribacteriumsp.NK2B42(OsCas12a)、Thiomicrospira sp.XS5(TsCas12a)、拟杆菌KA00251(Bacteroidales bacterium KA00251)(BbCas12a)、口腔拟杆菌(Bacteroidetes oral taxon 274)(BoCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceaebacterium MC2017)(Lb4Cas12a)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)(CeCas12a)、栖瘤胃普氏菌(Prevotella ruminicola strain BPI-34)(PrCas12a)、CandidatusSaccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungateistrain MB2003)(BhCas12a)、史密斯氏菌SC_K08D17(Smithella sp.SC_K08D17)(SsCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)(Lb3Cas12a)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Bytyrivibrio proteoclasticus)(BpCas12a)、普氏杆菌(Prevotelladisens)(PdCas12a)、溶纤维丁酸弧菌MD2001(Butyrivibrio fibrisolvens MD2001)(BfCas12a)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)PcCas12a、CandidatusMethanoplasma termitum(CMtCas12a)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)(PeCas12a)、Leptospira inadaiserovar Lyme(LiCas12a)、毛螺菌科细菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020)(Lb2Cas12a)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacaca)(PmCas12a)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovoculi 237)(MbCas12a)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)(EeCas12a)、Candidatus Saccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、直肠真杆菌(Eubacte riumrectale)(ErCas12a)、直肠酵母菌(Agathobacterrectalisstrain)(ArCas12a)、丁酸弧菌NC3005(Butyrivibrio sp.NC3005)(BsCas12a)、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)(AbCas12a)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12b的来源选自下组：卡克氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)、芽孢杆菌属V3-13种、外村尚芽孢杆菌(Bacillushisashii)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeria bacterium)、沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12b选自下组：AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AapCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b或其组合。
表1V型家族效应子属性(来源于：doi:10.3389/fcell.2020.622103)
aV代表A,C,和G.
bR代表A和G CB代表C，G和T。
在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas9、Cas12或Cas13，也涵盖Cas蛋白的功能变体或其同源物或直系同源物。中国专利申请CN202210508434.7中公开的Cas12a突变体，可用于本具体实施方式。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。
在一个实施方式中，II型Cas蛋白、V型Cas蛋白、VI型Cas蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变，并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。
融合蛋白或结合蛋白
如本文所用，本具体实施方式融合蛋白或结合蛋白包括第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白；
其中，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如下式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
在本具体实施方式中，第一连接肽、第二连接肽的长度独立地为0-1000aa，较佳地1-80aa，更佳地，5-60aa，又更佳地，10-50aa。一种优选的连接肽如SEQ IDNO.:2、3所示。
优选地，所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段构成全长的Cas蛋白；
或者，所述融合蛋白还包括一段到或多段中间融合蛋白，所述中间融合蛋白的结构包括Cas蛋白的中间片段及位于所述Cas蛋白的中间片段两端的靶标受体，所述Cas蛋白的中间片段和所述靶标受体之间还可以包括连接肽；所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段及一段或多段Cas蛋白的中间片段构成全长的Cas蛋白。
如本文所用，术语“第一融合蛋白(第一结合蛋白)或第二融合蛋白(第二结合蛋白)”还包括SEQ ID NO.:4、5、6、7所示的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的融合蛋白。该术语还包括线性以及非线性的融合蛋白(如环肽)。
