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CN117924488A - 阻断性cd40抗体及其应用 - Google Patents

阻断性cd40抗体及其应用 Download PDF

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CN117924488A CN202311718869.5A CN202311718869A CN117924488A CN 117924488 A CN117924488 A CN 117924488A CN 202311718869 A CN202311718869 A CN 202311718869A CN 117924488 A CN117924488 A CN 117924488A
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variable region
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李洋洋
武玉伟
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Hefei Tiangang Immune Drugs Co ltd
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Abstract

本发明提出了一种抗CD40的抗体及其应用，该抗体包括分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。本发明实施例的抗体能够与人CD40蛋白进行结合，阻断CD40与CD40L的结合，抑制CD40的下游信号，抑制CD40L介导的B细胞增殖，能够有效治疗和/或预防CD40介导的相关疾病。

Description

阻断性CD40抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体地，本发明涉及一种能够结合CD40的抗体或其抗原结合片段及用途。
背景技术
CD40是I型膜蛋白，主要在抗原呈递细胞(APC)表面表达，包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。研究表明，CD40也表达在血小板以及一些非造血细胞如成纤维细胞，内皮细胞、平滑肌细胞等表面，部分类型的肿瘤细胞也表达CD40。靶向CD40的疗法在自身免疫性疾病和癌症等免疫相关疾病中均有应用。CD40L(CD40 Ligand)是CD40的配体，是一种II型膜蛋白，其在多种细胞表面表达，包括活化的CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞、粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和血小板等。
CD40与CD40L的相互作用诱导体液及细胞介导的免疫应答。CD40L结合CD40后，向APC细胞内传递活化信号，促进APC细胞活化，上调共刺激配体如CD80、CD86表达，并促进APC增殖，进而促进免疫活化。在自身免疫性疾病中，利用阻断性CD40抗体结合CD40，抑制CD40的活化信号，能够缓解自身免疫性疾病患者如多发性硬化症等疾病的进展。
因此，业内亟需可用来干预CD40-CD40L结合的作用并阻断CD40信号传导的疾病药物。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。目前，阻断性CD40抗体如Iscalimab(诺华)、Ravagalimab(艾伯维)等均处于临床试验阶段。发明人的研究发现，Iscalimab、Ravagalimab会引发APC活化，上调CD80、CD86等表达，与这两种抗体的作用目的相违背。
基于此，发明人筛选得到一种鼠源抗CD40单克隆抗体，该单克隆抗体与人CD40蛋白具有较高的结合活性，此外，发明人对上述单克隆抗体的恒定区进行人源化，保留鼠源抗CD40单克隆抗体的CDR，以获得嵌合抗体，更进一步地，将所述嵌合抗体的轻链可变区或重链可变区中的框架区进行人源化，得到抗CD40的完全人源化抗体。所述CD40抗体能够特异性的靶向结合人CD40蛋白，强有效的阻断CD40与CD40L结合，抑制CD40下游信号，抑制B细胞增殖，并且不会引起APC细胞(如B细胞)活化，有望在自身免疫性疾病、移植排斥和癌症等免疫相关疾病中发挥作用。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够与人CD40蛋白进行结合，阻断CD40与CD40L的结合，抑制CD40的下游信号，抑制B细胞增殖，并且不会引起APC细胞(如B细胞)活化，从而有效治疗或预防CD40介导的相关疾病，并进行相关科学研究。
根据本发明的实施例，上述抗体或其抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:11所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括：1)如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区；或2)如SEQ ID NO:11所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段含有重链框架区序列和轻链框架区序列，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体、IgG2a抗体、IgG4抗体或其突变体或人源IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:9和13任一项所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:10和14任一项所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体中的至少之一。
在本文中，术语“单抗”是指仅可识别一种特定抗原表位的抗体。其中，常见的单抗为包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子，该重链或轻链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，该重链或轻链的羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)；L链和H链的V区分别称为VL和VH。此外，所述单抗还包括但不限于单链抗体、Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
在本文中，术语“CDR移植抗体”是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。需要说明的是，本申请中的多抗和单抗均可为CDR移植抗体。
根据本发明的实施例，所述单抗包括全长抗体、Fv抗体、单链抗体、Fab抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明一些具体实施方式中的核酸分子编码的抗体或其抗原结合片段能够与人CD40蛋白进行结合，有效治疗或预防CD40介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子进行可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述抗体或其抗原结合片段。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本领域技术人员可以理解，用来编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体或其抗原结合片段的表达，进而实现抗体或其抗原结合片段在体外的大量获得。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：将第三方面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述抗体或其抗原结合片段。根据本发明一些具体实施方式所提出的方法可以有效体外大量获得所述抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的一些具体实施方式，上述制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的一些具体实施方式，所述细胞不受特别限制，原核细胞或真核细胞均可使用。
