CN118109625A

CN118109625A - 与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记及应用

Info

Publication number: CN118109625A
Application number: CN202410049387.3A
Authority: CN
Inventors: 王盼乔; 胡建斌; 强军豪; 杜烜宇; 梁晓雪; 侯娟; 李翔; 毛文文; 李丽丽; 牛旭旭
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2024-01-12
Filing date: 2024-01-12
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本发明提供了一种与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记及应用。所述InDel分子标记由SEQ ID NO:1所示的上游引物CmFpt‑F和SEQ ID NO:2所示的下游引物CmFpt‑R扩增得到。该分子标记引物不仅在自然群体中与果肉厚度性状共分离，在不同育种材料中，其扩增带型也与果肉厚度表型一致。基于InDel分子标记设计的引物对及其试剂盒可以在出芽期或苗期开展甜瓜果肉厚度性状筛选。因此，本发明提供的分子标记、引物对及试剂盒等可直接用于甜瓜分子标记辅助育种，降低种植大群体的生产成本，加速育种进程，提高育种效率，具有重要的应用价值；同时能提高选择的准确性、加快品种培育的进程。

Description

与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，具体涉及与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记及应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是重要的葫芦科作物，具有较高营养价值和经济价值。中国甜瓜栽培历史悠久，可以追溯到汉武帝时期沿丝绸之路传入我国。中国甜瓜总栽培面积和产量均居世界首位，加速推动整个果蔬产业的快速发展，但单位亩产水平相对较低。

分子辅助选择育种技术是利用分子标记快速筛选目标性状的方法，近年来，在甜瓜育种中得到了很好应用。能够在分子水平上快速筛选所需要的育种材料和亲本，极大的缩短了育种年限。比起传统育种，分子育种更加精确、更加高效，能够实现从“经验育种”到“精确育种”的转化。分子标记育种可以加快植物育种的速度，然而目前非常缺少有效的产量性状辅助筛选的可靠标记，例如果肉厚度相关标记等，这对于甜瓜产业的下一步发展造成了巨大影响。

甜瓜的果肉厚度是甜瓜重要的质地品质，无论用于加工亦或鲜食，果肉越厚，其利用率越高，它与干物质积累及质地密切相关。通过全基因组关联分析鉴定甜瓜果肉厚度基因，利用现代分子生物技术改良种质，选育厚果肉品种对改良甜瓜质地品质和提升消费者利益具有重要意义。同时甜瓜的果肉厚度是甜瓜重要的农艺性状，直接决定甜瓜的果型与产量。果实的果肉厚度是非常重要的农艺性状，也是甜瓜产量的重要组成部分，直接决定果实的重量；果肉厚度是果实完全成熟后的农艺性状，且易受环境影响，是性状改良中的难点。常规育种需要在果实成熟后对果肉厚度进行鉴定，耗时长、成本高。

为此，东北农业大学于中国发明专利申请CN 116987814 A中公开了鉴定甜瓜果肉厚度性状的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用，该分子标记为CAPS分子标记，主要基于亲本杂交技术基于甜瓜基因组1号染色体发现的SNP位点开发的，其公开的鉴定方法虽然为甜瓜果肉厚度性状的分子鉴定提供了行之有效的分子育种工具。现有技术中未在甜瓜基因组其它染色体上发现与甜瓜果肉厚度性状的定位基因，也未见关于与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的报道。由此可见，现有技术中关于甜瓜果肉厚度性状的基因定位的报道比较少，不利于定向的提高甜瓜的产量，也不利于缩短育种进程。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在甜瓜分子育种的应用。

本发明的另一目的在于提供一种甜瓜果肉厚度的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种与甜瓜果肉厚度(Fruit pulp thickness,Fpt)共分离的InDel分子标记，由SEQ ID NO:1所示的上游引物CmFpt-F和SEQ ID NO:2所示的下游引物CmFpt-R扩增得到。其中，的核苷酸序列分别如下：

CmFpt-F：5’-TAAGAGGGAAAGGTCAGTACAGT(SEQ ID NO.1)；

CmFpt-R：5’-TCGTAGAAAACAACCAAACCCC(SEQ ID NO.2)。

其中，所述InDel分子标记包含CTATC和C两种基因型。CTATC基因型的性状表现为薄果肉状，C基因型的性状表现为薄果肉状。在本发明中所述薄果肉性状的果肉厚度范围优选为0.210-2.240cm，所述厚果肉性状的果肉厚度范围优选为2.278-3.983cm。