本具体实施方式还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本具体实施方式融合蛋白的功能或活性的多肽。本具体实施方式的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I或式II或其组合的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本具体实施方式还提供本具体实施方式第一融合蛋白(或第一结合蛋白)或第二融合蛋白(或第二结合蛋白)的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:4、5、6、7所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本具体实施方式的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在一优选实施方式中，本具体实施方式的第一融合蛋白(第一结合蛋白)或第二融合蛋白(第二结合蛋白)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4、5、6、7所示。
向导RNA(gRNA)
如本文所用，所述的“向导RNA”是成熟的crRNA与tracrRNA融合作为向导RNA，或者成熟的crRNA与scoutRNA融合作为向导RNA，或者crRNA单独作为向导RNA。
一般而言，向导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat sequences，又称DR序列)和导向序列(guide sequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA(如本具体实施方式中采用Cas12b的实施例)，也可以包括crRNA和scoutRNA，还可以只含有crRNA(如本具体实施方式中采用Cas12a的实施例)。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与顺式切割底物DNA具有足够互补性从而与所述顺式切割底物DNA杂交并引导CRISPR/Cas蛋白-向导RNA复合物与所述顺式切割底物DNA的特异性结合的多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与顺式切割底物DNA100％互补。所述的导向序列不与反式切割报告分子中的核酸互补。
在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应顺式切割底物DNA之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
本具体实施方式所述的crRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在两个序列之间的该位置上是同一的。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Pro.Natl.Acad.Sci.USA85:244,Thompson etal.,1994,Nucleic AcidsRes22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。
顺式(cis)切割活性
顺式切割活性是指Cas蛋白与向导RNA的同向重复序列结合，并在向导RNA的导向序列的引导下，识别并结合作为底物的核酸，与底物形成Cas蛋白-向导RNA-底物三元复合物，对底物进行特异性切割的活性。这样的底物，称为Cas蛋白顺式切割底物。当利用顺式切割活性进行检测时，对作为Cas蛋白顺式切割底物的核酸进行修饰，使其具有信号报告功能，这时这样的Cas蛋白顺式切割底物称为Cas蛋白顺式切割报告分子。
反式(trans)切割活性
反式切割活性是指Cas蛋白在向导RNA的同向重复序列结合，并在向导RNA的导向序列的引导下，识别并结合底物，与底物形成Cas蛋白-向导RNA-底物三元复合物，对底物进行特异性切割之外，对单链核酸分子(也可以为核酸分子的等同物，如核酸类似物分子)的非特异切割活性。如果对单链核酸分子进行修饰使其具有信号报告功能，在检测中这样的单链核酸分子被称为反式切割报告分子。反式切割报告分子，目前名称并不统一，或称为核酸探针(中国发明专利申请CN 107488710A)，或称为检测剂DNA(中国发明专利申请CN111630163A)，或称为掩蔽构建体(中国发明专利申请CN 115175996 A)，或称为单链核酸检测器(中国发明专利申请CN111690773A)。本申请的反式切割报告分子应作广义理解，包括核酸探针、检测剂DNA、掩蔽构建体和单链核酸检测器，以及由单链核酸的等同物(如单链核酸类似物)替代单链核酸构成的前述物质。
检测体系
本具体实施方式提供了一种检测非核酸靶标的检测体系，包括：
(a1)第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
(a2)第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
(b)Cas蛋白顺式切割底物(采用凝胶电泳显示结果或采用反式切割活性报告信号时选用)或Cas蛋白顺式切割报告分子(采用顺式切割活性报告信号时选用)；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
(d)任选的Cas蛋白反式切割报告分子(采用反式切割活性报告信号时选用)。
优选地，所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段构成全长的Cas蛋白；
或者，所述融合蛋白还包括一段到或多段中间融合蛋白，所述中间融合蛋白的结构包括Cas蛋白的中间片段及位于所述Cas蛋白的中间片段两端的靶标受体，所述Cas蛋白的中间片段和所述靶标受体之间还可以包括连接肽；所述Cas蛋白的N端片段、Cas蛋白的C端片段及一段或多段Cas蛋白的中间片段构成全长的Cas蛋白。
在一优选实施方式中，本具体实施方式的检测体系为拆分CRISPR/LbCas12a检测体系，包括：针对非核酸靶标的两个靶标受体与拆分CRISPR/LbCas12a蛋白的两个部分的融合体蛋白，CRISPR/LbCas12a激活双链DNA(activator dsDNA，即Cas蛋白顺式切割底物)，crRNA(即向导RNA)以及单链DNA(ssDNA)报告分子(即Cas蛋白反式切割报告分子)。
其中拆分CRISPR/LbCas12a蛋白为CRISPR/LbCas12a蛋白从N端730的氨基酸位点处拆分开的两个片段，两个靶标受体可以是与非核酸靶标特异性结合的氨基酸受体或非氨基酸受体，如核酸、蛋白，更具体地，如核酸适配体、多肽、抗体等。
crRNA是筛选出的高效激活CRISPR/LbCas12a蛋白的核酸内切酶活性的RNA，其序列见SEQ ID NO.8。CRISPR/LbCas12a激活双链DNA(activator dsDNA)是与crRNA对应的双链DNA，其序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
