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CN118127152A - 用于肠源exo-miRNA表达谱分析的组合物和方法 - Google Patents

用于肠源exo-miRNA表达谱分析的组合物和方法 Download PDF

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CN118127152A
CN118127152A CN202211531126.2A CN202211531126A CN118127152A CN 118127152 A CN118127152 A CN 118127152A CN 202211531126 A CN202211531126 A CN 202211531126A CN 118127152 A CN118127152 A CN 118127152A
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mirna
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王漱阳
杨乐梅
项建斌
娄加陶
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Fudan University
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Abstract

本发明涉及结直肠癌血浆肠源外泌体中微小RNA(miRNA)表达谱分析的组合物和方法。特别地，本发明涉及用于诊断结直肠癌、监测癌症治疗和/或治疗结直肠癌的血液分子标记物诊断试剂盒，该试剂盒包括多核酸分子，每种核酸分子编码一微小RNA序列，其中一或多种核酸分子在结直肠癌血浆和健康对照血浆中有差异表达，其中一或多种差异表达的核酸分子一起代表一个核酸表达特征，该核酸表达特征是预示结直肠癌存在的指征。本发明进一步涉及使用该核酸表达特征确定结直肠癌、同时预防或治疗这种病症的相应方法。最后，本发明直接关系预防和/或治疗结直肠癌的药物组合物。

Description

用于肠源exo-miRNA表达谱分析的组合物和方法
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及用于结直肠癌血浆肠源外泌体微小RNA(肠源exosome microRNA，简称肠源exo-miRNA表达谱分析的组合物和方法。用于结直肠癌血浆肠源(A33阳性)外泌体微小RNA表达谱分析的组合物和方法
背景技术
据资料记载，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界范围内最常见的肿瘤之一。据统计，在中国新发肿瘤中，CRC占比排名已升至第二(12.2％)，新增肿瘤死亡病例中CRC占比排名位列第五(9.5％)，高达59.4％的患者会发生转移(lnadomi J.(2020).Gatstroenterology，158(2)：289-290)。若能在病变进展的早期诊断，CRC是可治愈的。但在疾病早期，大部分患者没有疾病的表现症状，因此筛查对于早期发现CRC是有必要的。证据表明早期发现CRC可以明显降低其发病率和致死率(Anwar，R.(2006)Digestive andLiver Disease 34，279-282)。
起初，CRC以肠上皮细胞出现过度增生(非典型增生)为特征，病变首先在结肠或直肠内膜形成炎性腺瘤状息肉，后变成异常的赘生物腺瘤(即良性肿瘤)。一般情况下，腺瘤形成后(60岁时发病率约为60-70％)仅有一小亚群细胞恶变成为恶性的腺癌，而超过95％的CRC病例已被证明是腺癌(Muto，T.et al.(1975)Cancer 36，2251-2270；Fearon，E.R.andVogelstein，B.(1990)Cell 61，759-767)。
目前公认的CRC筛查方法包括结肠镜检查和粪便隐血试验。然后，这两个试验都有其严重的弊端。结肠镜检查虽然效果不错，但由于其费用高、不适感强、可能副作用大，许多人都迟疑做这个检查。另一方面，粪便隐血试验是一个既简单又便宜的检查，但其结果相对不准确。不管怎样，迄今为止还没有找到特异性的分子标记物能被用于可靠地诊断CRC，特别是已被证实为腺癌的CRC，和/或正从良性腺瘤转变成为恶性肿瘤这一进程中的CRC。
因此，发现新的生物标记物将有极大的临床重要性，特别是如果这些标记物能使得在肿瘤发展的早期进行诊断，从而允许癌症的早期治疗。理想的是这些标记物应该能使得在恶性细胞的存在尚不能由原位技术或活检或切除材料的显微镜分析检测到的阶段就能鉴定癌症。
许多诊断试验也被限制了，它们是通常基于分析仅仅单个分子标记物，这可能影响检测可靠性和/或精确性。另外，单个标记物通常不能进行有关潜伏期、肿瘤发展等的详细预测。因此，仍然持续需要鉴定其它的分子标记物和克服这些限制的其他测定形式。
一种解决这一问题的方法可以基于小调节RNA分子，特别是微小RNA(miRNA)，它们是一类进化保守的内源表达的非编码小RNA，大小为20-25个核苷酸(nt)，可以调节靶mRNA的表达。自从它们在大约10年前被发现就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。(Bartel，D.P.(2004)Cell 116，281-297，Ambros,V.(2004)Nature 431，350-355；He.L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5，522-531)。此外，由于miRNA在体外很稳定、体内存在时间长，它比mRNA更有优势来作为癌症标记物(Lu，J.et al.(2005)Nature 435，834-838；Lim，L.P.et al.(2005)Nature 433，769-773)。
根据miRNA与其靶之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异切割。可获得的现有数据表明miRNA在癌症中起着原癌基因或抑癌基因的作用，如癌症中mir-17-92的过表达起着原癌基因的作用，促进癌症发展，负调节肿瘤抑制基因和/或控制细胞分化、凋亡的基因；它也下调let-7a表达，而let-7a通过调节原癌基因和/或控制细胞分化、凋亡的基因起着肿瘤抑制基因的作用(Zhang，B.(2007)Dev Biol 302，1-12)。这些表明了miRNA在癌症发展过程中的作用。.