所述InDel分子标记含CTATC基因型的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全长100bp；所述InDel分子标记含C基因型的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，全长96bp。

SEQ ID NO.3：

SEQ ID NO.4：

其中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列中的下划线标记序列为变异序列。

本发明还提供一种用于检测与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的引物对CmFpt，所述引物对CmFpt包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物CmFpt-F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物CmFpt-R。

本发明还提供一种用于检测与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的试剂盒，包括上述用于检测与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的引物对CmFpt。所述试剂盒可以用来鉴定甜瓜果肉厚度性状。具体地，可以选择含有上述引物对CmFpt的试剂做成试剂盒，其中，所述试剂盒用试剂中的各个成分可以独立包装，也可以两个或多个成分混合一起包装。

本发明还提供一种上述与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记或上述引物对CmFpt或上述试剂盒在在甜瓜分子育种中的应用。其中，所述InDel分子标记或上述引物对CmFpt或上述试剂盒主要是用于鉴定或辅助鉴定甜瓜果肉厚度表型。利用所述InDel分子标记或引物对或试剂盒，能准确、快速、有效的鉴定甜瓜果肉厚度性状基因。本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来判定甜瓜果肉厚度品种。具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

本发明还公开了一种利用上述InDel分子标记或上述引物对CmFpt或上述试剂盒鉴定甜瓜果肉厚度性状的方法，包括PCR扩增上述引物对CmFpt，并结合电泳检测和/或基因测序法，根据PCR扩增产物的大小判断所述InDel分子标记在控制甜瓜果肉厚度性状上的基因型信息。

所述鉴定甜瓜果肉厚度性状的方法，具体包括步骤：

(1)提取待测甜瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用上述引物对CmFpt对模板进行PCR扩增，得到所述PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，当所述PCR扩增产物的长度为100bp时，所述待测品种为纯合薄果肉性状；当所述PCR扩增产物的长度为96bp时，所述待测品种为纯合厚果肉性状。

其中，纯合薄果肉性状的特征条带仅有一条如SEQ ID NO.3所示，纯合厚果肉性状也仅有一条特征条带，如SEQ ID NO.4所示。

另外，用于检测InDel分子标记是否存在的试剂在控制甜瓜果肉厚度的基因定位中的应用，利用本发明的分子标记，可以对控制甜瓜果肉厚度的基因进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明运用全基因组关联分析的方法，在甜瓜8号染色体上筛选获得与甜瓜果肉厚度性状相关的1个InDel分子标记，所述InDel分子标记的编号分别为：Chr8_6093182，该InDel分子标记的基因型C为厚果肉果实，基因型CTATC为薄果肉果实，以此作为甜瓜育种过程中果肉厚度性状的辅助选择标记。所述InDel分子标记不仅在自然群体中与果肉厚度性状共分离，在不同育种材料中，其扩增带型也与果肉厚度表型一致，因此可直接用于甜瓜分子标记辅助育种。另外，利用该InDel分子标记能够在出芽期或苗期即可准确快速的鉴定出甜瓜果肉厚度性状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

本发明利用基于InDel分子标记设计的引物对CmFpt及其试剂盒可以在出芽期或苗期开展甜瓜果肉厚度基因筛选，降低种植大群体的生产成本，加速育种进程，提高育种效率，具有重要的应用价值；同时能提高选择的准确性、加快品种培育的进程。

附图说明

图1为甜瓜果肉厚度性状全基因组关联分析的曼哈顿图，其中：横坐标代表每个变异位点所在的基因组位置；纵坐标代表MLM模型下每个标记位点P值的以10为底的负对数；

图2为甜瓜果肉厚度性状的全基因组关联分析的QQ图，其中：横坐标代表假设P值服从均匀[0，1]分布，所预期观察的P值以10为底的负对数；纵坐标代表观察到P值以10为底的负对数；

图3显著关联位点附近候选基因连锁不平衡区块分析，其中：红点从左到右依次代表显著性关联位点Fpt、WUS基因移码突变的indel和WUS基因非同义突变SNP的位置；

图4从头测序材料CmFpt引物ePCR产物的序列比对和果实特征；

图5为显著关联位点Chr8_6093182对应的不同基因型的样本果肉厚度性状分布箱形图；其中：***代表在0.001水平下不同基因型间果肉厚度差异极显著；

图6为甜瓜果肉厚度性状基因InDel标记的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；其中：21条泳带代表21份甜瓜核心材料中果实果肉厚度(Fpt)性状共分离标记的筛选结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