本具体实施方式的单链DNA(ssDNA)报告分子包括用于酶标仪荧光检测的ssDNAFQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA FB reporter；其中，所述ssDNA FQreporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5’-6FAM/CCCCCCCC/3’-BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5’-6FAM/CCCCCCCC/3’-BHQ1/；所述ssDNA FB reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和生物素(Biotin)标记的ssDNA,标记产物如下：/5FAM/CCCCCCCC/3’-Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5’-FAM/CCCCCCCC/3’-Bio/。
本具体实施方式的拆分CRISPR/LbCas12a蛋白和靶标受体的融合蛋白的制备方法包括：针对融合蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列，构建到pET28TEV表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
本具体实施方式提供基于拆分CRISPR/LbCas12a针对非核酸靶标的检测方法既可利用酶标仪荧光检测也可以利用免疫胶体金试纸条检测。当使用酶标仪荧光检测时，CRISPR/LbCas12a检测体系中DNA(ssDNA)报告分子为ssDNA FQ reporter，当使用免疫胶体金试纸条检测时，DNA(ssDNA)报告分子为ssDNA FB reporter。
在使用酶标仪荧光检测时，当拆分CRISPR/LbCas12a检测体系中存在待检测生物靶标分子时，待测生物靶标分子诱导靶标受体之间的二聚作用，使拆分LbCas12a片段重新结合并重新获得crRNA引导的DNA核酸酶活性。激活后的CRISPR/LbCas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样本中不存在靶标分子时，荧光读数显示为基底值。
在使用免疫胶体金试纸条检测时，将拆分CRISPR/LbCas12a检测体系切割后待检测样本加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的抗FAM抗体会与FAM标记的ssDNA报告分子结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告分子，从而显示条带；当拆分CRISPR/LbCas12a体系检测到非核酸靶标时，会将标记有FAM和生物素ssDNA报告分子切割断开，从而会有FAM标记的ssDNA片段被检测线抓获显色，当拆分CRISPR/LbCas12a体系检测不到非核酸靶标时，不能将标记有FAM和生物素ssDNA报告分子切割断开，从而不会产生FAM标记的ssDNA片段被检测线抓获的显色。
在本具体实施方式的各实施例中，以LbCas12a的Cas1-730片段、Cas731-1228片段为例，进行说明。其中，Cas1-730片段指基于SEQ ID NO.:1的Cas蛋白的氨基酸序列的第1-730位的片段，在下文也称LbCas12a蛋白的N730片段。Cas731-1228片段指基于SEQ ID NO.:1的Cas蛋白的氨基酸序列的第731-1228位的片段，在下文也称LbCas12a蛋白的C731片段。各实施例中拆分的cas蛋白(拆分cas protein)：指LbCas12a的从N端730氨基酸位点处拆分开的两个片段。当然，也可以从其他位点拆分，比如70、86、134、198、213、248、266、310、373、406、443、550、574、607、624、657、711、762、772、780、808、824、864、966、1039、1059、1078、1107、1118、1143、1157、1170、1202。
经过发明人实验验证，拆分的Cas蛋白在拆分处C末端和N末端被拉近后仍然具有顺式切割活性及非特异性的单链核酸及其等同物的反式切割活性。该体系可根据非核酸靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测。较佳地，拆分成两段的Cas蛋白在拆分处C末端和N末端被拉近后仍然具有顺式切割活性及非特异性ssDNA的反式切割活性；当然，也可以将Cas蛋白拆分成三段以上，如三段、四段、五段、六段、七段、八段、九段、十段。在下文中，本具体实施方式以两段为例。
参见图1，本具体实施方式的原理如下。
在使用酶标仪荧光检测时，当拆分CRISPR/LbCas12a检测体系中存在待检测生物靶标分子时，待测生物靶标分子诱导靶标受体之间的二聚作用，使拆分LbCas12a片段重新结合并重新获得crRNA引导的DNA核酸酶活性。激活后的CRISPR/LbCas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样本中不存在靶标分子时，荧光读数显示为基底值。
在使用免疫胶体金试纸条检测时，将拆分CRISPR/LbCas12a检测体系及待检测样本加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的抗FAM抗体会与FAM标记的ssDNA报告分子结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告分子，从而显示条带；当拆分CRISPR/LbCas12a体系检测到非核酸靶标时，会将标记有FAM和生物素ssDNA报告分子切割断开，从而会有FAM标记的ssDNA片段被检测线抓获显色，当拆分CRISPR/LbCas12a体系检测不到非核酸靶标时，不能将标记有FAM和生物素ssDNA报告分子切割断开，从而不会产生FAM标记的ssDNA片段被检测线抓获的显色。
因此，发明人提出了Cas蛋白的拆分蛋白的新用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。
发明人还提出了Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子的新用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。发明人还提出了向导RNA的新用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。发明人还提出了Cas蛋白反式切割报告分子的新用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。发明人还提出了缓冲液的新用途，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。