高通量的miRNA量化技术如miRNA芯片、实时RT-PCR为基础的TaqMan荧光定量检测miRNA等等，为研究整个癌症基因组中miRNA表达谱提供了有力的工具。越来越多的证据表明许多miRNA在癌症中表达失调，包括白血病、淋巴瘤、恶性胶质瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌，并且其在正常组织和癌组织中表达有差异(Zhang,L.(2008)Adv Exp Med Biol 622，69-78)。因此，miRNA谱可用于设计识别各种癌症的特征，表明其可以帮助进一步建立分子诊断、预后和治疗。miRNA在癌症中的异常表达表明这些miRNA可能用于生物标记物和分子治疗的靶点。
在许多可能样品种类中，血液是筛查高危人群最理想的，它可以以微创方式易于收集，可以早期检测、早期诊断、监测和有效治疗癌症。已证明肿瘤细胞产生的miRNA在人的血浆或血清中以相当稳定的形式存在，它可以免受内源性RNase降解。血浆或血清中肿瘤细胞产生的miRNA的水平足够被测量出来，用其作为生物标记物来发现癌症。再者，血浆和血清中miRNA的水平强烈关联，表明临床应用miRNA为生物标记物用于癌症诊断中无论用血浆或是血清样品都是合适的(Mitchell，P.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105，10513-10518；Gilad，S.et al.(2008)PLoS ONE 3，e3148；Chen，X.et al.(2008)Cell Res18，997－1006)。
一些研究报道了人CRC中血浆或血清miRNA的表达谱(Chen，X.(2008)Cell Res18，997-1006；Ng EK.O.(2009)Gut 58，1375-1381；Huang Z.2009，Iht J Cancer,published on line)。健康人的血液中可以检测出100多种循环中的miRNA(Mitchell，P.S.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105，10513-10518)，而这个表达谱与大肠癌患者的表达谱有明显区别，患者有几种肿瘤特异性的miRNA。陈和同事们证明在大肠癌患者血清里有69种miRNA是健康人所没有的(Chen，X.(2008)Cell Res 18，997-1006)。但是，如此大的表达谱很难运用到临床早筛早诊中。
然而，外周血游离的miRNA来源于各种组织细胞：上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及大量的白细胞，尤其在组织损伤和炎症发生的情况下。此外，若未能严格遵循采血和运输的规范化操作的话，在血液凝固过程中细胞破裂和释放出的核酸也会对外周血游离miRNA的检测产生干扰，从而较难确保临床检验的准确性、可信度和可重复性。
外泌体作为“液体活检”的最新研究对象，是近年来发现的一种由真核细胞主动分泌到细胞微环境中的小分子膜泡(直径为40-100nm)，广泛存在于血液、尿液等各种体液中。外泌体的生物发生起源于内体系统，即质膜的持续内陷导致多囊泡体(multivesicularbodies，MVBs)的形成，随后MVBs与质膜融合，引发外泌体释放。在此过程中，核酸(miRNA)、脂质、蛋白质等功能性物质被选择性地包裹进外泌体腔内，并且外泌体的双层膜结构可以保护其封装的物质免于在细胞外降解，增加其稳定性。研究证实，外周血外泌体中的miRNA要比外周血游离的更多、更稳定，因此外泌体中的miRNA既可作为分泌分子影响受体细胞表型，也可以通过外泌体结合特定细胞的表面受体从而进入靶细胞并对其进行调控，也可作为标志物在肿瘤诊治中发挥重要作用。
研究表明，外泌体中miRNA在CRC患者中存在特异性的表达，如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-92a、miR-375、miR-10b、miR-100。但血液外泌体中miRNA来源广泛，大多数来源于血细胞，难以实现器官或组织特异性，在一定程度上影响了诊断特异性。研究表明，不同组织细胞来源的外泌体，携带有组织特异性及疾病特异性的标志物，并有一些存在于外泌体表面可被检测。例如胰腺癌相关的GPC-1、神经组织特异的CD171、肠组织特异的A33等，均为具有一定组织特异性的外泌体表面蛋白标志物。
然而，目前检测的外泌体miRNA都是从外周血的总外泌体中检测所得，而非组织特异的外泌体。而血液中有大部分的外泌体来源于血细胞，这对于CRC标志物的检测无疑将造成难以忽略的影响。挖掘并发现临床适用的快速、简便、实用的组织特异性(即肠源特异性)外泌体内的分子标记物能够提高的CRC血液学筛查和早期诊断的特异性。
因此，仍有必要发现一组结直肠癌患者血浆或血清中肠源外泌体的miRNA诊断标记物。结合多种miRNA标记物，建立基于血样的miRNA表达谱(指纹)，从而能够无创、快速、准确、节省地鉴别出或有大肠癌的患者。此外，还持续需要相应的方法以筛查出早.期大肠癌高危人群；早期检测癌症的复发；和/或监测癌症治疗。
发明内容
本发明的一个目的是通过确定血液肠组织来源(A33阳性)外泌体中的多核酸分子为诊断结直肠癌、监测癌症治疗和/或治疗结直肠癌提供新的方法，每种核酸分子编码一个微小RNA(miRNA)序列，与健康对照和/或健康人相比，其中结直肠癌患者血浆中一种或多种多核酸分子有差异表达，其中一种或多种差异表达的核酸分子一起代表一个核酸表达特征，这个特征是预示结直肠癌发生的指征，在这里核酸表达特征包括肿瘤相关特征和血浆特异性特征。
进一步，本发明的一个目的是为鉴定显示或有结直肠癌的血样中一或多个核酸表达特征提供相应的方法。更为具体地，本发明的一个目的是提供方法来区分结直肠癌与健康对照和/或健康人。
这些及其它将从以下描述变得清楚的目的，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。
在第一方面，本发明涉及用于鉴定显示或有结直肠癌的肠源(A33阳性的)外泌体中分子标记的诊断试剂盒，试剂盒包含多核酸分子，每种核酸分子编码一个微RNA序列，其中一或多种多核酸分子在目的血浆和在健康对照中差异表达，这差异表达特征来源于肿瘤相关或血浆特异性特征，这其中一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，这个特征是预示结直肠癌发生的指征。
此处限定的核酸表达特征可包括至少五种核酸分子，优选地至少十种核酸分子，特别优选地至少十八种核酸分子。
核酸表达特征包括至少一种编码微小RNA序列的核酸分子，其表达在一或多个目的血浆中与一或多个健康对照相比被上调；以及包括至少一种编码微小RNA序列的核酸分子，其表达在一或多个目的血浆中与一或多个健康对照相比被下调。
