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CN117915957A - 用于调节mRNA剪接的组合物和方法 - Google Patents

用于调节mRNA剪接的组合物和方法 Download PDF

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CN117915957A
CN117915957A CN202280041112.4A CN202280041112A CN117915957A CN 117915957 A CN117915957 A CN 117915957A CN 202280041112 A CN202280041112 A CN 202280041112A CN 117915957 A CN117915957 A CN 117915957A
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CN
China
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compound
side chain
amino acid
ccpp
peg
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Pending
Application number
CN202280041112.4A
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English (en)
Inventor
钱自清
纳塔拉詹·塞瑟拉曼
沈秀龙
刘皓明
李翔
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Ant Rada Therapeutics Ltd By Share Ltd
Original Assignee
Ant Rada Therapeutics Ltd By Share Ltd
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Application filed by Ant Rada Therapeutics Ltd By Share Ltd filed Critical Ant Rada Therapeutics Ltd By Share Ltd
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Abstract

本发明提供了化合物，这些化合物包含至少一种与反义化合物(AC)缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。该AC调节RNA转录物的剪接。例如，该AC诱导外显子跳跃。外显子跳跃可导致蛋白质的表达或活性下调。外显子跳跃可引起所得mRNA的移码。该移码可得到提前终止密码子。该移码可导致无义介导的衰变。

Description

用于调节mRNA剪接的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下临时申请的权益：2021年5月10日提交的美国临时申请序列号63/186,664；2021年6月15日提交的美国临时申请序列号63/210,882；2022年3月21日提交的美国临时申请序列号63/321,921；2022年3月31日提交的美国临时申请序列号63/362,295；2021年9月1日提交的美国临时申请序列号63/239,671；2021年6月15日提交的美国临时申请序列号63/210,866；2022年1月11日提交的美国临时申请序列号63/298,587；以及2022年3月9日提交的美国临时申请序列号63/318,201，这些临时申请在不与本文提供的公开内容相冲突的情况下其各自全文以引用方式并入本文。
技术领域
本文提供了用于调节mRNA剪接的组合物和方法。具体地，提供了用于通过诱导外显子跳跃来调节感兴趣的蛋白质的表达或活性的组合物和方法，例如以在RNA转录物中引入移码，其可导致RNA转录物的无义介导的衰变。
背景技术
基因是编码功能性基因产物诸如蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。将基因编码转化成功能性基因产物的过程包括从遗传DNA转录RNA(转录物)和将RNA翻译成蛋白质的步骤。RNA首先从DNA转录为未成熟的“前mRNA”，其经历加工而变成成熟的信使RNA(mRNA)，该mRNA可被翻译成蛋白质。在真核生物中，加工步骤包括将经单核苷酸修饰的鸟嘌呤(G)核苷酸帽添加到RNA的5'端；将聚腺苷序列添加到RNA的3'端(聚A尾)；以及RNA剪接。
剪接是指从前mRNA去除内含子(间插序列)并将外显子(编码序列)连接在一起形成成熟mRNA的过程。
许多哺乳动物基因被选择性剪接，其中前mRNA序列中的不同外显子被包含或排除在成熟mRNA转录物中，使得一种基因可以生成不同的mRNA信息，其被翻译成具有不同大小和/或功能的蛋白质(同种型)。
选择性剪接可涉及转录物的外显子区和/或内含子区内的隐蔽剪接位点。隐蔽剪接位点是通常不使用的剪接位点，但是可以在常用剪接位点被阻断或不可用时或者在突变导致正常非活性位点变成活性剪接位点时使用。在隐蔽剪接中，剪接机制识别隐蔽剪接位点而不是典型剪接位点。通常，隐蔽剪接导致在mRNA中包含或排除部分或整个内含子或外显子序列。
前mRNA剪接的反义调节已被用于恢复隐蔽剪接，改变选择性剪接的基因的水平(同种型转换)，以及用于外显子跳跃，例如恢复破坏的阅读框或敲低不需要的基因的功能(Aartsma-Rus和Ommen，RNA(2007),13:1609-1624)。
在治疗剂中使用反义化合物的主要问题包括当全身施用时它们获得进入细胞内区室的能力有限，它们实现广泛或特异性靶向的组织分布的能力有限，以及获得靶向RNA的足够特异性以最小化脱靶效应的挑战。反义化合物的细胞内递送可通过使用载体系统(诸如聚合物、阳离子脂质体)或通过构建体的化学修饰(例如通过胆固醇分子的共价附接)来促进。然而，细胞内递送效率很低并且组织分布可能较窄。另外，现有技术仍然受到脱靶相互作用的阻碍。因此，仍然需要改进的递送系统以增加这些反义方法的有效性，并且仍然存在对有效组合物的未满足的需要，所述有效组合物将反义化合物广泛递送到细胞内区室的所有受影响的组织类型以特异性靶向给定基因产物，从而治疗由例如异常基因转录、剪接和/或翻译引起的疾病。
发明内容
本公开整体涉及用于调节基因诸如与疾病相关的基因的靶转录物(例如，前mRNA)的剪接的化合物、组合物和方法。在实施方案中，本公开涉及包含治疗性部分(TM)和细胞穿透肽(CPP)的化合物和组合物。TM可以是反义化合物(AC)，其结合靶转录物以调节靶转录物的剪接。在实施方案中，AC结合靶转录物的剪接元件(SE)或顺式作用剪接调控元件(SRE)的至少一部分，或者接近靶转录物的剪接元件或顺式作用剪接调控元件，以调节靶转录物的剪接。在实施方案中，AC与靶转录物的结合导致由靶转录物表达的蛋白质的表达或活性的下调。
在实施方案中，AC与靶转录物的结合导致外显子的跳跃。在实施方案中，外显子的跳跃导致移码。在实施方案中，移码得到提前终止密码子。在实施方案中，移码得到无义介导的衰变。在实施方案中，移码得到提前终止密码子和无义介导的衰变。
本文描述了其中本文所述的化合物或组合物用于治疗疾病的方法。在实施方案中，疾病是遗传性疾病。在实施方案中，所述化合物或组合物用于通过调节与遗传性疾病相关的基因的剪接来治疗该疾病。在实施方案中，所述化合物或组合物通过调节与遗传性疾病相关的基因转录物的剪接来治疗该疾病。在实施方案中，所述方法包括将本文所述的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者。在实施方案中，对其有需要的受试者是患有遗传性疾病或具有患遗传性疾病的风险的患者。在实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者。在实施方案中，遗传性疾病是与IRF-5、DUX4或GYS1或其遗传变体的异常表达相关的疾病。
CPP可以增强AC的细胞内递送以增强AC调节靶转录物的剪接的有效性。CPP可以是环状CPP(cCPP)。
本文所述的化合物可包含内体逃逸载体(EEV)，其被构造成允许在内体中内化到细胞中的化合物或其部分逃出内体并进入细胞溶质或细胞区室以允许AC作用于靶转录物并调节剪接。在实施方案中，EEV包含CPP，诸如cCPP。
在实施方案中，cCPP具有下式(A)：
或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R1、R2和R3中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R4、R5、R6、R7独立地是H或氨基酸侧链；
R4、R5、R6、R7中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N,N-二甲基精氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；
AASC是氨基酸侧链；并且
q是1、2、3或4。
在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I)：
或其质子化形式或盐，
其中每个m独立地是0-3的整数。
在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I-1)：
或其质子化形式或盐。在实施方案中，cCPP具有式(A)，具有下式(I-2)：或其质子化形式或盐。在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I-3)：
或其质子化形式或盐。
在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I-4)：
或其质子化形式或盐。
在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I-5)：
或其质子化形式或盐。
在实施方案中，式(A)的cCPP具有下式(I-6)：
或其质子化形式或盐。在实施方案中，cCPP具有下式(II)：
其中：
AASC是氨基酸侧链；
R1a、R1b和R1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d独立地是氨基酸侧链；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是 或其质子化形式或盐；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是胍或其质子化形式或盐；
每个n”独立地是0至5的整数；
每个n'独立地是0至3的整数；并且
如果n'是0，则R2a、R2b、R2b或R2d不存在。
在实施方案中，式(II)的cCPP具有下式(II-1)：
在实施方案中，式(II)的cCPP具有下式(IIa)：
在实施方案中，式(II)的cCPP具有下式(IIb)：
在实施方案中，式(II)的cCPP具有下式(IIc)：
或其质子化形式或盐。在实施方案中，cCPP具有以下结构：
或其质子化形式或盐，其中氨基酸侧链的至少一个原子被所述治疗性部分或接头替换或者至少一个孤对形成与所述治疗性部分或所述接头的键。
在实施方案中，cCPP具有以下结构：
或其质子化形式或盐，其中氨基酸侧链的至少一个原子被所述治疗性部分或接头替换或者至少一个孤对形成与所述治疗性部分或所述接头的键。
在实施方案中，化合物包含环外肽(EP)。在实施方案中，EP包含以下序列之一：KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH、KHKK、KKHK、KKKH、KHKH、HKHK、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、HBHBH、HBKBH、RRRRR、KKKKK、KKKRK、RKKKK、KRKKK、KKRKK、KKKKR、KBKBK、RKKKKG、KRKKKG、KKRKKG、KKKKRG、RKKKKB、KRKKKB、KKRKKB、KKKKRB、KKKRKV、RRRRRR、HHHHHH、RHRHRH、HRHRHR、KRKRKR、RKRKRK、RBRBRB、KBKBKB、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG，其中B是β-丙氨酸。
在实施方案中，化合物具有下式(C)：
或其质子化形式或盐，其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或包含芳基或杂芳基基团的侧链，其中R1、R2和R3中的至少一者是包含芳基或杂芳基基团的侧链；
R4和R7独立地是H或氨基酸侧链；
EP是环外肽；
每个m独立地是0-3的整数；
n是0-2的整数；
x'是1-23的整数；
y是1-5的整数；
q是1-4的整数；
z'是1-23的整数；并且
货物是AC。
在实施方案中，化合物包含式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：
或其质子化形式或盐，其中EP是环外肽，并且寡核苷酸是AC。
附图说明
图1A至图1B是示出剪接调控元件的示意图，包括剪接位点(A)和一般剪接反应(两个酯交换反应)(B)。
图2是示出反义化合物介导的外显子跳跃以产生最终导致靶转录物的无义介导的衰变的提前终止密码子的示意图。
图3示出了在本文所述的反义寡核苷酸中使用的经修饰的核苷酸。结构1-3(1＝硫代磷酸酯；2＝(SC5-Rp)-α,β-CAN；3＝PMO)是磷酸酯主链修饰；4(2-硫代-dT)是碱基修饰；5-8(5＝2'-OMe-RNA；6＝2'O-MOE-RNA；7＝2'F-RNA；8＝2'F-ANA)是2'糖修饰；9-11是限制性核苷酸；12-14(9＝LNA；10＝(S)-cET；11＝tcDNA；12＝FHNA；13＝(S)5'-C-甲基；14＝UNA)是另外的糖修饰；并且15-18(15＝E-VP；16＝膦酸甲酯；17＝5'硫代磷酸酯；18＝(S)-5'-C-甲基与磷酸酯)是5'磷酸酯稳定修饰；19是吗啉代糖。由Khvorova,A.等人，Nat.Biotechnol.(2017)3月；35(3):238-248改良而得。
图4A至图4D提供了用于合成二氨基磷酸酯连接的吗啉代寡聚物(PMO)的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(B)、鸟嘌呤(C)和胸腺嘧啶(D)吗啉代亚基单体的结构。
图5A至图5D示出了用于将反义化合物(AC)连接到肽诸如环状细胞穿透肽(cCPP)的缀合化学。图5A示出了用于具有N-羟基琥珀酰亚胺活化酯的肽(上图)或具有游离羧酸的肽(下图)与AC的5'端的伯胺之间的酰胺键形成反应的试剂。图5B示出了用于AC的3'端的伯胺或仲胺与具有四氟苯基(TFP)活化酯的肽的酰胺键形成反应的试剂。图5C示出了用于肽-叠氮化物经由无铜叠氮化物-炔环加成与经5'环辛炔修饰的AC的缀合的试剂。图5D示出了用于经3'修饰的环辛炔AC或经3'修饰的叠氮化物AC与含有接头-叠氮化物或接头-炔/环辛炔部分的肽诸如cCPP之间分别经由无铜叠氮化物-炔环加成或铜催化的叠氮化物-炔环加成(点击反应)的缀合的另一种示例性试剂。
图6示出了使用图5所示的缀合化学，用含有聚乙二醇(PEG)部分的另外的接头形式连接AC和CPP的缀合化学。指出了纯化方法。
图7A至图7D示出了在GAA敲除小鼠模型中未处理的小鼠、用PMO处理的小鼠和用各种浓度的EEV-PMO处理的小鼠的横膈膜(A和B)和心脏(C和D)中的GYS1蛋白(A和C)和GYS1mRNA(B和D)的水平。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)
图8A至图8D示出了未处理小鼠、用PMO处理的小鼠和用EEV-PMO处理的小鼠在处理后不同时间点的心脏(A)、横膈膜(B)、四头肌(C)和三头肌(D)中GYS1 mRNA水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)
图9A至图9D示出了未处理小鼠、用PMO处理的小鼠和用EEV-PMO处理的小鼠在处理后不同时间点的心脏(A)、横膈膜(B)、四头肌(C)和三头肌(D)中GYS1蛋白水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)
图10A至图10C是示出在用各种浓度的EEV-PMO处理的小鼠的肝脏(A)、小肠(B)和胫骨前肌(C)中IRF5 mRNA表达水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)。MPK(mpk)＝mg/kg。
图11A至图11B是示出用各种浓度的EEV#1-PMO、EEV#2-PMO、EEV#3-PMO和EEV#4-PMO处理小鼠巨噬细胞的体外实验中IRF5蛋白表达水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)
图12是示出在用各种浓度的PMO 220或EEV-PMO 220-814处理后野生型小鼠成肌细胞系C2C12中GYS1 mRNA水平的敲低的图。通过student t检验，相对于0(未处理)，N＝3，*p<0.05，**p<0.01。
图13A至图13B是示出在用各种浓度的PMO 220处理后小鼠成肌细胞(A)和小鼠成纤维细胞(B)中GYS1 mRNA水平的敲低的图。通过student t-检验，相对于NT(未处理)，N＝2，*p<0.05。
图14A至图14D是示出在用PMO 220或各种浓度的PMO-EEV 220-814处理GAA敲除小鼠后心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中GYS1 mRNA水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图15是示出在用PMO 220或各种浓度的PMO-EEV 220-814处理GAA敲除小鼠后肝脏中GYS2 mRNA水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图16A至图16D是示出在用PMO 220或各种浓度的PMO-EEV 220-1055处理GAA敲除小鼠后心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中GYS1 mRNA水平的图。
图17A至图17D是示出在用20mpk的PMO-EEV 220-1055处理GAA敲除小鼠后的不同时间点的心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中GYS1蛋白水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图18A至图18D是示出在用20mpk的PMO 220或20mpk的PMO-EEV 220-1055处理GAA敲除小鼠后的不同时间点的心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中药物暴露水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图19A至图19D是示出野生型小鼠、GAA敲除小鼠和用各种浓度的EEV-PMO 220-1120处理的GAA敲除小鼠的心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中GYS1 mRNA水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图20A至图20D是示出野生型小鼠、GAA敲除小鼠和用各种浓度的EEV-PMO 220-1120处理的GAA敲除小鼠的心脏(A)、横膈膜(B)、三头肌(C)和四头肌(D)中GYS1蛋白水平的图。MPK(mpk)＝mg/kg。
图21A至图21D是示出野生型小鼠、GAA敲除小鼠和用多个剂量的EEV-PMO 220-1055处理的GAA敲除小鼠的心脏(A)、横膈膜(B)和四头肌(C)中GYS1蛋白水平的图。
图22A至图22B是示出野生型小鼠、GAA敲除小鼠和用多个剂量的EEV-PMO 220-1055处理的GAA敲除小鼠的肝脏中GYS1(A)和GYS2(B)水平的图。
图23A至图23C示出了在用两个剂量的PMO或EEV-PMO 278-1120处理小鼠后小鼠TiA组织(A)、肝脏组织(B)和小肠组织(C)中IRF-5的表达水平。MPK(mpk)＝mg/kg。
图24A至图24C示出了在用一个剂量的PMO 278或PMO-EEV 278-1120处理小鼠后小鼠肝脏(A)、肾脏(B)和胫骨前肌(C)组织中的IRF-5表达水平。P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***。
图25A至图25B示出了在用各种浓度的EEV-PMO构建体220-814处理小鼠后，使用对GYS1非特异性的GYS抗体，在四头肌(A)和三头肌(B)中的GYS1蛋白水平。
图26A至图26C示出了在用各种浓度的EEV-PMO构建体220-814处理小鼠后，使用GYS1特异性抗体，在横膈膜(A)、心脏(B)和三头肌(C)中的GYS1蛋白水平。
图27A示出了用各种浓度的PMO-EEV 277-1120和278-1120处理后RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞的IRF-5表达水平。P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***。
图27B是在用EEV-PMO 278-1120处理RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞后的不同时间点的外显子跳跃百分比的柱状图。NT＝未处理。
图28A至图28B是示出在用各种浓度的各种EEV-PMO处理接着进行R848刺激后RAW264.7单核细胞/巨噬细胞中IRF-5表达水平(A)和外显子4跳跃百分比(B)的柱状图。
图29A至图29B是示出在用各种浓度的各种EEV-PMO处理后人THP1细胞中的IRF-5外显子4和外显子5跳跃水平的图。
具体实施方式
剪接
前mRNA分子在细胞核中制备，并且在转运到细胞质进行翻译之前或期间被加工。前mRNA的加工包括向转录物的3'端添加5'甲基化的鸟嘌呤帽和约200-250个碱基的聚(A)尾。前mRNA加工还包括剪接，其发生在约90％至约95％的哺乳动物mRNA的成熟中。内含子(或间插序列)是初级转录物(或编码它的DNA)的不包含在成熟mRNA的编码序列中的区域。外显子是初级转录物的当其到达细胞质时保留在成熟mRNA中的区域。转录物可具有多个内含子和外显子。外显子被剪接在一起形成成熟mRNA序列。剪接连接也称为剪接位点，其中连接的5'侧通常称为“5'剪接位点”或“剪接供体位点”，而3'侧称为“3'剪接位点”或“剪接受体位点”。在剪接中，上游外显子的3'端与下游外显子的5'端连接。因此，转录物(例如，前mRNA)在内含子的5'端具有外显子/内含子连接，并且在内含子的3'端具有内含子/外显子连接。去除内含子后，外显子在成熟mRNA中有时被称为外显子/外显子连接或边界的位置是连续的。隐蔽剪接位点是较少使用但当常用剪接位点被阻断或不可用时可以使用的那些。选择性剪接(定义为将外显子的不同组合剪接在一起)通常得到来自单个基因的多个mRNA转录物。
前mRNA中的内含子的去除由剪接体(一种核糖核蛋白(RNP)复合体，其包含五种小核核糖核蛋白(snRNP))和许多其他蛋白质催化(Will和Lührmann，Cold SpringHarb.Perspect.Biol.(2011),3(7):a003707；Havens等人，Wiley Interdiscip.RNA(2014),4(3),247-266.doi:10.1002/wrna.1158)。剪接部分地由剪接元件(SE)控制。如本文所用，“剪接元件”是存在于前mRNA中的发生剪接诸如典型剪接所必需的序列元件(图1A)。SE包含5'剪接位点(5'ss)和3'剪接位点(3'ss)。5'ss也称为供体剪接位点，包括几乎不变的“GU”二核苷酸序列以及较不保守的下游残基。5'剪接位点还包含外显子/内含子连接。如本文所用，外显子/内含子连接是上游10个核苷酸和从5'ss的GU序列的G起的10个核苷酸(+10和-10)的核苷酸序列。3'ss或受体剪接位点包含三个保守元件：分支剪接点(BSP)(有时称为分支点)、聚嘧啶或Py束和末端“AG”。BSP通常是位于3'ss中约18至约40个核苷酸的腺苷。Py束通常包含约15至约20个嘧啶残基，具体地尿嘧啶(U)(在图1A中示出为Xn)。然而，存在非典型的分支点；它们更远离3'剪接位点并且/或者利用非腺苷碱基(Montes等人Trends Genet.(2019),35(1):68-87)。3'ss还包含内含子/外显子连接。如本文所用，内含子/外显子连接是上游10个核苷酸和从3'ss的AG序列的G起的10个核苷酸(+10和-10)的核苷酸序列。
外显子在大多数剪接反应中通过与五种小核糖核蛋白(snRNP)的小核RNA(snRNA)组分的特异性碱基配对相互作用而被识别；U1、U2、U4、U5和U6(Havens等人，(2014)WileyInterdiscip.RNA.2013,4(3),247-266.doi:10.1002/wrna.1158；Wahl M.C.等人，Cell(2009),136:701-718)。每个snRNP包含被构造成识别特定核苷酸序列的小核RNA和一种或多种蛋白质。外显子剪接包括两个连续的剪接体催化的酯交换反应(图1B)。一般来讲，剪接反应由U1结合5'ss引发，随后U2结合分支剪接点(BPS)，最后U4、U5和U6在5'和3'剪接位点附近结合。然后置换U1和U4，随后进行第一酯交换反应，其中内含子内的分支点核苷酸(如图1B所示的A)的2'-OH对5'剪接位点处的内含子的第一核苷酸(如图1B所示的G)进行亲核攻击，从而形成套索中间体。在第二反应中，释放的5'外显子的3'-OH对3'剪接位点处的内含子的最后一个核苷酸(如图1B所示的G)进行亲核攻击，从而连接外显子并释放内含子套索。U4、U5和U6也被释放。
除SE之外，剪接部分地由剪接调控元件(SRE)调控。SRE包含顺式调控元件和反式作用剪接因子。顺式调控元件和反式作用剪接因子可促进典型剪接、选择性剪接或隐蔽剪接。
顺式调控元件是转录物内抑制或增强剪接的核苷酸序列。反式作用剪接因子是不位于转录物内并且用于增强或抑制剪接的蛋白质和/或寡核苷酸。顺式调控元件通常用于募集反式作用剪接因子，该反式作用剪接因子激活或抑制剪接。反式作用剪接因子通过与顺式调控元件结合来调控剪接。反式作用剪接因子包括富含丝氨酸/精氨酸(富含SR)的蛋白和异质核核糖核蛋白(hnRNPs)。
剪接顺式调控元件包括外显子剪接增强子(ESE)序列、外显子剪接沉默子(ESS)序列、内含子剪接增强子(ISE)序列和内含子剪接沉默子(ISS)序列(图1A)。ESE序列促进它们所驻留的外显子包含在mRNA中。ESS序列抑制它们所驻留的外显子包含在mRNA中。ISE序列从其在内含子内的位置增强选择性剪接位点的使用。ISS序列从其在内含子内的位置抑制选择性剪接位点的使用。通常，ISS的长度介于8个和16个核苷酸之间，并且比外显子-内含子连接处的剪接位点的保守性低。
前mRNA剪接还可通过在转录物内形成可影响剪接体或其他调控蛋白的结合的二级结构诸如末端茎环(TSL)来调控。末端茎环序列可以是SRE并且通常为约12个至约24个核苷酸，并且由于在12个至24个核苷酸序列内的互补性以及因此的结合而形成二级环结构。
每个SE和/或顺式作用SRE通过间插序列(IS)与相邻的顺式作用SRE和/或SE分开。
外显子跳跃
大多数真核生物前mRNA可以不同方式剪接，通常通过跳过外显子，以在称为选择性剪接的过程中产生不同的成熟mRNA同种型。术语“选择性剪接”是指以不同组合连接外显子(例如，连接不同的5'和3'剪接位点)。选择性剪接可以插入或去除氨基酸，使阅读框移位和/或引入终止密码子，这有助于基因和由基因表达的蛋白质的复杂性、灵活性和丰度。选择性剪接还可通过去除或插入调控元件、控制翻译、mRNA稳定性和/或定位来影响基因表达。据估计，破坏剪接的突变占所有致病突变的多达三分之一(Havens等人(2014)WileyInterdiscip.RNA.2013,4(3),247-266.doi:10.1002/wrna.1158；Lim K.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011),108:11093-11098；Faustino和Cooper，Genes&Dev.(2003),17:419-437；以及Sterne-Weiler T.等人，Genome Res.(2011),21:1563-1571)。
影响剪接过程的突变可以许多不同的方式发生(Havens等人，(2014)WileyInterdiscip.RNA.2013,4(3),247-266.doi:10.1002/wrna.1158)。例如，内含子突变可以破坏核心剪接位点(5'ss或3'ss、Py束或BPS内的序列)，导致突变的剪接位点(5'ss和/或3ss)上游或下游外显子的跳跃或内含子的保留。通常，当剪接位点突变时，在侧接外显子或内含子内激活假剪接位点，其在剪接后产生选择性转录物。内含子内的突变也可以破坏或产生从头剪接沉默子和/或增强子和/或产生从头隐蔽剪接位点。内含子剪接位点突变可占疾病突变的约10％-15％(Havens等人(2014)Wiley Interdiscip.RNA.2013,4(3),247-266.doi:10.1002/wrna.1158；Stenson P.D.等人，The Human Gene Mutation Database:2008update.Genome Med 2009,1:13)。发生在编码外显子内的突变(外显子突变)可导致从头隐蔽剪接位点的产生、具有调控功能的RNA二级结构的破坏和/或剪接沉默子或增强子的破坏，使得剪接位点不能被剪接所需的序列特异性RNA结合蛋白识别。对外显子突变的分析预测外显子内多达25％的突变可改变剪接(Ibid；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011),108:11093-11098)。隐蔽剪接是由前mRNA中的序列引起的，所述序列通常不被用作剪接位点，但被突变激活，所述突变使典型剪接位点失活或产生以前不存在的剪接位点(Arechavala-Gomeza等人，The Application of Clinical Genetics(2014),4(7),245-252；Roca X.等人Genes Dev.(2013)；27(2):129-144)。另外，促成由前mRNA生成的不同蛋白质的选择性剪接可通过将表达从一种同种型转移至与疾病相关的不同同种型而引起疾病(Ibid)。
靶向剪接反应或参与剪接的剪接元件(例如，SE和/或SRE)以诱导异常剪接可用于破坏参与疾病发病机制的蛋白质的基因表达。例如，可靶向剪接以引起外显子跳跃，从而引入导致非功能性或截短的蛋白质或降解RNA转录物的移码或终止密码子(Stenson P.D.等人，Genome Med.2008；1(13))。剪接诱导的阅读框校正、再成框和/或靶转录物的无义介导的衰变提供了治疗许多疾病和病症的机会。
化合物
本文公开了调节感兴趣的基因的表达和/或活性的化合物。在实施方案中，该化合物调节靶基因的靶转录物的剪接。在实施方案中，该化合物包含至少一种细胞穿透肽(CPP)和至少一个结合靶核苷酸序列的治疗性部分(TM)。在实施方案中，TM是反义化合物(AC)。在实施方案中，靶核苷酸序列包括接近或包含顺式作用剪接调控元件(SRE)的至少一部分和/或接近或包含剪接元件(SE)的至少一部分的核苷酸序列。
如本文所用，“剪接的调节”和“调节剪接”是指改变前mRNA转录物的加工，使得剪接的mRNA分子由于外显子跳跃或外显子包含、一个或多个外显子中的缺失或通常不存在于剪接的mRNA中的序列(例如，内含子序列)的缺失或添加而含有外显子的不同组合。调节剪接可包括中断或促进剪接过程的一个或多个步骤。如本文所用，术语“剪接过程”涵盖剪接反应的所有步骤，例如包括各种snRNP(例如，U1、U2、U3、U4和U5)与剪接元件和/或顺式作用剪接调控元件的结合、各种蛋白质和/或寡核苷酸与顺式调控元件的结合以及两个连续的酯交换反应，如例如图1B所示。
治疗性部分
在实施方案中，本公开描述了包括一个或多个治疗性部分(TM)的化合物，所述治疗性部分能够调节感兴趣的转录物从感兴趣的基因的剪接。在实施方案中，感兴趣的基因可以是致病基因。
TM与靶核苷酸序列结合(例如，杂交)。靶核苷酸序列通常包含在感兴趣的基因的靶转录物中。例如，靶向感兴趣的基因的TM可以结合靶转录物内的靶核苷酸序列(例如，剪接元件)。
TM可以是反义化合物(AC)、与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)基因编辑机制相关的一种或多种元件、多肽或它们的组合。
反义化合物(AC)
在实施方案中，治疗性部分包括可调节靶基因的靶转录物的剪接的反义化合物(AC)。AC是包含DNA碱基、经修饰的DNA碱基、RNA碱基、经修饰的RNA碱基、经修饰的核苷间连接、传统的核苷间连接、传统的DNA糖、经修饰的DNA糖、传统的RNA糖、经修饰的RNA糖或它们的组合的寡核苷酸。在实施方案中，AC包含与存在于靶转录物内的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述靶核苷酸序列接近或包含靶转录物内的剪接元件和/或剪接调控元件的至少一部分。
本文所述的AC可含有一个或多个不对称中心，并且因此产生对映体、非对映体和其他立体异构构型，这些构型可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)；α或β；或(D)或(L)。本文提供的反义化合物包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。
在实施方案中，AC诱导导致靶转录物中核苷酸的添加或缺失的选择性剪接。在一些实施方案中，AC诱导导致靶转录物的单个外显子内核苷酸的添加或缺失的选择性剪接。在实施方案中，AC诱导导致靶转录物的单个外显子内的核苷酸缺失的选择性剪接。在实施方案中，单个外显子内核苷酸的缺失导致截短蛋白质的翻译。在实施方案中，截短蛋白质对细胞的毒性低于未截短蛋白质。
在实施方案中，AC被设计成使得外显子被跳过(有时称为外显子跳跃)，导致靶蛋白和/或由靶基因调控的下游蛋白的表达或活性增加或降低。在实施方案中，提供了生成编码截短蛋白质和/或非功能性蛋白质的mRNA的AC。在实施方案中，提供了通过选择性剪接生成编码截短蛋白质和/或非功能性蛋白质的mRNA的AC。在实施方案中，提供了触发靶转录物降解的AC，例如通过无义介导的衰变。在实施方案中，提供了生成具有有益特性的替代mRNA同种型的反义化合物(AC)。
反义化合物(AC)可用于以任何合适的方式调节剪接。在实施方案中，AC可被设计成在空间上阻断对剪接位点、或剪接元件(SE)和/或顺式作用剪接调控元件(SRE)的至少一部分的接近，从而将剪接重定向到隐蔽或从头剪接位点。在实施方案中，AC可靶向剪接增强子序列(例如，ESE和/或ISE)或剪接沉默子序列(例如，ESS和/或ISS)以防止反式作用调控剪接因子结合在靶位点处并且有效地阻断或促进剪接。在实施方案中，AC可被设计成在剪接调控茎环的碱基上进行碱基配对以增强茎环结构。
在实施方案中，AC诱导所得经加工的转录物诸如mRNA中一个或多个核苷酸的添加或缺失。如果从开放读段添加或去除的核苷酸的数量可被三整除以产生整数，则所得的转录物可被翻译成具有比从转录物表达的对应物蛋白质更多或更少氨基酸的功能性或非功能性蛋白质，但在其他方面具有与从未添加或去除核苷酸的转录物表达的蛋白质相同的氨基酸序列(除了添加或缺失的氨基酸)。如果从开放阅读框添加或去除的核苷酸数量不能被三整除以产生整数，则所得的经加工的转录物诸如mRNA的开放读框被移位。例如，为诱导这种“移码”改变而添加或缺失的核苷酸数量可以是1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23等。由于遗传密码的三联体性质，不可被三整除的核苷酸数量的添加或缺失将所得的经加工的转录物诸如mRNA的阅读框移位到移码的下游。移位的阅读框可导致无义介导的衰变，可导致移码的无义下游内的提前终止密码子，并且/或者可导致具有完全不同氨基酸序列的蛋白质在移码下游的表达。
在实施方案中，AC诱导将提前终止密码子(PTC)引入开放阅读框中。如本文所用，“提前终止密码子”是与翻译起始密码子同相并且位于与翻译起始密码子同相的生理终止密码子上游的终止密码子。具有PTC的靶转录物可通过包括无义介导的衰变在内的各种机制去稳定化和降解。
无义介导的衰变是一种监视机制，其识别起始核酸外切和核酸内切降解途径以去除具有PTC的mRNA转录物，从而防止可能对细胞具有有害作用的截短蛋白质的表达。已经设想并综述了若干种无义介导的衰变途径(Lejeune等人，Biomedicines(2020),10(1):141；Brogna等人，Nature Structural and Molecular Biology(2009),16,108-113；Karousis等人，Wiley Interdiscip.Rev.RNA(2016),7(5):661-682)。在其中靶基因在疾病中过表达的实施方案中，诱导无义介导的衰变可用于降低靶蛋白的浓度，并因此治疗疾病。
在实施方案中，AC诱导外显子跳跃以导致靶转录物的无义介导的衰变。这与常规外显子跳跃形成对比，常规外显子跳跃旨在跳过外显子以诱导特定蛋白同种型的表达，从而校正错误剪接、选择性剪接并且/或者避免特定外显子中的有害突变。
在实施方案中，AC诱导靶转录物内外显子的外显子跳跃，其中外显子具有不能被三整除的核苷酸数量。在实施方案中，AC诱导具有不能被三整除的核苷酸数量的外显子的外显子跳跃，得到靶转录物内的PTC。在实施方案中，AC诱导具有不能被三整除的核苷酸数量的外显子的外显子跳跃，得到靶转录物内的PCT，其导致靶转录物的无义介导的衰变。在实施方案中，诱导靶转录物的无义介导的衰变导致靶转录物浓度降低。在实施方案中，诱导靶转录物的无义介导的衰变导致由靶转录物编码的靶蛋白的浓度降低。在实施方案中，诱导靶转录物的无义介导的衰变导致由靶基因调控的下游基因的蛋白水平增加和/或降低。
图2示出了AC诱导的外显子跳跃导致靶转录物的无义介导的衰变或蛋白质的翻译的过早终止的示例。AC结合前mRNA。在例示性实施方案中，AC结合在外显子三的内含子/外显子连接处。在其他实施方案中，AC可以在各种其他位置结合靶转录物以诱导外显子跳跃，从而导致靶转录物的无义介导的衰变(如别处论述)。外显子三中的核苷酸数量不能被三整除，例如52、106、232、365等。AC与内含子/外显子连接的结合通过多种可能的机制诱导外显子三的外显子跳跃。例如，AC与内含子/外显子连接的结合防止剪接机制接近剪接元件。除此之外或另选地，AC与内含子/外显子连接的结合防止完成剪接过程所需的一个或两个酯交换反应的完成。作为AC结合靶转录物的结果，外显子三被跳过，并且所得的转录物包含与外显子四连接的外显子二。作为AC结合靶转录物并跳过外显子三的结果，所得转录物的外显子四中的阅读框被移位。在例示的实施方案中，阅读框的移位将PTC引入所得的转录物中。作为AC结合靶转录物的结果，跳过外显子三和具有PTC的外显子四，所得的转录物被靶向并经历无义介导的衰变。
确定靶序列和设计反义化合物(AC)以诱导外显子跳跃可使用各种不同的方法来完成，包括例如由Aartsma-Rus,A.等人，Molecular Therapy(2008),17(3)548-553；以及Aartsma-Rus,A.等人，RNA(2007),13(10)1609-1624公开的那些。在实施方案中，AC与包含靶转录物的剪接元件(SE)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的整个SE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SE以及SE之间的间插序列的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与包含靶转录物的SRE的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的整个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SRE以及SRE之间的间插序列的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，靶核苷酸序列包含整个SE和/或SRE以及位于靶转录物的SE和/或SRE的上游和/或下游的一个或多个旁侧序列。在实施方案中，靶核苷酸序列包含SE和/或SRE的一部分而非全部，以及位于靶转录物的SE和/或SRE的上游和/或下游的一个或多个旁侧序列。