根据本发明的一些具体实施方式，所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施方式，所述真核细胞为哺乳动物细胞。根据本发明的一些具体实施例，当所述细胞为真核细胞，如哺乳动物细胞时所述重组抗体的表达效率较高。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸，或第三方面所述的表达载体，或能够表达第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施方式，所述重组细胞在合适条件下可高效并大量表达上述抗体或其抗原结合片段。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗体或其抗原结合片段表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗体或其抗原结合片段表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体或其抗原结合片段表达的条件。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种免疫缀合物，包括第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，以及治疗剂。如前所述，本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够有效与CD40蛋白进行结合，有效治疗或预防CD40相关疾病，因此，包含所述抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物同样能够与人CD40蛋白进行结合，所述免疫缀合物具有良好的预防和/或治疗CD40介导的疾病的效果。
根据本发明的实施例，所述免疫缀合物还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述治疗剂能够预防和/或治疗CD40介导的疾病或其他疾病。
根据本发明的实施例，所述CD40介导的疾病选自移植排斥、自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种组合物，包括第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的免疫缀合物。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或其抗原结合片段能够有效与人CD40蛋白进行结合并有效抑制CD40介导的B细胞活化，因此，包含上述物质的组合物同样可以有效与人CD40蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD40介导的疾病效果的，所述组合物的种类不受特别限制，可以为食品组合物或药物组合物。
本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合给药，例如，与化疗剂组合给药。因此，所述组合物还可以含有化疗剂。本发明的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物还可以与第二治疗剂组合，所述第二治疗剂的示例性试剂包括但不限于抑制CD40活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰CD40上游或下游信号转导的试剂。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，包括第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的免疫缀合物或第七方面所述的组合物。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或其抗原结合片段能够有效与人CD40蛋白进行结合，因此，包含有效量的所述抗体或其抗原结合片段的活性成分或其一系列物质的药物同样可以有效与人CD40蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD40介导的疾病效果的。
根据本发明的实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物还可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的抗体或其抗原结合片段的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，其中，给药的方式可以为口服给药、经鼻给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药或静脉给药或腹腔内给药，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。所述抗体或其抗原结合片段可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的免疫缀合物或第七方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD40介导的疾病。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或其抗原结合片段能够有效与人CD40蛋白进行结合，因此，包含有效量的所述抗体或其抗原结合片段或其一系列物质的药物同样可以有效与人CD40蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD40介导的疾病效果的。
根据本发明的实施例，上述制备药物的用途还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD40介导的相关疾病包括移植排斥、自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括但不限于下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述癌症包括但不限于下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明一些具体实施方式的抗体或其抗原结合片段能够有效与人CD40蛋白进行结合，因此，包含所述抗体或其抗原结合片段的试剂盒能够有效的对人CD40蛋白进行定性或定量检测。本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用人CD40和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗CD40抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗CD40抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在，例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病，也可以进行科研研究，利用所述试剂盒检测待测样品中的人CD40蛋白。这种相关疾病可包括CD40相关疾病，例如癌症。当然本文提供的抗体或其抗原结合片段也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。针对于上述应用场景，所述结合分子同样适用，此处不再累述。
