CN118027198A - 一种抗人cmtm6蛋白的单链抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单链抗体及其在抑制高表达人CMTM6蛋白的人肺癌细胞中的应用。该单链抗体的基因片段是由人CMTM6蛋白胞外段多肽免疫后的兔脾B淋巴细胞的轻、重链可变区基因片段通过柔性寡核苷酸链（Linker）连接而构建。对上述单链抗体进行可溶性表达，经ELISA及WB等实验证实该单链抗体对人CMTM6蛋白具有高的亲和力和特异性。用该单链抗体与高表达CMTM6的人肺癌细胞共培养，可以有效降低肿瘤细胞表面PD‑L1的表达，并且该单链抗体能够显著增强CD8+T细胞对高表达CMTM6蛋白的人肺癌细胞的杀伤能力，该单链抗体的制备能够为CMTM6相关肿瘤的治疗及研究提供一个新的方法。

Description

一种抗人CMTM6蛋白的单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种抗人CMTM6蛋白的单链抗体及该抗体在CMTM6基因相关的肿瘤诊断及治疗方面的应用。

背景技术

CMTM6基因（chemokine-like MARVEL transmembrane domain containingfamily member 6） 中文名为：含有MARVEL跨膜结构域的趋化素样因子家族6。又名趋化素样因子超家族6（chemokine-like factor super family member，CKLFSF6）。由北京大学人类基因组中心2003年首次报道，并于2005年由国际人类基因命名委员会命名。该基因位于3号染色体短臂2区2带3亚带，其编码的CMTM6蛋白由183个氨基酸残基组成，相对分子量为20,419 Da。CMTM6本质上就是趋化样因子，含有趋化因子的基本结构特征（4个保守的半胱氨酸和MARVEL跨膜结构域）和趋化（诱导细胞定向转移）功能，同时又具有趋化因子没有的功能（促进细胞增殖和分化，并有抑制细胞凋亡作用）。它们的蛋白质产物具有序列同源性和潜在的四次跨膜结构MARVEL结构域，参与膜泡运输、紧密连接等多种生物学过程。MARVEL结构域具有四次跨膜蛋白超家族（TM4SF），TM4SF是一组小分子量糖蛋白，参与调节细胞生长，信号转导和粘附效应，并与整合素结合形成跨膜复合体，调节细胞间及细胞与ECM的信号转导，在肿瘤细胞转化、生长、侵袭、转移及凋亡过程中起重要作用。

CMTM6具有四次跨膜蛋白超家族（TM4SF）和MARVEL结构域，因此与多种肿瘤密切相关。2017年， 两个研究小组均发现 CMTM6 是调控 PD-L1 稳定性的关键蛋白。Mezzadra选择12种人类肿瘤细胞系（包括人黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌以及慢性粒细胞白血病等）研究 CMTM6 与 PD-L1 表达的关系，结果显示，当敲低 CMTM6时，全部细胞系的 PD-L1 蛋白表达水平均明显降低2-11 倍。当检测 PD-L1 mRNA 表达时发现，在不同时间点上干扰 CMTM6，并不影响 PD-L1 的 mRNA水平，也不影响 MHC-I 和 PD-L2 蛋白表达，提示CMTM6 是在蛋白水平上调节PD-L1 而不是在转录水平上调节。Burr 等用干扰 RNA 技术敲减多种肿瘤细胞系（黑色素瘤细胞；肺癌细胞；乳腺癌细胞）的 CMTM6，发现敲减后 PD-L1表达显著下降。研究发现，在表达 CMTM6 的肿瘤细胞中，PD-L1 受到 CMTM6 的保护，不被内体循环降解。当敲除该肿瘤细胞的 CMTM6 后，PD-L1 经内体循环被溶酶体降解，证实了CMTM6 对PD-L1 的保护作用。由此可见，肿瘤细胞中 CMTM6 对 PD-L1 的保护是 PD-L1 抑制剂有效率低的重要原因之一，对 CMTM6 高表达的肿瘤单独采用PD-L1 抑制剂治疗，显然不会有效。由此可以看出，CMTM6是与肿瘤免疫逃逸有关的基因，通过上调肿瘤细胞的PD-L1，维持细胞表面PD-L1的稳定，从而使T细胞抑制，T细胞就不能对肿瘤进行识别和攻击，使肿瘤细胞逃脱T细胞杀伤。