发明人还提出了一种组合物或产品组合，这种组合物或产品组合的用途是用于制备检测非核酸靶标的试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。在一个优选的具体实施方式中，该组合物或产品组合包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白、Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子、向导RNA；进一步，还可以包括缓冲液。此技术方案是利用Cas蛋白的顺式切割活性进行检测，通过对产物的凝胶电泳或通过Cas蛋白顺式切割报告分子得到检测结果。在另一个优选的具体实施方式中，该组合物包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白、Cas蛋白顺式切割底物、向导RNA、Cas蛋白反式切割报告分子；进一步，还可以包括缓冲液。此技术方案是利用Cas蛋白的反式切割活性进行检测，通过Cas蛋白反式切割报告分子得到检测结果。
发明人还提出了一种试剂，该试剂用于制备检测非核酸靶标的试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。在一个优选的具体实施方式中，该试剂包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白，Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子、向导RNA、缓冲液。这种试剂是利用Cas蛋白的顺式切割活性进行检测，通过对产物的凝胶电泳或通过Cas蛋白顺式切割报告分子得到检测结果。在另一个优选的具体实施方式中，该试剂包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白，Cas蛋白顺式切割底物、向导RNA、缓冲液、Cas蛋白反式切割报告分子。此试剂是利用Cas蛋白的反式切割活性进行检测，通过Cas蛋白反式切割报告分子得到检测结果。
发明人还提出了一种试剂盒，该试剂盒用于检测非核酸靶标的方法。在一个优选的具体实施方式中，该试剂盒包括：第一容器及位于所述第一容器内的第一融合蛋白或第一结合蛋白，第二融合蛋白或第二结合蛋白；第二容器及位于所述第二容器内的Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子、第四容器及位于所述第四容器中的向导RNA、第五容器及位于所述第五容器中的缓冲液。这种试剂盒是利用Cas蛋白的顺式切割活性进行检测，通过对产物的凝胶电泳或通过Cas蛋白顺式切割报告分子得到检测结果。在另一个优选的具体实施方式中，该试剂盒包括：第一容器及位于所述第一容器内的第一融合蛋白或第一结合蛋白，第二融合蛋白或第二结合蛋白；第二容器及位于所述第二容器内的Cas蛋白顺式切割底物；第三容器及位于所述第三容器中的Cas蛋白反式切割报告分子；第四容器及位于所述第四容器中的向导RNA；第五容器及位于所述第五容器中的缓冲液。此试剂盒是利用Cas蛋白的反式切割活性进行检测，通过Cas蛋白反式切割报告分子得到检测结果。
发明人还提出了一种检测非核酸靶标的体系。在一个优选的具体实施方式中，所述检测非核酸靶标的体系包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白、Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子、向导RNA及缓冲液。这种检测非核酸靶标的体系是利用Cas蛋白的顺式切割活性进行检测，通过对产物的凝胶电泳或通过Cas蛋白顺式切割报告分子得到检测结果。在另一个优选的具体实施方式中，所述检测非核酸靶标的体系包括：第一融合蛋白或第一结合蛋白、第二融合蛋白或第二结合蛋白、Cas蛋白顺式切割底物、向导RNA、Cas蛋白反式切割报告分子及缓冲液。这种试剂盒是利用Cas蛋白的反式切割活性进行检测，通过Cas蛋白反式切割报告分子得到检测结果。
发明人还提出了基于前述组合物、试剂、试剂盒或检测非核酸靶标的体系的检测方法。优选地，所述一种检测非核酸靶标的方法，包括以下步骤：将待检样本与前述一个优选的具体实施方式中的组合物、前述试剂、前述试剂盒中的试剂或前述检测体系接触获得第一产物；将第一产物凝胶电泳或者检测第一产物的顺式切割信号。更优选地，所述一种检测非核酸靶标的方法，包括以下步骤：将待检样本与另一个优选的具体实施方式中的所述的组合物、所述试剂、所述的试剂盒中的试剂或前述检测体系接触获得第二产物；检测第二产物的反式切割信号。
在本具体实施方式的一个优选的实施方式中，所述的组合物、试剂、试剂盒、检测非核酸靶标的体系、检测方法中，所述Cas蛋白的N端片段和所述Cas蛋白的C端片段构成全长的Cas蛋白。所述Cas蛋白的N端片段为70-1170个氨基酸残基；Cas蛋白的C端为58-1158个氨基酸残基。所述所述Cas蛋白的N端片段Cas蛋白的第一拆分蛋白来源于Lachnospiraceaebacterium；所述Cas蛋白的C端片段来源于Lachnospiraceae bacterium。
本具体实施方式所述的非核酸靶标选自：雷帕霉素(Rapamycin)，又称西罗莫司(Sirolimus)是一种大环内酯类免疫抑制剂，适用于接受肾移植的患者，预防器官排斥；脱落酸(abscisic acid，ABA)是植物体内一种重要的激素，由类胡萝素降解形成，有阻遏赤霉酸及细胞分裂素促进生长的作用；与叶子的衰老、果实的脱落等有关。虽然含量甚微，但对调节植物体的生长、成熟和衰老有着重要的作用。
本具体实施方式所述的Cas蛋白是II型Cas蛋白、V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白；或者所述Cas蛋白是具有RuvC结构或HEPN结构的Cas蛋白。进一步，所述II型Cas蛋白是Cas9；所述V型Cas蛋白是Cas12；所述VI型Cas蛋白是Cas13，或者所述具有RuvC结构或HEPN结构的的Cas蛋白是Cas9、Cas12、Cas13。又进一步，所述II型Cas蛋白是II-A型、II-B型或者II-C型Cas蛋白；所述V型Cas蛋白是V-A型、V-B型、V-C型、V-D型、V-E型、V-F型、V-G型、V-H型、V-I型、V-J型、V-K型Cas蛋白或V-L型Cas蛋白；所述VI型Cas蛋白是VI-A、VI-B、VI-C、VI-D、VI-X或VI-Y。或者，所述II型Cas蛋白是Cas9a、Cas9b或Cas9c；所述V型Cas蛋白是Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k或Cas12l蛋白。
