CN118109431A

CN118109431A - 一种用于r-玻色因合成的羰基还原酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN118109431A
Application number: CN202410340037.2A
Authority: CN
Inventors: 倪国伟
Original assignee: Shanghai Weisangxiancheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Weisangxiancheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-24
Filing date: 2024-03-24
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本发明公开一种用于R‑玻色因合成的羰基还原酶及其制备方法和应用，是以来源于Leifsonia shinshuensis的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的羰基还原酶LsSDR为出发序列且具有相应的突变位点(例如S148L等)的氨基酸序列。本发明还公开该羰基还原酶的编码基因、载体、生物工程菌及合成玻色因的方法。本发明的优点在于酶活性好，热稳定性好，反应转化率高，产物立体选择性好。

Description

一种用于R-玻色因合成的羰基还原酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别是涉及一种用于R-玻色因合成的羰基还原酶及其制备方法和应用。

背景技术

玻色因(Pro-Xylane)，化学名羟丙基四氢吡喃三醇，是一种具有抗衰老活性物的木糖衍生物，在化妆品中有着广泛的应用。玻色因能使肌肤更强韧有弹性，改善颈部细纹，预防衰老。其作用机理是：玻色因可以促进糖胺聚糖的合成，以及促进l型、lV型、Vll型胶原蛋白的合成(Eur J Dermatol.2008May-Jun；18(3)：297-302)。

目前市面上的玻色因产品主要是以混合物形式为主，混合物中S(Ia)/R(Ib)异构体的比列在5∶5到7∶3之间。主要原因是，现有技术中羰基的还原采用硼氢化钠或者三乙酰硼氢化钠，反应立体选择性不理想。2002年欧莱雅公司就报道了一种玻色因的原研化学制备方法(WO02/051828A2)，但该方法是采用硼氢化钠还原β-丙酮木糖苷(II)的羰基，其存在反应立体选择性低，产物分离难和环境污染等缺点。

相较于化学法，生物酶催化合成法具有安全高效、成本低廉，立体选择性专一且对环境友好的优点。但是，目前酶法催化制备(R)-构型玻色因报道较少，主要原因是可选择的能够立体专一地制备R-玻色因的羰基还原酶的种类少，或者存在酶活性不佳、热稳定性不佳、立体选择性不佳或者转化率有待提高。

因此，本领域需要开发性能更好的羰基还原酶和/或其突变体，能为R-玻色因的生物催化合成提供更多的选择。

发明内容

针对现有技术制备R-玻色因合成中所存在的问题，本发明提供一类具有催化活性高、热稳定性更好、立体选择性强、和/或反应转化率高的特点的其他来源的羰基还原酶，同时还提供了与该羰基还原酶对应的核酸序列、重组表达质粒、基因工程菌株及其制备方法，以及该羰基还原酶在立体专一性合成R-玻色因中的应用和反应体系。

第一方面，本发明提供了一种羰基还原酶，所述羰基还原酶的氨基酸序列选自以下组：

突变体2：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点S148L的氨基酸序列；

突变体3：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点Q169K的氨基酸序列；

突变体5：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点S148L/Q169K的氨基酸序列；

突变体6：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点S148L/Q169R的氨基酸序列；

突变体7：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点L117V/S148L/Q169K的氨基酸序列；

突变体8：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点K111R/L117V/S148L/Q169K的氨基酸序列；

突变体9：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点K111R/L117V/L121F/S148L/Q169K的氨基酸序列；

突变体10：对应于SEQ ID NO：2且具有突变位点K111R/L117V/L121F/S148L/Q169K/L207V的氨基酸序列。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体2。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体3。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体5。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体6。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体7。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体8。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体9。

在一些具体实施方案中，所述羰基还原酶为突变体10。

本发明提供的上述羰基还原酶是针对来源于Leifsonia shinshuensis的羰基还原酶LsSDR(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)进行分子改造，从而获得酶活性和/或热稳定性提高的羰基还原酶突变体。