还有研究显示，该基因在正常组织低表达，在肿瘤组织中高表达，与肿瘤预后不良有非常密切的关系。国内Guan 等根据中国胶质瘤基因图谱计划(CGGA)数据库和癌症基因组图谱（TCGA）数据库的资料，分析了988例人胶质瘤患者CMTM6表达情况，结果显示CMTM6蛋白在人胶质瘤细胞中表达水平明显高于正常组织，高表达CMTM6的胶质瘤患者恶性程度高、预后差。Feng等对44例口腔鳞癌患者进行免疫组化分析，发现CMTM6阳性表达率（11/33）明显高于癌旁正常组织（0/22）。2017年Burr等用动物实验证明了CMTM6表达与生存期的关系。他们将一株高表达CMTM6的小鼠黑色素瘤细胞系（B16-OVA）接种到实验鼠皮下，建立移植瘤，又采用RNA干扰技术敲减该细胞系的CMTM6，然后按同样方法接种到实验鼠皮下，观察两组荷瘤小鼠的生存期，结果发现，CMTM6高表达组的生存期明显低于CMTM6敲减组的生存期。

为此本专利通过制备抗人CMTM6单链抗体，拮抗CMTM6蛋白，从而解除CMTM6对PD-L1的保护，减低肿瘤细胞PD-L1的表达，使得免疫抑制剂能够有效的阻断PD-L1和PD-1的结合，最终增强T细胞对肿瘤的识别和攻击，使肿瘤细胞无法逃避T细胞的杀伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人CMTM6蛋白的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

该抗人CMTM6蛋白单链抗体是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；重链可变区如SEQ ID NO：2中第1至121位所述氨基酸残基序列；轻链可变区如SEQ ID NO：2中第137位至251位所示氨基酸残基序列。

本发明中所述编码抗人CMTM6蛋白的单链抗体的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，由重链可变区的编码序列、连接肽的编码序列和轻链可变区的编码序列组成，重链可变区的编码序列如SEQ ID NO：1中第1至363位所示核苷酸序列；所述轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO：1中第409至753位所示核苷酸序列。

本发明的另一目的是将抗人CMTM6蛋白的单链抗体应用在制备与CMTM6基因相关的肿瘤药物中，为相关肿瘤的治疗研究提供了一个新的选择。

本发明还提供了一种重组噬菌体质粒，该重组噬菌粒由抗人CMTM6单链抗体基因与噬菌粒表达载体pCANTAB-5F连接而成。

本发明还提供了融合及可溶性表达目的单链抗体蛋白的重组大肠杆菌TG1及BL21（DE3）菌株，该重组菌分别转化含有目的片段的重组噬菌体质粒。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

本发明抗人CMTM6蛋白的单链抗体能拮抗人CMTM6蛋白；该单链抗体作为制备双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体研究的基础材料，用于人CMTM6基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

本发明抗人CMTM6蛋白单链抗体的制备方法及其应用，具体步骤如下：

（1）利用兔抗体轻、重链混合引物，从经过人CMTM6蛋白胞外段多肽免疫后的兔脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链（Linker）和所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；

（2）在单链抗体的基因片段两端分别引入不同的酶切位点并与同步双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒。将鉴定连接正确的重组噬菌粒转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07进行挽救，通过噬菌体展示技术将目的单链抗体基因片段与表达载体中的gIII基因融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出阳性重组噬菌粒；

（3）将筛选获得的阳性重组噬菌粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，从而获得与E-tag标签融合表达的抗人CMTM6蛋白的可溶性单链抗体，以该单链抗体为一抗，以抗E-tag抗体为二抗，采用ELISA和WB检测目的单链抗体的亲和力及特异性，证实该单链抗体可特异性识别并结合人CMTM6蛋白；