在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含25个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、10个或更少个、5个或更少个、4个或更少个、3个或更少个、或2个或更少个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含1个至25个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至4个、1个至3个、或1至2个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含2个至25个、2个至20个、2个至15个、2个至10个、2个至5个、2个至4个、或2个至3个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至5个、或3个至4个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含4个至25个、4个至20个、4个至15个、4个至10个、或4个至5个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含5个至25个、5个至20个、5个至15个、或5个至10个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含10个至25个、10个至20个、或10个至15个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含15个至25个或15个至20个碱基。在实施方案中，旁侧序列在SE和/或SRE的一侧或两侧包含20个至25个碱基。在实施方案中，旁侧序列包含间插序列或其一部分。
在实施方案中，AC与包含靶转录物的5'ss的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的外显子/内含子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的3'ss的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的Py束、BPS、末端“AG”和/或内含子/外显子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与包含靶转录物的剪接调控元件(SRE)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的整个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SRE以及靶转录物的SRE之间的间插序列的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的ESE的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含ISE的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的ESS的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的ISS的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与包含靶转录物的末端茎环(TLS)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与靶转录物的异常SE和/或SRE的至少一部分杂交，其中异常SE和/或SRE由靶基因中的突变产生。
在实施方案中，AC与包含靶转录物的SE和/或SRE、外显子/内含子连接或内含子/外显子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与由于靶转录物的重排或缺失而包含异常融合连接的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与靶转录物的选择性剪接的mRNA中的特定外显子杂交。
在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的剪接元件(SE)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的整个SE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的多个SE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含靶转录物的多个SE以及IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE之间的间插序列的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE的至少一部分和SE的一个或多个旁侧序列杂交。
在实施方案中，AC与包含IRF-5靶转录物的5'ss的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5靶转录物的外显子/内含子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5靶转录物的3'ss的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5靶转录物的Py束、BPS、末端“AG”和/或内含子/外显子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC结合不包含靶转录物的SE的至少一部分或SRE的至少一部分的靶核苷酸序列。在实施方案中，AC结合与SE和/或SRE足够接近的靶核苷酸序列以调节靶转录物的剪接。在实施方案中，结合不包含靶转录物的SE的至少一部分或SRE的至少一部分的靶核苷酸序列并且调节靶转录物的剪接的AC可以结合靶转录物并且在空间上阻断翻译因子或反式作用调节因子与SE或SRE的结合。
在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距25个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、10个或更少个、5个或更少个、4个或更少个、3个或更少个、或2个或更少个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距1个至25个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至4个、1个至3个、或1个至2个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距2个至25个、2个至20个、2个至15个、2个至10个、2个至5个、2个至4个、或2个至3个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至5个、或3个至4个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距4个至25个、4个至20个、4个至15个、4个至10个、或4个至5个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距5个至25个、5个至20个、5个至15个、或5个至10个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距10个至25个或10个至20个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距20个至25个核苷酸。
在实施方案中，AC与长度为约5个至约50个核酸的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列的长度相同。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列的长度不同。在实施方案中，AC比靶核酸序列长。
在实施方案中，AC的长度为5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、或45个或更多个核酸。在实施方案中，AC的长度为50个或更少个、45个或更少个、40个或更少个、35个或更少个、30个或更少个、25个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、或10个或更少个核酸。在实施方案中，AC的长度为5个至50个、5个至45个、5个至40个、5个至35个、5个至30个、5个至25个、5个至20个、5个至15个、或5个至10个核酸。在实施方案中，AC的长度为10个至50个、10个至45个、10个至40个、10个至35个、10个至30个、10个至25个、10个至20个、或10个至15个核酸。在实施方案中，AC的长度为15个至50个、15个至45个、15个至40个、15个至35个、15个至30个、15个至25个、或15个至20个核酸。在实施方案中，AC的长度为20个至50个、20个至45个、20个至40个、20个至35个、20个至30个、或20个至25个核酸。在实施方案中，AC的长度为25个至50个、25个至45个、25个至40个、25个至35个、或25个至30个核酸。在实施方案中，AC的长度为30个至50个、30个至45个、30个至40个、或30个至35个核酸。在实施方案中，AC的长度为35个至50个、35个至45个、或35个至40个核酸。在实施方案中，AC的长度为40个至50个或40个至45个核酸。在实施方案中，AC的长度为45个至50个核酸。在实施方案中，AC的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核酸。
在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有100％互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列不具有100％互补性。如本文所用，术语“互补百分比”是指与寡聚化合物或核酸(例如，靶核苷酸序列)的对应核碱基具有核碱基互补性的AC的核碱基数量除以AC的总长度(核碱基数量)。本领域技术人员认识到，在不消除反义化合物活性的情况下，包含错配是可能的。
在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、或零的错配。在一些实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的5％或更多、10％或更多、或15％或更多的错配。在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的零至5％、零至10％、零至15％、或零至20％的错配。在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的5％至10％、5％至15％、或5％至20％的错配。在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的10％至15％或10％至20％的错配。在实施方案中，AC包含与靶核苷酸序列的10％至20％的错配。
在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大、或99％或更大的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有100％或更小、99％或更小、98％或更小、97％或更小、96％或更小、95％或更小、90％或更小、85％或更小的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有80％至100％、80％至99％、80％至98％、80％至97％、80％至96％、80％至95％、80％至90％、或80％至85％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有85％至100％、85％至99％、85％至98％、85％至97％、85％至96％、85％至95％、或85％至90％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有90％至100％、90％至99％、90％至98％、90％至97％、90％至96％、或90％至95％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有95％至100％、95％至99％、95％至98％、95％至97％、或95％至96％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有96％至100％、96％至99％、96％至98％、或96％至97％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有97％至100％、97％至99％、或97％至98％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有98％至100％或98％至99％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有99％至100％的互补性。通过将互补核碱基的数量除以寡核苷酸的核碱基总数来计算寡核苷酸的互补性百分比。
在实施方案中，相对于AC杂交的靶核酸序列，AC包含1个、2个、3个、4个或5个错配。在实施方案中，相对于AC杂交的靶核酸序列，AC包含1个或2个错配。在实施方案中，相对于AC杂交的靶核酸序列，AC不包含错配。
在实施方案中，与未修饰的化合物相比，掺入核苷酸亲和力修饰允许更大数量的错配。类似地，某些寡核苷酸序列可比其他寡核苷酸序列更耐受错配。本领域普通技术人员能够确定AC与靶核苷酸序列之间的适当数量的错配，诸如通过确定热解链温度(Tm)。Tm或ΔTm可通过本领域普通技术人员熟悉的技术来计算。例如，Freier等人(Nucleic AcidsResearch(1997),25,22:4429-4443)描述的技术允许本领域普通技术人员评价核苷酸修饰提高RNA:DNA双链体解链温度的能力。
在实施方案中，AC包含在严格条件下与靶转录物杂交的序列，并且包含在严格条件下不与靶转录物杂交的序列。在实施方案中，AC包含在严格条件下不与靶序列杂交的第一序列、在严格条件下不与靶序列杂交的第二序列和在严格条件下与靶序列杂交的第三序列，其中第三序列位于第一序列与第二序列之间。
在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的剪接调控元件(SRE)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的整个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的多个SRE的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的多个SRE以及SRE之间的间插序列的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE的至少一部分和SE的一个或多个旁侧序列杂交。
在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ESE的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ISE的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ESS的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ISS的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的末端茎环(TLS)的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。
在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的异常SE和/或SRE的至少一部分杂交，其中异常SE和/或SRE由IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物中的突变产生。
在实施方案中，AC与包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的外显子-外显子连接、内含子-外显子连接和/或外显子-内含子连接的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与由于IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的一部分的重排或缺失而包含异常融合连接的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物中选择性剪接的mRNA中的特定外显子杂交。
在实施方案中，AC结合不包含IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ISS的SE的至少一部分或SRE的至少一部分的靶核苷酸序列。在实施方案中，AC结合与SE和/或SRE足够接近的靶核苷酸序列以调节IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的ISS的剪接。
在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距25个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、10个或更少个、5个或更少个、4个或更少个、3个或更少个、或2个或更少个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距1个至25个、1个至20个、1个至15个、1个至10个、1个至5个、1个至4个、1个至3个、或1个至2个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距2个至25个、2个至20个、2个至15个、2个至10个、2个至5个、2个至4个、或2个至3个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距3个至25个、3个至20个、3个至15个、3个至10个、3个至5个、或3个至4个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距4个至25个、4个至20个、4个至15个、4个至10个、或4个至5个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距5个至25个、5个至20个、5个至15个、或5个至10个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距10个至25个或10个至20个核苷酸。在实施方案中，AC结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列的3'端和/或5'端与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的SE和/或SRE的5'端和/或3'端相距20个至25个核苷酸。
在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的长度为约5个至约50个核酸的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列的长度相同。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列的长度不同。在实施方案中，AC比靶核酸序列长。
在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有100％互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列不具有100％互补性。如本文所用，术语“互补百分比”是指与寡聚化合物或核酸(例如，靶核苷酸序列)的对应核碱基具有核碱基互补性的AC的核碱基数量除以AC的总长度(核碱基数量)。本领域技术人员认识到，在不消除反义化合物活性的情况下，包含错配是可能的。
在实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶核苷酸序列的20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、或零的错配。在一些实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列的5％或更多、10％或更多、或15％或更多的错配。在实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列的零至5％、零至10％、零至15％、或零至20％的错配。在实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列的5％至10％、5％至15％、或5％至20％的错配。在实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列的10％至15％或10％至20％的错配。在实施方案中，AC包含与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列的10％至20％的错配。
在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大、或99％或更大的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有100％或更小、99％或更小、98％或更小、97％或更小、96％或更小、95％或更小、90％或更小、85％或更小的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有80％至100％、80％至99％、80％至98％、80％至97％、80％至96％、80％至95％、80％至90％、或80％至85％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有85％至100％、85％至99％、85％至98％、85％至97％、85％至96％、85％至95％、或85％至90％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有90％至100％、90％至99％、90％至98％、90％至97％、90％至96％、或90％至95％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有95％至100％、95％至99％、95％至98％、95％至97％、或95％至96％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有96％至100％、96％至99％、96％至98％、或96％至97％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有97％至100％、97％至99％、或97％至98％的互补性。在实施方案中，AC与靶核苷酸序列具有98％至100％或98％至99％的互补性。在实施方案中，AC与IRF-5、GYS1和/或DUX4靶转录物的靶核苷酸序列具有99％至100％的互补性。通过将互补核碱基的数量除以寡核苷酸的核碱基总数来计算寡核苷酸的互补性百分比。
反义机理
在实施方案中，AC调节蛋白质转录、翻译和表达的一个或多个方面。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交调节前mRNA剪接的一个或多个方面。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交恢复对突变的转录物序列的天然剪接。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交导致靶转录物的选择性剪接。
在实施方案中，AC杂交导致一个或多个外显子的外显子包含或外显子跳跃。在实施方案中，外显子跳跃增加由所得mRNA表达的蛋白质的活性。在实施方案中，外显子跳跃降低由所得mRNA表达的蛋白质的活性。在实施方案中，跳过一个或多个外显子诱导mRNA转录物中的移码。在实施方案中，移码得到编码具有降低活性的蛋白质的mRNA。在实施方案中，移码得到截短的或非功能性的蛋白质。在实施方案中，跳过一个或多个外显子导致在mRNA中引入提前终止密码子。在实施方案中，跳过一个或多个外显子导致mRNA转录物通过无义介导的衰变而降解。在实施方案中，跳过的外显子序列包含核酸缺失、取代或插入。在实施方案中，跳过的外显子不包含序列突变。在实施方案中，反义寡核苷酸与靶前mRNA转录物内的靶核苷酸序列杂交导致不同蛋白同种型的表达。
在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交防止在成熟mRNA分子中包含内含子序列。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交导致蛋白质同种型的表达增加。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交导致蛋白质同种型的表达减少。在实施方案中，AC与靶转录物的靶核苷酸序列的杂交导致包含蛋白质的无活性片段的重新剪接蛋白质的表达。
在实施方案中，AC包含DNA，并且AC与靶转录物的杂交导致经由RNA酶H的转录物降解。在实施方案中，AC包含被设计成不支持RNA酶H活性的核苷酸修饰。不支持RNA酶H活性的反义化合物的核苷酸修饰是已知的，包括但不限于2'-O-甲氧基乙基/硫代磷酸酯(MOE)修饰。有利地，具有MOE修饰的AC提高了对靶RNA的亲和力并且提高了核酸酶稳定性。
在实施方案中，AC通过空间阻断来调控转录、翻译或蛋白质表达。以下综述文章描述了空间阻断的机理及其应用，并且其全文以引用方式并入本文：Roberts等人，NatureReviews Drug Discovery(2020)19:673-694。
AC的功效可通过评价由其施用所影响的反义活性来评估。如本文所用，术语“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核苷酸序列杂交的任何可检测和/或可测量的活性。此类检测和/或测量可以是直接或间接的。在实施方案中，反义活性通过检测和/或测量由感兴趣的转录物表达的蛋白质的量来评估。在实施方案中，反义活性通过检测和/或测量感兴趣的转录物的量来评估。在实施方案中，反义活性通过检测和/或测量选择性剪接的RNA的量和/或从靶转录物翻译的蛋白质同种型的量来评估。在实施方案中，反义活性通过检测和/或测量由感兴趣的基因调控的下游转录物和/或蛋白质的量来评估。
反义化合物设计
AC的设计将取决于靶基因。将AC靶向特定的靶核苷酸序列可以是多步骤过程。该方法通常从识别感兴趣的基因开始。分析感兴趣的基因的转录物，并且识别靶核苷酸序列。在实施方案中，靶核苷酸序列包含剪接元件和/或剪接调控元件的至少一部分。在实施方案中，靶基因是IRF-5。在实施方案中，靶基因是GYS1。在实施方案中，靶基因是DUX4。
本领域技术人员将能够设计、合成和筛选不同核碱基序列的AC，以识别产生反义活性的序列。例如，可以设计抑制靶基因表达的反义化合物。根据针对预选靶核酸和/或靶基因的反义活性设计、合成和筛选AC的方法可见于例如由Stanley T.Crooke编辑的“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”,CRC Press,Boca Raton,Florida，其全文以引用方式并入用于所有目的。
AC结构
AC包括寡核苷酸和/或寡核苷。寡核苷酸和/或寡核苷是通过核苷间连接进行连接的核苷。核苷包含戊糖(例如，核糖或脱氧核糖)和与糖共价附接的含氮碱基。存在于DNA和/或RNA中的天然存在的(传统)碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。存在于DNA和/或RNA中的天然存在的(传统)糖是脱氧核糖(DNA)和核糖(RNA)。天然存在的(传统)核苷连接是磷酸二酯键。在实施方案中，本公开的AC可具有所有天然糖、碱基和核苷间连接。
经化学修饰的核苷通常用于掺入反义化合物中以增强一种或多种特性，诸如核酸酶抗性、药代动力学或对靶RNA的亲和力。在实施方案中，本公开的AC可具有一种或多种经修饰的核苷。在实施方案中，本公开的AC可具有一种或多种经修饰的糖。在实施方案中，本发明的AC可具有一种或多种经修饰的碱基。在实施方案中，本公开的AC可具有一种或多种经修饰的核苷间连接。
通常，核碱基是含有能够与另一核酸的碱基氢键合的一个或多个原子或原子团的任何基团。除“未修饰的”或“天然的”核碱基(A、G、T、C和U)之外，本领域技术人员已知的许多经修饰的核碱基或核碱基模拟物适用于本文所述的化合物。通常，经修饰的核碱基是指在结构上与亲本核碱基相当类似的核碱基，诸如7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-dT(图3)或G型夹。通常，核碱基模拟物是包含比经修饰的核碱基更复杂的结构的核碱基，诸如三环吩嗪核碱基模拟物。用于制备上述经修饰的核碱基的方法是本领域技术人员熟知的。
在实施方案中，AC可包含一种或多种具有经修饰的糖部分的核苷。在实施方案中，天然核苷的呋喃糖基糖可具有2'修饰、制备受限核苷的修饰等(参见图3)。例如，在实施方案中，天然核苷的呋喃糖基糖环可以多种方式修饰，包括但不限于添加取代基、桥接两个非偕环原子以形成双环核酸(BNA)或锁核酸；用C或N交换呋喃糖基环的氧；和/或取代这样的原子或基团(参见图3)。经修饰的糖是众所周知的，可用于增加或降低AC对其靶核苷酸序列的亲和力。经修饰的糖也可用于增加AC对核酸酶的抗性。糖也可用糖模拟基团等替换。在实施方案中，AC的核苷的一种或多种糖被如图3中的19所示的亚甲基吗啉环置换。
在实施方案中，AC包含一种或多种核苷，所述核苷包含双环修饰糖(BNA；有时称为桥接核酸)。BNA的示例包括但不限于LNA(4'-(CH2)-O-2'桥)、2'-硫代-LNA(4'-(CH2)-S-2'桥)、2'-氨基-LNA(4'-(CH2)-NR-2'桥)、ENA(4'-(CH2)2-O-2'桥)、4'-(CH2)3-2'桥接BNA、4'-(CH2CH(CH3))-2'桥接BNA"cEt(4'-(CH(CH3)-O-2'桥)和cMOE BNA(4'-(CH(CH2OCH3)-O-2'桥)。一些示例示于图3中。在专利文献以及科学文献中已制备并公开了BNA(Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.(2007),ACS Advanced online publication,10.1021/ja071106y；Albaek等人，J.Org.Chem.(2006),71,7731-7740；Fluiter等人，Chembiochem(2005),6,1104-1109；Singh等人，Chem.Commun.(1998),4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron(1998),54,3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2000),97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1998),8,2219-2222；WO 94/14226；WO 2005/021570；Singh等人，J.Org.Chem.(1998),63,10035-10039；WO 2007/090071；美国专利号7053207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；以及美国授权前公开号2004-0171570；2004-0219565；2004-0014959；2003-0207841；2004-0143114；和20030082807)。
在实施方案中，AC包含一种或多种核苷，所述核苷包含锁核酸(LNA)。在LNA中，核糖基糖环的2'-羟基基团与糖环的4'碳原子连接，从而形成2'-C,4'-C-氧亚甲基连接以形成双环糖部分(综述于Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs(2001),2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol.(2001),8,1-7；以及Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.(2001),3,239-243；还参见美国专利：6,268,490和6,670,461)。该连接可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，为此术语LNA用于双环部分；在该位置上为亚乙基基团的情况下，使用术语ENATM(Singh等人，Chem.Commun.(1998),4,455-456；ENATM；Morita等人，Bioorganic Medicinal Chemistry(2003),11,2211-2226)。LNA和其他双环糖类似物显示出与互补DNA和RNA的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3'-外切核酸降解的稳定性和良好的溶解特性。已经描述了含有LNA的有效且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2000),97,5633-5638)。
也已研究的LNA异构体是α-L-LNA，其已显示对3'-外切核酸酶具有优异的稳定性。将α-L-LNA掺入显示出有效反义活性的反义gapmer和嵌合体中(Frieden等人，NucleicAcids Research(2003),21,6365-6372)。
LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备以及它们的寡聚化和核酸识别特性已有描述(Koshkin等人，Tetrahedron(1998),54,3607-3630)。LNA及其制备也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
还制备了LNA的类似物，诸如硫代磷酸-LNA和2'-硫代-LNA(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。含有寡脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶底物的LNA类似物的制备也已有描述(WO 99/14226)。此外，一种构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物2'-氨基-LNA的合成已有描述(Singh等人，J.Org.Chem.(1998),63,10035-10039)。另外，已制备2'-氨基-LNA和2'-甲基氨基-LNA，并且先前已报道它们与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
在实施方案中，反义化合物是“三环-DNA(tc-DNA)”，其是指一类受约束的DNA类似物，其中每个核苷酸通过引入环丙烷环而被修饰以限制主链的构象柔性并且增强扭转角γ的主链几何形状。含同碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补的RNA形成非常稳定的A-T碱基对。
用于制备经修饰的糖的方法是本领域技术人员熟知的。一些教导制备此类经修饰的糖的代表性专利和出版物包括但不限于美国专利：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；和6,600,032；以及WO 2005/121371。
核苷间连接
本文描述了核苷间连接基团，其将核苷或另外经修饰的核苷单体单元连接在一起，从而形成寡核苷酸和/或含寡核苷酸的AC。AC可包括天然存在的核苷间连接、非天然的核苷间连接或两者。
在天然存在的DNA和RNA中，核苷间连接基团是将相邻核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物的磷酸二酯。在天然存在的DNA和RNA中，磷酸二酯与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在寡核苷酸内，磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。在天然存在的DNA和RNA中，RNA和DNA的连接或主链是3'至5'磷酸二酯连接。在实施方案中，AC的核苷间连接基团是磷酸二酯。在实施方案中，AC的核苷间连接基团是3'至5'磷酸二酯键。
非天然的核苷间连接基团的两个主要类别通过磷原子的存在或不存在来定义。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H2-O-)；以及N,N'-二甲肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。具有磷核苷间连接基团的AC称为寡核苷酸。具有非磷核苷间连接基团的反义化合物称为寡核苷。与天然磷酸二酯连接相比，经修饰的核苷间连接可用于改变(通常增加)反义化合物的核酸酶抗性。具有手性原子的核苷间连接可被制备为外消旋的、手性的或制备为混合物。代表性的手性核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和不含磷的连接的制备方法是本领域技术人员熟知的。
在实施方案中，具有经修饰的糖和/或经修饰的核碱基的两个或更多个核苷可使用氨基磷酸酯连接。在实施方案中，具有亚甲基吗啉环的两个或更多个核苷可通过如图3中的20所示的氨基磷酸酯核苷间连接进行连接，其中B1和B2是经修饰的或天然的核碱基。包含具有通过氨基磷酸酯核苷间连接进行连接的亚甲基吗啉环的核碱基的反义化合物可被称为氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)。
缀合基团
在实施方案中，AC通过一个或多个缀合基团的共价附接来修饰。一般来讲，缀合基团修饰AC的一种或多种特性，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。缀合基团在化学领域中是常规使用的，并且直接地或经由任选的连接部分或连接基团连接到亲本化合物诸如AC。缀合基团包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在实施方案中，缀合基团是聚乙二醇(PEG)，并且PEG与AC或CPP(本文别处论述的CPP)缀合。
在实施方案中，缀合基团包括脂质部分，诸如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989),86,6553)；胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1994),4,1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992),660,306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.(1993),3,2765)；硫胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.(1992),20,533)；脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.(1991),10,111；Kabanov等人，FEBS Lett.(1990),259,327；Svinarchuk等人，Biochimie(1993),75,49)；磷脂，例如二十六烷基外消旋甘油或三乙基铵-1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.(1995),36,3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.(1990),18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides(1995),14,969)；金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.(1995),36,3651)；棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta.(1995),1264,229)；或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.(1996),277,923)。
反义化合物的类型
可使用各种类型的AC，例如包括反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA、antagomir、适体、核酶、supermir、miRNA模拟物、miRNA抑制剂或它们的组合。
反义寡核苷酸
在各种实施方案中，反义化合物(AC)是与靶核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(ASO)。术语“反义寡核苷酸(ASO)”或简称“反义”意在包括与靶核苷酸序列互补的寡核苷酸。该术语还包括可能不与期望靶核苷酸序列完全互补的ASO。ASO包括与所选靶核苷酸序列或靶基因互补的单链DNA和/或RNA。ASO可包含一个或多个经修饰的DNA和/或RNA碱基、经修饰的糖和/或非天然的核苷间连接。在实施方案中，ASO可包含一个或多个氨基磷酸酯核苷间连接。在实施方案中，ASO是氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)。ASO可具有任何特征、任何长度、结合任何剪接元件并且实现关于AC所述的任何机制。在实施方案中，ASO诱导外显子跳跃以引入提前终止密码子并最终导致靶转录物的无义介导的降解。在实施方案中，ASO是PMO并且诱导外显子跳跃以引入提前终止密码子并最终导致靶转录物的无义介导的降解。