所述试剂盒还可以包括常规用于检测CD40，如包被液等。
在本发明的第十一方面，本发明提出了第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD40。如前所述，本发明一些具体实施方式的抗体或其抗原结合片段能够有效与人CD40蛋白进行结合，并阻断所述CD40蛋白与CD40L进行结合，因此，所述抗体或其抗原结合片段可以用于制备检测CD40蛋白的试剂盒，所述试剂盒能够有效的对人CD40白进行定性或定量检测。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种治疗或预防CD40介导的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向受试者施用药学上可接受量的以下中的至少之一：1)第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；2)第二方面所述的核酸分子；3)第三方面所述的表达载体；4)第五方面所述的重组细胞；5)第六方面所述的免疫缀合物；6)第七方面所述的组合物；和7)第八方面所述的药物。如前所述，所述抗体或其抗原结合片段能够与人CD40蛋白进行结合，能够有效治疗或预防CD40介导的相关疾病，优选为自移植排斥、自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症，因此，根据本发明实施例的方法能够有效治疗或预防CD40介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述治疗或预防疾病的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
本发明所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
在本发明的第十三方面，本发明提出了一种抑制表达人CD40抗原的细胞生长的方法，其包括向所述细胞给予第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人细胞表面CD40抗原特异性结合，其中该抗体或其抗原结合片段与该CD40抗原的结合抑制所述细胞的生长或分化。
在本发明的第十四方面，本发明提出了一种诱导清除外周B细胞的方法，其包括向所述细胞给予第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人细胞表面CD40抗原特异性结合，其中该抗体或其抗原结合片段与该CD40抗原的结合诱导清除所述细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体与人CD40蛋白结合的ELISA结果图；
图2为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体与猴CD40蛋白结合的ELISA结果图；
图3为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体与HCT-116人结直肠癌细胞结合的流式细胞术结果图；
图4为根据本发明具体实施例的21G6抗体、人源化h21G6抗体与HCT-116人结直肠癌细胞结合的流式细胞术结果图；
图5为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体与人外周血B细胞结合的流式细胞术结果图；
图6为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体阻断CD40L-mFc与HCT-116人结直肠癌细胞结合的流式细胞术结果图；
图7为根据本发明具体实施例的21G6抗体、人源化h21G6抗体阻断CD40L-mFc与HCT-116人结直肠癌细胞结合的流式细胞术结果图；
图8为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体抑制CD40L-mFc介导的CD40报告细胞活化的结果图；
图9为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体促进人外周血B细胞上调表达CD86分子的结果图；
图10为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体抑制CD40L-mFc介导的B细胞上调CD80表达的结果图；
图11为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体抑制CD40L-mFc介导的B细胞上调CD86表达的结果图；
图12为根据本发明具体实施例的21G6抗体、竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体抑制CD40L-mFc介导的B细胞增殖的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明所述的抗体或其抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。其中，所述抗体或抗原片段是采用Kabat编号系统进行编号和定义的。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人CD40的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD40抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核表达系统或原核表达系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的CD40嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链Fc区。所述的CD40嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
本文中，所述“单抗”是指具有单一抗原结合位点的抗体。
本文中，所述“多抗”是指具有两个或以上不同抗原结合位点的抗体。
在本文中，术语“突变体”或“变体”可以指包含对任何天然存在的或工程化的分子进行包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变获得的分子。
术语“互补决定区”或“CDR”或“CDR序列”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸序列，例如，通常包括：轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))；和/或来自“高变环”(例如，轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
在本文中，术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLASTAltschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