（4）将抗人CMTM6单链抗体与肺癌细胞H2122共培养后，能够有效降低肺癌细胞中PD-L1的表达，并且增强CD8+ T细胞对肺癌细胞的杀伤作用。

本发明的有益成果：本发明创造性地直接从经过人CMTM6蛋白胞外段多肽免疫后的兔脾B淋巴细胞内扩增获得抗体的轻、重链基因，通过噬菌体展示技术和间接ELISA简单、高效的获得了具有高亲和力与特异性的抗人CMTM6蛋白的单链抗体片段，克服了兔单克隆抗体制备难的问题。同时通过体外实验研究了该抗体对肺癌细胞免疫逃逸的影响。结果表明其能够有效减低肺癌细胞中PD-L1的表达，显著抑制肺癌细胞的免疫逃逸效果，增强T细胞对肺癌细胞的杀伤作用。该抗体的制备为今后肿瘤的诊断及治疗提供了一种新方法。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明直接从经过人CMTM6蛋白胞外段免疫后的兔脾B淋巴细胞内扩增获得抗体的轻、重链基因。与传统单克隆抗体的制备方法相比，减少了杂交瘤细胞株的制备过程。

（2）本发明所筛选出的单链抗体，具有高的抗人CMTM6蛋白抗体的亲和力和特异性。

（3）本发明还提供了抗人CMTM6单链抗体的原核表达系统，表达出了具有高亲和力和特异性的抗人CMTM6蛋白单链抗体。使简单、大量的制备抗人CMTM6蛋白抗体成为可能，能够有效降低生产抗体的成本，让抗人CMTM6单链抗体的应用更具有前景。

附图说明

图1为本发明人CMTM6蛋白胞外段序列预测结果；

图2为本发明兔脾B淋巴细胞cDNA扩增的轻、重链可变区片段电泳图，泳道1和6：DNA Maker，泳道2-5为扩增出的重链可变区条带，泳道7-9为扩增出的轻链可变区条带；

图3为本发明构建的抗人CMTM6单链抗体基因片段，泳道1：DNA Maker，泳道2-3：所制备的单链抗体条带；

图4为本发明含单链抗体基因重组噬菌体表达载体的Sfi I、Not I双酶切鉴定电泳图，泳道1：DNA Maker，泳道2：未酶切的重组质粒；泳道3：双酶切后的重组质粒条带；

图5为本发明SDS-PAGE检测纯化后的单链抗体电泳图，泳道1：蛋白质分子量标准，泳道2-3：经过亲和层析纯化后得单链抗体，为不同克隆样品；

图6为本发明通过ELISA检测抗人CMTM6单链抗体的效价；

图7为本发明使用抗人CMTM6单链抗体通过WB检测肺癌细胞H2122和正常肺上皮细胞BEAS-2B中CMTM6的表达情况，1：肺癌细胞H2122中CMTM6的表达，2：正常肺上皮细胞BEAS-2B中CMTM6的表达；

图8为本发明WB检测抗人CMTM6单链抗体对肺癌细胞H2122和正常肺上皮细胞BEAS-2B中PD-L1表达的影响，1：未加抗人CMTM6单链抗体的肺癌细胞H2122中PD-L1的表达，2：加入抗人CMTM6单链抗体与肺癌细胞H2122共孵育后H2122中PD-L1的表达，3：未加抗人CMTM6单链抗体的正常肺上皮细胞BEAS-2B中PD-L1的表达，4：加入抗人CMTM6单链抗体与正常肺上皮细胞BEAS-2B共孵育后BEAS-2B中PD-L1的表达；

图9为本发明加入抗人CMTM6单链抗体后CD8+ T细胞对肿瘤细胞杀伤效率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：CMTM6多肽抗原的确定及合成

1、人CMTM6蛋白胞外结构域预测：由于CMTM6蛋白是跨膜蛋白，但是目前其胞外序列尚未有报道，因此首先利用在线工具TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测CMTM6蛋白胞外片段。根据NCBI数据库提供的CMTM6蛋白（GenBank：NP_060271.1）序列，预测出该蛋白的胞外段共有2段，分别位于多肽序列的第1-67位氨基酸及126-134位氨基酸，结果见说明书附图1。

