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CN118221815A - 一种抗baff抗体及其应用 - Google Patents

一种抗baff抗体及其应用 Download PDF

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CN118221815A
CN118221815A CN202311756839.3A CN202311756839A CN118221815A CN 118221815 A CN118221815 A CN 118221815A CN 202311756839 A CN202311756839 A CN 202311756839A CN 118221815 A CN118221815 A CN 118221815A
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China
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seq
antibody
baff
antigen
variable region
Prior art date
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CN202311756839.3A
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王宗达
顾春银
邓俗俊
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Shanghai Jiyu Pharmaceutical Technology Co ltd
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Shanghai Jiyu Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供一种抗BAFF抗体及其应用，涉及一种抗BAFF抗体分子，其包括新的全人抗BAFF抗体，以及涉及使用所述抗BAFF抗体分子用于治疗、预防和/或诊断与BAFF相关的疾病。

Description

一种抗BAFF抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种抗BAFF抗体及其应用。
背景技术
B细胞活化因子(B-cell activating factor,BAFF)，也称为TALL-1、BLyS和ZTNF4，是肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族的一种细胞因子。BAFF与其受体BAFF-R(BR3)、TACI(跨膜激活剂和钙调节剂和亲环素配体相互作用分子)和BCMA(B细胞成熟抗原)之间的相互作用对于B细胞的形成和维护至关重要。适当表达水平的BAFF有助于维持机体正常水平的免疫性，BAFF表达水平不足则导致免疫缺陷，BAFF过度表达则导致自体免疫。
过度水平的BAFF导致的自身免疫性疾病包括红斑狼疮和类风湿性关节炎。因此，调节BAFF的产生对于治疗患有这些自身免疫性疾病的患者具有十分重要的意义。基于此，临床上仍需要提供更多的能够结合BAFF的抗体以满足市场需求。
发明内容
本发明提供一种特异性结合BAFF的抗体，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ IDNO:13-19所示的HCDR1，SEQ ID NO:20-26所示的HCDR2和SEQ ID NO:27-36所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:13所示的HCDR1，SEQ ID NO:20所示的HCDR2和SEQ ID NO:27所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:21所示的HCDR2和SEQ ID NO:28所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:15所示的HCDR1，SEQ ID NO:20所示的HCDR2和SEQ ID NO:29所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:30所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:16所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:15所示的HCDR1，SEQ ID NO:23所示的HCDR2和SEQ ID NO:32所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:17所示的HCDR1，SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:33所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:18所示的HCDR1，SEQ ID NO:25所示的HCDR2和SEQ ID NO:34所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:35所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:19所示的HCDR1，SEQ ID NO:26所示的HCDR2和SEQ ID NO:36所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:3-12。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:3-12。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:3。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:4。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:5。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:6。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:7。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:8。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:9。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:10。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:11。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL包含序列SEQ ID NO:2；重链可变区VH包含序列SEQ ID NO:12。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段是Fab、F(ab')2、Fv、Fd或scFv。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区CH。