本具体实施方式所述的Cas12a选自下组：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a、CeCas12a、PrCas12a、CsbCas12a、BhCas12a、SsCas12a、Lb3Cas12a、BpCas12a、PdCas12a、BfCas12a、PcCas12a、cMtCas12a、PeCas12a、LiCas12a、Lb2Cas12a、PmCas12a、MbCas12a、EeCas12a、CsbCas12a、ErCas12a、ArCas12a、BsCas12a、AbCas12a或其组合。或者，所述Cas12a的来源选自下组：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属、毛螺菌属、或其组合。或者，所述Cas12a的来源选自下组：图拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(FnCas12a)、氨基酸球菌属BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)(AsCas12a)、毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceaebacterium ND2006)(LbCas12a)、毛螺菌科细菌NC2008(Lachnospiraceae bacteriumNC2008)(Lb5Cas12a)、孔氏创伤球菌(Helcococcus sp kunzii)(HkCas12a)、Oribacteriumsp.NK2B42(OsCas12a)、Thiomicrospira sp.XS5(TsCas12a)、拟杆菌KA00251(Bacteroidales bacterium KA00251)(BbCas12a)、口腔拟杆菌(Bacteroidetes oraltaxon 274)(BoCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)(Lb4Cas12a)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)(CeCas12a)、栖瘤胃普氏菌(Prevotella ruminicola strain BPI-34)(PrCas12a)、Candidatus Saccharibacteriabacterium(CsbCas12a)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei strain MB2003)(BhCas12a)、史密斯氏菌SC_K08D17(Smithella sp.SC_K08D17)(SsCas12a)、毛螺菌科细菌MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)(Lb3Cas12a)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Bytyrivibrio proteoclasticus)(BpCas12a)、普氏杆菌(Prevotella disens)(PdCas12a)、溶纤维丁酸弧菌MD2001(Butyrivibrio fibrisolvens MD2001)(BfCas12a)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)PcCas12a、CandidatusMethanoplasma termitum(CMtCas12a)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)(PeCas12a)、Leptospira inadaiserovar Lyme(LiCas12a)、毛螺菌科细菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020)(Lb2Cas12a)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacaca)(PmCas12a)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovoculi 237)(MbCas12a)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)(EeCas12a)、Candidatus Saccharibacteria bacterium(CsbCas12a)、直肠真杆菌(Eubacte riumrectale)(ErCas12a)、直肠酵母菌(Agathobacterrectalisstrain)(ArCas12a)、丁酸弧菌NC3005(Butyrivibrio sp.NC3005)(BsCas12a)、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)(AbCas12a)或其组合。
本具体实施方式所述的Cas12b的来源选自下组：卡克氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)、芽孢杆菌属V3-13种、外村尚芽孢杆菌(Bacillushisashii)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeria bacterium)和沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis).进一步，所述Cas12b选自下组：AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AapCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12b和LsCas12b。
本具体实施方式所述的第一特异性靶标受体和/或第二特异性靶标受体是多肽或核酸。
本具体实施方式所述的Cas蛋白顺式切割底物是dsDNA、ssDNA或RNA。具体而言，Cas蛋白顺式切割底物与Cas蛋白的种类有关。如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12h、Cas12i或Cas12j的顺式切割底物可以是dsDNA，也可以是ssDNA；Cas12e或Cas12k的顺式切割底物是dsDNA；Cas12f、Cas12g的顺式切割底物是ssDNA。
本具体实施方式所述的Cas蛋白反式切割报告分子选自：荧光报告分子、试纸条报告分子、掩蔽构建体报告分子、电化学传感器报告分子；或者所述Cas蛋白反式切割报告分子选自基于金纳米颗粒的检测报告分子、基于荧光团的检测报告分子、基于荧光偏振的检测报告分子、基于胶体转变/分散的检测报告分子、基于电化学信号的检测报告分子、基于半导体信号的检测报告分子、基于颜色的检测报告分子。
本具体实施方式所述的缓冲液选自：HOLMES缓冲液、HOLMES Ca2+缓冲液、NEBuffer1.1、NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1、CutSmart、NEBuffer r1.1、NEBuffer r2.1、NEBufferr3.1、NEBuffer r3.1、rCutSmart缓冲液。HOLMES缓冲液、HOLMES Ca2+缓冲液购自安徽吐露港生物科技有限公司，NEBuffer系列和rCutSmart缓冲液购自New England Biolabs。
发明人还提出了前述组合物、试剂、试剂盒或检测非核酸靶标的体系的制备方法，包括如下步骤：
获得第一融合蛋白或第一结合蛋白；
获得第二融合蛋白或第二结合蛋白；
获得Cas蛋白顺式切割底物；以及
获得向导RNA。