2、人CMTM6蛋白胞外抗原表位筛选：鉴于第126-134位多肽序列只有8个氨基酸，若其作为抗原不能有效引起机体产生免疫反应，因此选择第1-67位氨基酸进行抗原表位筛选。首先通过在线工具ABCpred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html）进行抗原表位预测，然后根据预测的结果以及在线工具ProtParam和IEDB对各抗原表位多肽进行理化性质、抗原指数、β-转角、柔韧性、可及性和线性表位分析，然后结合DNAstar软件进一步确定最佳多肽序列。最后确定的人CMTM6蛋白胞外段抗原表位序列为第6-21位氨基酸，即：VYSPTTEEDPGPARGP。最后通过NCBI数据库进行BLAST比对未发现有与该序列相近的其它人源蛋白序列，最终确定人CMTM6蛋白第6-21位氨基酸序列作为抗原多肽。

实施例2：单链抗体基因片段的制备

1、免疫原制备：将筛选出的最佳多肽序列送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。因多肽序列较短，所以免疫时需要加入血蓝蛋白（KLH）作为载体蛋白进行共同免疫以增强抗原的免疫原性。使用ReadiLink™ KLH偶联试剂盒（AAT Bioquest，货号：AAT-B5502）将KLH与合成的多肽抗原偶联，具体步骤见试剂盒操作说明书。

2、免疫新西兰白兔：取2只新西兰兔（购自昆明医科大学实验动物中心）进行人CMTM6多肽抗原免疫实验，在接种前抽取5ml血液分离血清并冻存，用作后续对照实验。采用微量注射器给兔背部皮下多点（一般6个部位）注射，0，14，28，42，52天各免疫一次，免疫计量为100ug抗原，首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂（CFA），以后加强免疫为弗氏不完全佐剂（IFA）。并且用间接ELISA法对血清效价进行检测，当效价大于1:1000时，将兔继续饲养4周。4周后兔接受最后一次融合前的冲击免疫，100ug抗原用无热原的生理盐水稀释（总量200ul），不含佐剂。通过静脉注射抗原，经静脉注射冲击免疫后3天，收集兔脾细胞。

兔脾B淋巴细胞总RNA的提取和逆转录合成cDNA：将已分离得到的兔脾B淋巴细胞，使用Eastep® Super总RNA提取试剂盒（Promega，货号：LS1040）提取总RNA，提取的具体步骤见试剂盒说明书。最后将提取出的RNA尽快放在-80℃冰箱中。提取出的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见提取的总RNA的28S、18S、5S亚基大小正确，条带清晰无明显杂带，可用于下游的反转录实验。

使用GoScript Reverse Transcription System试剂盒（Promega，货号：A2801）进行反转录，具体步骤参见说明书操作。反转录出的cDNA可保存于-20℃冰箱。

重叠延伸PCR合成单链抗体基因片段：扩增兔轻、重链可变区简并引物序列如下：Vκ 5-1 sense primers：GACCCTRTGCTGACCCAGACTGCATCSCCC；Vκ 5-2 sense primers：RTGMTGACCCAGACWCCATCB；Vκ 5-3 sense primers：GTGATGACCCAGACTCCAGCC；Vκ 3 -1antisense primers：GTTTGATTTCYACCTTGGTSCCMG；Vκ 3-2 antisense primers：GTTTGATTTCCAGTTTGGTCCCTG；Vκ 3 -3 antisense primers：GTTTGATCTCCAGCTTGGTCTCCT；Vκ 3 -4 antisense primers：RATCTCCACCATGGTCCCTGAGCC；Vλ 5-1 sense primers：CAGCCTGTGCTGACTCAGCCRCCC；Vλ 5-2 sense primers：CAGCCTGTGCTGACTCATTYRYCC；Vλ 5-3sense primers：CAGTTTGTGCTGACTCAGCCCCAGTCTGTG；Vλ 5-4 sense primers：CAGSCTGCMCTSACTCAGCCGTCY；Vλ 5-5 sense primers：TCCTATGAGCTGACACAGCTGCCA；Vλ 5-6sense primers：TCCYTCGTGCTGACTCAGCCAGCC；Vλ 3 -1 antisense primers：CTGTGACGGTCAGCTGGGTCCCTC；Vλ 3-2 antisense primers：CTGTGA CAATGACCTTGGTCCTGC；Vλ 3-3 antisense primers：CAAGGACGGTCAGCTTGGTTCCTC。VH 5-1 sense primers：CAGGAGCAGCTGRWGGAGTCC；VH 5-2 sense primers：CAGTCAGTGAAGGAGTCC；VH 5-3 senseprimers：CAGTCGSTGGAGGAGTCCAGG；VH 5-4 sense primers：CAGTCGYTGGWGGAGTCCRGG；VJH3’ antisense primers：CTGARGAGAYGGTGACSAGGGTSCC。首先在PCR管内分别加入下列试剂进行轻链/重可变区扩增：兔脾B淋巴细胞cDNA 1μl；10uM VH/Vλ/Vκ sense primer或10uMVH/Vλ/Vκ antisense primer引物混合液1μl；2×Taq PCR Master Mix 22ul，总体系25ul。将上述体系配制好后放入PCR仪经95℃，5分钟；（95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环）；72℃ 10分钟，结束反应。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见扩增的重链可变区大小约为360bp，轻链可变区大小约340bp，与预期一致，电泳图见说明书附图2。