在某些实施方式中，所述重链恒定区CH的序列如SEQ ID NO:40所示。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含κ亚型的轻链恒定区CL。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区CH的序列如SEQ ID NO:41所示。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区CH和κ亚型的轻链恒定区CL。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区CH和轻链恒定区CL，所述重链恒定区CH的序列如SEQ ID NO:40所示，所述轻链恒定区CL的序列如SEQID NO:41所示。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的重链HC包含序列SEQ ID NO:42-52。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:42-52。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:42。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:43。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:44。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:45。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:46。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:47。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:48。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:49。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:50。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:51。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体的轻链LC包含序列SEQ ID NO:53，重链HC包含序列SEQ ID NO:52。
在某些实施方式中，所述抗BAFF抗体为单克隆抗体或全人单克隆抗体。
另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明所述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本发明提供一种抑制BAFF结合至哺乳动物细胞上一或多种BAFF受体的方法，其中所述BAFF受体为BAFF-R(BR3)、TACI(跨膜激活剂和钙调节剂和亲环素配体相互作用分子)和/或BCMA(B细胞成熟抗原)，该方法包括向所述细胞给予抗BAFF抗体分子，由此抑制BAFF受体介导的信号传导。
另一方面，本发明涉及所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的核酸分子和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗BAFF相关的疾病。
在某些实施方式中，所述BAFF相关的疾病包括免疫性疾病，其包括但不限于系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎和类风湿性关节炎。
另一方面，本发明涉及制备抗体分子的方法，其包括用一种或多种载体转让哺乳动物宿主细胞，培养所述的宿主细胞和回收及纯化所述的抗体分子。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本发明中，术语“一种”和“所述”通常包括多个指示物。
本文所述的“抗体分子”或“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语“抗体”不仅涵盖完整抗体分子，还包括所述抗体的片段以及所述抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在本文中所述术语抗体分子例如包括但非限于单链Fv(scFv)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2，二硫键连接的Fv(sdFv)，Fv，及完整抗体或全长抗体。术语“单链Fv”或“scFv”是指一种多肽，其包含与抗体VH结构域连接的抗体的VL结构域。特异性结合BAFF的抗体可以与其它抗原发生交叉反应，或者特异性结合BAFF的抗体与其它抗原不发生交叉反应。特异性结合BAFF的抗体可以例如通过免疫测定或其它本领域技术人员已知的方法鉴别。“完整抗体”或“全长抗体”指包含两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白，所述重链和轻链通过二硫键相互连接，所述蛋白包含：(1)就重链而言，包含重链可变区(本文缩写为“VH”)和含有三个结构域CH1、CH2、CH3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，包含轻链可变区(本文缩写为″VL″)和含有一个结构域CL的轻链恒定区。VH和VL可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为框架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。VH和VL含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的成分。本发明的抗体包括但不限于单特异性，多特异性，人或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗-Id抗体)，和上述任何抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。本发明的抗体可为一种单克隆抗体或者多克隆抗体，所述的单克隆抗体优选为全人单克隆抗体。
本发明中，术语“抗BAFF抗体”表示可与BAFF特异性结合的抗体。“特异性结合”常是指可测量且可再现的相互作用。例如抗原和抗体之间的结合，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更高的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。
本发明中，术语“可变区”(也称“可变结构域”)通常是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。重链和轻链可变区可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体中最可变的部分并且含有抗原结合位点。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中，它集中在VH和VL中的三个区段，所述三个区段被称为高变区(HVR)或被称为互补决定区(CDR)，分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可变结构域中更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区：HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR结构环区连接。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。
在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于IMGT本体论(IMGT-ONTOLOGY)的概念。例如，在本发明中，所述抗BAFF抗体的VL和VH的氨基酸序列可以按Chothia编码规则进行编码，所述抗BAFF抗体的LCDR1-3和HCDR1-3可以按Chothia定义。例如，在本发明中，所述抗BAFF抗体的VL和VH的氨基酸序列可以按Kabat规则定义，所述抗BAFF抗体的LCDR1-3和HCDR1-3可以按Kabat定义。
本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即集群中的抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。