如前所述，本发明的单抗可以是全长抗体或可仅包含其功能性片段(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CD40抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在本文中，所述“全长抗体”是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构，如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白E(IgE)。同一类免疫球蛋白也可以根据氨基酸组成分为不同的亚类，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。免疫球蛋白轻链根据恒定区的不同分为κ链或者λ链。
本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，纳米抗体、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇，如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有CD40结合活性。优选地，所述功能性片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于CD40，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少3个氨基酸，优选其来源的抗体序列的5、10、15、25、50和100个连续氨基酸。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗原结合片段”通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，示例性的，如包括CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，纳米抗体等。
在本文中，术语“CDR移植抗体”是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
在本文中，术语“Fab抗体”或“Fab”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“纳米抗体”(单域抗体或VHH抗体)，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的片段。
本发明所涉及的氨基酸或核酸序列详见表1。
表1
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：抗体的制备
(1)生成针对人CD40的鼠源单克隆抗体，用纯化的重组CD40胞外区His标签融合蛋白(CD40-His)(购自Acro)作为抗原，免疫Balb/c小鼠(9周龄，购自上海莱斯克，体重20g左右)。
免疫Balb/c小鼠使用纯化抗原和完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂进行3次免疫，通过尾静脉放血后检测免疫应答。通过ELISA、流式细胞术筛选血清，获取有抗人CD40免疫球蛋白的小鼠。并对有最高的抗CD40免疫球蛋白的小鼠取出脾细胞，将脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)进行融合。融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选，得到鼠单抗。
将候选杂交瘤细胞总数量培养到106，800rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(购自Invitrogen)提取总RNA；以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(具体序列选择参考Larrick，J.W.，et al.，(1990)Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991)BioTechniques，11，152-156)。PCR扩增在在50μl反应体系中进行，分别加入cDNA 2μl，10×PCR缓冲液5μl，上游及下游引物2μl(5μM)，dNTP 2μl，Taq酶1μl(Takara，Ex Taq)，H2O 38μl；95℃预变性5min，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32个循环，然后72℃延长7min。将扩增产物测序后，得到鼠单抗21G6的重链可变区序列和轻链可变区序列(重链可变区序列SEQ ID NO:7，以及轻链可变区序列SEQ ID NO:8)。
(2)小鼠抗体人源化实验：参照CD40抗体21G6抗体的轻链可变区序列和重链可变区序列，选取与其非CDR区匹配最好的人源化模板。将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，得到人源化的抗体。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，得到人源化之后的抗体h21G6抗体，人源化抗体h21G6抗体重链可变区的序列如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:12所示。
实施例2：抗体的生产
抗体的生产，具体实验操作如下：(1)利用ExpiCHO Expression Medium培养基(购自Thermo Fisher)培养ExpiCHO细胞(购自Thermo Fisher)，调整细胞浓度为6×106/mL，以获得ExpiCHO细胞溶液。(2)将含有抗体重链和抗体轻链的pcDNA3.4载体(委托南京金斯瑞合成)按照1：1的比例加入2mL OptiSFM培养基(购自Thermo Fisher)中，获得溶液A。(3)将160μL ExpiFectamineCHO转染试剂(购自Thermo Fisher)加入2mL OptiSFM培养基(购自Thermo Fisher)中，获得溶液B。(4)然后将溶液A和溶液B混合，获得转染混合物，并在5分钟内将转染混合物全部加入50mL ExpiCHO细胞溶液中。(5)在37℃、5％ CO2条件下培养1天后，加入8mL Feed、300μL Enhancer(购自Thermo Fisher)，并转入32℃、5％ CO2条件下，第5天添加8mL Feed，培养9天后收获培养上清。(6)利用Protein A纯化柱(购自纳微)从培养上清中亲和纯化，获得目的抗体。
实施例3：21G6抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测CD40抗体的结合特性。CD40胞外区His标签融合蛋白包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和CD40蛋白的结合特性。
用PBS缓冲液将人CD40-His蛋白或猴CD40-His蛋白(购自Acro)稀释为2μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％ Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μl/孔PBS/10％ BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，分别加入100μl/孔用PBST/0.05％ BSA梯度稀释的待测CD40抗体21G6(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μl/孔用PBST/0.05％ BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人IgG抗体二抗(购自Jacksonlab)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。