反义寡核苷酸已被证明能够有效作为蛋白质合成的靶向抑制剂，并且因此可用于通过靶向基因特异性抑制蛋白质合成。ASO抑制蛋白质合成的功效已被充分确定。迄今为止，这些化合物已在若干种体外和体内模型中显示出前景，包括炎性疾病、癌症和HIV的模型(Agrawal,Trends in Biotech.(1996),14:376-387)。反义也可通过与染色体DNA特异性杂交来影响细胞活性。
产生ASO的方法是本领域已知的，并且可以容易地适用于产生结合本公开的靶核苷酸序列的ASO。对于给定靶序列具有特异性的ASO序列的选择基于对所选靶核苷酸序列的分析以及对二级结构、Tm、结合能和相对稳定性的确定。反义寡核苷酸可基于它们相对不能形成将减少或抑制与宿主细胞中的靶核苷酸序列的特异性结合的二聚体、发夹或其他二级结构来选择。这些二级结构分析和靶位点选择考虑可例如使用第4版的OLIGO引物分析软件(Molecular Biology Insights)和/或BLASTN 2.0.5算法软件来进行(Altschul等人，Nucleic Acids Res.1997,25(17):3389-402)。
RNA干扰
在实施方案中，AC包含介导RNA干扰(RNAi)的分子。如本文所用，短语“介导RNAi”是指以序列特异性方式沉默靶转录物的能力。尽管不希望受理论束缚，但据信沉默使用RNAi机制或方法和引导RNA，例如约21个至约23个核苷酸的siRNA和/或miRNA化合物。在实施方案中，AC靶向靶转录物以进行降解。如此，在实施方案中，RNAi分子可用于破坏感兴趣的基因或多核苷酸的表达。在实施方案中，RNAi分子用于诱导靶转录物诸如前mRNA或成熟mRNA的降解。
在实施方案中，AC包含引发RNAi应答的小干扰RNA(siRNA)。在实施方案中，AC包含引发RNAi应答的微小RNA(miRNA)。
小干扰RNA(siRNA)是通常约16个至约30个核苷酸长的核酸双链体，其可与称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白复合物结合。负载有siRNA的RISC介导同源转录物的降解，因此siRNA可被设计成以高特异性敲低蛋白质表达。与其他反义技术不同，siRNA通过经非编码RNA进化以控制基因表达的天然机理发挥作用。包括靶向临床相关靶标的siRNA在内的多种RNAi试剂目前正处于药物开发中，如例如de Fougerolles,A.等人，Nature Reviews(2007)6:443-453中所述。
RNAi的治疗应用非常广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白的任何核苷酸序列来合成。迄今为止，siRNA构建体已显示出在体外和体内模型以及临床研究中特异性下调靶蛋白的能力。
虽然最先描述的RNAi分子是同时包含RNA有义链和RNA反义链的RNA:RNA杂交体，但现已证明DNA有义链：RNA反义杂交体、RNA有义链：DNA反义杂交体和DNA:DNA杂交体能够介导RNAi(Lamberton,J.S.和Christian,A.T.,Molecular Biotechnology(2003),24:111-119)。在实施方案中，使用包括这些不同类型的双链分子中的任一种的RNAi分子。此外，应当理解，RNAi分子可以多种形式被使用和引入细胞。因此，如本文所用，RNAi分子包括能够在细胞中介导RNAi的任何和所有分子，包括但不限于包含两条分开的链即有义链和反义链的双链寡核苷酸，例如小干扰RNA(siRNA)；包括通过非核苷酸接头连接在一起的两条分开的链的双链寡核苷酸；包含形成双链区的互补序列的发夹环的寡核苷酸，例如shRNAi分子，以及表达一种或多种多核苷酸的表达载体，所述一种或多种多核苷酸能够单独或与另一种多核苷酸组合形成双链多核苷酸。
如本文所用，“单链siRNA化合物”是由单个分子组成的siRNA化合物。它可包括由链内配对形成的双链体区，例如，它可以是或包括发夹或盘柄结构。单链siRNA化合物对于靶分子可以是反义的。
单链siRNA化合物可以足够长以使其能够进入RISC并参与RISC介导的靶mRNA的切割。单链siRNA化合物的长度是至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40或至多约50个核苷酸。在某些实施方案中，单链siRNA的长度小于约200、约100或约60个核苷酸。
发夹siRNA化合物可具有等于或至少约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸对的双链体区。双链体区的长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸对。在某些实施方案中，双链体区的长度范围是约15至约30、约17至约23、约19至约23和约19至约21个核苷酸对。发夹可具有单链突出端或末端未配对区。在某些实施方案中，突出端的长度是约2至约3个核苷酸。在实施方案中，突出端位于发夹的同一侧，并且在实施方案中位于发夹的反义侧。
如本文所用，“双链siRNA化合物”是包括多于一条并且在一些情况下两条链的siRNA化合物，其中链间杂交可形成双链体结构的区域。
双链siRNA化合物的反义链的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40或约60个核苷酸。其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸。长度范围可以是约17至约25、约19至约23、和约19至约21个核苷酸。如本文所用，术语“反义链”意指siRNA化合物的与靶分子(例如靶转录物的靶核苷酸序列)充分互补的链。
双链siRNA化合物的有义链的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40或约60个核苷酸。其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸。长度范围可以是约17至约25、约19至约23、和约19至约21个核苷酸。
双链siRNA化合物的双链部分的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约40或约60个核苷酸对，其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸对。长度范围可以是约15至约30、约17至约23、约19至约23和约19至约21个核苷酸对。
在实施方案中，siRNA化合物足够大以使其能够被内源分子(例如，被Dicer)切割，以产生较小的siRNA化合物，例如siRNA剂。
可选择有义链和反义链，使得双链siRNA化合物在分子的一端或两端包含单链或未配对区。因此，双链siRNA化合物可含有配对的有义链和反义链以含有突出端，例如一个或两个5'或3'突出端，或1至3个核苷酸的3'突出端。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。一些实施方案将具有至少一个3'突出端。在实施方案中，siRNA分子的两端将具有3'突出端。在实施方案中，突出端是2个核苷酸。
在实施方案中，双链体区的长度是约15至约30、或约18、约19、约20、约21、约22或约23个核苷酸，例如，在以上讨论的ssiRNA(具有粘性突出端的siRNA)化合物范围内。ssiRNA化合物可在长度和结构上类似于来自长dsiRNA的天然Dicer加工产物。还包括其中ssiRNA化合物的两条链连接(例如共价连接)的实施方案。在实施方案中，包括发夹或提供双链区的其他单链结构和3'突出端。
本文所述的siRNA化合物(包括双链siRNA化合物和单链siRNA化合物)可介导靶RNA(例如mRNA，例如编码蛋白质的基因的转录物)的沉默。为方便起见，此类mRNA在本文中也称为待沉默的mRNA。此类基因也被称为靶基因。通常，待沉默的RNA是内源基因。
在实施方案中，siRNA化合物与靶转录物“充分互补”，使得siRNA化合物沉默由靶mRNA编码的蛋白质的产生。在实施方案中，siRNA化合物与靶转录物的至少一部分“充分互补”，使得siRNA化合物沉默由靶转录物编码的基因产物的产生。在另一个实施方案中，siRNA化合物与靶核苷酸序列(例如，靶转录物的一部分)“精确互补”，使得靶核苷酸序列和siRNA化合物退火，例如在精确互补区域中形成仅由沃森-克里克碱基对组成的杂交体。与靶核苷酸序列“充分互补”可包括与靶核苷酸序列精确互补的内部区域(例如，至少约10个核苷酸)。此外，在某些实施方案中，siRNA化合物特异性区分单核苷酸差异。在这种情况下，如果在单核苷酸差异的区域(例如，在7个核苷酸内)发现精确互补，则siRNA化合物仅介导RNAi。
RNAi的治疗应用非常广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白的任何核苷酸序列来合成。迄今为止，siRNA构建体已显示出在体外和体内模型以及临床研究中特异性下调靶蛋白的能力。
微小RNA
在实施方案中，AC包括微小RNA分子。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的小RNA分子，其从植物和动物基因组中的DNA转录，但不翻译成蛋白质。经加工的miRNA是单链17-25个核苷酸的RNA分子，其被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中并且已被鉴定为发育、细胞增殖、凋亡和分化的关键调节因子。据信它们通过与特定mRNA的3'-非翻译区结合而在基因表达的调控中发挥作用。RISC通过翻译抑制、转录切割或两者介导基因表达的下调。RISC还与多种真核生物细胞核中的转录沉默有关。
Antagomir
在实施方案中，AC是antagomir。Antagomir是RNA样寡核苷酸，其具有针对RNA酶保护和药理学特性(诸如增强的组织和细胞摄取)的各种修饰。它们与正常RNA的不同之处在于例如糖、硫代磷酸酯主链和例如3'-端的胆固醇部分的完全2'-0-甲基化。Antagomir可用于通过形成包括antagomir和内源miRNA的双链体来有效地沉默内源miRNA，从而防止miRNA诱导的基因沉默。antagomir介导的miRNA沉默的示例是miR-122的沉默，描述于Krutzfeldt等人，Nature(2005),438:685-689中，其全文以引用方式明确并入本文。Antagomir RNA可使用标准固相寡核苷酸合成方案来合成(美国专利申请号11/502,158和11/657,341；其各自的公开内容以引用方式并入本文)。
antagomir可包括配体缀合的单体亚基和用于寡核苷酸合成的单体。单体描述于美国申请号10/916,185中。antagomir可具有ZXY结构，诸如PCT申请号PCT/US2004/07070中所述。antagomir可与两亲性部分复合。与寡核苷酸剂一起使用的两亲性部分描述于PCT申请号PCT/US2004/07070中。
适体
在实施方案中，AC包括适体。适体是以高亲和力和特异性与感兴趣的特定分子结合的核酸或肽分子(Tuerk和Gold,Science 249:505(1990)；Ellington和Szostak,Nature346:818(1990))。已成功生产了结合从大蛋白质到小有机分子的许多不同实体的DNA或RNA适体(Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.(1997),1:10-16；Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.(1999),9:324-9；以及Hermann和Patel,Science(2000),287:820-5)。适体可以是基于RNA或DNA的，并且可包含核开关。核开关是可直接结合小靶分子的mRNA分子的一部分，并且其与靶的结合影响基因的活性。因此，含有核开关的mRNA直接参与调节其自身的活性，这取决于其靶分子的存在与否。通常，通过重复几轮的体外选择或等效的SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)来工程化适体以结合多种分子靶标，诸如小分子、蛋白质、核酸，以及甚至细胞、组织和生物体。适体可通过任何已知方法制备，包括合成、重组和纯化方法，并且可单独使用或与对相同靶标特异性的其他适体组合使用。此外，术语“适体”还包括含有共有序列的“二级适体”，该共有序列源自将两种或更多种已知适体与给定靶标进行比较。在实施方案中，适体是“细胞内适体”或“intramer”，其特异性识别细胞内靶标(Famulok等人，ChemBiol.(2001),8(10):931-939；Yoon和Rossi,Adv.Drug Deliv.Rev.(2018),134:22-35；其各自以引用方式并入本文)。
核酶
在实施方案中，AC是核酶。核酶是具有特定催化结构域的RNA分子复合物，其具有核酸内切酶活性(Kim和Cech,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987),84(24):8788-92；Forster和Symons,Cell(1987)24,49(2):211-20)。例如，大量核酶以高度特异性加速磷酸酯转移反应，通常仅切割寡核苷酸底物中若干种磷酸酯中的一种(Cech等人，Cell(1981),27(3Pt2):487-96；Michel和Westhof,J.Mol.Biol.(1990),5,216(3):585-610；Reinhold-Hurek和Shub,Nature(1992),14,357(6374):173-6)。这种特异性归因于需要底物在化学反应前经由特异性碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(IGS)结合。
目前已知至少六种基本种类的天然存在的酶促RNA。在生理条件下，每一种都可反式催化RNA磷酸二酯键的水解(并因此可切割其他RNA分子)，通常，酶促核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，该靶结合部分保持紧密接近于用于切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，酶促核酸首先识别、然后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合到正确的位点，就起到酶促作用以切割靶RNA。此类靶RNA的策略性切割将破坏其指导编码蛋白合成的能力。在酶促核酸已结合并切割其RNA靶标后，其从该RNA中释放以寻找另一个靶标并且可重复地结合并切割新的靶标。
例如，酶促核酸分子可在锤头、发夹、δ型肝炎病毒、I组内含子或RNaseP RNA(与RNA引导序列结合)或脉孢菌属VS RNA基序中形成。锤头基序的具体示例由Rossi等人Nucleic Acids Res.(1992),20(17):4559-65描述。发夹基序的示例由以下文献描述：Hampel等人(欧洲专利申请公开号EP 0360257)；Hampel和Tritz,Biochemistry(1989),28(12):4929-33；Hampel等人，Nucleic Acids Res.(1990),18(2):299-304和美国专利5,631,359。肝炎病毒基序的示例由Perrotta和Been,Biochemistry(1992),31(47):11843-52描述；RNaseP基序的示例由Guerrier-Takada等人，Cell(1983),35(3Pt2):849-57描述；脉孢菌属VS RNA核酶基序由Collins(Saville和Collins,Cell(1990),61(4):685-96；Saville和Collins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991),88(19):8826-30；Collins和Olive,Biochemistry(1993),32(11):2795-9)描述；并且I族内含子的示例描述于美国专利4,987,071中。在实施方案中，酶促核苷酸分子具有与一个或多个靶基因DNA或RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且它们在该底物结合位点内或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，核酶构建体不需要限于本文提到的特定基序。
核酶可如国际专利申请公开号WO 93/23569和国际专利申请公开号WO 94/02595中所述进行设计，各自特别地以引入方式本文，并且如其中所述合成用于体外和体内测试。在实施方案中，核酶靶向靶转录物的靶核苷酸序列。
核酶活性可通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有以下修饰的核酶来增加：防止其被血清核糖核酸酶降解的修饰(参见例如国际专利申请公开号WO 92/07065；国际专利申请公开号WO 93/15187；国际专利申请公开号WO 91/03162；欧洲专利申请公开号92110298.4；美国专利5334711；和国际专利申请公开号WO 94/13688，其描述了可对酶促RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰)，增强其在细胞中的功效以及去除茎∏碱基以缩短RNA合成时间并降低化学需求的修饰。
Supermir
在实施方案中，AC是supermir。supermir是指RNA或DNA聚合物或两者或其修饰物的单链、双链或部分双链寡聚体或多聚体，其具有与miRNA基本上相同的核苷酸序列并且相对于其靶标而言是反义的，该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)连接组成的寡核苷酸，并且其含有至少一个功能类似的非天然存在的部分。此类经修饰或经取代的寡核苷酸具有期望的特性，诸如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。在实施方案中，supermir不包含有义链，并且在另一个实施方案中，supermir不以显著的程度自杂交。supermir可具有二级结构，但其在生理条件下基本上是单链的。基本上为单链的supermir是单链的，其程度为小于约50％(例如，小于约40％、约30％、约20％、约10％或约5％)的supermir与其自身双链体化。supermir可包含发夹片段，例如序列，例如在3'端可自杂交并形成双链体区，例如至少约1、约2、约3或约4或小于约8、约7、约6或约5个核苷酸或约5个核苷酸的双链体区。双链体区可通过接头连接，例如核苷酸接头，例如约3、约4、约5或约6个dT，例如经修饰的dT。在另一个实施方案中，supermir与例如长度为约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸的较短寡核苷酸(例如在supermir的3'和5'端之一或两者处或者在一端和非末端或中间)双链体化。
miRNA模拟物
在实施方案中，AC是miRNA模拟物。miRNA模拟物代表一类可用于模拟一种或多种miRNA的基因沉默能力的分子。因此，术语“微小RNA模拟物”是指能够进入RNAi途径并调控基因表达的合成非编码RNA(即，miRNA不是通过从内源miRNA的来源纯化获得的)。miRNA模拟物可被设计为成熟分子(例如单链)或模拟前体(例如初级或前miRNA)。miRNA模拟物可包括核酸(经修饰或经修饰的核酸)，包括寡核苷酸，其包括但不限于RNA、经修饰的RNA、DNA、经修饰的DNA、锁核酸、或2'-0,4'-C-乙烯桥联核酸(ENA)、或上述的任何组合(包括DNA-RNA杂交体)。此外，miRNA模拟物可包括能够影响递送、细胞内区室化、稳定性、特异性、功能性、链使用和/或效力的缀合物。在一个设计中，miRNA模拟物是双链分子(例如，具有长度在约16与约31个核苷酸之间的双链体区)并且含有与给定miRNA的成熟链具有同一性的一个或多个序列。修饰可包括在分子的一条或两条链上的2'修饰(包括2'-0甲基修饰和2'F修饰)和增强核酸稳定性和/或特异性的核苷间修饰(例如硫代磷酸酯修饰)。此外，miRNA模拟物可包含突出端。突出端可在任一条链的3'或5'端包含约1至约6个核苷酸，并且可被修饰以增强稳定性或功能性。在实施方案中，miRNA模拟物包含约16至约31个核苷酸的双链体区和以下化学修饰模式中的一者或多者：有义链含有核苷酸1和2的2'-0-甲基修饰(从有义寡核苷酸的5'端计数)，以及所有C和U；反义链修饰可包括所有C和U的2'F修饰、寡核苷酸5'端的磷酸化、以及与2个核苷酸3'突出端相关的稳定化核苷间连接。
miRNA抑制剂
在实施方案中，AC是miRNA抑制剂。术语“antimir”、“微小RNA抑制剂”、“miR抑制剂”或“miRNA抑制剂”是同义的，并且是指干扰特定miRNA能力的寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸。通常，抑制剂本质上是核酸或经修饰的核酸，包括寡核苷酸，其包括RNA、经修饰的RNA、DNA、经修饰的DNA、锁定核酸(LNA)或上述的任何组合。
修饰包括可影响递送、稳定性、特异性、细胞内区室化或效力的2'修饰(包括2'-0烷基修饰和2'F修饰)和核苷间修饰(例如硫代磷酸酯修饰)。此外，miRNA抑制剂可包括能够影响递送、细胞内区室化、稳定性和/或效力的缀合物。抑制剂可采用多种构型，包括单链、双链(RNA/RNA或RNA/DNA双链体)和发夹设计，通常，微小RNA抑制剂包括与待靶向的miRNA的成熟链(或多条链)互补或部分互补的一个或多个序列或序列的部分，此外，miRNA抑制剂还可包括位于成熟miRNA的反向互补序列的5'和3'处的附加序列。附加序列可以是成熟miRNA所来源的初级miRNA中与成熟miRNA相邻的序列的反向互补序列，或者附加序列可以是任意序列(具有A、G、C或U的混合物)。在实施方案中，附加序列中的一者或两者是能够形成发夹的任意序列。因此，在实施方案中，作为miRNA的反向互补的序列在5'侧和3'侧侧接发夹结构。当是双链时，微小RNA抑制剂可包括相反链上的核苷酸之间的错配。此外，可将微小RNA抑制剂连接到缀合部分以促进抑制剂摄入细胞中。例如，微小RNA抑制剂可与5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3羟基戊基氨基甲酸胆固醇酯连接，这允许微小RNA抑制剂被动摄入细胞内。微小RNA抑制剂，包括发夹miRNA抑制剂，详细描述于Vermeulen等人，“Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitorsof RISC Function,”RNA 13:723-730(2007)以及WO2007/095387和WO 2008/036825中，其各自全文以引用方式并入本文。本领域普通技术人员可从数据库中选择期望miRNA的序列并设计可用于本文公开的方法的抑制剂。
CRISPR基因编辑机制
在实施方案中，治疗性部分包含CRISPR基因编辑机制的一个或多个元件。如本文所用，“CRISPR基因编辑机制”是指可用于编辑基因组的蛋白质、核酸或它们的组合。基因编辑机制的非限制性示例包括引导RNA(gRNA)、核酸酶、核酸酶抑制剂以及它们的组合和复合物。以下专利文献描述了CRISPR基因编辑机制：美国专利号8,697,359、美国专利号8,771,945、美国专利号8,795,965、美国专利号8,865,406、美国专利号8,871,445、美国专利号8,889,356、美国专利号8,895,308、美国专利号8,906,616、美国专利号8,932,814、美国专利号8,945,839、美国专利号8,993,233、美国专利号8,999,641、美国专利申请号14/704,551和美国专利申请号13/842,859。上述专利文献各自全文以引用方式并入。
gRNA
在实施方案中，TM包括gRNA。gRNA靶向原核或真核细胞中的基因组基因座。
在实施方案中，gRNA是单分子引导RNA(sgRNA)。sgRNA包括间隔序列和支架序列。间隔序列是用于将核酸酶(例如，Cas9核酸酶)靶向至感兴趣的特定核苷酸区域(例如，待切割的基因组DNA序列)的短核酸序列。在实施方案中，间隔区的长度可以是约17-24个碱基，诸如长度约20个碱基。在实施方案中，间隔区的长度可以是约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个碱基。在实施方案中，间隔区的长度可以是至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个碱基。在实施方案中，间隔区的长度可以是约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个碱基。在实施方案中，间隔序列具有在约40％至约80％之间的GC含量。
在实施方案中，间隔区结合紧邻5'原间隔区相邻基序(PAM)之前的靶核苷酸序列。可基于期望的核酸酶选择PAM序列。例如，PAM序列可以是下表13中所示的PAM序列中的任何一种，其中N是指任何核酸，R是指A或G，Y是指C或T，W是指A或T，并且V是指A或C或G。
表13.核酸酶和PAM序列
在实施方案中，间隔区结合靶基因诸如人基因的哺乳动物靶转录物的靶核苷酸序列。在实施方案中，间隔区可结合靶转录物的靶核苷酸序列。在实施方案中，间隔区可结合靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列包含靶转录物的剪接元件(SE)和/或剪接调控元件(SRE)的至少一部分，或者与靶转录物的SE和/或SRE足够接近以调节剪接。
支架序列是sgRNA内负责核酸酶(例如，Cas9)结合的序列。支架序列不包括间隔/靶向序列。在实施方案中，支架的长度可以是约1至约10、约10至约20、约20至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约60、约60至约70、约70至约80、约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120或约120至约130个核苷酸。在实施方案中，支架的长度可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60,about 60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约110、约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、约119、约120、约121、约122、约123、约124、或约125个核苷酸。在实施方案中，支架的长度可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120或至少125个核苷酸。
在实施方案中，gRNA是双分子引导RNA，例如crRNA和tracrRNA。在实施方案中，gRNA还可包含聚(A)尾。
在实施方案中，多种gRNA可以在单一化合物中用作TM。在实施方案中，TM包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个gRNA。在实施方案中，gRNA识别相同的靶标。在实施方案中，gRNA识别不同的靶标。在实施方案中，包含gRNA的核酸包含编码启动子的序列，其中启动子驱动gRNA的表达。
核酸酶
在实施方案中，TM包括核酸酶。在实施方案中，核酸酶是II型、V-A型、V-B型、VC型、V-U型、VI-B型核酸酶。在实施方案中，核酸酶是类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或锌指核酸酶。在实施方案中，核酸酶是Cas9、Cas12a(CF3)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b或Cas14核酸酶。例如，在实施方案中，核酸酶是Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。
在实施方案中，核酸酶是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b或Cas14核酸酶的修饰形式或变体。在实施方案中，核酸酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶的修饰形式或变体。“修饰的”或“变体”核酸酶是例如截短的、与另一种蛋白质(诸如另一种核酸酶)融合的、催化失活的等核酸酶。在实施方案中，核酸酶可与天然存在的Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas14核酸酶或TALEN、大范围核酸酶或锌指核酸酶具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性。在实施方案中，核酸酶是源自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶(SpCas9)。在实施方案中，核酸酶与源自化脓性链球菌的Cas9核酸酶(SpCas9)具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在实施方案中，核酸酶是源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cas9(SaCas9)。在实施方案中，核酸酶与源自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在实施方案中，Cpf1是来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)(物种BV3L6，UniProt登录号U2UMQ6)的Cpf1酶。在实施方案中，核酸酶与来自氨基酸球菌属(物种BV3L6，UniProt登录号U2UMQ6)的Cpf1酶具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
在实施方案中，Cpf1是来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)的Cpf1酶(物种ND2006，UniProt登录号A0A182DWE3)。在实施方案中，核酸酶与来自毛螺菌科的Cpf1酶具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在实施方案中，对编码核酸酶的序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在实施方案中，对编码核酸酶的序列进行密码子优化以在人细胞或小鼠细胞中表达。
在实施方案中，核酸酶是可溶性蛋白质。
在实施方案中，TM是编码核酸酶的核苷酸序列。在实施方案中，编码核酸酶的核酸包含编码启动子的序列，其中启动子驱动核酸酶的表达。
gRNA和核酸酶组合
在实施方案中，本公开的化合物包含gRNA和核酸酶或编码核酸酶的核苷酸序列作为TM。在实施方案中，编码核酸酶和gRNA的核酸包含编码启动子的序列，其中启动子驱动核酸酶和gRNA的表达。在实施方案中，编码核酸酶和gRNA的核酸包含两个启动子，其中第一启动子控制核酸酶的表达，并且第二启动子控制gRNA的表达。在实施方案中，编码gRNA和核酸酶的核酸编码约1至约20种gRNA，或约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18或约19以及至多约20种gRNA。在实施方案中，gRNA识别不同的靶标。在实施方案中，gRNA识别相同的靶标。
在实施方案中，本公开的化合物包含核糖核蛋白(RNP)，该核糖核蛋白包含gRNA和核酸酶作为TM。
在实施方案中，组合物被递送到细胞，该组合物包含：(a)第一化合物，该第一化合物包含gRNA TM，以及(b)第二化合物，该第二化合物是或包含核酸酶。在实施方案中，组合物被递送到细胞，该组合物包含：(a)第一化合物，该第一化合物包含作为TM的核酸酶、CPP，以及(b)第二分子，该第二分子是或包含gRNA。在实施方案中，组合物被递送到细胞，该组合物包含：(a)第一化合物，该第一化合物包含gRNA作为TM，以及(b)第二化合物，该第二化合物包含核酸酶作为TM。
感兴趣的遗传元件
在实施方案中，本文公开的化合物包含感兴趣的遗传元件作为TM。在实施方案中，感兴趣的遗传元件替换被核酸酶切割的基因组DNA序列。感兴趣的遗传元件的非限制性示例包括基因、单核苷酸多态性、启动子或终止子。
核酸酶抑制剂
在实施方案中，本文公开的化合物包含核酸酶抑制剂作为TM。基因编辑的限制是潜在的脱靶编辑。核酸酶抑制剂的递送将限制脱靶编辑。在实施方案中，核酸酶抑制剂是多肽、多核苷酸或小分子。核酸酶抑制剂描述于美国公开号2020/087354、国际公开号2018/085288、美国公开号2018/0382741、国际公开号2019/089761、国际公开号2020/068304、国际公开号2020/041384和国际公开号2019/076651中，其各自全文以引用方式并入本文。
内体逃逸载体(EEV)
内体逃逸载体(EEV)可用于转运货物穿过细胞膜，例如，将货物递送到细胞的胞质溶胶或细胞核。货物可包含TM。EEV可包含细胞穿透肽(CPP)，例如环状细胞穿透肽(cCPP)。在实施方案中，EEV包含与环外肽(EP)缀合的cCPP。EP可互换地称为调节肽(MP)。EP可包含核定位信号(NLS)的序列。EP可与货物偶联。EP可与cCPP偶联。EP可与货物和cCPP偶联。EP、货物、cCPP或它们的组合之间的偶联可以是非共价的或共价的。EP可通过肽键附接到cCPP的N-末端。EP可通过肽键附接到cCPP的C-末端。EP可通过cCPP中氨基酸的侧链附接到cCPP。EP可通过赖氨酸的侧链附接到cCPP，赖氨酸可与cCPP中的谷氨酰胺的侧链缀合。EP可与寡核苷酸货物的5'或3'端缀合。EP可与接头偶联。环外肽可与接头的氨基基团缀合。EP可经由EP和cCPP的C-末端通过cCPP和/或EP上的侧链与接头偶联。例如，EP可包含末端赖氨酸，其然后可通过酰胺键与含有谷氨酰胺的cCPP偶联。当EP含有末端赖氨酸并且赖氨酸的侧链可用于附接cCPP时，C-末端或N-末端可附接到货物上的接头。
环外肽
环外肽(EP)可包含2至10个氨基酸残基，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，包括其间的所有范围和值。EP可包含6至9个氨基酸残基。EP可包含4至8个氨基酸残基。
环外肽中的每个氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指一种有机化合物，它是天然氨基酸的同属种，因为它具有与天然氨基酸类似的结构，从而模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其不是20种常见天然存在的氨基酸或稀有天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适的氨基酸的示例包括但不限于丙氨酸、别亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、萘基丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、它们的衍生物或它们的组合。这些和其他氨基酸连同它们在本文中使用的缩写列于表1中。例如，氨基酸可以是A、G、P、K、R、V、F、H、Nal或瓜氨酸。
EP可包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个包含含有胍基或其质子化形式的侧链的胺酸残基。EP可包含1或2个氨基酸残基，其包含含有胍基或其质子化形式的侧链。包含含有胍基的侧链的氨基酸残基可以是精氨酸残基。质子化形式在整个公开内容中可指其盐。
EP可包含至少两个、至少三个或至少四个或更多个赖氨酸残基。EP可包含2、3或4个赖氨酸残基。每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团可被保护基团取代，该保护基团包括例如三氟乙酰基(-COCF3)、烯丙氧基羰基(Alloc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)或(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基-3)-甲基丁基(ivDde)。每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团可被三氟乙酰基(-COCF3)取代。可包括保护基团以实现酰胺缀合。可在EP与cCPP缀合后去除保护基团。
EP可包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸残基。具有疏水侧链的氨基酸残基可选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。具有疏水侧链的氨基酸残基可以是缬氨酸或脯氨酸。
EP可包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个精氨酸残基。EP可包含至少两个、至少三个或至少四个或更多个赖氨酸残基和/或精氨酸残基。
EP可包含KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH(SEQ ID NO:1)、KHKK(SEQ ID NO:2)、KKHK(SEQ ID NO:3)、KKKH(SEQ ID NO:4)、KHKH(SEQ ID NO:5)、HKHK(SEQ ID NO:6)、KKKK(SEQ ID NO:7)、KKRK(SEQ ID NO:8)、KRKK(SEQ ID NO:9)、KRRK(SEQ ID NO:10)、RKKR(SEQ ID NO:11)、RRRR(SEQ ID NO:12)、KGKK(SEQ ID NO:13)、KKGK(SEQ ID NO:14)、HBHBH(SEQ ID NO:15)、HBKBH(SEQ ID NO:16)、RRRRR(SEQ ID NO:17)、KKKKK(SEQ ID NO:18)、KKKRK(SEQ ID NO:19)、RKKKK(SEQ ID NO:20)、KRKKK(SEQ ID NO:21)、KKRKK(SEQ ID NO:22)、KKKKR(SEQ IDNO:23)、KBKBK(SEQ ID NO:24)、RKKKKG(SEQ ID NO:25)、KRKKKG(SEQ ID NO:26)、KKRKKG(SEQ ID NO:27)、KKKKRG(SEQ ID NO:28)、RKKKKB(SEQ ID NO:29)、KRKKKB(SEQ ID NO:30)、KKRKKB(SEQ ID NO:31)、KKKKRB(SEQ ID NO:32)、KKKRKV(SEQ ID NO:33)、RRRRRR(SEQID NO:34)、HHHHHH(SEQ ID NO:35)、RHRHRH(SEQ ID NO:36)、HRHRHR(SEQ ID NO:37)、KRKRKR(SEQ ID NO:38)、RKRKRK(SEQ ID NO:39)、RBRBRB(SEQ ID NO:40)、KBKBKB(SEQ IDNO:41)、PKKKRKV(SEQ ID NO:42)、PGKKRKV(SEQ ID NO:43)、PKGKRKV(SEQ ID NO:44)、PKKGRKV(SEQ ID NO:45)、PKKKGKV(SEQ ID NO:46)、PKKKRGV(SEQ ID NO:47)或PKKKRKG(SEQ ID NO:48)，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。
EP可包含KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK(SEQ ID NO:7)、KKRK(SEQ ID NO:8)、KRKK(SEQ ID NO:9)、KRRK(SEQ ID NO:10)、RKKR(SEQ ID NO:11)、RRRR(SEQ ID NO:12)、KGKK(SEQ ID NO:13)、KKGK(SEQ ID NO:14)、KKKKK(SEQ ID NO:18)、KKKRK(SEQ ID NO:19)、KBKBK(SEQ ID NO:24)、KKKRKV(SEQ ID NO:33)、PKKKRKV(SEQ IDNO:42)、PGKKRKV(SEQ ID NO:43)、PKGKRKV(SEQ ID NO:44)、PKKGRKV(SEQ ID NO:45)、PKKKGKV(SEQ ID NO:46)、PKKKRGV(SEQ ID NO:47)或PKKKRKG(SEQ ID NO:48)。EP可包含PKKKRKV(SEQ ID NO:42)、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR(SEQ ID NO:49)、RBHBR(SEQ ID NO:50)或HBRBH(SEQ ID NO:51)，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。