在本发明中，术语“全人源抗体”或“人抗体”通常是指抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体部分对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术等。
本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。本发明中，术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分(例如病毒、核酸或蛋白质)。
如本领域已知，在本发明中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
在本发明中术语“宿主细胞”可包括已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本发明包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
在本发明中“KD”、“KD”或“KD”可互换使用，本发明中使用的“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知的，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH下测量)，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
本发明所述的“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂或缓冲液中的一种或其组合。其中，表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或吐温80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基或十八烷基肌氨酸等，其加入量应使结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于糖类，例如还原性糖或非还原性糖；氨基酸类，例如谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如三元醇、丙二醇或聚乙二醇；溶液稳定剂的加入量应使最后形成的制剂在本领域技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定的状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇或其组合。缓冲液包括但不限于Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或其组合。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明提供的抗BAFF抗体，能够特异性地结合BAFF蛋白，阻断泰它西普与BAFF的结合，具有有益效果。
附图说明
图1为抗BAFF抗体阻断泰它西普与人BAFF的结合。
具体实施方式
本发明的其他特征和优点通过下面的实施例将是显而易见的，该实施例不应理解为是限制性的。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1酵母展示文库构建与筛选
选择人轻链IGKV1-39*01Germline的序列和人PBMC的重链抗体可变区序列进行重组，构建了库容达到3.0×1010的全人源共同轻链噬菌体抗体库。使用全人源共同轻链噬菌体抗体文库针对生物素标记的人BAFF(Acro，货号：BAF-H82Q2，以下简称hBAFF-biotin)进行两轮淘选，获得阳性富集。
以噬菌体库两轮淘选后质粒为模板，设计引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增单链抗体(scFv)。回收PCR扩增的scFv基因片段与酵母展示质粒共转入酿酒酵母菌株EBY100(购自ATCC)，通过酿酒酵母的同源重组使scFv基因插入至酵母展示质粒中，进而实现在酵母细胞壁表面展示拥有共同轻链IGKV1-39*01的单链抗体。该酵母展示单链抗体库命名为JYYDL069。文库在100mL的SD-Trp培养基(Clontech，货号：630308)，30℃、225转/分钟培养过夜；取1.0×108细胞重悬于20mL YPGP液体培养基(2％半乳糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.54％Na2HPO4，0.86％NaH2PO4·H2O)，20℃、225转/分钟培养24小时，置于4℃冰箱待用。
文库诱导后菌液，测定菌液的OD600，按1OD为1.0×107细胞数计算，取3.0×107的JYYDL069细胞进行流式染色分选，分选后细胞在5mL SD-Trp液体培养基中30℃、225转/分钟培养过夜，备用。
实施例2单克隆酵母菌落测序与流式染色鉴定
JYYDL069分选后细胞涂布于SD-Trp固体培养基(Clontech，货号：630309)，30℃静置培养3天生长出酵母单克隆菌落。挑取92个单克隆进行测序，按照表1的方案对获得独一序列的酵母单克隆进行流式染色分析。方案1反映了单克隆与人BAFF的结合能力，PE平均荧光信号(MFI)越强代表单克隆与人BAFF结合能力越强；方案2反映了单克隆与猴BAFF(CynoBAFF)的结合能力；方案3反映了单克隆与无关抗原的结合能力；方案4反映了单克隆与泰它西普(内部自制，简称TACI-Fc，序列SEQ ID NO:1)的竞争水平，APC平均荧光信号强度越低，说明竞争越强。
表1 JYYDL069单克隆酵母菌落流式染色方案
酵母单克隆染色结果如表2所示，根据各克隆染色结果，排除与人、猴BAFF不结合、与泰它西普不竞争和有非特异性的克隆。最终挑取Y46D5、Y46B3、Y47A5、Y47H5、Y47C6、Y46F6、Y46B2、Y47G1、Y46D3、Y47G3克隆的抗体序列进行质粒构建，用于后续表达、鉴定。
表2酵母单克隆菌落流式染色分析结果
实施例3候选抗体表达
根据测序结果，上述得到的克隆重链可变区氨基酸序列为：
>Y46D5 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLYPFLTYYDFWSGPEVWGQGTLVTVSS
>Y46B3 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTDYDILTQHINWFDPWGQGTLVTVSS
>Y47A5 VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYYDILTGSDLGIDYWGQGTLVTVSS
>Y47H5 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDYYDILTGYHPRGMDVWGQGTMVTVSS
>Y47C6 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGHFSTYATNSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYDILTGYYIGAFDIWGQGTMVTVSS
>Y46F6 VH
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKERYDILTGIRLGAFDIWGQGTMVTVSS
>Y46B2 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLVGYDILTGYHFLLDYWGQGTLVTVSS
>Y47G1 VH
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITNSYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTGGTTKYNPSLKSRVTMSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAREAHYDILTGVPGWFDPWGQGTLVTVSS