在实施方案中，核酸表达特征包括任一或多个核酸编码血浆肠源(A33阳性的)外泌体特异性特征：hsa-miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-150-5p及hsa-miR-184的核酸分子，及内部稳定对照：RNU6。
在实施方案中，与一或多个健康对照相比，在一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中编码hsa-miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p，hsa-miR-124-3p和hsa-miR-184的任一或多种核酸分子的表达被上调以及miR-150-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调，且RNU6表达不变。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达特征包括任一或多个核酸编码血浆肠源(A33阳性的)外泌体特异性特征：miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p，hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，miR-204-5p及miR-486-5p，及内部稳定对照：RNU6。
在优选的实施方案中，与一或多个健康对照相比，在一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中编码hsa-miR-21－5p，hsa-miR-92a-3p，hsa-miR－124-3p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，miR-204-5p和miR-486-5p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-122-5p和miR-150-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调，且RNU6表达不变。
在第二方面，本发明涉及用于鉴定显示或有结直肠癌的一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体的方法，所述方法包括：(a)确定一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中多核酸分子的表达水平，每个核酸分子编码一个微RNA序列；(b)确定一或多个健康对照血浆肠源(A33阳性的)外泌体中多核酸分子的表达水平；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴定在目的血浆和对照血浆的肠源(A33阳性的)外泌体中有差异表达的一或多种多核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是预示着结直肠癌存在的指征。
在本发明的优选实施方案中，方法包括：(a)确定一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中核酸分子组合的表达水平，每个核酸分子编码一个微RNA序列，然后用特定公式计算；(b)确定健康对照血浆肠源(A33阳性的)外泌体中核酸分子组合的表达水平，然后用特定公式计算；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自计算结果鉴定一或多个目的血浆和对照的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中核酸分子组合的差异，其中所述一或多种差异表达的核酸分子组合一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是预示着结直肠癌存在的指征。
在本发明的更加优选的实施方案中，方法进一步用于区分结直肠癌与健康个体。
在第四方面，本发明涉及用于监测结直肠癌治疗的方法，该方法包括：(a)用本文限定的方法鉴定一或多个目的血浆中核酸表达特征；及(b)监测血液中编码微小RNA序列的属于核酸表达特征组合里的一或多种核酸分子表达水平，以此监测治疗前表达上调的血浆肠源(A33阳性的)外泌体核酸分子在治疗后表达下调及治疗前表达下调的分子治疗后上调。
在第五方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，该方法包括：(a)用本文限定的方法鉴定血浆肠源(A33阳性的)外泌体中核酸表达特征；及(b)修饰血液中编码微小RNA序列的属于核酸表达特征组合里的一或多种核酸分子表达水平，以使得血浆肠源(A33阳性的)外泌体中表达上调的核酸分子表达下调及表达下调的分子上调。
在第六方面，本发明涉及用于在血样中预防和/或治疗大肠癌治疗的药物组合物，这个组合物包括一或多个核酸分子，每个核酸分子编码一个与本文限定的大肠癌患者血浆肠源(A33阳性的)外泌体中表达上调的核酸分子编码的微小RNA序列至少部分互补的序列，和/或与相应的本文限定的表达下调的核酸分子编码的微小RNA序列。
最后，在第七方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗大肠癌的药物中的应用。
本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。
更具体的，
本发明基于如下的发现，基于血浆肠源(A33阳性的)外泌体中特定的miRNA表达特征有高度敏感性和准确性，结直肠癌可被可靠地鉴定，其中如本文所定义的所述表达特征通常包括被上调和下调的人类miRNA。
本发明的以下例证可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。
本发明将根据特定的实施方案许参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。
术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的精确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10％，优选±5％。
另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。
术语的进一步定义在以下使用术语时给出。
以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
本发明的一个目的是为诊断结直肠肠癌、监测癌症治疗和/或治疗结直肠癌提供新的方法，该方法是通过确定血液中多核酸分子，每个核酸分子编码一个微小RNA(miRNA)序列，与健康个体相比，结直肠癌的血浆肠源(A33阳性的)外泌体中其中一或多个多核酸分子有差异表达，这其中一或多个差异表达的核酸分子一起代表一个核酸表达特征，这个核酸表达特征是预示着结直肠癌存在的指征，它包括肿瘤相关特征和血浆特异性特征。