获得所述第一或第二融合蛋白包括以下步骤：
a1、构建所述第一或第二融合蛋白的表达质粒、构建所述第一或第二融合蛋白的病毒表达载体、构建整合有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的染色体、构建含有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的转座子或构建基因组中整合有所述第一或第二融合蛋白的基因序列的噬菌体；或者构建所述第一或第二融合蛋白的DNA或者mRNA；
a2、将所述表达质粒、所述病毒表达载体、所述染色体、所述转座子或所述噬菌体转化进宿主；或者将所述第一或第二融合蛋白的DNA或者mRNA置于无细胞蛋白质合成系统；
a3、表达产生所述第一或第二融合蛋白；
a4、提取所述第一或第二融合蛋白；
a5、纯化所述第一或第二融合蛋白。
所述宿主选自：原核细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述宿主为：原核细胞。
在本具体实施方式中，所述获得Cas蛋白顺式切割底物的方法是化学合成；
在本具体实施方式中，所述获得向导RNA的方法是化学合成。
本具体实施方式的主要优点包括：
(1)本具体实施方式首次开发了一种可检测非核酸靶标的检测体系，该检测体系含有(a)第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白；(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；还可以进一步包括(d)Cas蛋白反式切割报告分子。本发明人首次发现，拆分Cas蛋白在N末端和C末端被拉近后仍然具有顺式切割活性及非特异性ssDNA的反式切割活性，本具体实施方式的体系可根据非核酸靶标灵活更换受体，实现各类非核酸靶标的检测，并且本具体实施方式首次采用拆分Cas蛋白检测非核酸靶标，具有灵敏度高、特异性强、耗时短的特点。
(2)本具体实施方式首次采用拆分CRISPR/Cas12a检测非核酸靶标，具有灵敏度高、特异性强、耗时短等优势。这些优势使得本具体实施方式开发的基于拆分CRISPR/Cas12a胶体金试纸检测方法方便用于实验室和临床医学对生物标志物、代谢物等的快速检测和诊断。
下面结合具体实施例，进一步阐述本具体实施方式。应理解，这些实施例仅用于说明本具体实施方式而不用于限制本具体实施方式的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则本具体实施方式实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1：雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物的快速灵敏检测1.1蛋白制备
本实施例中的FKB和FKBP基因片段，是参考NCBI数据库中FRB和FKBP基因片段(登录号NP_001373429.1第2021-2114位点氨基酸(对应FRB)和登录号NP_000792.1(对应FKBP基因)，并分别与LbCas12a蛋白(SEQ ID NO.1)的N730和C731片段拼接在一起，进行原核密码子优化获得序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成拼接后的基因，并构建到pET28TEV载体，分别命名为pET28TEV-N730-FRB和pET28TEV-FKBP-C731，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白，分别命名为N730-FRB(SEQ IDNO.:4)和FKBP-C731(SEQ ID NO.:5)。
1.2crRNA和activator dsDNA(Cas蛋白顺式切割底物)的制备
crRNA是筛选出的高效激活CRISPR/LbCas12a蛋白的核酸内切酶活性的RNA，CRISPR/LbCas12a激活双链DNA(activator dsDNA)是与crRNA对应的双链DNA，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成。
本实施例提供的crRNA和activator dsDNA为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10，具体信息如表2所示。
表2crRNA和activator dsDNA
本检测采用最终体积20μL体系如表3、表4所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表3分子靶标与拆分LbCas12a预孵育体系
表4拆分CRISPR/Cas12a荧光法检测体系
其中，反式切割报告分子为ssDNA FQ报告分子。
10×缓冲液I成分包括10×HOLMES缓冲液I(购自安徽吐露港生物科技有限公司，下同)，将pH值由8.5调整为7.4，并添加终浓度为100mM的NaCl和体积比为0.2％的吐温20。
1.3全波长酶标仪荧光检测雷帕霉素及其类似物特异性
在特异性检测案例中，先将雷帕霉素及其类似物Everolimus、Deforolimus，以及对照物Rifamycin、Ampicillin、Kanamycin、Spectinomycin、Chloromycetin、tacrolimus、DMSO分别与拆分LbCas12a融合蛋白在室温按照表2.1体系预孵育10min，之后再加入表2.2中的预先混匀的荧光检测体系，混合均匀后于37℃反应5min。
利用荧光检测判定拆分CRISPR/LbCas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，在反应5min处检测荧光数值。该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对雷帕霉素及其类似物包括但不限于Everolimus、Deforolimus的特异性检测，见图2。
1.4全波长酶标仪荧光检测雷帕霉素的灵敏度
在灵敏度检测案例中，先将雷帕霉素进行梯度稀释，获得浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56nM的待测样本，分别将其与拆分LbCas12a融合蛋白在室温按照表2.1体系预孵育10min，之后再加入表2.2中的预先混匀的荧光检测体系，混合均匀后于37℃反应5min。
本实施例中，利用荧光检测判定拆分CRISPR/LbCas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，在反应30min，检测荧光数值，见图3。本实施例中，应用拆分CRISPR/LbCas12a荧光法检测雷帕霉素，能够实现1.56nM的雷帕霉素高灵敏度检出，见图4。
1.5胶体金试纸条检测雷帕霉素的灵敏度
根据实施例1.4所得结果，利用拆分CRISPR/LbCas12a体系检测雷帕霉素具有高灵敏度，因此采用该体系进行后续胶体金试纸条检测。
本检测采用最终体积50μL体系如表5、表6所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表5靶标与拆分LbCas12a预孵育体系