>Y46D3 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRYDILTGYSPYGMDVWGQGTMVTVSS
>Y47G3 VH
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGLTFSDHYMDWIRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPHFDILTGYYPGAFDIWGQGTMVTVSS
其中横线部分分别表示CDR1、CDR2和CDR3。
上述得到的克隆，其轻链的氨基酸序列相同，具体序列为：
>VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
其中横线部分分别表示CDR1、CDR2和CDR3。
按照Chothia编码规则，上述抗BAFF抗体的序列编号分别如表3和表4所示。
表3抗BAFF抗体的CDR序列信息
表4抗BAFF抗体可变区序列信息
将Y46D5、Y46B3、Y47A5、Y47H5、Y47C6、Y46F6、Y46B2、Y47G1、Y46D3、Y47G3克隆的重链可变区(VH)序列与恒定区IgG1 N297A序列(SEQ ID NO:40)连接，轻链IGKV1-39*01Germline的可变区序列与Kappa恒定区序列(SEQ ID NO:41)连接，构建得到抗体Ab2003.B02-Ab2003.B11。对抗体进行表达、纯化，表达信息如表5所示。
表5候选抗体表达、纯化数据
实施例4候选抗体结合测定
采用Octet RED96e(Fortébio)测定候选抗体Ab2003.B02-11与人BAFF(Kactus,货号：BAF-HM112)的亲合力。抗原及候选抗体均用1×PBST(1×PBS：生工，B548117-0500；0.02％吐温20：sigma，P1379)稀释，抗体使用浓度为5μg/ml，将候选抗体样品按200μL/孔加入96孔板(Greiner bio-one，货号：655209)，设置软件参数，温度30℃、收集标准动力学信号的频率为5.0Hz；用1×PBST预湿AHC传感器(Fortébio，货号：18-0015)10分钟，然后上机检测。每个循环包含以下步骤：1)浸入缓冲液60s；2)检测抗原是否与传感器有非特异性结合；3)10mM pH1.7的甘氨酸溶液再生；4)浸入缓冲液60s；5)抗体固化在传感器上，时间为60s；6)传感器浸入缓冲液180s；7)抗原与抗体结合，时间180s；8)抗原抗体的解离，时间10分钟；9)传感器再生。采用Fortébio的Data Analysis 11.0软件，对抗原-抗体以1:1的结合方式，测定结合速率(Kon)和解离速率(Koff)，以此计算抗体的平衡解离常数(KD)。结果显示，抗BAFF抗体均与人BAFF结合，亲合力结果如表6。
表6候选抗体与人BAFF的亲合力测定
实施例5候选抗体阻断活性评估
继续测定候选抗体阻断泰它西普与人BAFF结合的能力，用PBS将泰它西普稀释到1μg/mL的包被酶标板，100μL/孔，贴封板膜，4℃孵育过夜。第二天用洗涤液(PBS+0.05％TWEEN-20)洗板3次，继而用洗涤液配制封闭液(PBS+0.05％ TWEEN-20+2％BSA)，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭1小时。用封闭液配制生物素化的人BAFF，浓度分别为34ng/mL；随后用封闭液配制抗BAFF抗体、泰它西普，起始浓度为30μg/mL，5倍梯度稀释(稀释7个浓度点+1个0浓度点)；然后将50μL的抗体或者泰它西普与50μL生物素化人BAFF加入96孔板中，37℃共孵育1小时。用洗涤液洗板3次，封闭液1/5000稀释SA-HRP(sigma，S2438-250UG)，以100μL/孔加至酶标板内，37℃孵育1小时；用洗涤液洗板3次，以100μL/孔加入TMB显色液(Biopanda，货号：TMB-S-003)，室温避光反应10分钟，然后以50μL/孔加入终止液(Solarbio，货号：C1058)终止反应，在450nm波长处测定吸光值。如图1所示，抗BAFF抗体Ab2003.B02、Ab2003.B05、Ab2003.B08和Ab2003.B10能够阻断生物素化的BAFF与泰它西普的结合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗BAFF抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区VL和重链可变区VH，其中所述轻链可变区VL包含：SEQ ID NO:37所示的LCDR1，SEQ ID NO:38所示的LCDR2和SEQ ID NO:39所示的LCDR3；并且所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:13-19所示的HCDR1，SEQ ID NO:20-26所示的HCDR2和SEQ ID NO:27-36所示的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区VH包含：SEQ ID NO:13所示的HCDR1，SEQ ID NO:20所示的HCDR2和SEQ ID NO:27所示的HCDR3；或SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:21所示的HCDR2和SEQ ID NO:28所示的HCDR3；或SEQ ID NO:15所示的HCDR1，SEQ ID NO:20所示的HCDR2和SEQ ID NO:29所示的HCDR3；或SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:30所示的HCDR3；或SEQ ID NO:16所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:31所示的HCDR3；或SEQ ID NO:15所示的HCDR1，SEQ ID NO:23所示的HCDR2和SEQ ID NO:32所示的HCDR3；或SEQ ID NO:17所示的HCDR1，SEQ ID NO:24所示的HCDR2和SEQ ID NO:33所示的HCDR3；或SEQ ID NO:18所示的HCDR1，SEQ ID NO:25所示的HCDR2和SEQ ID NO:34所示的HCDR3；或SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:22所示的HCDR2和SEQ ID NO:35所示的HCDR3；或SEQ ID NO:19所示的HCDR1，SEQ ID NO:26所示的HCDR2和SEQ ID NO:36所示的HCDR3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区VL包含序列SEQ IDNO:2。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区VH包含序列SEQ IDNO:3-12。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其是Fab、F(ab')2、Fv、Fd或scFv。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区CH，所述重链恒定区CH的序列如SEQ ID NO:40所示。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链恒定区CL，所述轻链恒定区CL的序列如SEQ ID NO:41所示。
8.一种核酸分子，其编码包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求8所述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求1-7所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求8所述的核酸分子和/或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗BAFF相关的疾病。
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