EP可由KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK(SEQ ID NO:7)、KKRK(SEQ ID NO:8)、KRKK(SEQ ID NO:9)、KRRK(SEQ ID NO:10)、RKKR(SEQ ID NO:11)、RRRR(SEQ ID NO:12)、KGKK(SEQ ID NO:13)、KKGK(SEQ ID NO:14)、KKKKK(SEQ ID NO:18)、KKKRK(SEQ ID NO:19)、KBKBK(SEQ ID NO:24)、KKKRKV(SEQ ID NO:33)、PKKKRKV(SEQ IDNO:42)、PGKKRKV(SEQ ID NO:Z43)、PKGKRKV(SEQ ID NO:Z44)、PKKGRKV(SEQ ID NO:Z45)、PKKKGKV(SEQ ID NO:46)、PKKKRGV(SEQ ID NO:47)或PKKKRKG(SEQ ID NO:48)组成。EP可由PKKKRKV(SEQ ID NO:42)、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR(SEQ ID NO:49)、RBHBR(SEQ ID NO:50)或HBRBH(SEQ ID NO:51)组成，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。
EP可包含本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列。EP可由本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列组成。EP可包含NLS，该NLS包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQID NO:42)。EP可由NLS组成，该NLS包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:42)。EP可包含NLS，该NLS包含选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:52)、PAAKRVKLD(SEQ ID NO:53)、RQRRNELKRSF(SEQ ID NO:54)、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR(SEQ ID NO:Z55)、KAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:56)、VSRKRPRP(SEQ ID NO:57)、PPKKARED(SEQ ID NO:58)、PQPKKKPL(SEQ ID NO:59)、SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:60)、DRLRR(SEQ ID NO:61)、PKQKKRK(SEQ ID NO:62)、RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:63)、REKKKFLKRR(SEQ ID NO:64)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:65)和RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。EP可由NLS组成，该NLS包含选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:52)、PAAKRVKLD(SEQID NO:53)、RQRRNELKRSF(SEQ ID NO:54)、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR(SEQ ID NO:55)、KAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:56)、VSRKRPRP(SEQ ID NO:57)、PPKKARED(SEQ ID NO:58)、PQPKKKPL(SEQ ID NO:59)、SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:60)、DRLRR(SEQ ID NO:61)、PKQKKRK(SEQ ID NO:62)、RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:63)、REKKKFLKRR(SEQ ID NO:64)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:65)和RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。
所有环外序列还可含有N-末端乙酰基基团。因此，例如，EP可具有以下结构：Ac-PKKKRKV(SEQ ID NO:42)。
细胞穿透肽(CPP)
细胞穿透肽(CPP)可包含6至20个氨基酸残基。细胞穿透肽可以是环状细胞穿透肽(cCPP)。cCPP能够穿透细胞膜。环外肽(EP)可与cCPP缀合，并且所得构建体可称为内体逃逸载体(EEV)。cCPP可引导货物(例如，治疗性部分(TM)，诸如寡核苷酸、肽或小分子)穿透细胞膜。cCPP可将货物递送至细胞的胞质溶胶。cCPP可将货物递送至靶(例如，前mRNA)所在的细胞位置。为了将cCPP与货物(例如，肽、寡核苷酸或小分子)缀合，可替换cCPP上的至少一个键或孤对电子。
cCPP中氨基酸残基的总数在6至20个氨基酸残基的范围内，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基，包括其间的所有范围和子范围。cCPP可包含6至13个氨基酸残基。本文公开的cCPP可包含6至10个氨基酸。以举例的方式，包含6-10个氨基酸残基的cCPP可具有根据式I-A至I-E中任一种的结构：
其中AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、AA9和AA10是氨基酸残基。
cCPP可包含6至8个氨基酸。cCPP可包含8个氨基酸。
cCPP中的每个氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指一种有机化合物，它是天然氨基酸的同属种，因为它具有与天然氨基酸类似的结构，从而模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其不是20种常见天然存在的氨基酸或稀有天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适的氨基酸的示例包括但不限于丙氨酸、别亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、萘基丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、它们的衍生物或它们的组合。这些和其他氨基酸连同它们在本文中使用的缩写列于表1中。
表1.氨基酸缩写
如本文所用，“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用。“PEGm”和“PEGm”是或衍生自式HO(CO)-(CH2)n-(OCH2CH2)m-NH2的分子，其中n是1至5的任何整数，并且m是1至23的任何整数。在实施方案中，n是1或2。在实施方案中，n是1。在实施方案中，n是2。在实施方案中，n是1，并且m是2。在实施方案中，n是2，并且m是2。在实施方案中，n是1，并且m是4。在实施方案中，n是2，并且m是4。在实施方案中，n是1，并且m是12。在实施方案中，n是2，并且m是12。
如本文所用，“miniPEGm”或“miniPEGm”是或衍生自式HO(CO)-(CH2)n-(OCH2CH2)m-NH2的分子，其中n是1，并且m是1至23的任何整数。例如，“miniPEG2”或“miniPEG2”是或衍生自(2-[2-[2-氨基乙氧基]乙氧基]乙酸)，并且“miniPEG4”或“miniPEG4”是或衍生自HO(CO)-(CH2)n-(OCH2CH2)m-NH2，其中n是1，并且m是4。
cCPP可包含4至20个氨基酸，其中：(i)至少一个氨基酸具有包含胍基或其质子化形式的侧链；(ii)至少一个氨基酸不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链；并且(iii)至少两个氨基酸独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链。
至少两个氨基酸可不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链。如本文所用，当不存在侧链时，氨基酸在连接胺和羧酸的碳原子上具有两个氢原子(例如，-CH2-)。
不具有侧链的氨基酸可以是甘氨酸或β-丙氨酸。
cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少一个氨基酸可以是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳基或杂芳基基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。
cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少两个氨基酸可独立地是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳基或杂芳基基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。
cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少三个氨基酸可独立地是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳族或杂芳族基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸可具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。
甘氨酸和相关的氨基酸残基
cCPP可包含(i)1、2、3、4、5或6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)2个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。
cCPP可包含(i)1、2、3、4、5或6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)2个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)2或3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)1或2个甘氨酸残基。
cCPP可包含(i)3、4、5或6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。
cCPP可包含至少三个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4、5或6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸残基
在实施方案中，cCPP中的甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基都不是邻接的。两个或三个甘氨酸、β-丙氨酸、或4-氨基丁酸残基可以是邻接的。两个甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基可以是邻接的。
在实施方案中，cCPP中没有一个甘氨酸残基是邻接的。cCPP中的每个甘氨酸残基可被不能是甘氨酸的氨基酸残基分开。两个或三个甘氨酸残基可以是邻接的。两个甘氨酸残基可以是邻接的。
具有芳族或杂芳族基团的氨基酸侧链
cCPP可包含(ii)2、3、4、5或6个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)3个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)4个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)5个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)6个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2、3或4个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2或3个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。
cCPP可包含(ii)2、3、4、5或6个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)3个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)4个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)5个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)6个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2、3或4个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2或3个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。
芳族基团可以是6至14元芳基。芳基可以是苯基、萘基或蒽基，它们各自任选地被取代。芳基可以是苯基或萘基，它们各自任选地被取代。杂芳族基团可以是具有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是双(高萘基丙氨酸)、高萘基丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、双(高苯丙氨酸)、高苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、3-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、3-(2-喹啉基)-丙氨酸、O-苄基丝氨酸、3-(4-(苄氧基)苯基)-丙氨酸、S-(4-甲基苄基)半胱氨酸、N-(萘-2-基)谷氨酰胺、3-(1,1'-联苯-4-基)-丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸或酪氨酸，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可各自独立地选自：
其中N-末端的H和/或C-末端的H被肽键替换。
具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、高萘基丙氨酸、双(高苯丙氨酸)、双-(高萘基丙氨酸)、色氨酸或酪氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的残基。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸或高萘基丙氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、高苯丙氨酸、高萘基丙氨酸、双(高萘基丙氨酸)或双(高萘基丙氨酸)的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸或萘基丙氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。至少一个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。至少两个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。每个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。
在实施方案中，具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸没有一个是邻接的。两个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可以是邻接的。两个邻接的氨基酸可有相反的立体化学。两个邻接的氨基酸可具有相同的立体化学。三个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可以是邻接的。三个邻接的氨基酸可具有相同的立体化学。三个邻接的氨基酸可具有交替的立体化学。
包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是L-氨基酸。包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是D-氨基酸。包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。
任选的取代基可以是任何不显著降低(例如超过50％)cCPP的胞质递送效率的原子或基团，例如与不具有该取代基的其他相同序列相比。任选的取代基可以是疏水取代基或亲水取代基。任选的取代基可以是疏水取代基。取代基可增加疏水氨基酸的溶剂可及表面积(如本文所定义)。取代基可以是卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰基、烷基氨基甲酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、烷硫基或芳硫基。取代基可以是卤素。
尽管不希望受理论束缚，但据信相对于具有较低疏水性值的氨基酸，具有较高疏水性值的芳族或杂芳族基团的氨基酸(即具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸)可改善cCPP的胞质递送效率。每个疏水氨基酸可独立地具有大于甘氨酸的疏水性值。每个疏水氨基酸可独立地是疏水性值大于丙氨酸的疏水氨基酸。每个疏水氨基酸可独立地具有大于或等于苯丙氨酸的疏水性值。疏水性可使用本领域已知的疏水性标度来测量。表2列出了各种氨基酸的疏水性值，如Eisenberg和Weiss(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984；81(1):140-144)、Engleman等人(Ann.Rev.of Biophys.Biophys.Chem.1986；1986(15):321-53)、Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.1982；157(1):105-132)、Hoop和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981；78(6):3824-3828)以及Janin(Nature.1979；277(5696):491-492)所报道，所述文献各自的全部内容以引用方式并入本文。疏水性可使用Engleman等人报道的疏水性标度来测量。
表2.氨基酸疏水性
可选择芳族或杂芳族基团的大小以改善cCPP的胞质递送效率。尽管不希望受理论束缚，但据信与具有较小疏水氨基酸的其他相同序列相比，氨基酸侧链上的较大芳族或杂芳族基团可改善胞质递送效率。疏水氨基酸的大小可根据疏水氨基酸的分子量、疏水氨基酸的位阻效应、侧链的溶剂可及表面积(SASA)或它们的组合来测量。疏水氨基酸的大小可根据疏水氨基酸的分子量来测量，并且较大的疏水氨基酸具有分子量为至少约90g/mol、或至少约130g/mol、或至少约141g/mol的侧链。氨基酸的大小可根据疏水侧链的SASA来测量。疏水氨基酸可具有SASA大于或等于丙氨酸、或大于或等于甘氨酸的侧链。较大的疏水氨基酸可具有SASA大于丙氨酸或大于甘氨酸的侧链。疏水氨基酸可具有SASA大于或等于约哌啶-2-羧酸、大于或等于约色氨酸、大于或等于约苯丙氨酸、或大于或等于约萘基丙氨酸的芳族或杂芳族基团。第一疏水氨基酸(AAH1)可具有SASA为至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约或至少约的侧链。第二疏水氨基酸(AAH2)可具有SASA为至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约或至少约的侧链。AAH1和AAH2的侧链可具有至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约大于约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约至少约大于约至少约至少约至少约至少约或至少约的组合SASA。AAH2可以是疏水氨基酸残基，其侧链的SASA小于或等于AAH1的疏水侧链的SASA。以举例的方式而非限制，与具有Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，具有Nal-Arg基序的cCPP可表现出改善的胞质递送效率；与具有Nal-Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，具有Phe-Nal-Arg基序的cCPP可表现出改善的胞质递送效率；并且与具有nal-Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，phe-Nal-Arg基序可表现出改善的胞质递送效率。
如本文所用，“疏水表面积”或“SASA”是指氨基酸侧链的可被溶剂可及的表面积(报告为平方埃；)。SASA可使用由Shrake&Rupley(JMol Biol.79(2):351-71)开发的“滚球”算法来计算，其全文以引用方式并入本文用于所有目的。这种算法使用特定半径的溶剂“球体”来探测分子表面。球体的典型值是其近似于水分子的半径。
某些侧链的SASA值示于下表3中。本文所述的SASA值基于下表3中列出的理论值，如Tien等人(PLOS ONE 8(11):e80635，可得自doi.org/10.1371/journal.pone.0080635)所报道，其全文以引用方式并入本文用于所有目的。
表3.氨基酸SASA值
残基 理论值 经验值 Miller等人(1987) Rose等人(1985)
丙氨酸 129.0 121.0 113.0 118.1
精氨酸 274.0 265.0 241.0 256.0
天冬酰胺 195.0 187.0 158.0 165.5
天冬氨酸盐 193.0 187.0 151.0 158.7
半胱氨酸 167.0 148.0 140.0 146.1
谷氨酸盐 223.0 214.0 183.0 186.2
谷氨酰胺 225.0 214.0 189.0 193.2
甘氨酸 104.0 97.0 85.0 88.1
组氨酸 224.0 216.0 194.0 202.5
异亮氨酸 197.0 195.0 182.0 181.0
亮氨酸 201.0 191.0 180.0 193.1
赖氨酸 236.0 230.0 211.0 225.8
甲硫氨酸 224.0 203.0 204.0 203.4
苯丙氨酸 240.0 228.0 218.0 222.8
脯氨酸 159.0 154.0 143.0 146.8
丝氨酸 155.0 143.0 122.0 129.8
苏氨酸 172.0 163.0 146.0 152.5
色氨酸 285.0 264.0 259.0 266.3
酪氨酸 263.0 255.0 229.0 236.8
缬氨酸 174.0 165.0 160.0 164.5
具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基
如本文所用，胍是指以下结构：
如本文所用，质子化形式的胍是指以下结构：
胍置换基团是指氨基酸侧链上的官能团，其在生理pH或高于生理pH时将带正电荷，或者可再现胍基团的氢键给予和接受活性。
胍置换基团促进细胞渗透和治疗剂的递送，同时降低与胍基或其质子化形式相关的毒性。cCPP可包含至少一个具有包含胍或胍置换基团的侧链的氨基酸。cCPP可包含至少两个具有包含胍或胍置换基团的侧链的氨基酸。cCPP可包含至少三个具有包含胍或胍置换基团的侧链的氨基酸
胍或胍基团可以是胍或胍的等排体。胍或胍置换基团的碱性可低于胍。
如本文所用，胍置换基团是指 或其质子化形式。
本公开涉及包含4至20个氨基酸残基的cCPP，其中：(i)至少一个氨基酸具有包含胍基或其质子化形式的侧链；(ii)至少一个氨基酸残基不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链；并且(iii)至少两个氨基酸残基独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链。
至少两个氨基酸残基可不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链。如本文所用，当不存在侧链时，氨基酸残基在连接胺和羧酸的碳原子上具有两个氢原子(例如，-CH2-)。
cCPP可包含至少一个具有包含以下部分之一的侧链的氨基酸：
或其质子化形式。
cCPP可包含至少两个氨基酸，每个氨基酸独立地具有以下部分之一：
或其质子化形式。至少两个氨基酸可具有包含选自以下的相同部分的侧链： 或其质子化形式。至少一个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。至少两个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。一个、两个、三个或四个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。一个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。两个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。 或其质子化形式可附接到氨基酸侧链的末端。可附接到氨基酸侧链的末端。
cCPP可包含(iii)2、3、4、5或6个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)3个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)4个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)5个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)6个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2、3、4或5个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2、3或4个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2或3个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)至少一个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)两个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)三个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。
氨基酸残基可独立地具有包含不邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。两个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。三个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。四个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。邻接的氨基酸残基可具有相同的立体化学。邻接的氨基酸可具有交替的立体化学。
独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是L-氨基酸。独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是D-氨基酸。独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是L-氨基酸或D-氨基酸的混合物。
每个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可独立地是精氨酸、高精氨酸、2-氨基-3-丙酸、2-氨基-4-胍基丁酸或其质子化形式的残基。每个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可独立地是精氨酸残基或其质子化形式。
每个具有包含胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸可独立地是
或其质子化形式。
不受理论的束缚，假设胍置换基团相对于精氨酸具有降低的碱度，并且在一些情况下在生理pH下不带电荷(例如，-N(H)C(O))，并且能够维持与质膜上的磷脂的二齿氢键相互作用，这被认为促进有效的膜结合和随后的内化。正电荷的去除也被认为降低了cCPP的毒性。
本领域技术人员将理解，上述非天然芳族疏水氨基酸的N-末端/或C-末端在掺入本文公开的肽中后形成酰胺键。
cCPP可包含具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第一氨基酸和具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第二氨基酸，其中第一甘氨酸的N-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第一氨基酸形成肽键，并且第一甘氨酸的C-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第二氨基酸形成肽键。尽管按照惯例，术语“第一氨基酸”通常是指肽序列的N-末端氨基酸，但如本文所用，“第一氨基酸”用于将所指氨基酸与cCPP中的另一氨基酸(例如，“第二个氨基酸”)区分开，使得术语“第一氨基酸”可以是或可指位于肽序列的N-末端的氨基酸。
cCPP可包含：第二甘氨酸的N-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸形成肽键，并且第二甘氨酸的C-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸形成肽键。
cCPP可包含具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第一氨基酸，和具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第二氨基酸，其中第三甘氨酸的N-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第一氨基酸形成肽键，并且第三甘氨酸的C-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第二氨基酸形成肽键。
cCPP可包含天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或高谷氨酰胺的残基。cCPP可包含天冬酰胺的残基。cCPP可包含谷氨酰胺的残基。
cCPP可包含酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的残基。
尽管不希望受理论束缚，但据信cCPP中氨基酸的手性可影响胞质摄取效率。cCPP可包含至少一个D氨基酸。cCPP可包含一至十五个D氨基酸。cCPP可包含一至十个D氨基酸。cCPP可包含1、2、3或4个D氨基酸。cCPP可包含具有交替的D和L手性的2、3、4、5、6、7或8个邻接的氨基酸。cCPP可包含具有相同手性的三个邻接的氨基酸。cCPP可包含具有相同手性的两个邻接的氨基酸。至少两个氨基酸可具有相反的手性。具有相反手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少三个氨基酸可具有相对于彼此交替的立体化学。相对于彼此具有交替手性的至少三个氨基酸可彼此相邻。至少四个氨基酸具有相对于彼此交替的立体化学。相对于彼此具有交替手性的至少四个氨基酸可彼此相邻。至少两个氨基酸可具有相同的手性。具有相同手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少两个氨基酸具有相同的手性并且至少两个氨基酸具有相反的手性。具有相反手性的至少两个氨基酸可与具有相同手性的至少两个氨基酸相邻。因此，cCPP中的相邻氨基酸可具有以下序列中的任一种：D-L；L-D；D-L-L-D；L-D-D-L；L-D-L-L-D；D-L-D-D-L；D-L-L-D-L；或L-D-D-L-D。形成cCPP的氨基酸残基都可以是L-氨基酸。形成cCPP的氨基酸残基都可以是D-氨基酸。
至少两个氨基酸可具有不同的手性。具有不同手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少三个氨基酸相对于相邻氨基酸可具有不同的手性。至少四个氨基酸相对于相邻氨基酸可具有不同的手性。至少两个氨基酸具有相同的手性并且至少两个氨基酸具有不同的手性。形成cCPP的一个或多个氨基酸残基可以是非手性的。cCPP可包含3、4或5个氨基酸的基序，其中具有相同手性的两个氨基酸可被非手性氨基酸分开。cCPP可包含下列序列：D-X-D；D-X-D-X；D-X-D-X-D；L-X-L；L-X-L-X；或L-X-L-X-L，其中X是非手性氨基酸。非手性氨基酸可以是甘氨酸。
具有包含以下的侧链的氨基酸：
或其质子化形式，可与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸相邻。具有包含以下的侧链的氨基酸： 或其质子化形式，可与至少一个具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸相邻。具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸可与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸相邻。两个具有包含以下的侧链的氨基酸可彼此相邻： 或其质子化形式。两个具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸彼此相邻。cCPP可包含至少两个具有可包含芳族或杂芳族基团的侧链的邻接氨基酸，和至少两个具有包含以下的侧链的不相邻氨基酸： 或其质子化形式。cCPP可包含至少两个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的邻接氨基酸和至少两个具有包含或其质子化形式的侧链的不相邻氨基酸。相邻氨基酸可具有相同的手性。相邻氨基酸可具有相反的手性。氨基酸的其他组合可具有D和L氨基酸的任何排列，例如，在前述段落中描述的任何序列。
至少两个具有包含以下的侧链的氨基酸：
或其质子化形式，与至少两个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸交替。
cCPP可具有式(A)的结构：
或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R1、R2和R3中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R4、R5、R6、R7独立地是H或氨基酸侧链；
R4、R5、R6、R7中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N,N-二甲基精氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；
AASC是氨基酸侧链；并且
q是1、2、3或4。
在实施方案中，式(A)的环肽不是FfΦRrRrQ(SEQ ID NO:67)。在实施方案中，式(A)的环肽是FfΦRrRrQ(SEQ ID NO:67)。
cCPP可具有式(I)的结构：
或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3可各自独立地是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基；
R1、R2和R3中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R4和R7独立地是H或氨基酸侧链；
AASC是氨基酸侧链；
q是1、2、3或4；并且
每个m独立地是0、1、2或3的整数。
R1、R2和R3可各自独立地是H、-亚烷基-芳基或-亚烷基-杂芳基。R1、R2和R3可各自独立地是H、-C1-3亚烷基-芳基或-C1-3亚烷基-杂芳基。R1、R2和R3可各自独立地是H或-亚烷基-芳基。R1、R2和R3可各自独立地是H或-C1-3亚烷基-芳基。C1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R1、R2和R3可各自独立地是H、-C1-3亚烷基-Ph或-C1-3亚烷基-萘基。R1、R2和R3可各自独立地是H、-CH2Ph或-CH2萘基。R1、R2和R3可各自独立地是H或-CH2Ph。
R1、R2和R3可各自独立地是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。
R1可以是酪氨酸的侧链。R1可以是苯丙氨酸的侧链。R1可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R1可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R1可以是色氨酸的侧链。R1可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R1可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R1可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R1可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R1可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R1可以是高苯丙氨酸的侧链。R1可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R1可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R1可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R1可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R1可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R1可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R1可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R1可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。
R2可以是酪氨酸的侧链。R2可以是苯丙氨酸的侧链。R2可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R1可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R2可以是色氨酸的侧链。R2可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R2可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R2可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R2可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R2可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R2可以是高苯丙氨酸的侧链。R2可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R2可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R2可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R2可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R2可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R2可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R2可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R2可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。