本发明以野生型的羰基还原酶LsSDR为模板，利用随机点突变试剂盒(II Site-Directed Mutagenesis Kit)进行易错PCR，或通过半理性设计对野生型的羰基还原酶基因LsSDR进行突变，获得含有进化的羰基还原酶基因的质粒文库。通过高通量筛选获得酶活性提高的突变位点，并对这些突变位点建立突变文库，筛选出具有更优的酶活性和/或热稳定性的突变体。

本发明提供的上述羰基还原酶，与野生型的羰基还原酶LsSDR相比，酶的活性更高，热稳定性更好，产物立体选择性也更好。

第二方面，本发明还提供前述第一方面所述的羰基还原酶的编码基因。所述编码基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：1所示的序列为出发序列，根据所述羰基还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的差异，对密码子进行相应的突变(例如碱基替换)后得到。

本发明还提供了一种分离的核酸，所述核酸是编码前述第一方面所述的羰基还原酶的核酸。

其中，所述核酸的制备方法可为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：通过基因克隆技术获得编码所述羰基还原酶的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码所述羰基还原酶的核酸分子。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体装载有前述第二方面所述的羰基还原的编码基因。

在一种优选的实施方式中，所述表达载体为重组质粒。

在一种优选的实施方式中，所述表达载体为pET22b(+)载体。

其中，所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，一般是将所述核酸连接于各种表达载体上构建而成。

本发明还提供了一种包含上述表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含前述第二方面所述的羰基还原酶的编码基因。

其中，所述重组表达转化体的制备方法一般是将所述表达载体转化至宿主微生物中制得。所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。将所述重组表达载体(如质粒)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌株。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热激法等。

第四方面，本发明还提供前述第一方面所述的羰基还原酶在催化羰基化合物中的应用。

具体地，本发明提供前述第一方面所述的羰基还原酶作为催化剂在以β-丙酮木糖苷为底物经生物催化还原羰基制备R-玻色因中的应用。

具体的方法为，一种以β-丙酮木糖苷为底物经生物催化还原羰基制备R-玻色因的方法，其包括以下步骤：

(a)在液态反应体系中，以式II化合物β-丙酮木糖苷为底物，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，得到式Ib化合物R-玻色因；

(b)任选地从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出式Ib化合物R-玻色因；

其中，所述羰基还原酶为前述第一方面所述的羰基还原酶。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，式II化合物浓度为1-1000g/L。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为10g/L以上、30g/L以上、50g/L以上、70g/L以上、90g/L以上、100g/L以上、120g/L以上、140g/L以上、160g/L以上、180g/L以上、200g/L以上、220g/L以上、240g/L以上、260g/L以上、280g/L以上、300g/L以上、320g/L以上、350g/L以上、400g/L以上、或450g/L以上。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，所述式II化合物的浓度为10-500g/L；优选地，所述式II化合物的浓度为20-250g/L；进一步优选地，为50-150g/L。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，还存在共底物。

在一些具体的实施方式中，所述共底物选自：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、甲酸钠、或其组合。

在一些具体的实施方式中，所述共底物为异丙醇。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，共底物的质量体积浓度为5％～50％(w/v)。

在一些具体的实施方式中，所述辅酶选自下组：还原性辅酶、氧化性辅酶、或其组合。

在一些具体的实施方式中，所述还原性辅酶选自下组：NADH、NADPH、或其组合。

在一些具体的实施方式中，所述氧化性辅酶选自下组：NAD+、NADP+、或其组合。

在一些具体的实施方式中，所述NAD+用量与底物用量比率为0.01％～2.0％(w/w)；优选地，比率为0.1％～1.0％(w/w)。

在一些具体的实施方式中，所述NADP+的用量与底物用量比率为0.01％～2.0％(w/w)；优选地，比率为0.1％～1.0％(w/w)。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(a)中，反应温度为5℃～45℃。反应温度也可以选择为15℃～40℃，或20℃～35℃。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(a)中，反应时间为0.1～240小时。通过监控式I化合物的转化率来确定合适的反应终点。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(a)中，反应体系的pH为6.0～9.0；优选地，pH为6.0～8.0；进一步优选地，pH为6.5～7.5。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系中，羰基还原酶的存在形式为：游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。