将大小正确的条带进行切胶纯化，胶回收的步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书操作；将纯化后的条带再次取2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟，确定胶回收后DNA的质量，使用NANODORP测定DNA浓度。

用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端引入Sfi I和Not I酶切位点：通过北京擎科生物有限公司化学合成Linker序列（序列如下：GGTGG AGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG），利用重叠延伸PCR法用Linker混合物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区片段进行连接，连接产物在RS Primers（酶切位点引物）作用下在重链的5'末端加上Sfi I限制性位点和轻链的3'末端加上Not I酶切位点，可用于后续与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E（购自Pharmacia公司）进行连接。Linker序列简并引物为：Linker sense：GGCACCCTSGTCACCRTCTCYTCAGGGTGGAGGCGGTTCAGGC；Linker antisense：CGAGCTCGGCCGCCTGGGCCCCGA TCCGCCACCGCCAGA。带Sfi I酶切位点的重链可变区简并引物序列为：H-Sfi 1f：CTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG；H-Sfi 2f：CTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG；H-Sfi 3f：CTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG。带Not I酶切位点轻链可变区简并引物序列为：L-Not 1r：GAGTCATTCTGCGGCCGCAC AGATGGTGCAGCCACAGTTAGGATCTCCAGCTCGGTCCC；L-Not2r：GAGTCATTCTGCG GCCGCGACAGATGGTGCAGCCACAGTTTTGACSACCACCTCGGTCC。重链可变区与Linker连接的PCR反应体系：Linker片段 1ul，重链可变区片段1ul，10uM H-Sfi 1-3f 1ul，10uM Linker antisense引物 1ul，2×Taq PCR Master Mix 21ul。PCR反应条件为：98℃，3分钟；（98℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环）；72℃ 10分钟，结束反应。轻链链可变区与重链可变区-Linker片段连接的PCR反应体系：重链可变区-Linker片段 1ul，轻链可变区片段 1ul，10uM Linker sense引物 1ul，10uM L-Not 1-2r引物 1ul，2×Taq PCRMaster Mix 21ul。PCR反应条件为：98℃，3分钟；（98℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环）；72℃ 10分钟，结束反应。最终获得重链可变区-Linker-轻链可变区形式的单链抗体片段。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见单链抗体条带大小约780bp左右，与预期一致，条带集中，清晰无杂带，电泳结果见说明书附图3。目的条带进行切胶纯化及纯化后的浓度测定。

实施例3：单链抗体库的建立及筛选鉴定

1、重组噬菌粒的构建

1.1重组表达载体及单链抗体片段的双酶切：将经琼脂糖凝胶鉴定大小正确的单链抗体片段及表达载体质粒pCANTAB-5E（购自Pharmacia公司）分别先进行Sfi I酶切，在200μl PCR反应管内分别加入表达载体质粒/单链抗体片段各30μl；Sfi I酶（10U/μl）4μl；10×Buffer M 5μl，ddH2O 11μl，上述体系配置好后50℃反应4小时。将酶切产物经过胶回收纯化后，在新的200μl PCR反应管中加入纯化产物30μl，Not I酶（10U/μl）2μl，10×Buffer H 5μl，BSA 2μl，Trion X-100 2μl，ddH2O 9μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，表达载体质粒双酶切后在3.5kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