R3可以是酪氨酸的侧链。R3可以是苯丙氨酸的侧链。R3可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R3可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R3可以是色氨酸的侧链。R3可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R3可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R3可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R3可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R3可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R3可以是高苯丙氨酸的侧链。R3可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R3可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R3可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R3可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R3可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R3可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R3可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R3可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。
R4可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R4可以是H、-C1-3亚烷基-芳基或-C1-3亚烷基-杂芳基。R4可以是H或-亚烷基-芳基。R4可以是H或-C1-3亚烷基-芳基。C1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R4可以是H、-C1-3亚烷基-Ph或-C1-3亚烷基-萘基。R4可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R4可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R4可以是H、-CH2Ph或-CH2萘基。R4可以是H或-CH2Ph。
R5可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R5可以是H、-C1-3亚烷基-芳基或-C1-3亚烷基-杂芳基。R5可以是H或-亚烷基-芳基。R5可以是H或-C1-3亚烷基-芳基。C1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R5可以是H、-C1-3亚烷基-Ph或-C1-3亚烷基-萘基。R5可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R4可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R5可以是H、-CH2Ph或-CH2萘基。R4可以是H或-CH2Ph。
R6可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R6可以是H、-C1-3亚烷基-芳基或-C1-3亚烷基-杂芳基。R6可以是H或-亚烷基-芳基。R6可以是H或-C1-3亚烷基-芳基。C1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R6可以是H、-C1-3亚烷基-Ph或-C1-3亚烷基-萘基。R6可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R6可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R6可以是H、-CH2Ph或-CH2萘基。R6可以是H或-CH2Ph。
R7可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R7可以是H、-C1-3亚烷基-芳基或-C1-3亚烷基-杂芳基。R7可以是H或-亚烷基-芳基。R7可以是H或-C1-3亚烷基-芳基。C1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R7可以是H、-C1-3亚烷基-Ph或-C1-3亚烷基-萘基。R7可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R7可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R7可以是H、-CH2Ph或-CH2萘基。R7可以是H或-CH2Ph。
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的一者、两者或三者可以是-CH2Ph。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的一者可以是-CH2Ph。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的两者可以是-CH2Ph。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的三者可以是-CH2Ph。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是-CH2Ph。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中不超过四者可以是-CH2Ph。
R1、R2、R3和R4中的一者、两者或三者是-CH2Ph。R1、R2、R3和R4中的一者是-CH2Ph。R1、R2、R3和R4中的两者是-CH2Ph。R1、R2、R3和R4中的三者是-CH2Ph。R1、R2、R3和R4中的至少一者是-CH2Ph。
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的一者、两者或三者可以是H。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的一者可以是H。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的两者是H。R1、R2、R3、R5、R6和R7中的三者可以是H。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是H。R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中不超过三者可以是-CH2Ph。
R1、R2、R3和R4中的一者、两者或三者是H。R1、R2、R3和R4中的一者是H。R1、R2、R3和R4中的两者是H。R1、R2、R3和R4中的三者是H。R1、R2、R3和R4中的至少一者是H。
R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是瓜氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少一者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。
R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是瓜氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少两者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。
R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是瓜氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R4、R5、R6和R7中的至少三者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。
AASC可以是天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺残基的侧链。AASC可以是谷氨酰胺残基的侧链。cCPP还可包含与AASC(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺的残基)缀合的接头。因此，cCPP还可包含与天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺残基缀合的接头。cCPP还可包含与谷氨酰胺残基缀合的接头。
q可以是1、2或3。q可以是1或2。q可以是1。q可以是2。q可以是3。q可以是4。
m可以是1-3。m可以是1或2。m可以是0，m可以是1。m可以是2。m可以是3。
式(A)的cCPP可具有式(I)的结构：
或其质子化形式，其中AASC、R2、R3、R4、R7、m和q如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-a)或式(I-b)的结构：
或其质子化形式，其中AASC、R1、R2、R3、R4和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-1)、(I-2)、(I-3)或(I-4)的结构：
或其质子化形式，其中AASC和m如本文所定义。式(A)的cCPP可具有式(I-5)或(I-6)的结构：
或其质子化形式，其中AASC如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-1)的结构：
或其质子化形式，
其中AASC和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-2)的结构：
或其质子化形式，其中AASC和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-3)的结构：
或其质子化形式，其中AASC和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-4)的结构：
或其质子化形式，其中AASC和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-5)的结构：
或其质子化形式，
其中AASC和m如本文所定义。
式(A)的cCPP可具有式(I-6)的结构：
或其质子化形式，其中AASC和m如本文所定义。
cCPP可包含以下序列之一：FGFGRGR(SEQ ID NO:68)；GfFGrGr(SEQ ID NO:69)、FfΦGRGR(SEQ ID NO:70)；FfFGRGR(SEQ ID NO:71)；或FfΦGrGr(SEQ ID NO:72)。cCPP可具有以下序列之一：FGFΦ(SEQ ID NO:73)；GfFGrGrQ(SEQ ID NO:74)、FfΦGRGRQ(SEQ IDNO:75)；FfFGRGRQ(SEQ ID NO:76)；或FfΦGrGrQ(SEQ ID NO:77)。
本公开还涉及具有式(II)的结构的cCPP：
其中：
AASC是氨基酸侧链；
R1a、R1b和R1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d独立地是氨基酸侧链；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是 或其质子化形式；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是胍或其质子化形式；
每个n”独立地是整数0、1、2、3、4或5；
每个n'独立地是0、1、2或3的整数；并且
如果n'是0，则R2a、R2b、R2b或R2d不存在。
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少两者可以是 或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的两者或三者可以是 或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的一者可以是 或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者可以是或其质子化形式，并且R2a、R2b、R2c和R2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的至少两者可以是或其质子化形式，并且R2a、R2b、R2c和R2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。
所有R2a、R2b、R2c和R2d可以是 或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者可以是或其质子化形式，并且R2a、R2b、R2c和R2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。R2a、R2b、R2c和R2d中的至少两者可以是或其质子化形式，并且R2a、R2b、R2c和R2d的其余部分是胍或其质子化形式。
R2a、R2b、R2c和R2d中的每一者可独立地是2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、鸟氨酸、赖氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、高赖氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、2-氨基丁酸、天冬氨酸、谷氨酸或高谷氨酸的侧链。
AASC可以是其中t可以是0至5的整数。AASC可以是其中t可以是0至5的整数。t可以是1至5。t是2或3。t可以是2。t可以是3。
R1a、R1b和R1c可各自独立地是6至14元芳基。R1a、R1b和R1c可各自独立地是具有一个或多个选自N、O或S的杂原子的6至14元杂芳基。R1a、R1b和R1c可各自独立地选自苯基、萘基、蒽基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。R1a、R1b和R1c可各自独立地选自苯基、萘基或蒽基。R1a、R1b和R1c可各自独立地是苯基或萘基。R1a、R1b和R1c可各自独立地选自吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
每个n'可独立地是1或2。每个n'可以是1。每个n'可以是2。至少一个n'可以是0。至少一个n'可以是1。至少一个n'可以是2。至少一个n'可以是3。至少一个n'可以是4。至少一个n'可以是5。
每个n"可独立地是1至3的整数。每个n"可独立地是2或3。每个n"可以是2。每个n"可以是3。至少一个n"可以是0。至少一个n"可以是1。至少一个n"可以是2。至少一个n"可以是3。
每个n"可独立地是1或2，并且每个n'可独立地是2或3。每个n"可以是1并且每个n'可独立地是2或3。每个n"可以是1并且每个n'可以是2。每个n"是1并且每个n'是3。
式(II)的cCPP可具有式(II-1)的结构：
其中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R2c、R2d、AASC、n'和n”如本文所定义。
式(II)的cCPP可具有式(IIa)的结构：
其中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R2c、R2d、AASC-和n'如本文所定义。
式(II)的cCPP可具有式(IIb)的结构：
其中R2a、R2b、AASC-和n'如本文所定义。
cCPP可具有式(IIc)的结构：
或其质子化形式，其中：
AASC和n'如本文所定义。
式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：
其中AASC和n如本文所定义。式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：
其中AASC和n如本文所定义式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：
其中AASC和n如本文所定义。式(II)的cCPP可具有以下结构：
式(II)的cCPP可具有以下结构：
cCPP可具有式(III)的结构：
其中：
AASC是氨基酸侧链；
R1a、R1b和R1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；
R2a和R2c各自独立地是H、 或其质子化形式；
R2b和R2d各自独立地是胍或其质子化形式；
每个n"独立地是1至3的整数；
每个n'独立地是1至5的整数；并且
每个p'独立地是0至5的整数。
式(III)的cCPP可具有式(III-1)的结构：
其中：
AASC、R1a、R1b、R1c、R2a、R2c、R2b、R2d、n'、n"和p'如本文所定义。
式(III)的cCPP可具有式(IIIa)的结构：
其中：
AASC、R2a、R2c、R2b、R2d、n'、n"和p'如本文所定义。
在式(III)、(III-1)和(IIIa)中，Ra和Rc可以是H。Ra和Rc可以是H并且Rb和Rd可各自独立地是胍或其质子化形式。Ra可以是H。Rb可以是H。p'可以是0。Ra和Rc可以是H并且每个p'可以是0。
在式(III)、(III-1)和(IIIa)中，Ra和Rc可以是H，Rb和Rd可各自独立地是胍或其质子化形式，n"可以是2或3，并且每个p'可以是0。
p'可以是0。p'可以是1。p'可以是2。p'可以是3。p'可以是4。p'可以是5。
cCPP可具有以下结构：
式(A)的cCPP可选自：
CPP序列 SEQ ID NO:
(FfΦRrRrQ) 78
(FfΦCit-r-Cit-rQ) 79
(FfΦGrGrQ) 80
(FfFGRGRQ) 81
(FGFGRGRQ) 82
(GfFGrGrQ) 83
(FGFGRRRQ) 84
(FGFRRRRQ) 85
式(A)的cCPP可选自：
CPP序列 SEQ ID NO:
FΦRRRRQ 86
fΦRrRrQ 87
FfΦRrRrQ 78
FfΦCit-r-Cit-rQ 79
FfΦGrGrQ 80
FfΦRGRGQ 88
FfFGRGRQ 81
FGFGRGRQ 82
GfFGrGrQ 83
FGFGRRRQ 84
FGFRRRRQ 85
在实施方案中，cCPP选自：
其中Φ＝L-萘基丙氨酸；-萘基丙氨酸；Ω＝L-正亮氨酸
在实施方案中，cCPP不选自：
其中Φ＝L-萘基丙氨酸；-萘基丙氨酸；Ω＝L-正亮氨酸
AASC可与接头缀合。
接头
本公开的cCPP可与接头缀合。接头可将货物连接至cCPP。接头可附接到cCPP的氨基酸的侧链，并且货物可附接在接头上的合适位置处。
接头可以是任何合适的部分，其可将cCPP与一个或多个附加部分(例如环外肽(EP)和/或货物)缀合。在与cCPP和一个或多个附加部分缀合之前，接头具有两个或更多个官能团，它们各自能够独立地与cCPP和一个或多个附加部分形成共价键。如果货物是寡核苷酸，接头可共价结合到货物的5'端或货物的3'端。接头可共价结合到货物的5'端。接头可共价结合到货物的3'端。如果货物是肽，接头可共价结合到货物的N-末端或C-末端。接头可共价结合到寡核苷酸或肽货物的主链。接头可以是将本文所述的cCPP与货物诸如寡核苷酸、肽或小分子缀合的任何合适的部分。
接头可包括烃接头。
接头可包含切割位点。切割位点可以是二硫化物或胱天蛋白酶切割位点(例如，Val-Cit-PABC)。
接头可包含：(i)一个或多个D或L氨基酸，它们各自任选地被取代；(ii)任选取代的亚烷基；(iii)任选取代的亚烯基；(iv)任选取代的亚炔基；(v)任选取代的碳环基；(vi)任选取代的杂环基；(vii)一个或多个-(R1-J-R2)z"-亚基，其中R1和R2在每种情况下各自独立地选自亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基和杂环基，每个J独立地是C、NR3、-NR3C(O)-、S和O，其中R3独立地选自H、烷基、烯基、炔基、碳环基和杂环基，它们各自任选地被取代，并且z"是1至50的整数；(viii)-(R1-J)z"-或-(J-R1)z"-，其中R1在每种情况下各自独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR3、-NR3C(O)-、S或O，其中R3是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z"是1至50的整数；或(ix)接头可包括(i)至(x)中的一者或多者。
接头可包含一个或多个D或L氨基酸和/或-(R1-J-R2)z"-，其中R1和R2在每种情况下各自独立地是亚烷基，每个J独立地是C、NR3、-NR3C(O)-、S和O，其中R4独立地选自H和烷基，并且z"是1至50的整数；或它们的组合。
接头可包含-(OCH2CH2)z'-(例如，作为间隔区)，其中z'是1至23的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。“-(OCH2CH2)z'"也可称为聚乙二醇(PEG)。
接头可包含一个或多个氨基酸。接头可包含肽。接头可包含-(OCH2CH2)z'-和肽，其中z'是1至23的整数。肽可包含2至10个氨基酸。接头还可包含能够通过点击化学反应的官能团(FG)。FG可以是叠氮化物或炔，并且当货物与接头缀合时形成三唑。
接头可包含(i)β丙氨酸残基和赖氨酸残基；(ii)-(J-R1)z"；或(iii)它们的组合。每个R1可独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR3、-NR3C(O)-、S或O，其中R3是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z"可以是1至50的整数。每个R1可以是亚烷基并且每个J可以是O。
接头可包含(i)β-丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合的残基；以及(ii)-(R1-J)z"-或-(J-R1)z"。每个R1可独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR3、-NR3C(O)-、S或O，其中R3是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z"可以是1至50的整数。每个R1可以是亚烷基并且每个J可以是O。接头可包含甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合。
接头可以是三价接头。接头可具有以下结构： 其中A1、B1和C1可独立地是烃接头(例如，NRH-(CH2)n-COOH)、PEG接头(例如，NRH-(CH2O)n-COOH，其中R是H、甲基或乙基)或一个或多个氨基酸残基，并且Z独立地是保护基团。接头还可掺入切割位点，包括二硫化物[NH2-(CH2O)n-S-S-(CH2O)n-COOH]或胱天蛋白酶切割位点(Val-Cit-PABC)。
烃可以是甘氨酸或β-丙氨酸的残基。
接头可以是二价的并且将cCPP连接到货物。接头可以是二价的并且将cCPP连接到环外肽(EP)。
接头可以是三价的并且将cCPP连接到货物和EP。
接头可以是二价或三价C1-C50亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-N(C1-C4烷基)-、-N(环烷基)-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(C1-C4烷基)-、-S(O)2N(环烷基)-、-N(H)C(O)-、-N(C1-C4烷基)C(O)-、-N(环烷基)C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(C1-C4烷基)、-C(O)N(环烷基)、芳基、杂环基、杂芳基、环烷基或环烯基替换。接头可以是二价或三价C1-C50亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-O-、-C(O)N(H)-或它们的组合替换。
接头可具有以下结构：
其中：每个AA独立地是氨基酸残基；*是与AASC的附接点，并且AASC是cCPP的氨基酸残基的侧链；x是1-10的整数；y是1-5的整数；z是1-10的整数。X可以是1-5的整数。X可以是1-3的整数。X可以是1。Y可以是2-4的整数。Y可以是4。Z可以是1-5的整数。Z可以是1-3的整数。Z可以是1。每个AA可独立地选自甘氨酸、β-丙氨
酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸。
cCPP可通过接头(“L”)附接到货物。接头可通过结合基团(“M”)与货物缀合。
接头可具有以下结构：
其中：x是1-10的整数；y是1-5的整数；z是1-10的整数；每个AA独立地是氨基酸残基；*是与AASC的附接点，并且AASC是cCPP的氨基酸残基的侧链；并且M是本文所定义的结合基团。
接头可具有以下结构：
其中：x'是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与AASC的附接点，并且AASC是cCPP的氨基酸残基的侧链；并且M是本文所定义的结合基团。
接头可具有以下结构：
其中：x'是1-23的整数；y是1-5的整数；并且z'是1-23的整数；*是与AASC的附接点，并且AASC是cCPP的氨基酸残基的侧链。
x可以是1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，包括其间的所有范围和子范围。
x'可以是1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23，包括其间的所有范围和子范围。X'可以是5-15的整数。X'可以是9-13的整数。X'可以是1-5的整数。X'可以是1。
y可以是1-5的整数，例如1、2、3、4或5，包括其间的所有范围和子范围。Y可以是2-5的整数。Y可以是3-5的整数。Y可以是3或4。Y可以是4或5。Y可以是3。Y可以是4。Y可以是5。
z可以是1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，包括其间的所有范围和子范围。
z'可以是1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23，包括其间的所有范围和子范围。Z'可以是5-15的整数。Z'可以是9-13的整数。Z'可以是11。
如上所讨论，接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到货物上的任何合适的位置。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到寡核苷酸货物的3'端或寡核苷酸货物的5'端。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到肽货物的N-末端或C-末端。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到寡核苷酸或肽货物的主链。
接头可结合到cCPP上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。接头可结合到cCPP上的赖氨酸的侧链。
接头可结合到肽货物上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基的还原侧链)。接头可结合到肽货物上的赖氨酸的侧链。
接头可具有以下结构：
其中
M是将L与货物例如寡核苷酸缀合的基团；
AAs是cCPP上的氨基酸的侧链或末端；
每个AAx独立地是氨基酸残基；
o是0-10的整数；并且
p是0至5的整数。
接头可具有以下结构：
其中
M是将L与货物例如寡核苷酸缀合的基团；
AAs是cCPP上的氨基酸的侧链或末端；
每个AAx独立地是氨基酸残基；
o是0-10的整数；并且
p是0至5的整数。
M可包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代。M可选自：
其中R是烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基。
M可选自：
其中：R10是亚烷基、环烷基或其中a是0至10。
M可以是R10可以是并且a是0至10。M可以是
M可以是异双官能交联剂，例如其公开于Williams等人Curr.Protoc Nucleic Acid Chem.2010,42,4.41.1-4.41.20中，全文以引用方式并入本文。
M可以是-C(O)-。
AAs可以是cCPP上的氨基酸的侧链或末端。AAs的非限制性示例包括天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸，或谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。AAs可以是如本文所定义的AASC。
每个AAx独立地是天然或非天然氨基酸。一个或多个AAx可以是天然氨基酸。一个或多个AAx可以是非天然氨基酸。一个或多个AAx可以是β-氨基酸。β-氨基酸可以是β-丙氨酸。
o可以是0至10的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。O可以是0、1、2或3。O可以是0。O可以是1。O可以是2。O可以是3。
p可以是0至5，例如0、1、2、3、4或5。P可以是0。P可以是1。P可以是2。P可以是3。P可以是4。P可以是5。
接头可具有以下结构：
其中M、AAs、每个-(R1-J-R2)z"-、o和z"如本文所定义；r可以是0或1。
r可以是0。R可以是1。
接头可具有以下结构：
其中M、AAs、o、p、q、r和z"各自可如本文所定义。
z"可以是1至50的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50，包括其间的所有范围和值。Z"可以是5-20的整数。Z"可以是10-15的整数。
接头可具有以下结构：
其中：
M、AAs和o如本文所定义。
合适接头的其他非限制性示例包括：
其中M和AAs如本文所定义。
本文提供了包含cCPP和与前mRNA序列中的靶标互补的AC的化合物，该化合物还包含L，其中接头通过结合基团(M)与AC缀合，其中M是
本文提供了包含cCPP和货物的化合物，该货物包含与前mRNA序列中的靶标互补的反义化合物(AC)，例如反义寡核苷酸，其中该化合物还包含L，其中接头通过结合基团(M)与AC缀合，其中M选自：
其中：R1是亚烷基、环烷基或其中t'是0至10，其中每个R独立地是烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，其中R1是并且t'是2。
接头可具有以下结构：
其中AAs如本文所定义，并且m'是0-10。
接头可具有下式：
接头可具有下式：其中“碱基”是货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3'端的核碱基。
接头可具有下式：
其中“碱基”对应于货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3'端的核碱基。
接头可具有下式：
其中“碱基”是货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3'端的核碱基。
接头可具有下式：其中“碱基”是货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3'端的核碱基。
接头可具有下式：
接头可在货物上的任何合适的位置处共价结合到货物。接头共价结合到货物的3'端或寡核苷酸货物的5'端。接头可共价结合到货物的主链。
接头可结合到cCPP上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。接头可结合到cCPP上的赖氨酸的侧链。
cCPP-接头缀合物
cCPP可与本文所定义的接头缀合。接头可与如本文所定义的cCPP的AASC缀合。
接头可包含-(OCH2CH2)z'-亚基(例如，作为间隔区)，其中z'是1至23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。“-(OCH2CH2)z'”也称为PEG。cCPP-接头缀合物可具有选自表4的结构：
表4：cCPP-接头缀合物和SEQ ID NO
接头可包含-(OCH2CH2)z'-亚基和肽亚基，其中z'是1至23的整数。肽亚基可包含2至10个氨基酸。cCPP-接头缀合物可具有选自表5的结构：
表5：cCPP-接头缀合物和SEQ ID NO
提供了包含环状细胞穿透肽(cCPP)、接头和环外肽(EP)的EEV。EEV可具有式(B)的结构：
或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R4和R7独立地是H或氨基酸侧链；
EP是如本文所定义的环外肽；
每个m独立地是0-3的整数；
n是0-2的整数；
x'是1-20的整数；
y是1-5的整数；
q是1-4；并且
z'是1-23的整数。
R1、R2、R3、R4、R7、EP、m、q、y、x'、z'如本文所述。
n可以是0。n可以是1。n可以是2。
EEV可具有式(B-a)或(B-b)的结构：
或其质子化形式，其中EP(示出为“PE”)、R1、R2、R3、R4、m和z'如上文在式(B)中所定义。
EEV可具有式(B-c)的结构：
或其质子化形式，其中EP、R1、R2、R3、R4和m如以上在式(B)中所定义；AA是如本文所定义的氨基酸；M如本文所定义；n是0-2的整数；x是1-10的整数；y是1-5的整数；z是1-10的整数。
EEV可具有式(B-1)、(B-2)、(B-3)或(B-4)的结构：
或其质子化形式，其中EP如上文在式(B)中所定义。
EEV可包含式(B)并且可具有以下结构：Ac-PKKKRKVAEEA-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:132-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)或Ac-PK-KKR-KV-AEEA-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:133-K(环[SEQ ID NO:83])-PEG12-OH)。
EEV可包含下式的cCPP：
EEV可包含下式：Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FfFGRGRQ)-miniPEG2-K(N3)(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-Lys(环(SEQ ID NO:81)-PEG2-K(N3))。
EEV可以是：
EEV可以是
EEV可以是Ac-P-K(Tfa)-K(Tfa)-K(Tfa)-R-K(Tfa)-V-miniPEG2-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:134-miniPEG2-K(环(SEQ ID NO:135)-PEG12-OH)。
EEV可以是
EEV可以是Ac-P-K-K-K-R-K-V-miniPEG2-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH(Ac-SEQID NO:42-PEG2-K(环(SEQ ID NO:135)-PEG12-OH)。
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是：
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可以是
EEV可选自
EEV可选自：
Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-Lys(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FfΦGrGrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:80])-miniPEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFGRGRQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:82])-miniPEG2-K(N3)-NH2)
Ac-KR-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-KR-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKGKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:46-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKG-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:48-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG2-K(N3)-NH2)
Ac-KKKRK-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:19-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FFΦGRGRQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42mini-PEG2-Lys(环[SEQ ID NO:80])-miniPEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[βhFfΦGrGrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:142])-miniPEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FfΦSrSrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:143])-miniPEG2-K(N3)-NH2)。
EEV可选自：
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环(SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFKRKRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:144])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFRGRGQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:145])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFGRGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:146])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFGRrRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:147])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)，以及
Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-Lys(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)。
EEV可选自：
Ac-K-K-K-R-K-G-miniPEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:148-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-K-K-K-R-K-miniPEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:19-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-K-K-R-K-K-PEG4-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:22-PEG4-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-K-R-K-K-K-PEG4-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:21-PEG4-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-K-K-K-K-R-PEG4-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:23-PEG4-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-R-K-K-K-K-PEG4-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:20-PEG4-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)，以及
Ac-K-K-K-R-K-PEG4-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:19-PEG4-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)。
EEV可选自：
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG2-K(N3)-NH2)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG2-K(N3)-NH2
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG2-K(N3)-NH2)，以及
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)。
货物可以是蛋白质并且EEV可以选自：
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)Ac-rr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)
Ac-rr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)
Ac-rrr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rrr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)
Ac-rhr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rhr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)
Ac-rbr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-rbr-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)
Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)Ac-rbrbr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:138-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)Ac-rbhbr-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:149-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:80])-PEG12-OH)Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-OH)Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FfFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:81])-PEG12-OH)Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)
Ac-hbrbh-PEG2-K(环[GfFGrGrQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:133])-PEG12-OH)
Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)
Ac-hbrbh-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH
(Ac-SEQ ID NO:141-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)，
其中b是β-丙氨酸，并且环外序列可以是D或L立体化学。
货物
细胞穿透肽(CPP)，诸如环状细胞穿透肽(例如，cCPP)，可与货物缀合。如本文所用，“货物”是期望递送到细胞中的化合物或部分。货物可与接头的末端羰基基团缀合。环肽的至少一个原子可被货物替换或者至少一个孤对可形成的与货物键。货物可通过接头与cCPP缀合。货物可通过接头与AASC缀合。cCPP的至少一个原子可被治疗性部分替换或者cCPP的至少一个孤对形成与治疗性部分的键。cCPP的氨基酸侧链上的羟基基团可被与货物的键替换。cCPP的谷氨酰胺侧链上的羟基基团可被与货物的键替换。货物可通过接头与cCPP缀合。货物可通过接头与AASC缀合。
在实施方案中，氨基酸侧链包含与接头或货物缀合的化学反应性基团。化学反应性基团可包括胺基团、羧酸、酰胺、羟基基团、巯基基团、胍基、酚基团、硫醚基团、咪唑基团或吲哚基团。在实施方案中，与货物缀合的cCPP的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、高谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或色氨酸。
货物可包含一个或多个可检测部分、一个或多个治疗性部分(TM)、一个或多个靶向部分或它们的任何组合。在实施方案中，货物包含TM。在实施方案中，TM包含反义化合物(AC)。在实施方案中，AC结合靶基因转录物的剪接元件(SE)的至少一部分或与靶基因转录物的SE足够接近以调节靶基因转录物的剪接。在实施方案中，AC结合靶IRF-5、DPMK或DUX4基因转录物的SE的至少一部分。在实施方案中，AC足够接近地结合靶IRF-5、DPMK或DUX4基因转录物的SE，以调节靶IRF-5、DPMK或DUX4基因转录物的剪接。
与货物部分缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)
环状细胞穿透肽(cCPP)可与货物部分缀合。
货物部分可在末端羰基处与接头缀合以提供以下结构：
其中：
EP是环外肽，并且M、AASC、货物、x'、y和z'如上文所定义，*是与AASC的附接点。x'可以是1。y可以是4。z'可以是11。-(OCH2CH-2)x'-和/或-(OCH2CH-2)z'-可独立地被一个或多个氨基酸替换，包括例如甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合。
内体逃逸载体(EEV)可包含环状细胞穿透肽(cCPP)、环外肽(EP)和接头，并且可与货物缀合以形成包含式(C)的结构的EEV-缀合物：
或其质子化形式，
其中：
R1、R2和R3可各自独立地是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基；
R4是H或氨基酸侧链；
EP是如本文所定义的环外肽；
货物是如本文所定义的部分；
每个m独立地是0-3的整数；
n是0-2的整数；
x'是2-20的整数；
y是1-5的整数；
q是1-4的整数；并且
z'是2-20的整数。
R1、R2、R3，R4、EP、货物、m、n、x'、y、q和z'如本文所定义。
EEV可与货物缀合，并且EEV-缀合物可包含式(C-a)或(C-b)的结构：
或其质子化形式，其中EP、m和z如上文在式(C)中所定义。
EEV可与货物缀合，并且EEV-缀合物可包含式(C-c)的结构：
或其质子化形式，其中EP、R1、R2、R3、R4和m如上文在式(III)中所定义；AA可以是如本文所定义的氨基酸；n可以是0-2的整数；x可以是1-10的整数；y可以是1-5的整数；z可以是1-10的整数。
EEV可与寡核苷酸货物缀合，并且EEV-寡核苷酸缀合物可包含式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：
EEV可与寡核苷酸货物缀合，并且EEV-缀合物可包含以下结构：
胞质递送效率
对环状细胞穿透肽(cCPP)的修饰可提高胞质递送效率。通过将具有经修饰的序列的cCPP的胞质递送效率与对照序列进行比较，可测量改善的胞质摄取效率。调控序列不包括修饰序列中的特定置换氨基酸残基(包括但不限于精氨酸、苯丙氨酸和/或甘氨酸)，但在其他方面是相同的。
如本文所用，胞质递送效率是指cCPP穿过细胞膜并进入细胞的胞质溶胶的能力。cCPP的胞质递送效率不一定依赖于受体或细胞类型。胞质递送效率可指绝对胞质递送效率或相对胞质递送效率。
绝对胞质递送效率是生长培养基中cCPP(或cCPP-货物缀合物)的胞质浓度与cCPP(或cCPP-货物缀合物)的浓度的比率。相对胞质溶胶递送效率是指与对照cCPP在胞质溶胶中的浓度相比cCPP在胞质溶胶中的浓度。定量可通过荧光标记cCPP(例如，用FITC染料)并使用本领域熟知的技术测量荧光强度来实现。
通过比较(i)被细胞类型(例如，HeLa细胞)内化的本发明cCPP的量与(ii)被相同细胞类型内化的对照cCPP的量来确定相对胞质递送效率。为了测量相对胞质递送效率，可将细胞类型在cCPP的存在下孵育指定的时间段(例如，30分钟、1小时、2小时等)，之后使用本领域已知的方法例如荧光显微术定量被细胞内化的cCPP的量。单独地，将相同浓度的对照cCPP在该细胞类型的存在下孵育相同的时间段，并且对被细胞内化的对照cCPP的量进行定量。
相对胞质递送效率可通过测量具有经修饰的序列的cCPP对胞内靶标的IC50并将具有经修饰的序列的cCPP对对照序列的IC50(如本文所述)进行比较来确定。
与环(FfФRrRrQ,SEQ ID NO:150)相比，cCPP的相对胞质递送效率可在约50％至约450％的范围内，例如约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％、约500％、约510％、约520％、约530％、约540％、约550％、约560％、约570％、约580％或约590％，包括其间的所有范围和值。与包含环(FfФRrRrQ,SEQ ID NO:150)的环肽相比，cCPP的相对胞质递送效率可提高大于约600％。
绝对胞质递送效力为约40％至约100％，例如约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，包括其间的所有值和子范围。
与其他相同的序列相比，本公开的cCPP可将胞质递送效率提高约1.1倍至约30倍，例如，约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约10、约10.5、约11.0、约11.5、约12.0、约12.5、约13.0、约13.5、约14.0、约14.5、约15.0、约15.5、约16.0、约16.5、约17.0、约17.5、约18.0、约18.5、约19.0、约19.5、约20、约20.5、约21.0、约21.5、约22.0、约22.5、约23.0、约23.5、约24.0、约24.5、约25.0、约25.5、约26.0、约26.5、约27.0、约27.5、约28.0、约28.5、约29.0、或约29.5倍，包括其间的所有值和子范围。
可检测部分
在实施方案中，本文公开的化合物包含可检测部分。在实施方案中，可检测部分在细胞穿透肽的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处(例如，在CPP中的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处)附接到细胞穿透肽。在实施方案中，治疗性部分包含可检测部分。可检测部分可包括任何可检测标记。合适的可检测标记的示例包括但不限于UV-Vis标记、近红外标记、发光基团、磷光基团、磁自旋共振标记、光敏剂、光可切割部分、螯合中心、重原子、放射性同位素、同位素可检测自旋共振标记、顺磁性部分、发色团或它们的任何组合。在实施方案中，标记在不添加其他试剂的情况下是可检测的。
在实施方案中，可检测部分是生物相容的可检测部分，使得化合物可适用于多种生物应用。如本文所用，“生物相容的”和“生物学上相容的”通常是指连同其任何代谢物或降解产物一起通常对细胞和组织无毒并且当细胞和组织在它们的存在下孵育(例如，培养)时不对细胞和组织造成任何显著不良作用的化合物。
可检测部分可含有发光体，诸如荧光标记或近红外标记。合适的发光体的示例包括但不限于金属卟啉；苯并卟啉；氮杂苯并卟啉；萘卟啉；酞菁；多环芳族烃，诸如二萘嵌苯二亚胺、芘；偶氮染料；呫吨染料；二吡咯亚甲基硼、氮杂二吡咯亚甲基硼、花青染料、金属配体络合物诸如联吡啶、联吡啶类、菲咯啉、香豆素以及钌和铱的乙酰丙酮化物；吖啶、嗪衍生物，诸如二苯并嗪；氮杂轮烯、方酸；8-羟基喹啉、聚甲炔、发光纳米粒子，诸如量子点、纳米晶体；喹诺酮；铽络合物；无机磷光体；离子载体，诸如冠醚附属或衍生的染料；或它们的组合。合适的发光体的具体示例包括但不限于八乙基卟啉Pd(II)；八乙基卟啉Pt(II)；四苯基卟啉Pd(II)；四苯基卟啉Pt(II)；内消旋-四苯基卟啉四苯并卟吩Pd(II)；内消旋-四苯基甲基苯并卟啉Pt(II)；八乙基卟啉酮Pd(II)；八乙基卟啉酮Pt(II)；内消旋-四(五氟苯基)卟啉Pd(II)；内消旋-四(五氟苯基)卟啉Pt(II)；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)Ru(II)(Ru(dpp)3)；三(1,10-菲咯啉)Ru(II)(Ru(phen)3)，三(2,2'-联吡啶)氯化钌(II)六水合物(Ru(bpy)3)；赤藓红B；荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；曙红；((N-甲基-苯并咪唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素)铱(III)；
苯并噻唑)((苯并噻唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素))-2-(乙酰丙酮化物)；Lumogen染料；Macroflex荧光红；Macrolex荧光黄；得克萨斯红；罗丹明B；罗丹明6G；硫罗丹明；间甲酚；百里酚蓝；二甲苯酚蓝；甲酚红；氯酚蓝；溴甲酚绿；溴甲酚红；溴百里酚蓝；Cy2；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；4-硝基苯酚；茜素；酚酞；邻甲酚酞；氯酚红；钙镁试剂；溴二甲苯酚；酚红；中性红；硝嗪；3,4,5,6-四溴酚酞；刚果红；荧光素；曙红；2',7'-二氯荧光素；5(6)-羧基荧光素；羧基萘并荧光素；8-羟基芘-136-三磺酸；半萘并罗丹荧(semi-naphthorhodafluor)；半萘并荧光素；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)；(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)四苯基硼；八乙基卟啉铂(II)；二烷基碳菁；双十八烷基环氧碳菁；芴基甲氧基碳酰氯；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；绿色荧光蛋白(GFP)；以及它们的衍生物或组合。
在一些示例中，可检测部分可包括罗丹明B(Rho)、异硫氰酸荧光素(FITC)、7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)、绿色荧光蛋白(GFP)或它们的衍生物或组合。
制备方法
本文所述的化合物可以有机合成领域技术人员已知的多种方式或本领域技术人员所理解的其变化形式制备。本文所述的化合物可由容易获得的起始材料制备。最佳反应条件可随所用的特定反应物或溶剂而变化，但此类条件可由本领域技术人员确定。
本文所述化合物的变化形式包括如针对每种化合物所述的各种成分的添加、减去或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，分子的手性可改变。另外，化合物合成可涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的使用以及适当的保护基团的选择可由本领域技术人员确定。保护基团的化学性质可见于例如Wuts和Greene,ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第4版，Wiley&Sons,2006，其全文以引用方式并入本文。
用于制备所公开的化合物和组合物的起始材料和试剂可购自商业供应商诸如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,WI)、Acros Organics(Morris Plains,NJ)、FisherScientific(Pittsburgh,PA)、Sigma(St.Louis,MO)、Pfizer(New York,NY)、GlaxoSmithKline(Raleigh,NC)、Merck(Whitehouse Station,NJ)、Johnson&Johnson(NewBrunswick,NJ)、Aventis(Bridgewater,NJ)、AstraZeneca(Wilmington,DE)、Novartis(Basel,Switzerland)、Wyeth(Madison,NJ)、Bristol-Myers-Squibb(New York,NY)、Roche(Basel,Switzerland)、Lilly(Indianapolis,IN)、Abbott(Abbott Park,IL)、ScheringPlough(Kenilworth,NJ)、或Boehringer Ingelheim(Ingelheim,Germany)，或者通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中所述的程序制备，该参考文献诸如Fieser andFieser's Reagents for Organic Synthesis，第1-17卷(John Wiley and Sons,1991)；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷和补充版(Elsevier SciencePublishers,1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons,1991)；March'sAdvanced Organic Chemistry,(John Wiley and Sons，第4版)；以及Larock'sComprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)。其他材料，诸如本文公开的药物载剂可从商业来源获得。
制备本文所述化合物的反应可在溶剂中进行，该溶剂可由有机合成领域的技术人员选择。在进行反应的条件(例如，温度和压力)下，溶剂可基本上不与起始材料(反应物)、中间体或产物反应。反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。产物或中间体形成可根据本领域已知的任何合适的方法进行监测。例如，产物形成可通过光谱手段诸如核磁共振光谱法(例如，1H或13C)、红外光谱法、分光光度测定(例如，UV-可见光)或质谱法，或通过色谱法诸如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法来监测。
所公开的化合物可通过固相肽合成来制备，其中氨基酸α-N-末端被酸或碱保护基团保护。此类保护基团应具有对肽连接形成条件稳定的特性，同时可容易地去除而不破坏生长的肽链或使其中所含的任何手性中心外消旋化。合适的保护基团是9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、联苯基异丙氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片基氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基团对于所公开化合物的合成是特别优选的。对于侧链氨基基团如赖氨酸和精氨酸，其他优选的侧链保护基团是2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；对于酪氨酸是苄基、邻溴苄氧基-羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸是叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸是三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸是甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸是苄基和叔丁基，并且对于半胱氨酸是三苯基甲基(三苯甲基)。
在固相肽合成方法中，将α-C-末端氨基酸附接到合适的固体支持物或树脂上。可用于上述合成的合适固体支持物是对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性以及不溶于所用介质的那些材料。用于合成α-C-末端羧基肽的固体支持物是可购自AppliedBiosystems(Foster City,Calif.)的4-羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)或4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰胺基乙基树脂。α-C-末端氨基酸通过N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，在有或没有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧代-3-唑烷基)氯化膦(BOPCl)的情况下，在10℃至50℃的温度下在溶剂诸如二氯甲烷或DMF中介导偶联约1至约24小时而偶联到树脂上。当固体支持物是4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在如上所述与α-C-末端氨基酸偶联之前，用仲胺(优选地哌啶)切割Fmoc基团。一种用于与脱保护的4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂偶联的方法是在DMF中的O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。可在自动多肽合成仪中进行连续的受保护氨基酸的偶联。在一个示例中，用Fmoc保护生长肽链的氨基酸中的α-N-末端。从生长肽的α-N-末端侧去除Fmoc保护基团是通过用仲胺(优选地哌啶)处理完成的。然后以约3倍摩尔过量引入每个受保护的氨基酸，并且优选地在DMF中进行偶联。偶联剂可以是O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。在固相合成结束时，将多肽从树脂上去除并脱保护，连续地或在单一操作中进行。通过用包含茴香硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的切割试剂处理树脂结合的多肽，可在单一操作中完成多肽的去除和脱保护。在多肽的α-C-末端是烷基酰胺的情况下，通过用烷基胺氨解来切割树脂。另选地，可通过酯交换(例如，用甲醇)、接着氨解或通过直接转酰胺基来去除肽。受保护的肽可在此时纯化或直接用于下一步骤。侧链保护基团的去除可使用上述切割混合物来完成。完全脱保护的肽可通过使用任何或所有以下类型的一系列色谱步骤来纯化：在弱碱性树脂(乙酸盐形式)上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)上的疏水吸附色谱法；硅胶吸附色谱法；羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；分配色谱法(例如，在Sephadex G-25、LH-20上)或逆流分布；高效液相色谱法(HPLC)，特别是在辛基-十八烷基甲硅烷基-二氧化硅键合相柱填料上的反相HPLC。
上述聚合物诸如PEG基团可以在任何合适的条件下附接到寡核苷酸，诸如AC。可使用本领域已知的任何方法，包括经由酰化、还原烷基化、迈克尔加成、硫醇烷基化或通过PEG部分上的反应性基团(例如，醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与AC上的反应性基团(例如，醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其他化学选择性缀合/连接方法。可用于将水溶性聚合物连接到一种或多种蛋白质的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸根、三氟乙磺酸根、azidirine、环氧乙烷、5-吡啶基和α-卤代酰基(例如，α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原烷基化附接到AC，则所选择的聚合物应具有单一反应性醛，从而控制聚合度。参见例如Kinstler等人，Adv.Drug.Delivery Rev.(2002),54:477-485；Roberts等人，Adv.Drug Delivery Rev.(2002),54:459-476；以及Zalipsky等人，Adv.Drug Delivery Rev.(1995),16:157-182。
为了将AC或接头直接共价连接到CPP，CPP的合适当氨基酸残基可以与有机衍生剂反应，所述有机衍生剂能够与氨基酸的所选侧链或N-末端或C-末端反应。肽或缀合物部分上的反应性基团包括例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。
制备AC和将AC与线性CPP缀合的方法一般描述于美国公开号2018/0298383中，该公开以引用方式并入本文用于所有目的。所述方法可应用于本文公开的环状CPP。
合成方案提供于图5A至图5D和图6中。
包含CPP和可用于与AC缀合的反应性基团的化合物的非限制性示例示于表6中。还示出了示例性接头基团。反应性基团的示例包括四氟苯基酯(TFP)、游离羧酸(COOH)和叠氮化物(N3)。在表6中，n是0至20的整数；Pipa6是AcRXRRBRRXRYQFLIRXRBRXRB，其中B是β-丙氨酸，并且X是氨基己酸；Dap是2,3-二氨基丙酸；NLS是核定位序列；βA是β丙氨酸；-ss-是二硫化物；PABC是聚(A)结合蛋白C-末端结构域；Cx是长度x的烷基链，其中x是某一数字；并且BCN是双环[6.1.0]壬炔。
表6.包含CPP和反应性基团的化合物
在实施方案中，CPP具有可用于与AC缀合的游离羧酸基团。在实施方案中，EEV具有可用于与AC缀合的游离羧酸基团。
下面的结构是用于与包含叠氮化物的化合物进行点击反应的经3'环辛炔修饰的PMO：
CPP和接头经由酰胺键与AC的3'端缀合的示例性方案如下所示。
CPP和接头经由应变促进的叠氮化物-炔环加成与经3'-环辛炔修饰的PMO缀合的示例性方案如下所示：
用于将AC和CPP与含有聚乙二醇部分的附加接头连接的缀合化学的示例如下所示：
将CPP-接头经由应变促进的叠氮化物-炔环加成(点击化学)与经5'-环辛炔修饰的PMO缀合的示例如下所示：
合成寡聚反义化合物的方法是本领域已知的。本公开不受合成AC的方法的限制。在实施方案中，本文提供了具有反应性磷基团的化合物，所述反应性磷基团可用于形成核苷间连接，包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间连接。前体或反义化合物的制备和/或纯化方法不是对本文提供的组合物或方法的限制。DNA、RNA和反义化合物的合成和纯化方法是本领域技术人员众所周知的。
经修饰的和未修饰的核苷的寡聚化可根据DNA(Protocols forOligonucleotides and Analogs，编者Agrawal(1993),Humana Press)和/或RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217；Gait等人，Applications of Chemicallysynthesized RNA in RNA:Protein Interactions，编者Smith(1998),1-36；Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)的文献程序常规地进行。
本文提供的反义化合物可通过众所周知的固相合成技术便利地且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商出售，包括例如Applied Biosystems(Foster City,CA)。可以附加地或另选地使用本领域已知的用于此类合成的任何其他手段。使用类似技术制备寡核苷酸诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。本公开不受反义化合物合成方法的限制。
寡核苷酸纯化和分析的方法是本领域技术人员已知的。分析方法包括毛细管电泳(CE)和电喷雾质谱法。此类合成和分析方法可以在多孔板中进行。本发明的方法不受寡聚物纯化方法的限制。
疾病
在一些实施方案中，可通过施用包含一种或多种本文所述化合物的组合物来治疗、预防或改善各种疾病或病症。在实施方案中，用本公开的组合物治疗、预防或改善的疾病与剪接、蛋白质表达和/或蛋白质活性的调节异常相关。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗、预防或改善疾病或病症。可使用本公开的化合物治疗、预防或调节的例示性疾病或病症可包括但不限于癌症，包括例如急性髓系白血病、B细胞白血病/淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、结直肠癌、杜氏肌肉营养不良症、食管鳞状细胞癌、范科尼贫血、胃癌、恶性胶质瘤、肝细胞癌、肺癌、林奇综合征、套细胞淋巴瘤、黑素瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺导管腺癌、增生性病症、前列腺癌和小肠神经内分泌癌；心血管病症，包括例如动脉粥样硬化、心脏肥大、扩张型心肌病、高血压、局部缺血/再灌注损伤、血栓形成(深静脉)和血栓形成(静脉)；先天性异常，包括小眼畸形、苗勒氏发育不全、骨脆性(成骨不全症)和佝偻病；内分泌疾病，包括新生儿糖尿病和2型糖尿病；血液病，包括血小板无力症、α-地中海贫血和β-地中海贫血；免疫病症，包括IPEX综合征、鼻息肉、严重联合免疫缺陷病、系统性红斑狼疮和维斯科特-奥尔德里奇综合征；肺部病症，包括肺纤维化；肌骨骼病症，包括肌纤维化、面肩胛肱肌营养不良、眼咽肌营养不良、强直性肌营养不良和眼咽型肌营养不良；神经病症，包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、焦虑症、法布里病、脆性X综合征、弗里德里希共济失调、亨廷顿病、异染性脑白质营养不良、伪缺乏症、神经精神疾病、帕金森病和自杀行为；应激；泽尔韦格综合征；糖原贮积病，诸如庞贝氏症；以及它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗、预防或改善与异常基因转录、剪接和/或翻译相关的疾病。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗、预防或改善与异常IRF-5、GYS1和/或DUX4转录、剪接和/或翻译相关的疾病。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗、预防或改善与以下相关的疾病：IRF-5、GYS1和/或DUX4上调；IRF-5、GYS1和/或DUX4多态性；突变体IRF-5、GYS1和/或DUX4的积累；或它们的组合。
糖原贮积病
糖原合成和降解是涉及许多不同酶促反应的多步骤过程。例如，α-葡糖苷酶(GAA)通过切割α-1,4和α-1,6糖苷键催化糖原的水解，从而允许葡萄糖被释放到细胞质中。在不存在GAA的情况下，糖原在各种组织(主要是心肌和骨骼肌)中的溶酶体内积累。由该蛋白质的缺乏引起的病症被称为糖原贮积病(GSD)(Douillard-Guilloux等人，Hum.Mol.Genet.(2010),19(4):684-96)。
GSD是糖原代谢的遗传代谢病症。糖原贮积病有超过12种类型，其基于酶缺乏和受影响的组织(主要是肝脏或肌肉)进行分类。0型GSD是由于糖原合酶的缺乏。I型是由于缺乏葡萄糖-6-磷酸酶a。II型是由于缺乏α-葡糖苷酶(GAA)。III型是由于缺乏糖原脱支酶(GDE)。IV型是由于缺乏糖原分支活性。V型是由于缺乏糖原磷酸化酶的肌同工型(由PYGM编码)。VI型是由于缺乏糖原磷酸化酶的肝脏同工型(由PYGL编码)。几乎没有关于其余GSD的信息，并且若干种以前的GSD已被分类到其他病症中。糖原贮积病的列表提供于表7中(Ellingwood S.等人，(2018),J.Endocrinol.238(3):R131-R141.doi:10.1530/JOE-18-0120)。
表7：糖原贮积病
*OMIM(在线人类孟德尔遗传)；#在早期来源中，GSD XI型与乳酸脱氢酶A(OMIM612933)缺乏相关。
糖原贮积病II型(GSDII)或庞贝氏症是由编码酸性葡糖苷酶α(GAA)的基因中的突变引起的常染色体隐性溶酶体贮积病，所述突变导致对于复合糖、糖原的分解必不可少的GAA蛋白的缺失或缺乏。通常，身体使用GAA分解复杂碳水化合物糖原并将其转化为葡萄糖。无法实现适当的分解和糖原代谢异常导致糖原在身体细胞中，特别是在心肌细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞中的过度积累，这可导致正常组织和器官功能的损伤和退化。庞贝氏症患者会经历严重的肌相关问题，包括全身的进行性肌无力，尤其是在腿、躯干和横膈膜中。随着病症的发展，呼吸问题可能会导致呼吸衰竭。迄今为止，已经在GAA中鉴定出超过300种致病性突变。在美国和欧洲，普遍估计总共5,000至10,000名患者患有庞贝氏症；然而，新生儿筛查的出现表明该疾病诊断不足。
基于症状的发病年龄和严重程度，庞贝氏症通常被分类为婴儿型庞贝氏症(IOPD)或晚发型庞贝氏症(LOPD)。IOPD的特征在于严重的肌无力和异常减少的肌张力，并且通常在生命的前几个月内显现。如果不进行治疗，由于进行性心力衰竭、呼吸窘迫或由喂养困难导致的营养不良，IOPD通常是致命的。LOPD存在于儿童期、青春期或成人期。患有LOPD的患者通常具有较轻微的症状，诸如活动能力降低和呼吸问题。具有LOPD的患者会经历进行性行走困难和呼吸下降。LOPD的初始症状可能是微妙的，并且多年来未被注意到。
在提交时，目前唯一批准的用于庞贝氏症的疗法是阿葡糖苷酶α(在美国为Lumizyme，在其他地区为Myozyme)和阿伐糖苷酶α-ngpt(在美国为Nexviazyme)，它们都是经由IV输注递送的酶替代疗法(ERT)的形式。尽管用ERT治疗庞贝氏症的婴儿患者已显示出改善的生存率，但ERT不是治愈性的，并且在长期观察研究中，许多患者持续具有增加的心肌病和心力衰竭两者的风险。这些患者还会经历残余肌无力，包括吞咽困难和伴随的增加的误吸风险。ERT改善骨骼肌肌病和呼吸功能障碍的能力特别有限，主要是由于其不能穿透受该病影响的关键组织、在细胞溶胶中缺乏活性以及潜在的免疫原性。尽管可获得ERT，但在IOPD或LOPD或的患者中仍然存在显著未满足的医疗需求。
GAA通过切割α-1,4和α-1,6糖苷键催化糖原的水解，从而允许葡萄糖被释放到细胞质中。在不存在GAA的情况下，糖原在各种组织(主要是心肌和骨骼肌)中的溶酶体内积累。由该蛋白质的缺乏引起的病症被称为糖原贮积病(GSD)(Douillard-Guilloux(2010)Hum.Mol.Genet.19(4):684-96)。
可治疗糖原贮积病的一种方式是通过下调糖原合成，例如通过下调糖原合酶的表达和/或活性。糖原合酶有两种主要的同功酶，GYS1和GYS2。GYS1在骨骼肌和心肌中遍在表达(NCBI参考2997)。GYS2主要在肝脏和脂肪组织中表达(NCBI基因参考2998)。GYS1用于分解摄入的葡萄糖，为肌肉提供糖原能量储备。相比之下，GYS2用于维持血糖水平。GYS1和GYS2的mRNA的比对显示，两种同工酶的54％共享71％的同源性。
已证明，下调糖原合酶(GYS1)表达导致糖原积累的逆转(Douillard-Guilloux等人，Hum.Mol.Genet.(2010),19(4):684-96)。已对GYS1的结构和作用机制进行了综述(Palm,D.C.等人，FEBS(2013),280(1),2-27；以及Baskaran S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010)107,17563-17568)。由于GYS1和GYS1的功能差异，重要的是选择性靶向GYS1进行下调。
在实施方案中，提供了一种用于治疗糖原贮积病的方法。在实施方案中，该方法包括施用下调糖原合成的化合物。在实施方案中，该方法包括施用下调糖原合酶的表达的化合物。在实施方案中，该方法包括施用下调糖原合酶的肌形式(GYS1)的表达的化合物。在实施方案中，所述化合物包含AC。AC可以是任何AC并且具有如本文别处所述的任何AC特征。在实施方案中，AC可结合到如本文别处所述的靶转录物的SE或SRE的至少一部分。在实施方案中，AC可结合到如本文别处所述的靶转录物的SE或SRE附近。在实施方案中，AC是ASO。在实施方案中，ASO是PMO。AC可结合到如本文别处所述的GYS1靶转录物的任何剪接元件。
在实施方案中，提供了一种用于治疗糖原贮积病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗与肌肉组织中糖原积累相关的糖原贮积病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗与心肌组织中糖原积累相关的糖原贮积病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗与骨骼肌组织中糖原积累相关的糖原贮积病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗II型糖原贮积病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗庞贝氏症的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗安德森氏症的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗麦卡德尔病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗拉福拉病的方法。在实施方案中，提供了一种用于治疗塔里乌病(Tariu disease)的方法。
在实施方案中，GYS1由编码同种型1或同种型2的核苷酸序列编码。核苷酸序列可通过在线NCBI数据库公开获得(同种型1＝NM_002103.5；同种型2＝NM_001161587.2)。在实施方案中，编码GYS1的核苷酸序列与编码同种型1或同种型2的核苷酸序列的区别在于一个或多个核酸。在实施方案中，编码GYS1的核苷酸序列的区别在于一种或多种多态性(例如，单核苷酸多态性或SNP)。在实施方案中，编码GYS1的核苷酸序列与编码同种型1或同种型2的核苷酸序列共享小于100％的序列同一性，在实施方案中，GYS1由与编码同种型1或同种型2的核酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列编码。在实施方案中，GYS1由与编码同种型1或同种型2的核酸序列具有80％至100％、90％至100％、95％至100％、或99％至100％同一性的核苷酸序列编码。