在一些具体的实施方式中，所述反应体系为磷酸缓冲盐体系。

在一些具体的实施方式中，所述的反应体系含有选自下组的溶剂：水、醇、或其组合。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式II化合物的ee值≥99％；优选地，式II化合物的ee值≥99.9％。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥50％式I化合物被转化为式Ib化合物；优选地，≥80％式I化合物被转化为式Ib化合物；较优选地，≥95％式I化合物被转化为式Ib化合物；更优选地，≥99％式I化合物被转化为式Ib化合物。

本发明提供的上述反应体系，能够进行酶促反应，以高转化率制得高光学纯度的S-玻色因。优选地，光学纯度为ee值≥98％；更优选地，光学纯度为ee值≥99％。

技术术语

羰基还原酶

在本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。

在本发明中，所述的羰基还原酶包括是野生型的和突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。本发明中提及的野生型的羰基还原酶是来自Leifsonia shinshuensis的羰基还原酶LsSDR基因(登录号QNE37363.1)，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，其编码基因如SEQ ID No：1所示。

本发明中提供的羰基还原酶是在野生型的羰基还原酶的基础上通过筛选获得的一系列突变体，其相对于野生型羰基还原酶均在活性和热稳定性等方面具有优势，对R-玻色因的立体选择性更好。

反应体系中可以用上述羰基还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或者纯酶等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)或者休止细胞菌体的质量与底物的质量比率为10～100％。

辅酶

本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。

典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本较为昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD+、NADP+。

当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇，(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。

在一个优选实施方式中，辅酶为NAD+，辅酶再生体系为醇脱氢酶，本发明优选醇脱氢酶与共底物异丙醇。NAD+用量与底物用量比率为0.01％～2.0％(w/w)。缓冲体系为磷酸缓冲盐，浓度为0.1mol/L。缓冲液的pH为6-10。

立体异构体

本发明中，立体异构体是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，它可分为顺反异构体、对映异构体两种，也可分为对映异构体和非对映异构体两大类。在化学反应或酶促反应中，一种立体异构体相对于另一立体异构体优先形成，称之为立体选择性。立体选择性可以是部分的，这时一种立体异构体的形成比另一种有利，或者立体选择性可以是完全的，这时只形成一种立体异构体。当立体异构体是对映体时，立体选择性是指对映体选择性，即一种对映体在两种对映体总和中的分数(通常报道为百分比)。其(通常为百分比)在本领域中通常可选地报道为根据如下公式由其计算的对映体过量(ee)：[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]。在立体异构体是非对映异构体时，立体选择性是指非对映体选择性，即一种非对映体在两种非对映体混合物中的分数(通常报道为百分比)，通常可选地报道为非对映体过量(d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。本发明中，基本上立体异构体纯，酶能够将底物转化为具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％立体异构体过量的相应产物；优选为，至少约98％立体异构体过量；更优选为，至少约99％立体异构体过量。

生物催化制备方法

本发明提供了一种使用羰基还原酶催化还原β-丙酮木糖苷(II)制备化合物R-玻色因(Ib)的方法。其中，羰基还原酶是来源于Leifsonia shinshuensis的羰基还原酶LsSDR的突变体，反应式如下所示：

根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物与磷酸缓冲液混合搅拌，加入湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NAD+和共底物，用碳酸氢钠调节pH在6.5-7.5之间，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，优选至反应转化率达到80％以上(例如90％，95％或99％)。反应终止后，离心或硅藻土过滤，除去菌体，取上清液纳滤除盐，浓缩后结晶纯化得到产品。

本发明的主要技术效果有：

1)本申请筛选得到的羰基还原酶具有更好的热稳定性。

2)本申请筛选得到的羰基还原酶在催化还原β-丙酮木糖苷制备R-玻色因的反应中表现出更优的反应活性。

3)利用本申请筛选得到的羰基还原酶和本发明提供的制备方法来制备R-玻色因，相比现有技术水平，反应转化率有显著提升，反应成本降低。

4)本申请筛选得到的羰基还原酶在催化还原β-丙酮木糖苷制备R-玻色因的反应中具有很高的立体选择性，R构型产物光学纯度高，ee值达100％。

5)本发明为R-玻色因的酶催化合成提供一类新的来源的羰基还原酶，其具有催化活性高、热稳定性好、立体选择性强、和/或反应转化率较高的优点，为工业生产提供了更多更优的选择。