1.2重组表达载体的连接：将经过Sfi I和Not I同步双酶切后的表达载体pCANTAB-5E与ScFv目的片段按摩尔比1:5进行连接，从而构建出含有单链抗体基因的重组表达载体pCANTAB-ScFv。连接总体积为10μl，16℃反应4小时。将连接产物全部加入100μl的TG1感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后再冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB/Amp平板上37℃倒置培养10小时。

1.3重组表达载体的鉴定：挑取LB/Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH2O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR反应的模板。PCR鉴定插入片段使用表达载体pCANTAB-5E的通用引物，S1F:CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC；S6R:GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer 2.5μl；dNTPs（2.5mM each）2μl；S1F（10μM）0.5μl ，S6R（10μM）0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0. 5μl；ddH2O 14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃ 4分钟（94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环），72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的921bp处出现条带。将重组表达载体pCANTAB-ScFv进行Sfi I和Not I分步双酶切，可见在4.5kb左右和770bp处有酶切条带，确认为阳性重组克隆，酶切电泳结果见说明书附图4。

2 噬菌体抗体库的富集和筛选

2.1噬菌体抗体库的富集：按细菌数量与辅助噬菌体数量1:20的比例加入辅助噬菌体M13K07（购自GE healthcare公司）于鉴定为阳性含有pCANTAB-ScFv的重组子菌液内，放恒温摇床内37℃，150rpm，培养2小时。当看到液体变浑浊时，放入离心机内，室温下1500g离心25分钟，弃上清。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，200rpm，过夜振荡培养。所得的液体即为经过富集后的噬菌体培养液。

2.2间接ELISA法筛选特异性单链抗体：将所得培养液室温下低速离心25分钟，吸取上清，上清内加入1/5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。用PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将合成的CMTM6胞外段蛋白分别稀释至5μg/ml，在每个酶标板孔内加入100μl稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，每孔加入0.15M PBS-Tweenz（磷酸盐-吐温）洗涤缓冲液300μl，置振荡摇床上振摇3分钟，弃孔内液体，重复洗涤3次。每孔加入1％ BSA-PBS封闭液100μl，置37℃恒温培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100μl适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清作为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1:2000稀释的酶标二抗（HRP标记的抗M13g8p蛋白）100μl新鲜配制的TMB（四甲基联苯胺）底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M 硫酸 50μl终止反应。使用酶标仪读取OD450值，凡待测孔值/阴性对照孔值≥2即为阳性，筛选出的含有该单链抗体的重组噬菌体则可用于后续的表达及测序。

3、单链抗体的可溶性表达、纯化及鉴定

3.1单链抗体的可溶性表达：将经过ELISA筛选出的含有阳性重组噬菌体的菌液重新扩大培养至OD600≈0.8。将培养好的菌液提取质粒，步骤按QIAGEN质粒小提试剂盒说明书进行。将3μl各个质粒分别转化至100μl BL21(DE3)感受态中。挑取阳性单克隆接于5ml的LB/Amp液体培养基中培养，取前一次的培养菌液按1/100比例加入到1L新的LB/Amp液体培养基中培养至OD600≈0.8。收集培养后的菌体，用灭菌PBS缓冲液重悬菌体，加入100U/μl溶菌酶使溶菌酶终浓度达到1U/μl，室温放置15分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟后收集上清。