若未特别指明，本发明中所采用的术语均为所属领域常用术语，实施例中所采用的技术手段，如制备工艺、测试方法等等，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

用于标记开发的179份材料由国家西瓜甜瓜种质中期库(郑州)提供，用于验证引物扩增效果的21份甜瓜育种材料为本实验室河南农业大学甜瓜生物技术与种质创新实验室基于国家西瓜甜瓜种质中期库(郑州)提供的甜瓜种子经自交分离纯化所得。需要解释的是，采用该材料作为研究基础，仅是实验材料获得的便捷性原因，不应理解为本申请相关技术方案的实现必须依赖于该实验材料。

本发明主要是以通过179份甜瓜材料构建GWAS分析的群体，所选甜瓜材料种植于郑州河南农业大学毛庄科教园区的塑料大棚中。植株定植30天后，采取每个材料的顶端幼嫩叶片作为提取基因组DNA的样本，甜瓜果实成熟后调查果肉厚度性状作为GWAS分析的表型数据。179份甜瓜的重测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成，采用Illumina测序技术，测序深度>18X。对产出的测序数据进行质控与过滤，将质控合格的数据比对DHL92(v3.6.1)参考基因组序列，获得群体基因组中变异信息，通过对果肉厚度相关性状进行关联分析，挖掘出与甜瓜果肉厚度性状相关的分子标记。

本发明获得了2489603个高质量的多态性标记(SNP和InDel等)，用于全基因组关联分析，当检出的标记的P值小于2×10^-8时，认为达到了与性状显著关联水平。基于甜瓜果肉厚度性状关联分析结果，在甜瓜基因组8号染色体上筛选到甜瓜果肉厚度性状相关的1个InDel分子标记，所述InDel分子标记位点在甜瓜基因组8号染色体上的第6093182位，编号为：Chr8_6093182。

本发明根据InDel分子标记Chr8_6093182设计了一对引物CmFpt。经验证，本发明获得的与甜瓜果肉厚度相关的InDel分子标记能在甜瓜果肉厚度性状辅助选择中应用，其基因型C为厚果肉果实；基因型CTATC为薄果肉果实。

下面以具体实施例进一步详细说明本发明所要保护的技术方案。

实施例1与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的开发

1.1全基因组关联分析群体的构建

利用国家西瓜甜瓜种质中期库(中国郑州)提供的179份甜瓜材料，构建甜瓜全基因组关联分析群体。2022年至2023年所有甜瓜材料种植于郑州河南农业大学毛庄科教园区的塑料大棚中，每年分春秋两季，每个材料分别种植5株。生产管理过程包括，种子进行常温浸泡6h、在28℃暗光培养催芽、露白播种于72孔穴盘中，放置于日光温室内进行育苗。生长到三叶一心时定植于塑料大棚中。定植方式：高畦整地、单垄双行、三角定植、宽窄行距(株距45cm、窄行距60cm、宽行距80cm)。整枝方式：单蔓整枝、盛花期上午10:00之前进行人工授粉、正常进行肥水以及病虫害管理、果实成熟后进行果肉厚度性状调查。