附图说明

图1为玻色因的消旋体手性HPLC图谱，图中S-玻色因构型保留时间约为9.151min和R-玻色因构型保留时间为9.681min。

图2为本申请的羰基还原酶催化所得式Ib化合物的手性HPLC图谱，图中显示R构型ee值达100％。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1：羰基还原酶的初筛试验

本实施例中对多种羰基还原酶进行初步筛选，其中，

LsSDR来源于Leifsonia shinshuensis，其Genbank序号为QNE37363.1；

LSADH来源于Leifsonia sp.strain S749，其Genbank序号为AB213459；

ARQR来源于Agrobacterium radiobacter ECU2556，其Genbank序号为WP_015918093.1；

AKR来源于Thermotoga maritima MSB8，其Genbank序号为WP_004082270.1；

LsSDR来源于Nakaseomyces glabratus，其Genbank序号为登录号KAI8399263。

筛选结果如表1所示，其中具体反应条件见相应的注释。

表1部分羰基还原酶的筛选结果

编号	羰基还原酶	转化率(％)	ee值(％)	玻色因的构型
					1	LsSDR^a	90	100	S
2	LSADH^a	70	95	R
					3	ARQR^b	31	98	R
4	AKR^b	7	91	S
					5	LsSDR^b	85	100	R

a表示反应条件为：2mL反应体系(1)：10g/L底物，20g/L葡萄糖，1mM NAD(P)，10g/LGDH，磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.0)，28℃，220rpm，20h。

b表示反应条件为：2mL反应体系(2)：10g/L底物，20％异丙醇，1mM NAD(P)，磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.0)，28℃，220rpm，20h。

由表1知，来源不同的羰基还原酶对本发明中的底物β-丙酮木糖苷的还原效果存在显著差异，产物的立体构型也有区别。羰基还原酶LSADH、ARQR和LsSDR在反应后均得到了R-玻色因，但相比其他羰基还原酶，羰基还原酶LsSDR在转化率和立体选择性两方面同时具有优势。

实施例2：羰基还原酶工程菌的构建

将来源于Leifsonia shinshuensis的羰基还原酶LsSDR基因(登录号QNE37363.1)，经密码子优化合成后，克隆入pET22b(+)载体中，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于含有氨苄霉素抗性平板上培养。挑取阳性转化子单菌落进行培养，并提取质粒测序，确定后提取重组质粒，然后导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，至氨苄霉素抗性平板培养，挑取单菌落至LB培养基中培养，获得羰基还原酶的重组基因工程菌。

实施例3：羰基还原酶突变库的构建及筛选

以野生型的羰基还原酶LsSDR为模板，利用随机点突变试剂盒(IISite-Directed Mutagenesis Kit)进行易错PCR或通过半理性设计对野生型的羰基还原酶基因LsSDR进行突变，获得含有进化的羰基还原酶基因的质粒文库。将构建后的质粒文库转入大肠杆菌BL21(DE3)中，然后涂布至含50μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。挑取单菌落至含400μL LB培养基(含50μg/mL氨苄霉素)的96孔板中，37℃，200rpm过夜培养得到羰基还原酶突变种子液。吸取10μL羰基还原酶突变种子液转至含400μL发酵培养基(含50μg/mL氨苄霉素)的96孔板中，37℃，800rpm培养至OD₆₀₀值＞0.8。采用终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，28℃对突变体诱导表达，然后继续培养20h。

发酵培养基配方如下：酵母提取物(2.0％)，胰蛋白胨(1.2％)，氯化钠(0.3％)，甘油(1％)，磷酸氢二钾(0.2％)，七水硫酸镁(0.05％)。

发酵培养结束后，将96孔板放置离心机中，3000g，30min离心收集菌体，然后用200μL裂解缓冲液(含有1000U溶菌酶的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.0)重新悬浮菌体，然后30℃裂解1h后，至离心机中4℃，4000g，离心30min，吸取澄清的上清液测定突变体活性和热稳定性。