表6拆分CRISPR/Cas12a胶体金法检测体系
其中，反式切割报告分子为ssDNA FB reporter。
10×缓冲液I成分包括10×HOLMES缓冲液I，将pH值由8.5调整为7.4，并添加终浓度为100mM的NaCl和体积比为0.2％的Tween20。
本实施例中，先将雷帕霉素进行梯度稀释，获得浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.12nM的待测样本，分别将其与拆分LbCas12a融合蛋白在室温按照表3.1体系预孵育10min，之后再加入表3.2中的预先混匀的检测体系，混合均匀后于37℃反应30min，随后插入本实施例中胶体金试纸条，并在室温下温育3min。判定试纸条检测结果，拍照保存，见图5。结果显示，拆分CRISPR/LbCas12a荧光法和胶体金试纸条均能够实现对雷帕霉素灵敏、快速、准确检测。
实施例2：脱落酸(Abscisic Acid，ABA)的快速灵敏检测
2.1蛋白制备
本案例中的ABI和PYL1基因片段，是参考NCBI数据库中ABI和PYL1基因片段(登录号NC_003075.7，第126-424位点氨基酸(对应于ABI)和登录号NP_001331305.1，第33-210位点氨基酸(对应于PYL1)，并分别与LbCas12a蛋白(SEQ ID NO.1)的N730和C731片段拼接在一起，进行原核密码子优化获得序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成拼接后的基因，并构建到pET28TEV载体，分别命名为pET28TEV-N730-ABI和pET28TEV-PLY1-C731，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白，分别命名为N730-ABI(SEQ ID NO.:6)和PLY1-C731(SEQ ID NO.:7)。
2.2crRNA和activator dsDNA的制备
crRNA是筛选出的高效激活CRISPR/LbCas12a蛋白的核酸内切酶活性的RNA，CRISPR/LbCas12a激活双链DNA(activator dsDNA)是与crRNA对应的双链DNA，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成。
本实施例提供的crRNA和activator dsDNA为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10，具体信息如表1所示。
本检测采用最终体积20μL体系如表7、表8所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表7分子靶标与拆分LbCas12a预孵育体系
表8拆分CRISPR/Cas12a荧光法检测体系
其中，反式切割报告分子为ssDNA FQ reporter。
10×缓冲液II成分为10×HOLMES缓冲液I，将pH值由8.5调整为8.0，并添加终浓度为800mM的NaCl，pH为5.5且终浓度为200mM的NaAc，体积比为0.2％的Tween20。
2.3全波长酶标仪荧光检测ABA特异性
在特异性检测案例中，先将ABA以及对照物Maleic hydrazide、Gibberellin、Zeatin、Chlormequat、Epibrassinolide、Kinetin、6-Benzyl aminopurine、indole-3-acetic acid、DMSO分别与拆分LbCas12a融合蛋白在室温按照表4.1体系预孵育10min，之后再加入表4.2中的预先混匀的荧光检测体系，混合均匀后于37℃反应5min。
利用荧光检测判定拆分CRISPR/LbCas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，在反应5min处检测荧光数值。该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对ABA的特异性检测，见图6。
2.4全波长酶标仪荧光检测ABA的灵敏度
在灵敏度检测案例中，先将ABA进行梯度稀释，获得浓度为500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.80nM的待测样本，分别将其与拆分LbCas12a融合蛋白在室温按照表4.1体系预孵育10min，之后再加入表4.2中的预先混匀的荧光检测体系，混合均匀后于37℃反应5min。
本实施例中，利用荧光检测判定拆分CRISPR/LbCas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，在反应30min，检测荧光数值，见图7。本实施例中，应用拆分CRISPR/LbCas12a荧光法检测ABA，能够实现7.80nM的ABA高灵敏度检出，见图8。
序列信息：
SEQ ID NO.:1LbCas12a
MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDENNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIDRGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKH*
SEQ ID NO.2，连接肽
EFGGSGSSGGSGGSGGSG
SEQ ID NO.3，连接肽
GGSGGSGGGSGSGSGGGT
SEQ ID NO.:4，N730-FRB(LbCas12a的N端片段(Cas1-730片段)-连接肽-雷帕霉素受体)MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDEEFGGSGSSGGSGGSGGSGILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKGGSGGSGGGSGSGSGG*
SEQ ID NO.:5，FKBP-C731(雷帕霉素受体-连接肽-LbCas12a的C端片段(Cas731-1228片段))MGGSGSSGGSGGSGGSGMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGSGGSGGGSGSGSGGGTNNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIDRGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKH*
SEQ ID NO.:6，N730-ABI(LbCas12a的N端(N730)+连接肽+脱落酸受体)MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDEEFGGSGSSGGSGGSGGSGVPLYGFTSICGRRPEMEAAVSTIPRFLQSSSGSMLDGRFDPQSAAHFFGVYDGHGGSQVANYCRERMHLALAEEIAKEKPMLCDGDTWLEKWKKALFNSFLRVDSEIESVAPETVGSTSVVAVVFPSHIFVANCGDSRAVLCRGKTALPLSVDHKPDREDEAARIEAAGGKVIQWNGARVFGVLAMSRSIGDRYLKPSIIPDPEVTAVKRVKEDDCLILASDGVWDVMTDEEACEMARKRILLWHKKNAVAGDASLLADERRKEGKDPAAMSAAEYLSKLAIQRGSKDNISVVVVDLKGGSGGSGGGSGSGSGG*