本文中所用的术语“结直肠”涉及到结肠、直肠和/或阑尾，即整个大肠。
本文中所用的术语“癌症”(通常称为“癌”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重组)。这种改变的例子可特别涉及到细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此，术语“大肠癌”指结肠、直肠和阑尾的细胞癌性生长。
最常见的结直肠(CRC)细胞类型是腺癌，占病例的95％。其它类型的CRC包括淋巴瘤和鳞状细胞癌。
结直肠癌可根据Dukes系统(Dukes，C.E.(1932)J.Pathol.Bacteriol.35，323-325)分类，该系统通过以下分期：Dukes A-肿瘤局限在肠壁；Dukes B-肿瘤侵袭穿过肠壁；Dukes C-肿瘤侵犯到淋巴结：及Dukes D-肿瘤有远处转移。
本文中所用术语“血浆”是血液中黄色的液体成分，正常情况下全血中红细胞悬浮在上面。它在全血中占55％体积，大部分是水(90％体积)，且包含溶解蛋白、葡萄糖、凝血因子、矿离子、激素和二氧化碳(血浆是主要的分泌产物运输媒介)。血浆的制备是将新鲜血液旋转离心直到血细胞沉入管底，然后倒出或吸出血浆。血浆的密度大约为1025kg/m3，或1.025kg/1。目前研究表明血浆中miRNA是稳定的。术语“血浆样品”是指从受检者或健康对照获得的血浆。
本文中所用术语“患者”是指至少怀疑为结直肠癌的人。本文所用的“目的血浆”是指从患者体内收集的血浆。术语“健康个体”或“健康对照”通常指一个没有癌性表型特征的健康人。而本文所用“对照血浆”指从健康个体体内收集的血浆。然而，在其它应用上，如和其它类型癌症比较时，从其它类型癌症患者体内收集的血浆通常被认为“对照”。
通常，所用的血浆样品是从生物标本中获得，标本收集了被诊断有结直肠癌的对象。此外，为了获得“比较样品”的数据，也要收集其它已知疾病状态的对象。生物标本包括机体组织和液体，如结直肠组织、血清、血细胞、痰和尿液。另外，生物标本可从已有结直肠癌性特征的个体或怀疑有结直肠癌的个体中获得。而且，如果有必要，从获得的机体组织和液体样品要纯化，然后用作生物样品。根据本发明，从对象获得的生物样品决定了本发明中的核酸标记物表达水平。
本发明中用体外方法检测的样品一般应该以临床可接受的方式收集，特别是要保存好核酸(尤其是RNA)或蛋白。待分析的样品一般是血液。此外，也要用肺组织和其它类型的样品。样品可以合并，特别在最初加工之后。但是也可以使用未合并的样品。
本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(Bartel，D.P.(2004)Cell 23，281-292；He，L.and Hannon，G.J.(2004)Nat Rev Genet 5，522-531)。一个“微RNA”指来源于一个基因座的一个RNA分子从转录产物加工形成局部RNA前体miRNA结构。成熟的miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工一般通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的核酸内切酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生通常折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，miRNA双链体被Dicer切割，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的片段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA一般来源于与预测的蛋白质编码区不同的基因组片段。
本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工为成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。一般，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构一般长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，那些与miRNA配对的残基及任何间插节段，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任意核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。本发明编码微RNA序列的核酸分子一般编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。然而，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调控序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5′→3′)匹配或相应于所编码的miRNA(5′→3′)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5′→3′)序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3′→5′)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。
因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，此处为大肠癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。
在本发明中确定的多核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码一个miRNA序列。
本文所用术语“肠源外泌体”也被理解为包括“肠组织源性外泌体”，是指由肠上皮细胞主动释放的细胞外囊泡(EV)，直径为40-160nm(平均为100nm)。外泌体的生物发生起源于内体系统，即质膜的持续内陷导致MVB的形成，随后MVB与质膜融合，引发外泌体释放。此外，外泌体包含许多生物活性成分，包括DNA、RNA、脂质、蛋白质、氨基酸和代谢物。在外泌体腔内也发现了各种RNA，包括miRNA、mRNA和其他ncRNA。其中，由于其在物种间的高度保守性和在基因表达中的广泛调控作用，miRNA备受关注。作为短片段(20-24nt)非编码RNA，miRNA可以影响mRNA的翻译和稳定性，从而在转录后水平上调控多细胞生物的基因表达。