1.2样品的采集和表型数据的调查

甜瓜植物长至成株期，在晴天上午8点，取侧枝顶端幼嫩叶片于锡箔纸放液氮中迅速冷冻，带回实验室后保存于-80℃冰箱。

待甜瓜果实成熟后，然后选择发育良好(非畸形)的成熟果实用于测量果肉厚度这一性状，每个果实随机测量四次取平均值。

1.3甜瓜基因组DNA的提取与检测

使用改良CTAB法提取总DNA，实验过程包括以下步骤：

(1)使用液氮将叶片冻脆，后用高通量冷冻研磨仪磨碎至成粉末状备用。

(2)向离心管中加入800μL已经在65℃水浴锅中预热1h的2％CTAB，震荡，使甜瓜叶粉末于液体充分接触，放入65℃水浴锅内1h，期间每10min混匀一次；

(3)水浴后晾至室温，加入800μL的氯仿/异戊醇(体积比24:1)溶液，充分摇匀后，于4℃采用12000r/min的转速离心10min；

(4)吸出600μL上清液并置于1.5mL离心管中，加入600μL-20℃预冷的异丙醇，充分摇匀，-20℃沉淀0.5～1h；

(6)取出离心管，于4℃采用12000r/min的转速离心9min，离心后吸出上清液，保留沉淀；

(7)用75％的乙醇清洗2～3次，室温晾干，加入蒸馏水补足80μL，获得待测甜瓜DNA样品。

利用NanoDrop 2000超微量分光光度计进行DNA纯度及浓度的检测，通过琼脂糖凝胶电泳检测完整性，符合要求的保留在-20℃冰箱备用。

1.4测序与数据过滤

对上述检测合格的基因组DNA样品，进行超声波打碎后电泳筛选300bp大小的片段，然后通过PCR扩增建库，质检合格的文库上机测序。Illumina测序完成后，对原始数据Raw Reads进行接头、随机引物的去除和低质量reads的过滤。以甜瓜DHL92 v3.6.1(http://cucurbitgenomics.org/organism/18)为参考基因组，将Clean Reads比对到参考基因组上，利用GATK 4.0获取全基因组变异信息，并对低质量SNP和InDel进行过滤。

1.5全基因组关联分析及引物开发

变异位点SNP_and_InDel.vcf经过质控之后，使用TASSEL 5.0软件的混合线性模型MLM进行关联分析，挖掘出与甜瓜果肉厚度相关的变异位点。当检出的变异位点的P值小于2×10^-8时，被认为是显著关联位点。本实验中甜瓜果肉厚度性状在8号染色体上关联到1个显著性INDEL位点：Chr8_6093182，如表1所述。并利用R packages绘制了全基因组位点P值的曼哈顿图和QQ plot图，如图1和图2所示，GWAS结果峰值显著，QQ plot拟合一致性高，证明关联分析定位结果准确。

表1与甜瓜果肉厚度显著相关的InDel位点信息

标记名称

染色体

位置/bp

参考

变异

效应值

标准误

P值

chr08-6093182

chr08

6093182

CTATC

C

0.33912

0.057711

1.79×10^-8

利用LDBlockShow软件绘制连锁不平衡blocks图，如图3所示，并在显著性位点chr08-6093182连锁不平衡区域内鉴定到2个候选基因MELO3C007898和MELO3C007899。其中MELO3C007898(chr08:6099745..6102041)编码WUSCHEL蛋白，简称WUS基因，WUS基因对作物不定根发育、糖积累和细胞分裂素含量都有影响。对GWAS群体WUS基因内部变异注释发现了1个移码突变(ATT->A)和1个错义突变(T->C)。候选基因MELO3C007899(chr08:6106785..6110535)编码WD重复序列蛋白，简称WDR82基因，基因编码区上没有位点变异。所以控制果肉厚度性状最有可能的候选基因为WUS，基因上游InDel标记chr08-6093182，Fpt与候选基因WUS紧密连锁，如图3所示。

针对该果肉厚度显著关联InDel变异位点，设计了1对InDel分子标记的引物对，命名为CmFpt，该引物对CmFpt包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物CmFpt-F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物CmFpt-R。

经验证，所述InDel分子标记与果肉厚度性状共分离，如表2所示，当chr08-6093182位点的基因型为CTATC时，对应果肉厚度范围优选为0.210-2.240cm，为薄果肉性状；当chr08-6093182位点的基因型由CTATC突变为C时表现为厚果肉性状，对应果肉厚度范围优选为2.278-3.983cm。

表2甜瓜关联群体材料果肉厚度表型值与chr08_6093182基因型数据

实施例2在已测序样本中验证InDel分子标记的多态性

搜集已完成从头测序的6份甜瓜品种：薄果肉品种DHL92、IVF77(http://cucurbitgenomics.org/v2)和马泡(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/)，厚果肉类型Harukei-3、Payzawat和Charmono(http://cucurbitgenomics.org/v2)；6份品种在果肉厚度上具有明显区别。在其基因组上进行甜瓜果肉厚度标记引物对CmFpt的ePCR反应，扩增产物见图4。ePCR扩增结果显示，在6份品种间存在4bp的插入缺失变异，证明该InDel分子标记可以在6种不同果肉厚度品种间，特异性结合并扩增出多态性。

利用关联分析的179材料进行基因型分析发现，如表3所示，该InDel位点为碱基C的材料，平均果肉厚度为2.87cm；该InDel位点表现为碱基CATCT的甜瓜材料，平均果肉厚度平均值为1.50cm；杂合位点CATCT/C对应果肉厚度平均值为2.07cm。使用R软件包ggplot2绘制基因型与表型分布箱型图如图5所示，CATCT与C不同基因型对应的果肉厚度差异极显著(P<0.01)，证明了本发明实施例中的InDel位点可准确区分甜瓜果肉厚度性状。