SEQ ID NO.:7，PLY1-C731(脱落酸受体+连接肽+LbCas12a的C端(C731))MGGSGSSGGSGGSGGSGTQDEFTQLSQSIAEFHTYQLGNGRCSSLLAQRIHAPPETVWSVVRRFDRPQIYKHFIKSCNVSEDFEMRVGCTRDVNVISGLPANTSRERLDLLDDDRRVTGFSITGGEHRLRNYKSVTTVHRFEKEEEEERIWTVVLESYVVDVPEGNSEEDTRLFADTVIRLNLQKLASITEAMNGGSGGSGGGSGSGSGGGTNNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIDRGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKH*
SEQ NO.8crRNA
AAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUU
SEQ NO.9activator dsDNA-R
CCGAATTCAGTAGAAAGTTGCGATAACAAAACTGGCCGTCGTTTTAC AAC
SEQ NO.10activator dsDNA-F
GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTC GG
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测非核酸靶标的检测体系，其特征在于，包括：
(a1)第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
(a2)第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Cas蛋白顺式切割底物是所述Cas蛋白顺式切割报告分子的组成部分。
3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测非核酸靶标的检测体系还包括：
(d)Cas蛋白反式切割报告分子，所述Cas蛋白反式切割报告分子具有不与所述Cas蛋白的向导RNA的导向序列杂交的单链核酸分子。
4.一种检测非核酸靶标的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的第一融合蛋白或第一结合蛋白，和第二融合蛋白或第二结合蛋白；所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；
iii)任选的第三容器以及位于第三容器内的Cas蛋白反式切割报告分子；
iv)第四容器以及位于第四容器内的向导RNA；
v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液。
5.一种检测非核酸靶标的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供权利要求1所述的检测非核酸靶标的检测体系，并且所述的检测体系还含有待检测的样本，并对检测体系发出的信号进行检测，
其中，如果检测到检测体系发出的信号，则表示所述样本中存在非核酸靶标；而如果检测不到检测体系发出的信号，则表示所述样本中不存在非核酸靶标。
6.一种组合物或产品组合，其特征在于，包括：
(a1)第一融合蛋白或第一结合蛋白，所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
(a2)第二融合蛋白或第二结合蛋白，所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键；
(b)Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；和
(c)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于所述Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子。
7.一种组合物或产品组合的用途，所述组合如权利要求6所述，其特征在于，所述组合物或产品组合的用途是用于制备检测非核酸靶标的试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标的方法。
8.一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒或检测非核酸靶标的体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得第一融合蛋白或第一结合蛋白；
获得第二融合蛋白或第二结合蛋白；
获得Cas蛋白顺式切割底物；
获得向导RNA；
所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
9.一种Cas蛋白的拆分蛋白、Cas蛋白顺式切割底物、Cas蛋白顺式切割报告分子、向导RNA、Cas蛋白反式切割报告分子或缓冲液的用途，其特征在于，用于制备检测非核酸靶标的组合物、产品组合、试剂、试剂盒或体系，或者用于检测非核酸靶标。
10.一种试剂，其特征在于，包括：
第一融合蛋白或第一结合蛋白；
第二融合蛋白或第二结合蛋白；
Cas蛋白顺式切割底物或Cas蛋白顺式切割报告分子；
向导RNA，所述向导RNA可引导Cas蛋白与所述Cas蛋白顺式切割底物结合；以及缓冲液；
所述第一融合蛋白或第一结合蛋白的结构如式I所示：
Z1-L1-A1(I)；
所述第二融合蛋白或第二结合蛋白的结构如式II所示：
A2-L2-Z2(II)；
式中，
Z1为Cas蛋白的N端片段；
L1为第一连接肽；
A1为第一靶标受体；
A2为第二靶标受体；
L2为第二连接肽；
Z2为Cas蛋白的C端片段；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20240702 Assignee: Wuxi Tolo port Biomedical Technology Co.,Ltd. Assignor: SHANGHAI TOLO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2025980000082 Denomination of invention: Non nucleic acid target detection method and application based on splitting Cas protein License type: Common License Record date: 20250103 |