本文所用术语“A33阳性”是指外泌体表面表达A33蛋白。A33，又称GPA33，是一种跨膜的免疫球蛋白，它在正常的肠道上皮和95％以上的大肠癌肿瘤上皮细胞上都有表达，且在大肠癌中表达增加(Suresh M.Mol Cell Proteomics，2010,9(2)：197-208.)。因此我们选择A33胞外段(aa 150-200)作为肠源外泌体捕获的靶标。
本文所用术语“差异表达”是指相比于健康对照，特定miRNA在疾病血浆中的表达水平是有改变的，其可以是上调(即在血浆中miRNA浓度增加)或下调(即在血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，相比对照血浆，核酸分子在疾病血浆样品中被激活到一个更高或更低的水平。
在本发明范围内，如果核酸分子在疾病血浆样品和对照样品中的相应表达水平一般相差至少5％或至少10％，优选地至少20％或至少25％，最优选地至少30％或至少50％，该核酸分子被认为是有差异表达的。因此，后者的值相应于给定核酸分子在疾病血浆样品中的表达水平相比于对照血浆样品分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在疾病血浆样品中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。
本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在待分析血浆样品中的浓度。
如上所述，术语“对照血浆”一般指从没有结直肠癌表型特征的(健康)个体收集的血浆。然而，在某些应用中，如和其它类型的癌症比较，从其它类型癌症患者中收集的血浆一般被认为“对照血浆”。
表达水平的确定一般遵循本领域熟知的已建立的标准程序(Sambrook，J.et a1.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Mamual.2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(2001)CurrentProtocols in Molecular Biology.Wiley&Sons,Hoboken，NJ)。可以在RNA水平进行确定，例如用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行确定。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任意核酸分子。但是，由于pri-miRNA及pre-mRNA半寿期短，一般仅测量成熟miRNA的浓度。
在特异的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在多个样品或对照样品的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。
所获得的疾病血浆和对照血浆中表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，已知管家基因的表达水平不根据所收集样品的个体的疾病状态而不同。典型的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氧酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在所收集样品的个体的各种非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。
然而，替代在任何实验中确定血浆样品的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，血浆样品中各自的表达水平可以用归一化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。
在本发明中，通过血浆样品所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是大肠癌的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在结直肠癌患者的血浆与健康对照的血浆肠源(A33阳性)外泌体之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定一个个体的表型状态的miRNA序列。
在第一方面，本发明涉及血液中分子标记物的诊断试剂盒，该试剂盒包括多核酸分子，每个核酸分子编码一微RNA序列，与及健康对照相比，目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中的其中一或多种多核酸分子有差异表达，其中差异表达的特征来源于肿瘤相关或血浆特异性特征，其中一或多个差异表达的核酸分子一起代表一个核酸表达特征，该核酸表达特征是大肠癌存在的指征。
本文所述的核酸表达特征，可包括至少七种核酸分子，优选地至少十一种核酸分子，及特别优选地至少十九种核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，与一或多个健康对照相比，一或多个目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中该微RNA表达上调，并包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，与一或多个健康对照相比，一或多个目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中该微RNA表达下调。
本文所述的结直肠癌组织细胞是来自被诊断为结直肠癌的对象分离而收集到的癌性大肠细胞。所述的非癌组织细胞一般来自一个没有癌性表型特征的(健康)野生型细胞。
通常，包含在核酸表达特征的核酸分子是人类的序列(下文称为″hsa″(人类)。
在优选的实施方案中，核酸表达特征包括任一或多种编码肿瘤相关特征的核酸分子：hsa-miR－146a-5p(SEQ ID NO：1)，hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO：2)，hsa－miR-122-5p(SEQ ID NO：3)，hsa-miR－184(SEQ ID NO：4，hsa-miR-196a-5p(SEQ ID NO：5，hsa-miR-150-5p(SEQ ID NO：6，hsa-miR-21－5p(SEQ ID NO：7，hsa-miR-26a-5p(SEQ ID NO：8，hsa-miR-124-3p(SEQ ID NO：9，hsa-miR-204-5p(SEQ ID NO：10。
为使血浆表达水平均一化，获得包含在核酸表达特征的编码微RNA序列的核酸分子，RNU6(SEQ ID NO：11)应被优先应用，它们在结直肠癌血浆肠源(A33阳性)外泌体中稳定表达。
上述miRNA的核酸序列列于表1。