表3不同基因型甜瓜果肉厚度分布情况

实施例3甜瓜果肉厚度共分离InDel分子标记及其引物对CmFpt的应用

利用实施例1中开发的InDel分子标记的引物对CmFpt对表4所示的21个甜瓜育种材料中进行扩增验证，结构如图6所示。

3.1利用实施例1中方法提取苗期待测植株DNA

实验材料为果肉厚度范围为2.82-3.67的厚果肉甜瓜和果肉厚度范围为0.24-1.45cm的薄果肉甜瓜，其中，所述厚果肉甜瓜为：HNA24、网纹238、PI-164569、PMR-45、Ames29564、NSL 34600、NSL 60241、NSL 74171、PI 236355、PI 273442、PI 446930，所述薄果肉甜瓜为：PI 536473、PI 406737、PI 536473、PI 536476、PI 614174、PI 614440、PI 614481、PI 614574、益都黄银-1、冰瓜材料。

按照实施例1中的方法进行在72孔穴盘中育苗，每个材料播种3株。于三叶一心期取叶片样品，按照实施例1中改良CTAB法提取新鲜叶片DNA。

表4验证甜瓜果肉厚度InDel分子标记的样本及Chr08_6093182基因型信息

分组	品种名	来源地	果肉厚度/cm	基因型	扩增产物大小/bp
						H	HNA24	中国	2.82	C	96
H	网纹238	中国	3.59	C	96
						H	PI-164569	俄罗斯	3.53	C	96
H	PMR-45	日本	2.98	C	96
						H	Ames 29564	土库曼斯坦	3.05	C	96
H	NSL 34600	美国	3.64	C	96
						H	NSL 60241	美国	3.27	C	96
H	NSL 74171	美国	3.67	C	96
						H	PI 236355	英国	3.04	C	96
H	PI 273442	加拿大	3.37	C	96
						H	PI 446930	以色列	3.11	C	96
B	PI 536473	马尔代夫	0.41	CTATC	100
						B	PI 406737	印度	0.49	CTATC	100
B	PI 536473	印度	0.42	CTATC	100
						B	PI 536476	印度	0.47	CTATC	100
B	PI 614174	印度	0.24	CTATC	100
						B	PI 614440	印度	0.49	CTATC	100
B	PI 614481	印度	0.55	CTATC	100
						B	PI 614574	印度	0.52	CTATC	100
B	益都黄银-1	中国	1.45	CTATC	100
						B	冰瓜	中国	0.74	CTATC	100

注：H组甜瓜品种为厚果肉材料共11份；B组为薄果肉材料共10份。

3.2 InDel标记的PCR扩增

以21份甜瓜育种材料基因组DNA为模板，采用实施例1中筛选出的分子InDel标记引物对CmFpt进行PCR扩增。PCR扩增时采用10μL反应体系包括：浓度为100ng·μL^-1的基因组DNA 1μL，2×Taq PCR StarMix with Loading Day(包括Taq DNA Polymerase、Mg²⁺和dNTPs)5.0μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，ddH₂O 3μL。PCR扩增仪的反应程序设置为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸10min，4℃保存。由擎科生物科技(南京)对PCR扩增产物进行Sanger测序。

3.3 PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测

聚丙烯酰胺凝胶的制备，所需试剂和用量如表5所示。将配置好的溶液均匀混合，匀速缓慢倒入玻璃板之中(避免气泡产生)，后缓慢匀速插入梳子，等待溶液凝固。在电泳槽中先倒入适量0.5xTBE，然后将胶拆除夹子装入电泳槽内，而后在电泳槽上部倒入适量0.5xTBE，缓慢匀速拔掉梳子。在凝胶第一个点样孔前点入1μL 2000 DNA Marker，然后将PCR产物各1.0μL依次加到点样孔中。将线连接电泳仪和电泳槽后，进行电泳1.0h。