将190μL反应液(含0.4mM底物、1mMNADPH)加入新的96孔酶标板中，再加入10μL的上清液后，在吸光度340nm下检测NADPH的变化。利用NADPH的消耗量计算反应突变体酶活的高低。

热稳定性测试方法：上述野生型酶和突变体酶的上清液于45℃孵育1h后测活，以未经热处理的酶液作参照，计算野生型酶和突变体残余酶活的相对活性。测活体系同上：190μL反应液(含0.4mM底物、1mM NADPH)，10μL的45℃孵育过的酶液。

各个突变体的相对活性和相对热稳定性如表2。

表2代表性的羰基还原酶突变体及其相对活性和相对热稳定性

*野生型羰基还原酶LsSDR(SEQ ID NO：2)的活性和热稳定性都设为100％。

表2数据显示，羰基还原酶LsSDR的活性增强敏感型突变残基位置有S148L、Q169K等，其相对活性＞130％，特别是同时具有S148L、Q169K突变位点的突变体的活性更好；而且，还意外地发现突变体9和10的相对活性能达400％以上。羰基还原酶LsSDR的热稳定性增强敏感型突变残基位置有K111R、S148L、Q169K等，其相对热稳定性＞200％，特别是同时具有S148L、Q169K突变位点的突变体的热稳定性更好，例如突变体5、7、8、9和10的相对热稳定性能达400％以上。与野生型相比较，本实施例提供的代表性的羰基还原酶突变体具有更好的活性和热稳定性。

实施例4：突变体在还原β-丙酮木糖苷制备R-玻色因中的应用

反应条件：取0.05M的磷酸盐缓冲液(1.6mL)，加入NAD+(0.001g)，加入异丙醇(0.4mL)充分溶解，加入前述发酵突变体羰基还原酶或野生型羰基还原酶LsSDR(0.06g)。剧烈搅拌分批加入底物β-丙酮木糖苷(0.2g)，30℃，220rpm反应3h。加入2mL的乙腈进行淬灭。使用示差检测转化率和产物立体选择性(％)ee值，如表3所示。

表3野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶催化活性和立体选择性

实施例5克级化合物R-玻色因生物催化制备

取0.05M的磷酸盐缓冲液(70mL)，加入NAD⁺(0.01g)，加入异丙醇(30mL)充分溶解，加入羰基还原酶突变体9(8g)。加入底物β-丙酮木糖苷(20g)，30℃，220rpm反应。监控反应转化率＞98％时，终止反应。菌体离心去除，上清液纳滤除盐，减压浓缩，结晶纯化得9.1g产物，纯度99.9％，收率91％，ee值100％。

实施例6克级化合物R-玻色因生物催化制备

取0.05M的磷酸盐缓冲液(60mL)，加入NADP⁺(0.01g)，加入异丙醇(40mL)充分溶解，加入羰基还原酶突变体10(5g)。加入底物β-丙酮木糖苷(30g)，45℃，220rpm反应。监控反应转化率＞98％时，终止反应。菌体离心去除，上清液纳滤除盐，减压浓缩，结晶纯化得9.2g产物，纯度99.9％，收率92％，ee值100％。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列选自以下组：

2.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶是突变体2。

3.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体3。

4.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体5。

5.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体6。

6.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体7。

7.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体8。

8.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体9。

9.如权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶为突变体10。

10.一种编码如权利要求1-9任一项所述的羰基还原酶的编码基因。

11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体装载有如权利要求10所述的羰基还原酶的编码基因；优选地，所述表达载体为重组质粒；优选地，所述表达载体为pET22b(+)载体。

12.一种基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含如权利要求10所述的羰基还原酶的编码基因；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

13.一种以β-丙酮木糖苷为底物经生物催化还原羰基制备R-玻色因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

其中，所述羰基还原酶为如权利要求1-9任一项所述的羰基还原酶。