表1
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http：//microma.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36，D154－D158)。
在更为优先的实施方案中，与一或多个健康对照相比，一或多个目的血浆中任一或多种核酸分子编码，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，miR-204-5p和miR-486-5p表达上调，任一或多种核酸分子编码hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-122-5p和miR-150-5p表达下调；RNU6表达不变。
如本文所用，术语“任一或多种多核酸分子”及“所述核酸分子的一或多种”可涉及所述多核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
本文所用术语“核酸组合”是指用至少两种核酸表达水平作为一个整体。优选地可以一个整体用相关变化或通过公式计算结果。
在第二方面，本发明涉及用于鉴定显示或有结直肠癌的一或多个目的血浆的方法，所述方法包括：(a)确定一或多个目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中多核酸分子的表达水平，每个核酸分子编码一个微RNA序列；(b)确定一或多个健康对照血浆中多核酸分子的表达水平；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴定在目的血浆和对照血浆肠源(A33阳性)外泌体中有差异表达的一或多种多核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文指定的核酸表达特征，该核酸表达特征是预示着结直肠癌存在的指征。
在本发明的优选实施方案中，方法包括：(a)确定一或多个目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中核酸分子组合的表达水平，每个核酸分子编码一个微RNA序列，然后用特定公式计算；(b)确定健康对照血浆肠源(A33阳性)外泌体中核酸分子组合的表达水平，然后用特定公式计算；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自计算结果鉴定一或多个目的血浆和对照血浆肠源(A33阳性)外泌体中核酸分子组合的差异，其中所述一或多种差异表达的核酸分子组合一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是预示着结直肠癌存在的指征。
在第三方面，本发明涉及用于监测结直肠癌治疗的方法，该方法包括：(a)用本文限定的方法鉴定一或多个目的血浆肠源(A33阳性)外泌体中核酸表达特征；及(b)监测血液中编码微RNA序列的属于核酸表达特征组合里的一或多种核酸分子表达水平，以此监测治疗前表达上调的血浆肠源(A33阳性)外泌体核酸分子在治疗后表达下调及治疗前表达下调的分子治疗后上调。
本文中术语“修饰编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未修饰的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未修饰的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。
在第四方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，该方法包括：(a)用本文限定的方法鉴定血浆肠源(A33阳性)外泌体中核酸表达特征；及(b)修饰血液中编码微RNA序列的属于核酸表达特征组合里的一或多种核酸分子表达水平，以使得血浆肠源(A33阳性)外泌体中表达上调的核酸分子表达下调及表达下调的分子上调。
在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以此方式被修饰，由此其在血浆肠源(A33阳性)外泌体中表达被上调的核酸分子的表达被下调并且其在血浆中表达被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与癌症患者血浆中所述分子的调节是反循环模式发生的，以于扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。
在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入患者中。
本文所用术语“导入到血液中”是指使得一或多种核酸分子转移进入血液中的任何操纵。这种技术的例子包括注射、消化吸收或其它可能参与的任何技术。
本文所用术语“互补序列”指被理解为“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)导入血液中能与上调的内源性“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。
两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即它们不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在进一步的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。
“互补”核酸分子(即编码核酸分子的核酸序列与编码下调的微RNA序列的核酸分子的核酸序列互补)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的一或多个修饰的核苷酸的合成核酸分子。
例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2′-O-甲基基团或者2′-O-甲氧基基团(也称作2′-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2′-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(Orom，U.A.et al.(2006)Gene 372，137-141).
最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt，J.et al.(2005)Nature 438，685--689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert，M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4，721-726).