3.2 可溶性单链抗体的纯化：使用Pierce 蛋白L色谱纯化柱（ThermoScientific，货号：89929）对抗人CMTM6单链抗体进行亲和层析纯化，具体操作步骤见产品说明书。用5-10柱体积的结合缓冲液以5mL/分钟平衡预装柱，将上一步收集到的上清样品20ml与结合缓冲液按1:1进行稀释。将稀释后的样品加入到预装柱中，只要抗体总量小于预装柱容量的80%即可。设置流速为1mL/分钟，并用5-10倍柱体积的结合缓冲液洗涤预装柱。用约2-5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，每管收集1mL洗脱缓冲液，连续收集多管，直至洗脱缓冲液全部流出。每1mL洗脱缓冲液中加入100μL中和缓冲液，通过SDS-PAGE分析蛋白分子量及纯化效果。

3.3 SDS-PAGE确定单链抗体的相对分子量：在上一步纯化所得的单链抗体蛋白中加入一定量的2×SDS上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热10分钟，冷却后即可上样20ul进行电泳。电泳完毕，取出分离胶放在盛有去离子水的容器中，加热沸腾后取出。加入快速染色液浸没分离胶即可，在脱色摇床上摇10分钟，当蛋白条带已可见时弃染色液。再次加入约50ml的水，加热沸腾2分钟，停止加热继续在脱色摇床上摇30分钟后观察结果。结果可见在26KDa处出现目的条带，与预期一致，电泳结果见说明书附图5。

4、ELISA检测抗人CMTM6单链抗体的亲和力：用pH为9.6的包被液将人CMTM6胞外段多肽抗原稀释至终浓度为5ug/ml，在96孔板中的每个孔中加入100ul 已经稀释过的抗原，在4℃过夜铺板。第二天弃掉孔内缓冲液，使用吸水纸拍干，每孔再次加入300ul 的ELISA洗涤液（0.5％ 吐温/0.1M PBS）洗板三次。96孔板的各孔中加入100ul 的1% BSA-PBS 封闭液进行封闭，置于37℃恒温培养箱内孵育约1小时。洗板后每孔中加入抗人CMTM6单链抗体。按照不同比例稀释（1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600），37℃恒温培养箱孵育1h。洗涤后加100ul 已经按照1:5000 比例稀释的HRP标记的抗E-tag标签抗体（Abcam,货号：ab19400），置于37℃的恒温培养箱孵育1 小时。洗板后各孔加入100ul TMB 试剂，将96孔板置于暗处（此步骤需要避光操作）反应15-20 分钟，当阳性实验组孔内变为蓝色时，而空白及阴性对照组的孔内无明显的颜色变化时即终止反应。加入50ul的终止液终止显色反应，酶标仪在波长450nm下进行吸光值的检测。

ELISA结果显示当抗人CMTM6单链抗体稀释到1:1600时，抗人CMTM6单链抗体不能与人CMTM6胞外段多肽有效特异性结合，即抗人CMTM6单链抗体的效价为1:1600，结果见说明书附图6。

5、WB检测抗人CMTM6单链抗体的特异性：取高表达CMTM6的肺癌细胞H2122以及人正常肺上皮细胞BEAS-2B，使用全蛋白提取试剂盒（索莱宝，货号：BC3710）提取细胞总蛋白，总蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳。按照1:500的比例稀释抗人CMTM6单链抗体，一抗与PVDF膜在4℃过夜孵育。再按照1:5000的比例稀释HRP标记的抗E-tag标签抗体，二抗与PVDF 膜在37℃孵育4h。使用ECL化学发光法检测试剂盒（索莱宝，货号：SW2040）进行化学发光显色，凝胶成像仪拍照。WB结果显示抗人CMTM6单链抗体能够与肿瘤细胞中的CMTM6蛋白特异性结合，结果见说明书附图7。

6、将鉴定结果正确的单链抗体进行测序：将可溶性表达结果正确且亲和力最高的含有单链抗体基因重组表达载体的菌液送测序公司测序，DNA测序结果表明单链抗体的基因序列排列方式为VH-Linker-VL，在IMGT数据库中比对发现序列符合兔轻重链可变区基因结构，具体序列见SEQ ID NO：1。