在实施方案中，所述方法包括施用诱导GYS1靶转录物中一个或多个外显子的外显子跳跃的化合物。在实施方案中，所述方法包括施用包含反义化合物(AC)的化合物，所述反义化合物诱导GYS1靶转录物中一个或多个外显子的跳跃。在实施方案中，AC与GYS1转录物的靶核苷酸序列的杂交导致靶转录物中一个或多个外显子的包含或跳跃。在实施方案中，一个或多个外显子的跳跃或包含诱导GYS1靶转录物中的移码。在实施方案中，移码得到编码具有降低活性的糖原合酶的GYS1转录物。在实施方案中，移码得到截短的或非功能性的糖原合酶。在实施方案中，移码导致在GYS1转录物中引入提前终止密码子。在实施方案中，引入提前终止密码子导致GYS1 mRNA转录物通过无义介导的衰变而降解。
在实施方案中，化合物包含诱导人和/或小鼠GYS1的外显子2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中的一者或多者的跳跃的反义化合物(AC)。在实施方案中，化合物包含诱导一个或多个外显子跳跃以产生框外移码的AC，从而导致GYS1靶转录物被降解(例如，无义介导的衰变)或被翻译成具有降低活性或无活性的GYS1蛋白。在实施方案中，化合物包含诱导外显子2、5、6、7、8、10、12和/或14中的一者或多者的跳跃以产生框外移码的AC。在实施方案中，化合物包含诱导一个或多个外显子的跳跃以在GYS1靶转录物中产生框内缺失的AC。在实施方案中，化合物包含诱导外显子3、4、9、11、13和/或15中的一者或多者的跳跃的AC。在实施方案中，化合物包含诱导外显子3、4、9、11、13和/或15中的一者或多者的跳跃以在GYS1靶转录物中产生框内缺失的AC。
在实施方案中，化合物包含结合一个或多个外显子/内含子和/或内含子/外显子连接以诱导外显子跳跃的AC。在实施方案中，AC化合物包含表8中的下列序列中的任一个，其中大写字母表示外显子核苷酸，小写字母表示内含子核苷酸。在表8中，SEQ ID NO:151-247被设计成诱导外显子跳跃以产生移码改变。在实施方案中，移码改变得到提前终止密码子。在实施方案中，移码改变导致GYS1靶转录物的无义介导的衰变。在表8中，SEQ ID NO:249-318被设计成诱导外显子跳跃以产生框内缺失。表8中列出的AC被设计成结合包含外显子、外显子/内含子连接和/或内含子/外显子连接的靶核苷酸序列。
表8：靶向GYS1的各种AC序列
在一些实施方案中，AC包含来自美国申请号16/867,261和/或Clayton等人，Molecular Therapy-Nucleic Acids(2014)3,e206的PMO序列，如表9中列出的那些，或其一部分。
PMO序列被设计成诱导外显子跳跃，从而导致移码改变。在实施方案中，移码改变得到提前终止密码子，其导致GYS1靶转录物的无义介导的衰变。SEQ ID NO:321-327被设计成结合包含GYS1靶转录物的内含子/外显子和/或外显子/内含子连接的靶核苷酸序列。SEQID NO:319和327被设计成结合包含靶GYS1转录物的内含子序列的靶核苷酸序列。
表9：靶向GYS1的各种AC序列
SEQ ID NO: 序列(5'至3') 要跳过的外显子
319 TCAGGGTTGTGGACTCAATCATGCC 8
320 AAGGACCAGGGTAAGACTAGGGACT 5
321 GTCCTGGACAAGGATTGCTGACCAT 8
322 CTGCTTCCTTGTCTACATTGAACTG 5
323 ATACCCGGCCCAGGTACTTCCAATC 14
324 CTGGACAAGGATTGCTGACCATAGT 8
325 TCCCACCGAGCAGGCCTTACTCTGA 7
326 GACCACAGCTCAGACCCTACCTGGT 5
327 TCACTGTCTGGCTCACATACCCATA 6
在实施方案中，AC包含表8和/或表9中任一序列的10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个连续碱基。在实施方案中，AC包含表8和/或表9中任一序列的25个或更少个、20个或更少个、或15个或更少个连续碱基。在实施方案中，AC包含表8和/或表9中任一序列的10个至25个、10个至20个、或10个至15个连续碱基。在实施方案中，AC包含表8和/或表9中任一序列的15个至25个或15个至20个连续碱基。在实施方案中，AC包含表8和/或表9中任一序列的20-25个连续碱基。
在实施方案中，将使用小鼠GYS1的小鼠模型用于研究诱导GYS1靶转录物中的外显子跳跃的化合物的作用。小鼠和人GYS1二在19号染色体上具有97％同源性。另外，小鼠和人GYS1都具有16个外显子和相同的剪接模式，得到737个氨基酸长的全长蛋白质。
在实施方案中，化合物包含通过靶向其起始密码子而诱导人和/或小鼠GYS1下调的反义化合物(AC)。此类序列的示例包括表10中的那些。
表10：靶向GYS1的各种AC序列
干扰素调节因子5(IRF-5)
在实施方案中，提供了用于调节干扰素调节因子5(IRF-5)的活性的化合物。IRF-5是IRF转录因子家族的成员，其在单核细胞、巨噬细胞、B细胞和树突状细胞中高度表达，并且其表达可以在其他类型的细胞中被I型干扰素诱导(Almuttaqi和Udalova,FEBS J.(2018),286:1624-1637)。IRF-5参与先天和适应性免疫、抗病毒防御、促炎性细胞因子的产生、巨噬细胞极化、细胞生长调节以及分化和凋亡。
异常IRF-5表达与多种疾病相关。此外，增加的IRF5 mRNA水平与疾病病理高度相关。例如，IRF-5的上调可导致IFN的产生增加，这与多种炎性疾病的发展有关，所述炎性疾病包括自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、肥胖症、神经病理性疼痛、心血管疾病(例如，动脉粥样硬化)和代谢功能障碍(Banga等人，Sci.Adv.(2020),6:eaay1057)。另外，与较高的IRF-5表达相关的IRF-5基因多态性与对炎性和自身免疫性疾病的易感性相关，所述炎性和自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、多发性硬化症(MS)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)和舍格伦综合征(Almuttaqi和Udalova(2018)FEBS J.286:1624-1637；Thompson等人，Front.Immunol.,2018,9:2622；Ban等人，InternationalImmunology(2018),30,11:529-536；Chehimi等人，J.Clin.Med.(2017),6,712,doi.org/10.3390/jcm6070068)。此外，IRF-5参与I型干扰素和Toll样受体信号传导通路，并且是细胞因子表达的下游调节剂(Krisjansdottir等人，J.Med.Genet.(2008),45:362-369)。
IRF-5以由三个另选的非编码5'外显子和至少九个选择性剪接的mRNA生成的多种同种型存在。IRF-5同种型的序列可例如通过在线NCBI数据库公开获得。同种型显示出细胞类型特异性表达、亚细胞定位和功能。一些同种型与自身免疫疾病的风险相关。例如，同种型2与IRF-5的过表达和对自身免疫疾病诸如系统性红斑狼疮的易感性有关。另外，导致更高mRNA表达的多态性(包括编码IRF-5的基因中的单核苷酸多态性)与许多自身免疫疾病相关(Krausgruber等人，Nat.Immunol.(2010),12(3):231-238；Kozyrev等人，Arthritis andRheumatology(2007),56(4):1234-1241)。
已对IRF-5活化、作用机制、信号传导通路和调控元件进行了综述(Song等人，J.Clin.Invest.(2020),130(12):6700-6717；Almutaqqi和Udalova FEBS J.(2018),286:1624-1637；Banga等人，Sci.Adv.(2020),6:eaay1057；Thompson等人，Front.Immunol.(2018),9:2622)。
编码IRF-5的基因包含9个外显子(外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8和外显子9)。外显子1位于5'-非翻译区(5'-UTR)，并且具有三个变体，外显子1A、外显子1B、外显子1C和外显子1D。主要同种型包含外显子1A。外显子1B与IRF-5超活化和疾病进展相关。引入供体剪接位点的单核苷酸多态性(SNP)(例如，rs2004640)可导致增加的外显子1B转录物表达和减少的外显子1C衍生的转录物表达。其他SNP(例如，rs2280714)也与升高的IRF-5表达相关(Kozyrev等人，Arthritis andRheumatology(2007),56(4):1234-1241)。
下面提供了IRF-5的六个同种型。
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型1)
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型2)
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型3)
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型4)
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型5)
人干扰素调节因子5(IRF-5)(同种型6)
在实施方案中，IRF-5由编码IRF-5同种型1、IRF-5同种型2、IRF-5同种型3、IRF-5同种型4、IRF-5同种型5或IRF-5同种型6的核苷酸序列编码。在实施方案中，编码IRF-5的核苷酸序列与编码IRF-5同种型1、IRF-5同种型2、IRF-5同种型3、IRF-5同种型4、IRF-5同种型5或IRF-5同种型6的核苷酸序列的区别在于一个或多个核酸。在实施方案中，编码IRF-5的核苷酸序列的区别在于一种或多种多态性(例如，单核苷酸多态性或SNP)。在实施方案中，编码IRF-5的核苷酸序列与编码IRF-5同种型1、IRF-5同种型2、IRF-5同种型3、IRF-5同种型4、IRF-5同种型5或IRF-5同种型6的核苷酸序列共享小于100％的序列同一性。在实施方案中，IRF-5由与编码IRF-5同种型1、IRF-5同种型2、IRF-5同种型3、IRF-5同种型4、IRF-5同种型5或IRF-5同种型6的核酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列编码。在实施方案中，IRF-5由与编码IRF-5同种型1、IRF-5同种型2、IRF-5同种型3、IRF-5同种型4、IRF-5同种型5或IRF-5同种型6的核酸序列具有80％至100％、90％至100％、95％至100％、或99％至100％同一性的核苷酸序列编码。
IRF-5已被证明能够影响炎性巨噬细胞表型(Almuttaqi和Udalova,FEBS J.(2018),286:1624-1637)。巨噬细胞可分类为M1(经典活化的巨噬细胞)或M2(替代性活化的巨噬细胞)，并且可根据组织微环境相互转化。有三类替代性活化的巨噬细胞(M2a、M2b和M2c)。在正常组织中，M1与M2巨噬细胞的比率受到高度调节。M1和M2巨噬细胞之间的不平衡可导致诸如哮喘、慢性肺病、动脉粥样硬化或类风湿性关节炎中的破骨细胞生成的病状。IRF-5是促炎M1巨噬细胞极化的主要调节因子(Weiss等人Mediators of Inflammation(2013)Dx.doi.org/10.1155/2013/245804)。
)。天然单核细胞或募集的巨噬细胞暴露于Th1细胞因子IFN-γ、TNF或LPS会促进M1发育，其分泌促炎细胞因子诸如TNF、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23，并且促进Th1淋巴细胞的发育。单核细胞暴露于IL-4和IL-13会促进M2a表型，其表达促进Th2细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞生长的趋化因子。M2b巨噬细胞由LPS、免疫复合物、凋亡细胞和IL-1Ra的组合诱导。M2b巨噬细胞分泌高水平的IL-10和促炎细胞因子TNF和IL-6并且表达iNOS。M2c巨噬细胞由IL-10、TGF-β和糖皮质激素的组合诱导并且分泌IL-10和TGF-β，其促进Th2淋巴细胞的发育(Duque和Descoteaux.(2014)Front.Immunol.5:491.Doi:10.3389/fimmu.2014.00491)。
IRF-5在巨噬细胞中的表达由炎性刺激可逆地诱导，并且有助于巨噬细胞极化。IRF-5上调M1巨噬细胞的表达并下调M2巨噬细胞的表达(Krausgruber等人，Nat.Immunol.(2010),12(3):231-238)。
在实施方案中，提供了一种用于治疗炎性疾病的方法。在实施方案中，疾病与IRF-5的异常表达相关。在实施方案中，疾病与IRF-5过表达相关。在实施方案中，所述方法包括施用下调IRF-5表达的化合物。在实施方案中，所述化合物包含AC。AC可以是任何AC并且具有如本文别处所述的任何AC特征。在实施方案中，AC可结合到如本文别处所述的靶转录物的SE或SRE的至少一部分。在实施方案中，AC可结合到如本文别处所述的靶转录物的SE或SRE附近。在实施方案中，AC是ASO。在实施方案中，ASO是PMO。AC可结合到如本文别处所述的IRF-5靶转录物的任何剪接元件(SE)。
在实施方案中，所述方法包括施用诱导IRF-5mRNA转录物中一个或多个外显子的外显子跳跃的化合物。在实施方案中，所述方法包括施用包含反义化合物(AC)的化合物，所述反义化合物诱导IRF-5靶转录物中一个或多个外显子的跳跃。在实施方案中，AC与包含IRF-5靶转录物的至少一部分的靶核苷酸序列的杂交导致mRNA转录物中一个或多个外显子的包含或跳跃。在实施方案中，一个或多个外显子的跳跃或包含诱导IRF-5靶转录物中的移码。在实施方案中，移码得到编码具有降低活性的蛋白质的IRF-5靶转录物。在实施方案中，移码得到截短的或非功能性的IRF-5。在实施方案中，移码导致在IRF-5mRNA转录物中引入提前终止密码子。在实施方案中，移码导致IRF-5mRNA转录物通过无义介导的衰变而降解。在实施方案中，化合物包含诱导人和/或小鼠IRF-5的外显子2、3、4、5、6、7和/或8中的一者或多者的跳跃的反义化合物(AC)。在实施方案中，化合物包含诱导一个或多个外显子跳跃以产生框外移码的AC，从而导致IRF-5靶转录物被降解(例如，无义介导的衰变)或被翻译成具有降低活性或无活性的IRF-5蛋白。在实施方案中，化合物包含诱导外显子3、4、5和/或8中的一者或多者的跳跃以产生框外移码的AC。
在实施方案中，AC包含表11中的SEQ ID NO:157-161中的任一中。在实施方案中，AC包含表11中任一序列的10个至25个、10个至20个、或10个至15个连续碱基。在实施方案中，SEQ ID NO:340、365、369或其片段诱导外显子4的跳跃以在外显子5中产生提前终止密码子。在实施方案中，SEQ ID NO:340、365、369或其片段诱导外显子4的外显子跳跃，从而导致IRF-5靶转录物的无义介导的衰变。在实施方案中，SEQ ID NO:340和365或其片段诱导外显子4的跳跃以产生提前终止密码子。在实施方案中，SEQ ID NO:366至368或其片段诱导外显子5的外显子跳跃，从而导致外显子6中的提前终止密码子。在实施方案中，SEQ ID NO:366-368或其片段诱导外显子5的外显子跳跃，从而导致IRF-5靶转录物的无义介导的衰变。
表11：诱导外显子跳跃的AC序列
在实施方案中，化合物包含诱导一个或多个外显子的跳跃以在IRF-5靶转录物中产生框内缺失的AC。在实施方案中，化合物包含诱导外显子6和/或7中的一者或多者的跳跃以在IRF-5靶转录物中产生框内缺失的AC。
在实施方案中，提供了一种用于治疗与IRF-5相关的疾病或病症的方法。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5遗传变异相关。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5基因中的遗传突变相关。在实施方案中，IRF-5中的遗传突变导致IRF-5过表达。在实施方案中，遗传突变导致替代性同种型表达。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5过表达相关。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5同种型表达相关。
在实施方案中，提供了一种用于治疗患者的炎症、自身抗体产生、炎症细胞浸润、胶原沉积或炎性细胞因子产生的方法。
IRF-5参与多种疾病已有记载(参见例如Graham等人，Nat Genet.(2006),38(5):550-5；Rueda等人，Arthritis Rheum.(2006),54(12):3815-9；Henrique da Mota,ClinRheumatol.(2015),34(9):1495-501；Sigurdsson等人，Hum Mol Genet.(2008),17(6):872-81；Peng，等人，Nephrology(Carlton)(2010),15(7):710-3；Ishimura等人，J ClinImmunol.(2011),31(6):946-51；Summers等人，J Rheumatol.(2008),35(11):2106-18；Ni等人，Inflammation(2019),2(5):1821-1829；Dideberg等人，Hum Mol Genet.(2007),16(24):3008-16；Lim等人，J.Dig.Dis.(2015),16(4):205-16；Nordal等人，Ann.Rheum.Dis.(2012),71(7):1197-202；Rebora,Int.J.Dermatol.(2016),55(4):408-16；Zhao等人，Rheumatol.Int.(2017),37(8):1303-131；Carmona等人，PLoS One(2013),8(1):e54419；Flesch等人，Tissue Antigens(2011),78(1):65-8；Heijde等人，Arthritis Rheum.(2007),56(12):3989-94；Hafler等人，Genes Immun.(2009),10(1):68-76；Balasa等人，Eur.Cytokine Netw.(2012),23(4):166-72；Byre等人，Mucosal Immunol.(2017),10(3):716-726；Wang等人，Gene(2012),10,504(2):220-5；Pimenta等人，Mol.Cancer(2015),14(1):32；Rambod等人，Clin Rheumatol.(2018),37(10):2661-2665；Davi等人，JRheumatol.(2011),38(4):769-74；Zimmerman等人，Kidney 360(2020),1(3):179-190；Pandey等人，Mucosal.Immunol.(2019),12(4):874-887；Masuda等人，Nat.Commun.(2014),5:3771；Alzaid等人，JCI Insight(2016),1(20):e88689；Senevirante等人，Circulation(2017),136(12):1140-1154；Cevik等人，J.Biol.Chem.(2017),292(52):21676-21689；Sharif等人，Ann.Rheum.Dis.(2012),71(7):1197-1202；以及Yang等人，J Pediatr.Surg.(2017),52(12):1984-1988)。
在实施方案中，提供了使用本文公开的一种或多种化合物下调患者的IRF-5表达的方法。在实施方案中，巨噬细胞中的IRF-5表达降低。在实施方案中，库普弗细胞中的IRF-5表达降低。在实施方案中，胃肠道中的IRF-5表达降低。在实施方案中，IRF-5在肝脏中的表达降低。在实施方案中，IRF-5在肺部中的表达降低。在实施方案中，IRF-5在肾脏中的表达降低。在实施方案中，IRF-5在关节中的表达降低。在实施方案中，IRF-5在中枢神经系统中的表达降低。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗与IRF-5相关的疾病。与IRF-5相关的疾病的示例包括但不限于炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性硬化症、舍格伦综合征、多发性硬化症、硬皮病、间质性肺病(SSc-ILD)、多囊性肾病(PKD)、慢性肾病(CKD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、哮喘、重症哮喘以及它们的组合。在实施方案中，本文公开的化合物用于减少患者的炎症、硬化症、纤维化、蛋白尿、关节炎症、自身抗体产生、炎性细胞浸润、胶原沉积、炎性细胞因子产生或它们的组合。在实施方案中，本文公开的化合物用于减少胃肠道中的炎症、腹泻、疼痛、疲劳、腹部痉挛、便血、肠道炎症、胃肠道上皮屏障破坏、生态失调、排便频率增加、肛门括约肌的里急后重或疼痛性痉挛、便秘、意外的体重减轻或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗炎性疾病。“炎性疾病”是指其中先天或适应性免疫应答的激活是临床状况的主要原因的疾病。炎性疾病包括但不限于寻常痤疮、哮喘、COPD、自身免疫疾病、乳糜泻、慢性(斑块)前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病(IBD、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎、动脉粥样硬化、变态反应(1、2和3型超敏反应、花粉症)、炎性肌病如系统性硬化症，并且包括皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎、契-东综合征、慢性肉芽肿病、维生素A缺乏症、癌症(实体瘤、胆囊癌)、牙周炎、肉芽肿性炎症(肺结核、麻风病、结节病和梅毒)、纤维素性炎症、化脓性炎症、浆液性炎症、溃疡性炎症和缺血性心脏病、I型糖尿病、糖尿病性肾病以及它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗自身免疫疾病。“自身免疫疾病”是指患者的免疫系统攻击患者自身组织的疾病或病症。自身免疫疾病或病症的示例包括但不限于炎症反应，诸如炎症性皮肤病，包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病相关的反应(诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性病症，诸如湿疹和哮喘以及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附不足；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮性肾炎、皮肤狼疮)；系统性硬化症(硬皮病)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺综合征；自身免疫性甲状腺炎；桥本氏甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；舍格伦综合征；幼年型糖尿病；以及与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，其通常存在于肺结核、结节病、多肌炎、皮肌炎中；肉芽肿病和血管炎；原发性胆汁性肝硬化；恶性贫血(艾迪森病)；自身免疫性胃炎；自身免疫性肝炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；白癜风；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷沉球蛋白血症或库姆斯阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯病；兰伯特-伊顿肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺病；赖特氏病；僵人综合征；白塞病；巨细胞动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症；自身免疫性脑脊髓炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；强直性脊柱炎；肺纤维化；或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗自身免疫疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症(硬皮病)、多肌炎/皮肌炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、舍格伦综合征、自身免疫性脑脊髓炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、结节病、白塞病、重症肌无力、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化、结肠炎、肺纤维化、抗磷脂综合征或牛皮癣。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗心血管疾病。在实施方案中，心血管疾病与炎症相关。在实施方案中，心血管疾病包括系统性硬皮病。在实施方案中，心血管疾病包括动脉瘤；心绞痛；动脉粥样硬化；脑血管意外(卒中)；脑血管疾病；充血性心力衰竭；冠状动脉疾病；心肌梗死(心脏病发作)；外周血管疾病；或它们的组合。在实施方案中，心血管疾病包括动脉粥样硬化。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗胃肠疾病。在实施方案中，胃肠疾病包括克罗恩氏病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病、舍格伦综合征或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗泌尿系统疾病。在实施方案中，泌尿系统疾病包括系统性红斑狼疮、系统性硬皮病或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗遗传性、家族性或先天性疾病。在实施方案中，遗传性、家族性或先天性疾病包括克罗恩氏病、原发性胆汁性肝硬化、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、牛皮癣、炎性肠病或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗内分泌系统疾病。在实施方案中，内分泌系统疾病包括甲状腺腺癌、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、甲状腺功能减退或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗细胞增殖病症。在实施方案中，细胞增殖病症包括原发性胆汁性肝硬化、甲状腺腺癌、瘤或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗免疫系统疾病。在实施方案中，免疫系统疾病包括舍格伦综合征、炎性肠病、牛皮癣、肌炎、系统性硬皮病、自身免疫疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗血液病。在实施方案中，血液病包括系统性红斑狼疮。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗肌骨骼或结缔组织疾病。在实施方案中，肌骨骼或结缔组织疾病包括肌炎、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性脊柱侧凸或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗神经炎症性疾病。在实施方案中，神经炎症性疾病或病症包括由于创伤性脑损伤引起的炎症、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、自身免疫性脑炎、急性视神经炎(AON)、慢性脑膜炎、抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)病、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎(NMO)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症(MS)或它们的组合。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗由于微生物诸如病毒、细菌、真菌、寄生生物或它们的组合的感染引起的炎症。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗与纤维化相关的疾病，其在本文中被称为纤维化疾病。“纤维化”是指例如由于损伤、刺激或慢性炎症引起的纤维结缔组织的病理性形成，并且包括组织中超过正常量的成纤维细胞积累和胶原沉积。“纤维化疾病”是指与病理性纤维化相关的疾病。纤维化疾病的示例包括但不限于特发性肺纤维化；硬皮病；皮肤硬皮病；肺部硬皮病；胶原血管病(例如，狼疮；类风湿性关节炎；硬皮病)；遗传性肺纤维化(例如，赫曼斯基-普德拉克综合征)；放射线肺炎；哮喘；哮喘气道重塑；化疗诱导的肺纤维化(例如，博来霉素、甲氨蝶呤或环磷酰胺诱导)；放射性纤维化；戈谢病；间质性肺病；腹膜后纤维化；骨髓纤维化；间质或肺血管疾病；与药物暴露相关的纤维化或间质性肺病；与暴露相关的间质性肺病，诸如石棉肺、硅肺病和颗粒暴露；慢性超敏性肺炎；粘连；肠或腹腔粘连；心脏纤维化；肾纤维化；硬化症；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诱导的纤维化；或它们的组合。在实施方案中，纤维化疾病包括非酒精性脂肪性肝炎NASH。
在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗呼吸系统或胸部疾病，诸如系统性硬皮病。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗皮肤系统疾病，诸如牛皮癣或系统性硬皮病。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗视觉系统疾病，诸如舍格伦综合征或系统性硬皮病。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗与嗜酸性粒细胞计数、肾小球滤过率、收缩压、白细胞的嗜酸性粒细胞百分比或它们的组合相关的病症。在实施方案中，本文公开的化合物用于治疗溃疡疾病或口腔溃疡。
炎性肠病(IBD)
炎性肠病(IBD)是指以胃肠(GI)道的慢性炎症为特征的两种病症：克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。IBD的常见症状包括持续性腹泻、腹痛、直肠出血/便血、体重减轻和疲劳。2015年，估计有1.3％的美国成人(3百万人)报告被诊断为IBD(克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。IBD与肠巨噬细胞中由IRF-5促进的炎性巨噬细胞表型相关。
类风湿性关节炎(RA)
类风湿性关节炎(RA)是影响全世界0.5％至1％人口的自身免疫疾病。它会引起关节疼痛和遍及患者身体的损伤。RA的治疗通常包括使用减缓病情并防止关节变形的药物，称为改善病情的抗风湿药物(DMARD)和靶向免疫系统的触发引起关节和组织损伤的炎症的部分的生物制剂(抗体)。IRF-5多态性已被鉴定为RA的风险因素。降低的IRF-5水平与降低的疾病表型相关。TLR3和TLR7的IRF-5活化促进炎性细胞因子和趋化因子产生。
舍格伦综合征(SS)
舍格伦综合征(SS)是通过眼干和口干鉴定的免疫病症。该病症通常伴随有其他免疫系统病症，诸如类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。该疾病主要影响年龄在40-60岁之间的女性。在美国，原发性SS的患病率估计为每10,000个居民2至10个。现有的SS疗法包括治疗眼干和口干的症状。尚没有疾病改善疗法。在多项研究中，IRF-5rs2004640T等位基因和CGGGG插入/缺失与SS相关。
多发性硬化症(MS)
多发性硬化症(MS)是使中枢神经系统(脑和脊髓)衰弱的疾病。在MS中，免疫系统攻击覆盖神经纤维的保护鞘(髓磷脂)并且引起患者的脑和身体之间的通信问题。多发性硬化症引起广泛的神经症状，包括感觉或运动麻痹、视觉障碍、共济失调、协调受损、疼痛、认知功能障碍和疲劳。目前的估计表明在美国有300,000至400,000个个体受到影响，并且在全世界有超过2百万个个体受到影响。MS的治疗通常限于皮质类固醇和血浆置换疗法。
两种单核苷酸多态性(SNP)(rs4728142、rs3807306)和位于IRF-5基因的启动子和第一内含子中的5bp插入-缺失多态性与MS高度相关。Kristjansdottir等人(2008)“Interferon regulatory factor 5(IRF-5)gene variants are associated withmultiple sclerosis in three distinct populations,”J.Med.Genet.45(6):362-369。
硬皮病或系统性硬化症(SSc)
硬皮病是与皮肤和内部器官的广泛纤维化、小血管病变和产生自身抗体的免疫失调相关的慢性结缔组织疾病。Sharif等人(2012)“IRF-5polymorphism predictsprognosis in patients with systemic sclerosis,”Ann.Rheum.Dis.71(7):1197-1202。
IRF-5变体rs4728142与SSc患者的较长生存期和较低IRF-5转录物水平相关，并且预示SSc患者的较长生存期和较温和的间质性肺病(ILD)。不具有IRF-5rs4728142拷贝的患者增加了IRF-5表达水平并且经历了更严重的ILD和更短的生存期。在系统性硬化症(SS)的全基因组关联研究(GWAS)中鉴定了另外的单核苷酸多态性(rs10488631和rs12537284)。Sharif等人(2012)“IRF-5polymorphism predicts prognosis in patients withsystemic sclerosis,”Ann Rheum Dis.71(7):1197-202。
双同源盒4(DUX4)基因
面肩胛肱型肌营养不良(FSHD)是第三种最常见的遗传性肌营养不良的形式。它是由骨骼肌中转录因子双同源盒(DUX4)的不完全抑制引起的。肌原细胞中的DUX4过表达诱导不同的毒性级联反应，包括氧化应激反应的增加、无义介导的衰变抑制和肌生成的抑制(Bouwman等人，Curr.Opin.Neurol.(2020),33(5):635-640)。
DUX4基因位于4号染色体末端附近的称为D4Z4的区域。所述区域包含11至超过100个重复区段，每个区段约3,300个DNA碱基(3.3kb)长。D4Z4区中的每个重复区段含有DUX4基因的拷贝。最接近染色体末端的拷贝称为DUX4，而其他拷贝称为“DUX4样”或DUX4L。
DUXc也已被鉴定为在FSHD中被上调(Ansseau等人，PLoS One.(2009),4(10):e7482,doi:10.1371/journal.pone.0007482)。DUXc已被定位于D4Z4区的42kb着丝粒序列。DUX4c编码47kb与DUX4相同的蛋白质，羧基端区域除外。
FSHD的特征在于位于4号染色体的亚端粒区域中的D4Z4阵列的收缩，从而导致DUX4转录因子的异常表达和数百个基因的错误调控(Marsollier等人，(Int.J.Mol.Sci.(2018),19,1347,doi:10.3390/ijms19051347)。
人DUX4基因有四种变体，其核苷酸序列可通过NCBI数据库公开获得：变体1(NM_001306068.3)、变体2(NM_001293798.3)、变体3(NR_137167.1)和变体4(NM_001363820.2)。DUX4变体1和变体2都编码全长DUX4(DUX4-fl)。全长DUX4的过表达与FSHD相关。变体1和变体2之间的区别在于变体2与变体1相比在3'UTR中缺乏替代区段。与变体1相比，DUX4变体3在3'端具有多个差异，包括不同的3'末端。该变体被表示为非编码的，因为使用5'-最期望的翻译起始密码子使得该转录物成为无义介导的mRNA衰变(NMD)的候选物。与变体1相比，变体4缺少大部分编码区。与同种型DUX4-fl相比，所得截短的DUX4同种型(DUX4-s)具有更短且不同的C末端。DUX4-s蛋白已被证明对细胞无毒。
DUX4包含三个外显子。外显子一是DUX4蛋白的编码外显子，外显子2和3是未翻译的。全长DUX4蛋白包含两个DNA结合结构域和C-末端反式激活结构域。DUX4的截短同种型包含两个蛋白结合结构域，但不包含C-末端反式激活结构域。第一外显子包含两个5'剪接位点。根据所使用的5'ss，产生编码全长或截短的DUX4蛋白的转录物。为了产生全长同种型，使用位于第一外显子3'端的第一5'ss。为了产生截短的同种型，使用位于外显子1内并且比第一5'ss更接近转录物的5'端的第二5'ss。
变体1、2和4共享最后一个外显子。变体1、2和4的序列如下所示。
变体1(DUX4-fl2)：
变体2(DUX4-fl1)：
变体4(DUX4-s)：
由于FSHD是由获得功能突变引起的，因此DUX4和/或DUX4c抑制是有前景的治疗策略。除此之外或另选地，由于DUX4-s已被证明是无毒的，因此通过上调DUX4-s的表达来下调DUX4-fl的表达是可能的治疗策略。然而，DUX4的许多高度同源的拷贝可存在于人类基因组中，并且D4Z4重复片段是极其富含GC的，使得DUX4和DUX4c成为困难的靶标。此时，尚没有预防或延缓FSHD患者的病情进展的疗法(Bouwman等人，Curr.Opin.Neurol.(2020),33(5):635-640)。
美国专利号10,907,157和加拿大专利号2999192描述了使用反义剂和RNA干扰剂来降低DUX4或DUX4c的表达。公布PCT US2017/019422已使用小核RNA来诱导DUX4的外显子跳跃，从而导致DUX4-s的表达。靶向DUX4的各种SE的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物已显示出能够改变DUX4下游基因的表达(Marsollier等人，Human molecular genetics(2016),25(8),1468-1478；以及Lu-Nguyen等人，Hum Mol Genet.(2021),30(15):1398-1412)。
本文提供了用于调节DUX4和/或DUX4c表达的组合物和方法。在实施方案中，提供了用于治疗FSHD的化合物。在实施方案中，提供了诱导DUX4转录物中外显子跳跃的化合物，从而导致DUX4-s而不是DUX4-fl的表达。在实施方案中，该化合物包含至少一种AC和至少一种CPP。
在实施方案中，AC与包含DUX4转录物的剪接元件的至少一部分的靶核苷酸序列杂交。在实施方案中，AC与包含DUX4转录物的至少一部分的靶核苷酸序列杂交并且诱导外显子跳跃以产生编码DUX4-s的转录物。在实施方案中，外显子跳跃上调DUX4-s的表达。在实施方案中，外显子跳跃下调DUX4-fl的表达。
在实施方案中，提供了诱导DUX4靶转录物的选择性剪接的化合物和方法。在实施方案中，提供了将DUX4的剪接转移到第二个5'ss以产生编码截短的DUX4蛋白的转录物的化合物和方法。在实施方案中，提供了下调全长DUX4 mRNA转录物和/或蛋白质的产生的化合物和方法。在实施方案中，提供了上调截短的DUX4 mRNA转录物和/或蛋白质的产生的化合物和方法。在实施方案中，所述化合物包含AC。AC可以是任何AC并且具有如本文别处所述的任何AC特征。在实施方案中，AC是ASO。在实施方案中，ASO是PMO。AC可结合到如本文别处所述的DUX4靶转录物的任何剪接元件。
在实施方案中，AC包含公布PCT US2017/019422(美国专利号11,180,755)中的小核RNA的任何部分。在实施方案中，AC包含表12中的序列的任何部分。
表12：靶向DUX4的各种AC序列
在实施方案中，AC可包含表12中任一序列的10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个连续碱基。在实施方案中，AC可包含表12中任一序列的25个或更少个、20个或更少个、或15个或更少个连续碱基。在实施方案中，AC可包含表12中任一序列的10-25个、10-20个或10-15个连续碱基。在实施方案中，AC可包含表12中任一序列的15-25个或10-20个连续碱基。在实施方案中，AC可包含表12中任一序列的20-25个连续碱基。