在本发明的特别优选的实施方案中，一或多种表达下调的编码微小RNA的核酸分子选自这个组，包括hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-122-5p和miR-150-5p，关于表达特征，如上所述很可能预示着结直肠癌。
在本发明的进一步优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编码破上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入血液中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即额外的“有义”核酸分子)导入所述血液中而实现。导入血液中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。
在一个特别优选的实施方案中，一或多种表达上调的编码微小RNA的核酸分子选自这个组，包括hsa-miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，miR-204-5p和miR486-5p，关于表达特征，如上所述很可能预示着大肠癌。
导入血液中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达。
为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤抑制也可以参与肿瘤发生(Esquela-Kerscher，A.and Slack，F.J(2006)supra；Calin，G.A.andCroce,CM.(2007)supra；Blenkiron，C.and Miska，E.A.(2007)supra)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤抑制基因以及癌基因。
如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。
为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5′非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgamo元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻遏子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3′非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。
此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(Naguibneva，1.et al.(2006)Biomed Pharmacother 60，633-638)。
因此，被导入提供的血液中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。
在第五方面，本发明涉及用于在血样中预防和/或治疗结直肠癌治疗的药物组合物，这个组合物包括一或多个核酸分子，每个核酸分子编码一个与本文限定的结直肠癌患者血浆肠源(A33阳性)外泌体中表达上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补的序列，和/或与相应的本文限定的表达下调的核酸分子编码的微RNA序列。
最后，在第六方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗结直癌的药物中的应用。
在本发明范围内，合适的药物组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经含服和舌下)、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物，或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。可以局部或全身性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。所述制剂可以包装为独立剂量单位。
本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。
使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro，A.L.and Gennaro，A.R.(2000)Remington：TheScience and Practice of Pharmacy,20th Ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA；Crowder，T.M.et al.(2003)A Guide to Pharmaceutical ParticulateScience.Interpharm/CRC，Boca Raton，FL；Niazi，S.K.(2004)Handbook ofPharmaceutical Mamufacturing Formulations，CRC Press，Boca Raton，FL)。
为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂防、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
所述药物组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。
为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。
一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek，J.et al.(2004)Nature432，173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以中于全身性输送(Elmen，J.et al.(2008)Nature 452，896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(Zimmermann，T.S.et al.(2006)Nature 441，111-114)。近年来，描述了一类称作lipidoids的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc，A.et a1.(2008)Nat.Biotechnol.26，561-569)。
进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼梢蛋白是使梢子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song，E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23，709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles，A.et al.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6，443-453；Kim，D.H.and Rossi，J.J.(2007)Nat.Genet.8，173-184)中。
本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。
附图说明
图1，描绘了流程图，示意说明用于确定本发明的表达特征的基本方法步骤，所述表达特征用于鉴定显示或有结直肠癌的一或多个目的血浆肠源(A33阳性的)外泌体微小RNA。
图2示例ROC曲线分析，用定量RT-PCR检测结直肠癌目的血浆和健康对照血浆肠源(A33阳性的)外泌体的两个肿瘤相关的miRNA(hsa-miR-92a-3p and miR-150-5p)，结果显示这些血浆肠源(A33阳性的)外泌体miRNA作为诊断性标记物有高度的敏感性和特异性。
具体实施方式
实施例1：血浆样品收集与制备
研究对象采集空腹静脉血10mL，EDTA抗凝，在2小时内800g×10min，16000g×10min两次离心出血浆。取血浆650μL，3000g离心15min，除去沉淀和脂质层，然后取600μL上清于新的EP管，16000g离心10min以避免大颗粒物质堵塞凝胶，最后将血浆样本储存在-80℃备用。
根据厂商指导用凝胶排阻色谱法(BE-SEC柱子，江苏为真生物医药技术股份有限公司，50620001)富集血浆总外泌体，用Anti-A33蛋白胞外段抗体ab197370标记的磁珠免疫(江苏为真生物医药技术股份有限公司，50630004)吸附纯化肠源外泌体。用miRNeasyMicro Kit分离试剂盒(QIAGEN，Germany)从血浆中提取总RNA。用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Waltham，MA)定量。用RNA 6000Pico LabChip试剂盒(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)通过2100生物分析仪进行质量控制。
表2显示用于本发明的血液标本的基准特征。所有患者的样品都是手术的获得的。患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库。肿瘤组织病理由三位病理学家根据世界卫生组织肿瘤分类系统分别分类。
表2
血液标本的基准特征
全基因组miRNA分析 数量
健康个体 5
大肠癌 6
定量RT-PCR分析
健康个体 5
大肠癌 6
总数 22
实施例2：血浆样品中miRNA表达谱的分析
使用Illumina NovaSeq6000第二代高通量测序根据厂商指导对其中11个血浆样品中(差异)表达的miRNA进行测序分析。对于每个样本，产生了不少于20M的raw reads，且碱基质量大于20(Q20)的比重大于98％。通过测序共检测到312个已知的miRNAs。
以P-value＜＝0.05，Fold-change(FC)＞＝2为条件，筛选到了18个差异表达的血浆肠源外泌体miRNA(表3)。如果满足这两个标准，则认为所述miRNA在大肠癌患者与健康个体中分别差异表达。
表3
测序结果显示的血浆肠源外泌体miRNA在大肠癌患者与健康个体中的表达差异比 较
CRC与健康对照miRNA差异表达分析试验数据总结在表4。表4列出分别与对照组织和健康对照血浆相比，CRC患者组织和血浆的miRNA表达显著差异。“t”表示大肠癌组织，“n”表示匹配的正常组织，而“p”表示结直肠癌患者，“h”表示健康对照。特别优选的miRNA(SEQID NO：1-SEQ ID NO：10在表4中列出：SEQ ID NO：21to SEQ ID NO：24in Table 5，respectively)用粗体表示。
表4
大肠癌血浆肠源外泌体中肿瘤相关miRNA特征
Note：infmeans‘∞’.