实施例4：抗人CMTM6单链抗体对肿瘤细胞的抑制作用

1、抗人CMTM6单链抗体对肿瘤细胞表面PD-L1表达的影响

6孔板分别培养高表达CMTM6和PD-L1的肺癌细胞H2122以及人正常肺上皮细胞BEAS-2B，每孔分别加入100ug的抗人CMTM6单链抗体或等量PBS缓冲液与H2122/BEAS-2B细胞共培养24h。使用全蛋白提取试剂盒（索莱宝，货号：BC3710）提取共培养后的H2122/BEAS-2B细胞总蛋白，总蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳。按照1:100的比例稀释抗人PD-L1兔单克隆抗体（Abcam，货号：ab205921），一抗与PVDF 膜在4℃过夜孵育。用TBST 将HRP 标记的羊抗兔IgG二抗以1:3000的比例稀释，稀释后的二抗与PVDF膜在37℃下孵育2h，使用ECL化学发光法检测试剂盒（索莱宝，货号：SW2040）进行化学发光显色，凝胶成像仪拍照。WB结果显示抗人CMTM6单链抗体能够降低肿瘤细胞中PD-L1的表达，结果见说明书附图8。

2、抗人CMTM6单链抗体对肿瘤细胞免疫逃逸的影响

使用人外周血淋巴细胞分离液（Solarbio，货号：P8610）分离人外周血淋巴细胞，具体步骤参照说明书操作。再通过EasySep 免疫磁珠人CD8+T细胞分选试剂盒（北京诺为生物，货号：19663）将分离出的淋巴细胞分选出CD8+ T细胞。将提取出的人淋巴细胞添加EasySep 人类记忆CD8+T 50µL/mL细胞，充分混合并在室温（15-25℃）下孵育10分钟。漩涡磁珠30秒，以确保颗粒均匀的处于悬浮液中，且没有明显的颗粒聚集体。添加EasySep D150µL/mL磁珠，充分混合并在室内室温孵育10分钟。使用移液枪上下吹打2-3次，以混合离心管中的细胞，将磁铁插入无盖的离心管中，静置2.5分钟。拿起EasyStep 磁铁，并在一个连续的运动中反转磁铁将所需馏分倒入新的5mL聚苯乙烯管中，这个磁性标记的不需要的细胞将保留在原始离心管内，通过EasySep磁铁的磁场，磁铁把磁铁和管子留在里面倒立2-3秒，然后回到直立状态。从EasySep上拆下原管磁铁并放置新管将所需细胞装入磁体中并放置2.5分钟。重复上一步，在磁体中总共分离2次（每次2.5分钟），富集细胞即为CD8+ T细胞。将分离好的CD8+ T细胞用完全培养基重悬，接种于培养板中，培养24h，即可用于后续实验。

按乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（Solarbio，货号：BC0685）说明书将培养孔分为：无细胞的培养孔（背景空白对照孔），未经处理的对照细胞孔（样品对照孔），未经处理的用于后续裂解的细胞孔（样品最大酶活性对照孔），H2122/ BEAS-2B细胞与CD8+ T细胞共培养孔和加入了抗人CMTM6单链抗体（100ug/孔）的H2122/BEAS-2B细胞与CD8+ T细胞共培养药物处理的细胞孔（药物处理样品孔）。其中H2122/BEAS-2B与CD8+ T细胞按5:1的比例共培养，每孔分别加入8000个H2122/BEAS-2B细胞。到预定检测时间前1小时，从细胞培养箱中取出96孔板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入LDH释放剂，加入体积为培养液体积的10%。到达预定时间后，将细胞培养板用离心机400g室温条件下离心5min，分别取各孔上清液120μl，加入到新的96孔板中。各孔分别加入60μl LDH检测工作液，室温孵育30min，然后再490nm处测定吸光度；使用600nm作为参考波长进行双波长测定。计算细胞死亡率（%）=（处理样品吸光度-样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度）×100%。结果显示抗人CMTM6单链抗体能够通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，增强CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，结果见说明书附图9。

Claims (4)

1.一种抗人CMTM6蛋白的单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述抗人CMTM6蛋白的单链抗体的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述抗人CMTM6蛋白的单链抗体在制备与人CMTM6基因相关的肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述抗人CMTM6蛋白的单链抗体在制备与人CMTM6基因相关的肿瘤药物中的应用，其特征在于：与人CMTM6基因相关的肺癌细胞。