实验结果如图1和图2所示，表明本发明的CD40抗体不仅能够结合人CD40蛋白，还能够结合猴CD40蛋白，并且结合两者的活性与竞品Iscalimab、Ravagalimab抗体相似。
实施例4：21G6抗体流式细胞术结合实验
流式细胞术实验被用于检测CD40抗体的结合特性，向细胞中加入CD40抗体，抗体加入后信号的强弱用于判断鼠源抗体和CD40的结合特性。
(1)用PBS将HCT-116人结直肠癌细胞稀释为2×106/ml，以100μl/管的体积加于1.5ml EP管中，向其中加入10μl/管山羊血清，于4℃封闭30min。分别加入不同浓度梯度的21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、人源化h21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:13，以及轻链序列SEQ ID NO:14)、hIgG1LALA(购自百英生物)，于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS，4℃3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管PBS重悬细胞，向其中加入1μl/管APC标记的山羊抗人IgG抗体二抗(购自Jackson lab)，4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
实验结果如图3所示，显示本发明的21G6抗体能够结合HCT-116人结直肠癌细胞，并且结合活性强于竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体。人源化h21G6抗体结合HCT-116人结直肠癌细胞的结合活性结果如图4所示，进一步显示本发明的人源化h21G6抗体能够结合HCT-116人结直肠癌细胞，并且结合活性与21G6抗体相似。
(2)用PBS将人外周血PBMC(外周血单个核细胞)稀释为2×106/ml(购自合佑生生物)，以100μl/管的体积加于1.5ml EP管中，向其中加入10μl/管山羊血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度梯度的21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)，于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS，4℃3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管PBS重悬细胞，向其中加入1μl/管APC标记的山羊抗人IgG抗体二抗(购自Jackson lab)、FITC标记的CD19抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，
实验结果如图5所示，进一步显示本发明的21G6抗体能够结合人外周血B细胞，并且结合活性强于竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体。
实施例5：CD40抗体阻断能力的检测
流式细胞术实验被用于检测CD40抗体的阻断特性。CD40抗体与CD40L-mFc蛋白加入到HCT-116细胞中，APC标记的抗小鼠IgG抗体加入后信号的强弱用于判断抗体对CD40L-mFc结合HCT-116细胞的影响。
用PBS将HCT-116人结直肠癌细胞稀释为2×106/ml，以100μl/管的体积加于1.5mlEP管中，向其中加入10μl/管山羊血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度梯度的21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ IDNO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)以及0.5μg/ml的CD40L-mFc蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)，于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS，4℃3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管PBS重悬细胞，向其中加入1μl/管APC标记的山羊抗小鼠IgG抗体二抗(购自Biolegend)，4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
实验结果如图6和图7所示，表明本发明的21G6抗体能够阻断CD40L与HCT-116细胞结合，阻断活性与竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体相似；且人源化h21G6抗体也能够阻断CD40L与HCT-116细胞结合，阻断活性与21G6抗体相似。
实施例6：21G6抗体抑制CD40报告细胞活化实验
报告细胞实验被用于检测CD40抗体影响CD40下游活化信号的特性，向CD40报告细胞中加入CD40L-mFc和CD40抗体，抗体加入后荧光素酶信号的强弱用于判断CD40抗体对CD40下游活化信号的影响。
用完全DMEM培养基将CD40报告细胞稀释为2×105/ml(购自科佰生物)，以100μl/管的体积加于96孔板中，向其中加入0.5μg/ml的CD40L-mFc和梯度稀释的待测CD40抗体21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)，37℃孵育6h。向其中加入荧光素酶底物，用酶标仪进行检测。
实验结果如图8所示，显示本发明的CD40抗体21G6能够抑制CD40报告细胞活化，竞品Iscalimab、Ravagalimab抗体无法达到同样的效果，竞品单抗仅在个别浓度具有抑制功能，并且抑制功能弱于21G6。
实施例7：CD40抗体影响B细胞活化的实验
流式细胞术实验被用于检测CD40抗体对B细胞表达CD86的影响，向人外周血PBMC中加入CD40抗体，抗体加入后CD86的表达用于判断CD40抗体引发B细胞活化的情况。
用完全RPMI 1640培养基将人外周血PBMC稀释为2×106/ml(购自合佑生生物)，以100μl/管的体积加于96孔板中，向其中加入CD40抗体21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)，37℃孵育24h。标记CD19和CD86荧光抗体(购自Biolegend)，然后用200μl/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
实验结果如图9所示，显示本发明的CD40抗体21G6不会促进B细胞表达CD86，竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体会促进B细胞上调表达CD86。21G6和竞品抗体的研发目的都是CD40拮抗剂，而竞品抗体引起B细胞活化，这对于抗体功能十分不利。
实施例8：CD40抗体抑制CD40L介导的B细胞活化
流式细胞术实验被用于检测CD40抗体对CD40L介导的B细胞上调CD80、CD86的影响，向人外周血PBMC中加入CD40L-mFc和CD40抗体，抗体加入后CD80、CD86的表达用于判断CD40抗体抑制CD40L介导的B细胞活化。