实施例3：测序数据的验证
为验证(和/或定量)测序所获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的定量RT-PCR，采用TB Green qPCR测定法(Takara,Japan)进行验证。简而言之，根据说明书的指导使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒进行逆转录(RT)。包含2X mRQBuffer、mRQ Enzyme的6.25ul RT溶液混合物中加入200ng总RNA逆转录，然后RT溶液在PCR仪(Thermal cycler alpha engine，Bio-rad)上进行37℃ 60min、85℃ 5min的热循环。根据说明书的指导使用TB Green qPCR Master Mix试剂盒进行定量PCR。2ul RT产物在2X TBGreen Advantage qPCR Premix、PCR Forward Primer(10μM)、PCR Reverse Primer(10μM)、50X ROX Reference Dye LSR混合物中扩增，每个反应重复两次。实时PCR在ThermoFisher Scientific公司的StepOnePlus System实时荧光定量PCR仪器上进行，程序为96℃30s初始加热，然后40个循环的95℃ 5s、60℃ 30s。miRNA通过2*ΔΔCt法相对定量。每个miRNA Ct值经内部稳定对照U6进行均一化。
所获得的结果证实在大肠癌中miRNA表达的全局高特异性调节。因此，本文所述的miRNA的相应亚集代表独特的miRNA表达特征，用于大肠癌的表达谱分析，其不仅使得可以鉴别癌的发生状态本身，而且使得可以与肝细胞癌和肺癌相区别。
本发明对miRNA表达特征的确定为通过血液监测、发现、诊断大肠癌提供了一个独特的分子标记物。此外，该表达特征可被用于监测大肠癌患者的治疗反应及引导做出治疗决策。另外，该表达特征还可用于开发抗大肠癌的药物。
在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。

Claims (10)

1.miRNA作为结直肠癌检测或治疗靶点的用途，其特征在于，所述miRNA选自miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p及hsa-miR-486-5p的一种或多种。
2.测量miRNA表达水平的试剂在制备结直肠癌诊断试剂中的用途，所述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p，hsa-miR-486-5p的一种或多种，所述诊断试剂通过测量样品中所述miRNA的表达水平来诊断受试者是否患有结直肠癌或处于结直肠癌的风险中，其中与对照样品相应的miRNA表达水平相比，hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-184、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p表达上调，或者hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-122-5p和/或hsa-miR-150-5p表达下调，指示着受试者患有结直肠癌或处于发生结直肠癌的风险中。
3.一种结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有能够检测miRNA表达水平的试剂，所述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测miRNA表达水平的试剂为多核酸分子，每个多核酸分子编码相应的miRNA序列或者与相应的miRNA部分或全部互补，所述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，进一步含有内部稳定对照RNU6。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于检测血浆肠源(A33阳性)外泌体中miRNA表达水平，所述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，
hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p。
7.测量miRNA表达水平的试剂在制备监测结直肠癌治疗进程中的用途，所
述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-miR-122-5p，hsa-miR-124-
3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-196a-5p，hsa-
miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p，所述测量试剂监测治疗后血液中hsa-
miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-184、hsa-miR-
196a-5p、hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p表达水平下调，或者hsa-
miR-146a-5p，hsa-miR-122-5p和/或hsa-miR-150-5p表达水平上调。
8.促进hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-184、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p表达下调，或者hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-122-5p和/或hsa-miR-150-5p表达上调的一种或多种多核酸分子在制备治疗或预防结直肠癌药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述一种或多种核酸分子编码
hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-184、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-
122-5p和/或hsa-miR-150-5p。
10.如权利要求8所述的用途，所述一种或多种多核酸分子与相应的miRNA
部分互补或全部互补，所述miRNA为miR-21-5p，hsa-miR-92a-3p,hsa-
miR-122-5p，hsa-miR-124-3p，hsa-miR-146a-5p，miR-150-5p，hsa-miR-
184，hsa-miR-196a-5p，hsa-miR-204-5p和/或hsa-miR-486-5p。
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