表5聚丙烯酰胺凝胶制备所用试剂和用量

试剂	用量
		19:1聚丙烯酰胺溶液	24mL
5×TBE	16mL
		DdH₂O	10mL
TEMED	60μL
		10％APS	600μL

电泳结束后，将缓冲液从电泳槽中回收，将凝胶从玻璃板中小心取出，放入装有蒸馏水的塑料槽漂洗后，倒去蒸馏水。加入1000mL溶有1.2g AgNO₃的水溶液，置于摇床上染色2min。染色结束后用少量蒸馏水迅速漂洗，然后将蒸馏水倒出。加入显色液进行显色，直至显现出条带为止，蒸馏水漂洗后在灯箱上拍照分析。显色液配方为15g NaOH和15mL甲醛溶液溶解到1000mL蒸馏水。

3.4扩增结果

由表4和图6可以看出：利用InDel分子标记的引物对CmFpt检测果肉厚度范围为0.24-1.45cm的薄果肉材料时，可通过PCR扩增获得100bp的特征条带，所述100bp的特征条带的具体碱基序列SEQ ID NO.3所示；相同分子标记下，而果肉厚度范围为2.82-3.67cm的厚果肉材料扩增后的产物为96bp的片段，厚果肉材料扩增序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ IDNO.4序列比对发现是在薄果肉材料扩增序列SEQ ID NO.3的第46个碱基处，发生4个基因TATC的缺失。

实施例4用于检测甜瓜果肉厚度性状的InDel分子标记试剂盒及其在果肉厚度基因型鉴定中的应用

本实施例提供一种用于检测与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的试剂盒，包括实施例1中提供的用于检测与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记的引物对CmFpt。本实施例中，所述试剂盒主要由含有上述引物对CmFpt、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs和ddH₂O的试剂制成。

本实施例还提供一种利用上述试剂盒在控制甜瓜果肉厚度性状的基因型鉴定中的应用，先扩增所述引物对CmFpt，再结合电泳检测和/或基因测序结果来判断控制甜瓜果肉厚度性状的基因型信息。具体地，本实施例提供的利用试剂盒在控制甜瓜果肉厚度性状的基因型鉴定中的应用实施方法，与前述实施例3提供的甜瓜果肉厚度共分离InDel分子标记及其引物对CmFpt的应用的具体实施方法相同。

以上实施例表明，本发明的所保护的技术方案可将甜瓜厚果肉材料与薄果肉材料进行有效区分，准确并快速检测出材料的果肉厚度相关基因型变异。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims

1. 一种与甜瓜果肉厚度共分离的InDel分子标记，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示的上游引物CmFpt-F和SEQ ID NO:2所示的下游引物CmFpt-R扩增得到。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，它包含CTATC和C两种基因型，且CTATC基因型的形状表现为薄果肉性状，C基因型的形状表现为厚果肉性状；

优选地，所述薄果肉性状的果肉厚度范围为0.210 - 2.240 cm，所述厚果肉性状的果肉厚度范围为2.278 - 3.983 cm。

3. 根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，它含CTATC基因型的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全长100 bp；它含C基因型的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，全长96 bp。

4.一种用于检测权利要求1～3任一项所述的InDel分子标记的引物对，其特征在于，包括所述上游引物CmFpt-F和下游引物CmFpt-R。

5.一种用于检测权利要求1～3任一项所述的InDel分子标记的试剂盒，其特征在于，包括所述上游引物CmFpt-F和下游引物CmFpt-R。

6.一种权利要求1～3任一项所述的InDel分子标记或权利要求4所述的引物对或权利要求5所示的试剂盒在甜瓜分子育种中的应用；

优选地，所述应用为鉴定或辅助鉴定甜瓜果肉厚度表型。

7.一种利用权利要求1～3任一项所述的InDel分子标记或权利要求4所述的引物对或权利要求5所示的试剂盒鉴定甜瓜果肉厚度性状的方法，包括PCR扩增所述上游引物CmFpt-F和下游引物CmFpt-R，并结合电泳检测和/或基因测序法，根据PCR扩增产物的大小判断所述InDel分子标记在控制甜瓜果肉厚度性状上的基因型信息。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括步骤：

（1）提取待测甜瓜基因组DNA；

（2）以所述步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用所述上游引物CmFpt-F和下游引物CmFpt-R对模板进行PCR扩增，得到所述PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行电泳检测和/或基因测序；

（3）根据所述步骤（2）检测出的电泳条带和/或基因测序结果进行判定，当所述PCR扩增产物的长度为100 bp时，所述待测品种为纯合薄果肉性状；当所述PCR扩增产物的长度为96bp时，所述待测品种为纯合厚果肉性状。