用完全RPMI 1640培养基将人外周血PBMC稀释为2×106/ml(购自合佑生生物)，以100μl/管的体积加于96孔板中，向其中加入CD40抗体21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、Ravagalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:17，以及轻链序列SEQ ID NO:18)、hIgG1LALA(购自百英生物)及0.5μg/ml CD40L-mFc，37℃孵育24h。标记CD19、CD80和CD86荧光抗体(购自Biolegend)，然后用200μl/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
实验结果结果如图10和图11所示，图10显示本发明的CD40抗体21G6抑制B细胞表达CD80，并且抑制作用强于竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体，而且竞品在高浓度时抑制作用进一步减弱；图11显示本发明的CD40抗体21G6抑制B细胞表达CD86，并且抑制作用强于竞品Iscalimab抗体、Ravagalimab抗体，而且竞品在高浓度时抑制作用进一步减弱。
实施例9：CD40抗体抑制B细胞增殖实验
流式细胞术实验被用于检测CD40抗体的抑制B细胞增殖的特性，将人外周血PBMC标记CFSE，加入CD40抗体及CD40L-mFc，培养120h，CFSE信号的强弱用于判断CD40抗体对B细胞增殖的影响。
利用5μM CFSE标记PBMC细胞，标记完成后，用完全RPMI 1640培养基将人外周血PBMC稀释为2×105/ml(购自赛笠生物)，以100μl/管的体积加于96孔板中，向其中加入0.5μg/ml CD40L-mFc，以及21G6抗体(重链序列SEQ ID NO:9，以及轻链序列SEQ ID NO:10)、竞品Iscalimab抗体(重链序列SEQ ID NO:15，以及轻链序列SEQ ID NO:16)、hIgG1LALA(购自百英生物)，37℃孵育120h。然后用流式细胞仪进行检测。
结果如图12，显示本发明的CD40抗体21G6能够有效抑制CD40L介导的B细胞增殖，而竞品Iscalimab抗体抑制B细胞增殖作用大幅弱于21G6抗体。
从以上实验结果可以看出，本发明得到的抗体的能够结合人及猴CD40；能够阻断CD40和CD40L的结合；能够抑制CD40下游活化信号，抑制B细胞增殖。因此，该抗体能够干扰免疫细胞间的信号传导，调节免疫活性和炎症反应，这些功能使得该抗体在治疗或预防CD40介导的相关疾病方面具有良好的潜力，为疾病治疗和免疫调节提供了新的选择和策略。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

Claims (18)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，如SEQ IDNO:5所示的轻链可变区CDR2，如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11所示的重链可变区；和/或
如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
1)如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区；或
2)如SEQ ID NO:11所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段含有重链框架区序列和轻链框架区序列，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一；
任选地，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体；
任选地，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体、IgG2a抗体、IgG4抗体或其突变体或人源IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体或其突变体。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:9和13任一项所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:10和14任一项所示氨基酸序列的轻链；
任选地，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链和SEQID NO:10所示氨基酸序列的轻链；
任选地，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体中的至少之一；
任选地，所述单抗包括全长抗体、Fv抗体、单链抗体、Fab抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；
任选地，所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
9.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求9所述的核酸分子。
11.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体或能够表达权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求10所述的表达载体导入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
任选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
13.一种免疫缀合物，其特征在于，包括：权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及治疗剂；所述抗体或其抗原结合片段与所述治疗剂偶联；
任选地，所述治疗剂能够预防和/或治疗CD40介导的疾病；
任选地，所述CD40介导的疾病选自移植排斥、自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症。
14.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11～12任一项所述的重组细胞或权利要求13所述的免疫缀合物。
15.一种药物，其特征在于，包括：
权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11～12任一项所述的重组细胞、权利要求13所述的免疫缀合物或权利要求14所述的组合物；
任选地，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料。
16.权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11～12任一项所述的重组细胞、权利要求13所述的免疫缀合物或权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD40介导的疾病；
任选地，所述CD40介导的疾病选自移植排斥、自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症。
17.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
权利要求9所述的核酸分子；
权利要求10所述的表达载体；或者
权利要求11～12任一项所述的重组细胞。
18.权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体或权利要求11～12任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD40。
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