治疗方法
本公开提供了一种治疗对其有需要的患者的疾病的方法，该方法包括施用本文公开的化合物。在实施方案中，疾病是本公开中提供的任何疾病。在实施方案中，治疗疾病的方法包括向患者施用本文公开的化合物，从而治疗疾病。在实施方案中，治疗与IRF-5、GYS1或DUX4相关的疾病的方法包括向患者施用本文公开的化合物，从而治疗疾病。
在实施方案中，患者被鉴定为患有与IRF-5、GYS1或DUX4相关的疾病或具有患所述疾病的风险。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5、GYS1或DUX4遗传变异相关。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5基因、GYS1基因或DUX4基因的遗传突变相关。在实施方案中，遗传突变导致IRF-5、GYS1或DUX4(例如，DUX4-fl)的过表达。在实施方案中，遗传突变导致IRF-5、GYS1或DUX4的另选同种型的表达。在实施方案中，疾病或病症与IRF-5、GYS1或DUX4(例如，DUX4-fl)的过表达相关。
在各种实施方案中，治疗是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制患者的一种或多种症状，延迟所述症状的发作，降低所述症状的严重程度和/或发生率。
在实施方案中，提供了一种通过下调靶蛋白的表达来治疗疾病或病症的方法。在实施方案中，靶蛋白的表达通过诱导外显子跳跃来下调。在实施方案中，外显子跳跃诱导导致靶蛋白的表达或活性降低的移码。在实施方案中，外显子跳跃导致提前终止密码子和靶转录物的降解。在实施方案中，治疗导致蛋白质同种型的表达降低。
在实施方案中，治疗调节对其有需要的患者的IRF-5活性。在实施方案中，治疗调节患者的细胞中的IRF-5活性。在实施方案中，治疗调节患者的免疫细胞中的IRF-5活性。在实施方案中，免疫细胞是单核细胞、淋巴细胞或树突状细胞。在实施方案中，淋巴细胞是B-淋巴细胞。在实施方案中，单核细胞是巨噬细胞。在实施方案中，巨噬细胞是组织驻留巨噬细胞。在实施方案中，巨噬细胞是单核细胞衍生的巨噬细胞。在实施方案中，巨噬细胞是库普弗细胞、肾小球内系膜细胞、肺泡巨噬细胞、窦组织细胞、霍夫鲍尔细胞、小神经胶质细胞或朗格汉斯细胞。在实施方案中，免疫细胞是库普弗细胞。
在实施方案中，治疗调节对其有需要的患者的DUX4活性。在实施方案中，治疗调节患者的细胞中的DUX4活性。在实施方案中，治疗调节患者的肌细胞中的DUX4活性。在实施方案中，肌细胞是骨骼肌细胞。
在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低5％至10％、5％至20％、5％至30％、5％至40％、5％至50％、5％至60％、5％至70％、5％至80％、5％至90％或5％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低10％至20％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％或10％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低20％至30％、20％至40％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％或20％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低30％至40％、30％至50％、30％至60％、30％至70％、30％至80％、30％至90％或30％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％或40％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％或50％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低60％至70％、60％至80％、60％至90％或60％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低70％至80％、70％至90％或70％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达降低80％至90％或80％至100％。在实施方案中，与治疗前的患者、未治疗的患有类似疾病的一个或多个对照个体中靶蛋白的平均水平和/或活性相比，或与使用未与本文公开的CPP缀合的治疗性部分的治疗相比，根据本公开的治疗导致患者的IRF-5、DUX4-fl或GYS1活性和/或表达的降低90％至100％。
如本文所用的术语“改善”、“增加”、“减少”、“降低”等表示相对于对照的值。在实施方案中，合适的对照是基线测量，诸如在开始本文所述的治疗之前同一个体中的测量，或在不存在本文所述的治疗的对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是患有相同疾病的个体，其与被治疗的个体的年龄和/或性别大致相同(以确保被治疗的个体和对照个体的疾病阶段是相当的)。
被治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是患有疾病或具有发展疾病的可能性的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人)。个体可能患有由异常基因表达或异常基因剪接介导的疾病。在各种实施方案中，患有疾病的个体的野生型靶蛋白表达或活性水平可低于未患该疾病的个体的正常蛋白表达或活性水平的约1％-99％。在实施方案中，该范围包括但不限于低于正常胸苷磷酸化酶表达或活性水平的约80％-99％、低于约65％-80％、低于约50％-65％、低于约30％-50％、低于约25％-30％、低于约20％-25％、低于约15％-20％、低于约10％-15％、低于约5％-10％、低于约1％-5％。在实施方案中，个体的靶蛋白表达或活性水平可以比正常野生型靶蛋白表达或活性水平高1％-500％。在实施方案中，该范围包括但不限于高约1％-10％、约10％-50％、约50％-100％、约100％-200％、约200％-300％、约300％-400％、约400％-500％或约500％-1000％。
在实施方案中，个体是最近被诊断患有疾病的患者。通常，早期治疗(在确诊后尽可能快地开始治疗)减少了疾病的影响并且增加了治疗的有益效果。
组合物和施用方法
在实施方案中，提供了包含一种或多种本文所述化合物的组合物。
在实施方案中，提供了所公开的化合物的药学上可接受的盐和/或前药。药学上可接受的盐包括根据化合物上发现的特定取代基用酸或碱制备的所公开的化合物的盐。在其中本文公开的化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的条件下，以盐的形式施用化合物可以是适当的。药学上可接受的碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理上可接受的酸加成盐的示例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、碳酸、硫酸和有机酸如乙酸、丙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、扁桃酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、α-糖磷酸、马来酸、甲苯磺酸、甲磺酸等。因此，本文公开了盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。化合物的药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准方法获得，例如，通过使足够碱性的化合物诸如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应。还可制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
所公开的化合物和含有它们的组合物的体内应用可通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来实现。例如，所公开的化合物可被配制成生理学上或药学上可接受的形式，并通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括例如口服和肠胃外施用途径。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内和鞘内施用，诸如通过注射。所公开的化合物或组合物的施用可以是单次施用，或以连续或不同的间隔施用，如本领域技术人员可容易地确定的。
本文公开的化合物和包含它们的组合物也可利用脂质体技术、缓释胶囊、可植入泵和可生物降解容器来施用。这些递送方法可有利地在延长的时间段内提供均匀的剂量。化合物还可以其盐衍生物形式或结晶形式施用。
本文公开的化合物可根据用于制备药学上可接受的组合物的已知方法配制。在本领域技术人员熟知且容易获得的许多来源中详细描述了制剂。例如，Remington'sPharmaceutical Science,E.W.Martin(1995)描述了可与所公开的方法结合使用的制剂。通常，本文公开的化合物可被配制成使得有效量的化合物与合适的载剂组合，以便促进化合物的有效施用。所用的组合物还可以是各种形式。这些剂型包括例如固体、半固体和液体剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射和可输注溶液、以及喷雾剂。形式取决于预期的施用方式和治疗应用。组合物还可包含本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载剂和稀释剂。与化合物一起使用的载剂或稀释剂的示例包括乙醇、二甲亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水和等效载剂和稀释剂。为了提供用于期望的治疗性治疗的此类剂量的施用，基于包含载剂或稀释剂的总组合物的重量，本文公开的组合物可有利地包含总共约0.1重量％至100重量％之间的主题化合物中的一种或多种。
适于施用的制剂包括例如无菌注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前仅需要无菌液体载剂(例如注射用水)的条件。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应当理解，除了以上特别提及的成分外，本文公开的组合物还可包含本领域中关于所讨论的制剂类型的其他常规剂。
本文公开的化合物和包含它们的组合物可通过与细胞直接接触或经由载剂手段递送至细胞。用于将化合物和组合物递送至细胞的载剂手段是本领域已知的，并且包括例如将组合物包封在脂质体部分中。用于将本文公开的化合物和组合物递送至细胞的另一手段包括将化合物附接到靶向递送至靶细胞的蛋白质或核酸。美国专利号6,960,648和美国申请公开号20030032594和20020120100公开了可与另一种组合物偶联并允许该组合物跨生物膜易位的氨基酸序列。美国申请公开号20020035243也描述了用于跨细胞膜转运生物部分以用于细胞内递送的组合物。也可将化合物掺入聚合物中，该聚合物的示例包括用于颅内肿瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酯)聚合物；摩尔比为20:80的聚[双(对羧基苯氧基)丙烷：癸二酸](如GLIADEL中所用)；软骨素；甲壳质；和壳聚糖。
本文公开的化合物和组合物，包括其药学上可接受的盐或前药，可通过输注或注射静脉内、肌内或腹膜内施用。活性剂或其盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精以及它们的混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适于临时制备任选地包封在脂质体中的无菌可注射或可输注溶液或分散体。最终剂型应当是无菌的、流体的并且在制造和储存条件下是稳定的。液体载剂或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯以及它们的合适混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来维持。任选地，可通过各种其他抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，期望包含等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。通过包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的本文公开的化合物和/或药剂与上文列举的各种其他成分掺入适当溶剂中，根据需要，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上存在于先前无菌过滤的溶液中的任何附加的期望成分的粉末。
对于局部施用，本文公开的化合物和药剂可作为液体或固体形式应用。然而，通常期望将它们作为与皮肤病学可接受的载剂组合的组合物局部施用于皮肤，该载剂可以是固体或液体。本文公开的化合物和药剂以及组合物可局部施用于患者的皮肤以减小恶性或良性生长物的大小(并且可包括完全去除)，或治疗感染部位。本文公开的化合物和药剂可直接应用于生长或感染部位。在实施方案中，化合物和药剂以诸如软膏、霜剂、洗剂、溶液剂、酊剂等制剂应用于生长或感染部位。
有用的固体载剂包括精细分散的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载剂包括水、醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中化合物可以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。可添加佐剂诸如香料和附加的抗微生物剂以改善针对给定用途的特性。所得液体组合物可从吸收垫应用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用例如泵型或气溶胶喷雾器喷雾到受影响区域上。
增稠剂诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可与液体载剂一起使用以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，用于直接应用于使用者的皮肤。
本文公开的化合物和药剂以及药物组合物的有用剂量可通过比较它们在动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的。
组合物施用的剂量范围是大到足以产生影响症状或障碍的期望效果的剂量范围。剂量不应大到引起不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，剂量可由个别医师调整。剂量可变化，并且可每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。
还公开了包含本文公开的化合物与药学上可接受的载剂的组合的药物组合物。在实施方案中，该药物组合物适于口服、局部或肠胃外施用。施用于患者、具体地人的剂量应当足以在合理的时间范围内在患者中实现治疗反应，而没有致死毒性，并且不会引起超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括患者的状况(健康)、患者的体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率、治疗比率以及病理状况的严重程度和阶段。
还公开了在一个或多个容器中包含本文公开的化合物的试剂盒。所公开的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载剂和/或稀释剂。在实施方案中，试剂盒包括一种或多种如本文所述的其他组分、助剂或佐剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗癌剂，诸如本文所述的那些药剂。在实施方案中，试剂盒包括描述如何施用试剂盒的化合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何合适的尺寸、形状或构型。在实施方案中，本文公开的化合物和/或药剂作为固体(诸如片剂、丸剂或粉末形式)提供在试剂盒中。在另一个实施方案中，本文公开的化合物和/或药剂作为液体或溶液提供在试剂盒中。在实施方案中，试剂盒包括含有液体或溶液形式的本文公开的化合物和/或药剂的安瓿或注射器。
某些定义
如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种此类组合物的混合物，提及“一种药剂”包括两种或更多种此类药剂的混合物，提及“该组分”包括两种或更多种此类组分的混合物，等等。
术语“约”当紧接在数值之前时意指范围(例如，该值的加或减10％)。例如，“约50”可意指45至55，“约25,000”可意指22,500至27,500等。除非本公开的上下文另外指出，或者与此类解释不一致。例如，在诸如“约49、约50、约55、…”的数值列表中，“约50”意指延伸至小于前后值之间一半间隔的范围，例如，大于49.5至小于52.5。此外，短语“小于约”值或“大于约”值应当根据本文提供的术语“约”的定义来理解。类似地，术语“约”当在一系列数值或数值范围(例如，“约10、20、30”或“约10-30”)之前时分别指该系列中的所有数值或该范围的端点。
如本文所用，“细胞穿透肽”或“CPP”是指促进将货物例如治疗性部分(TM)递送到细胞中的肽。在实施方案中，CPP是环状的并且表示为“cCPP”。在实施方案中，cCPP能够引导治疗性部分穿透细胞膜。在实施方案中，cCPP将治疗性部分递送到细胞的胞质溶胶。在实施方案中，cCPP将反义化合物(AC)递送到前mRNA所在的细胞位置。
如本文所用，术语“内体逃逸载体”(EEV)是指通过化学连接(即，共价键或非共价相互作用)与接头和/或环外肽(EP)缀合的cCPP。EEV可以是式(B)的EEV。
如本文所用，术语“EEV-缀合物”是指通过化学连接(即，共价键或非共价相互作用)与货物缀合的本文定义的内体逃逸载体。货物可以是可通过EEV递送到细胞中的治疗性部分(例如，寡核苷酸、肽或小分子)。EEV-缀合物可以是式(C)的EEV-缀合物。
如本文所用，术语“环外肽”(EP)和“调节肽”(MP)可互换使用，是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，其可与本文公开的环状细胞穿透肽(cCPP)缀合。当与本文公开的环肽缀合时，EP可改变化合物的组织分布和/或保留。典型地，EP包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个精氨酸残基。本文描述了EP的非限制性示例。EP可以是在本领域中被鉴定为“核定位序列”(NLS)的肽。核定位序列的非限制性示例包括SV40病毒大T抗原的核定位序列，其最小功能单元是七个氨基酸的序列PKKKRKV(SEQ ID NO:42)、具有序列NLSKRPAAIKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:52)的双分型核质蛋白NLS、具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO:53)或RQRRNELKRSF(SEQ ID NO:54)的c-myc核定位序列、来自输入蛋白-α的IBB域的序列RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQID NO:50)、肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:57)和PPKKARED(SEQ ID NO:58)、人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO:59)、小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:60)、流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:61)和PKQKKRK(SEQ ID NO:62)、肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:63)和小鼠Mxl蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:64)、人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:65)和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:66)。国际公开号2001/038547描述了NLS的附加示例并且全文以引用方式并入本文。
如本文所用，“接头”或“L”是指将一个或多个部分(例如，环外肽(EP)和货物，例如寡核苷酸、肽或小分子)与环状细胞穿透肽(cCPP)共价结合的部分。接头可包含天然或非天然氨基酸或多肽。接头可以是含有两个或更多个适于将cCPP结合到货物部分从而形成本文公开的化合物的适当官能团的合成化合物。接头可包含聚乙二醇(PEG)部分。接头可包含一个或多个氨基酸。cCPP可经由接头与货物共价结合。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含通过一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的α氨基基团连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。两个或更多个氨基酸残基可通过一个氨基酸的羧基基团与α氨基基团连接。多肽的两个或更多个氨基酸可通过肽键接合。多肽可包括肽主链修饰，其中两个或更多个氨基酸通过除肽键以外的键共价连接。多肽可包括一种或多种非天然氨基酸、氨基酸类似物或能够整合到多肽中的其他合成分子。术语多肽包括天然存在的和人工存在的氨基酸。术语多肽包括例如包含约2至约100个氨基酸残基的肽以及包含超过约100个氨基酸残基或超过约1000个氨基酸残基的蛋白质，包括但不限于治疗性蛋白质，诸如抗体、酶、受体、可溶性蛋白质等。
如本文所用，术语“邻接”是指通过共价键连接的两个氨基酸。例如，在代表性环状细胞穿透肽(cCPP)诸如AA1/AA2、AA2/AA3、AA3/AA4和AA5/AA1的情况下举例说明了邻接氨基酸对。
如本文所用，化学物质的残基是指存在于特定产物中的化学物质的衍生物。为了形成产物，该物质的至少一个原子被与另一部分的键取代，使得产物含有该化学物质的衍生物或残基。例如，本文所述的环状细胞穿透肽(cCPP)具有通过形成一个或多个肽键而掺入其中的氨基酸(例如，精氨酸)。掺入cCPP中的氨基酸可称为残基，或简单地称为氨基酸。因此，精氨酸或精氨酸残基是指
术语“其质子化形式”是指氨基酸的质子化形式。例如，精氨酸侧链上的胍基可被质子化以形成胍基团。质子化形式的精氨酸的结构是
如本文所用，术语“手性”是指具有多于一种在原子的三维空间排列上不同的立体异构体的分子，其中一种立体异构体是另一种立体异构体的不可重叠的镜像。除了甘氨酸外，氨基酸具有与羧基基团相邻的手性碳原子。术语“对映体”是指手性的立体异构体。手性分子可以是具有“D”和“L”对映体的氨基酸残基。没有手性中心的分子，诸如甘氨酸，可被称为“非手性的”。
如本文所用，术语“疏水的”是指不溶于水或在水中溶解度极小的部分。通常，中性部分和/或非极性部分，或者主要是中性和/或非极性的部分是疏水的。疏水性可通过本文公开的方法之一来测量。
如本文所用，“芳族”是指具有4n+2π电子的不饱和环分子，其中n是任何整数。术语“非芳族”是指不属于芳族定义的任何不饱和环分子。
“烷基”、“烷基链”或“烷基基团”是指具有一至四十个碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的完全饱和的直链或支链烃链基团。包括包含1至40个碳原子的任何数量的烷基。包含至多40个碳原子的烷基是C1-C40烷基，包含至多10个碳原子的烷基是C1-C10烷基，包含至多6个碳原子的烷基是C1-C6烷基，并且包含至多5个碳原子的烷基是C1-C5烷基。C1-C5烷基包括C5烷基、C4烷基、C3烷基、C2烷基和C1烷基(即，甲基)。C1-C6烷基包括上文对于C1-C5烷基所述的所有部分，但也包括C6烷基。C1-C10烷基包括上文对于C1-C5烷基和C1-C6烷基所述的所有部分，但也包括C7、C8、C9和C10烷基。类似地，C1-C12烷基包括所有前述部分，但也包括C11和C12烷基。C1-C12烷基的非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基基团可任选地被取代。
“亚烷基”、“亚烷基链”或“亚烷基基团”是指具有一至四十个碳原子的完全饱和的直链或支链二价烃链基团。C2-C40亚烷基的非限制性示例包括亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可任选地被取代。
“烯基”、“烯基链”或“烯基基团”是指具有二至四十个碳原子并具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃链基团。每个烯基基团通过单键与分子的其余部分附接。包括包含2至40个碳原子的任何数量的烯基基团。包含至多40个碳原子的烯基是C2-C40烯基，包含至多10个碳原子的烯基是C2-C10烯基，包含至多6个碳原子的烯基是C2-C6烯基，并且包含至多5个碳原子的烯基是C2-C5烯基。C2-C5烯基包括C5烯基、C4烯基、C3烯基和C2烯基。C2-C6烯基包括上文关于C2-C5烯基所述的所有部分，但也包括C6烯基。C2-C10烯基包括上文对于C2-C5烯基和C2-C6烯基所述的所有部分，但也包括C7、C8、C9和C10烯基。类似地，C2-C12烯基包括所有前述部分，但也包括C11和C12烯基。C2-C12烯基的非限制性示例包括乙烯基(ethenyl/vinyl))、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-己烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一烯基、2-十一烯基、3-十一烯基、4-十一烯基、5-十一烯基、6-十一烯基、7-十一烯基、8-十一烯基、9-十一烯基、10-十一烯基、1-十二烯基、2-十二烯基、3-十二烯基、4-十二烯基、5-十二烯基、6-十二烯基、7-十二烯基、8-十二烯基、9-十二烯基、10-十二烯基和11-十二烯基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基基团可任选地被取代。
“亚烯基”、“亚烯基链”或“亚烯基基团”是指具有二至四十个碳原子并且具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链二价烃链基团。C2-C40亚烯基的非限制性示例包括乙烯、丙烯、丁烯等。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烯基链可以是任选的。
“烷氧基”或“烷氧基基团”是指基团-OR，其中R是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷氧基基团可任选地被取代。
“酰基”或“酰基基团”是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，如本文所定义。除非在说明书中另有具体说明，否则酰基可任选地被取代。
“烷基氨基甲酰基”或“烷基氨基甲酰基基团”是指基团-O-C(O)-NRaRb，其中Ra和Rb相同或不同并且独立地是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基，或RaRb可合一起形成如本文所定义的环烷基基团或杂环基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基氨基甲酰基基团可任选地被取代。
“烷基羧酰胺基”或“烷基羧酰胺基基团”是指基团-C(O)-NRaRb，其中Ra和Rb相同或不同并且独立地是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基或杂环基基团，或RaRb可合一起形成如本文所定义的环烷基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基羧酰胺基基团可任选地被取代。
“芳基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环体系基团。为了本发明的目的，芳基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠环或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯(acenaphthylene)、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、薁(azulene)、苯、屈(chrysene)、荧蒽(fluoranthene)、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯(pleiadene)、芘和苯并菲的芳基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则术语“芳基”意指包括任选取代的芳基基团。
“杂芳基”是指包含氢原子、一至十三个碳原子、一至六个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5至20元环体系基团。为了本发明的目的，杂芳基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠环或桥环体系；并且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。示例包括但不限于氮杂环庚烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯基、1,4-苯并二烷基、苯并萘并呋喃基、苯并唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、中氮茚基、异唑基、萘啶基、二唑基、2-氧代氮杂环庚烯基、唑基、环氧乙烷基、1-氧吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非在说明书中另有具体说明，否则杂芳基基团可任选地被取代。
本文所用的术语“取代的”意指其中至少一个原子被非氢原子替换的任何上述基团(即，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰基、烷基氨基甲酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、烷硫基或芳硫基)，该非氢原子诸如但不限于：卤素原子，诸如F、Cl、Br和I；基团诸如羟基基团、烷氧基基团和酯基团等中的氧原子；基团诸如硫醇基团、硫代烷基基团、砜基团、磺酰基基团和亚砜基团中的硫原子；基团诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团诸如三烷基甲硅烷基基团、二烷基芳基甲硅烷基基团、烷基二芳基甲硅烷基基团和三芳基甲硅烷基基团中的硅原子；以及各种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指其中一个或多个原子被与杂原子(诸如氧代、羰基、羧基和酯基团中的氧)的高阶键(例如双键或三键)替换的任何上述基团；以及基团诸如亚胺、肟、腙和腈中的氮。例如，“取代的”包括其中一个或多个原子被-NRgRh、-NRgC(＝O)Rh、-NRgC(＝O)NRgRh、-NRgC(＝O)ORh、-NRgSO2Rh、-OC(＝O)NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SO2Rg、-OSO2Rg、-SO2ORg、＝NSO2Rg和-SO2NRgRh替换的任何上述基团。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被-C(＝O)Rg、-C(＝O)ORg、-C(＝O)NRgRh、-CH2SO2Rg、-CH2SO2NRgRh替换的任何上述基团。在上文中，Rg和Rh相同或不同，并且独立地是氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”还意指其中一个或多个原子被氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤代、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基替换的任何上述基团。“取代的”还可意指侧链上的一个或多个原子被烷基、烯基、炔基、酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基替换的氨基酸。此外，前述取代基中的每一者还可任选地被上述取代基中的一者或多者取代。
如本文所用，符号(下文中可称为“附接点键”)表示作为两个化学实体之间的附接点的键，其中一个化学实体被描述为与附接点附接，另一个未被描述为与附接点附接。例如，表示化学实体“XY”经由附接点键与另一化学实体键合。此外，与未描述的化学实体的具体附接点可通过推断来指定。例如，化合物CH3-R3，其中R3是H或推断当R3是“XY”时，附接点键是与R3被描述为与CH3键合的键相同的键。
如本文所用，“受试者”是指个体。因此，“受试者”可包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟。“受试者”还可包括哺乳动物，诸如灵长类动物或人。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如，医师)的治疗下的受试者。
术语“抑制”是指活性、反应、病症、疾病或其他生物参数的降低。这可包括但不限于活性、反应、病症或疾病的完全消除。这还可包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病症或疾病减少10％。因此，减少可以是与天然或对照水平相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何量的减少。
“减少”或该词的其他形式，诸如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”，意指事件或特征(例如，肿瘤生长)的降低。应当理解，这通常与一些标准或预期值有关，换句话讲，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”意指相对于标准或对照(例如，未治疗的肿瘤)减少肿瘤的生长速率。
术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍而对患者进行的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或障碍的治疗，并且还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或障碍的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而非治愈疾病、病理状况或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或障碍的特定疗法的治疗。
术语“治疗有效”是指所用组合物的量足以改善疾病或障碍的一种或多种病因或症状。此类改善仅需要减少或改变，而不必消除。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“载剂”意指化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，其有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或用于其预期用途或目的的任何其他特征。例如，可选择载剂以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指适于施用于患者的载剂。药学上可接受的载剂是指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在临近使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当的流动性可例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可期望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可注射制剂可例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，该无菌固体组合物可在临近使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载剂可包括糖诸如乳糖。
术语“药学上可接受的盐”包括通过使用作碱的活性化合物与无机酸或有机酸反应以形成盐而获得的那些，例如盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟脑磺酸、草酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、甲酸、氢溴酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、水杨酸、扁桃酸、碳酸等的盐。本领域技术人员将进一步认识到，酸加成盐可通过化合物与适当的无机酸或有机酸经由多种已知方法中的任一种反应来制备。术语“药学上可接受的盐”还包括通过使用作酸的活性化合物与无机碱或有机碱反应以形成盐而获得的那些，例如乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三-(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺(ephenamine)、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸等的盐。无机或金属盐的非限制性示例包括锂盐、钠盐、钙盐、钾盐、镁盐等。
如本文所用，术语“肠胃外施用”是指通过注射或输注施用。肠胃外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用或肌内施用。
如本文所用，术语“皮下施用”是指在皮肤下方施用。“静脉内施用”意指施用到静脉中。
如本文所用，术语“剂量”是指在单次施用中提供的药剂的指定量。在实施方案中，剂量可以两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂施用。在需要皮下施用的实施方案中，期望剂量需要不易通过单次注射施用的体积。在此类实施方案中，可以使用两个或更多个注射剂以达到期望的剂量。在实施方案中，剂量可以在两个或更多个注射剂中施用以减少病人的注射部位反应。
如本文所用，术语“剂量单位”是指在其中提供药剂的形式。在实施方案中，剂量单位是包含冻干的反义寡核苷酸的小瓶。在实施方案中，剂量单位是包含重构的反义寡核苷酸的小瓶。
术语“治疗性部分”(TM)是指可用于治疗疾病或病症的至少一种症状的化合物，并且可包括但不限于治疗性多肽、寡核苷酸、小分子和可用于治疗疾病或病症的至少一种症状的其他药剂。在实施方案中，治疗性部分调节靶蛋白的表达或活性。在实施方案中，治疗性部分调节剪接。在实施方案中，治疗性部分诱导靶mRNA转录物中的外显子跳跃。在实施方案中，治疗性部分下调靶蛋白的表达或活性。在实施方案中，治疗性部分通过诱导靶转录物中的外显子跳跃来下调靶蛋白的表达或活性。
术语“调节(modulate)”、“调节(modulating)”和“调节(modulation)”是指当与调节前的表达、功能或活性水平相比时对表达、功能或活性的扰动。调节可包括表达、功能或活性的增加(刺激或诱导)或降低(抑制或减少)。在实施方案中，本文公开的化合物包含下调靶蛋白的表达、功能和/或活性的治疗性部分(TM)。在实施方案中，本文公开的化合物包含上调靶蛋白的表达、功能和/或活性的治疗性部分。
“氨基酸”是指包含氨基基团和羧酸基团并且具有通式的有机化合物，其中R可以是任何有机基团。氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。氨基酸可以是蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。术语“氨基酸侧链”或“侧链”是指与天然或非天然α-氨基酸的α-碳结合的特征性取代基(“R”)。氨基酸可经由肽键掺入多肽中。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个寡核苷酸或多肽序列之间的分别是相同的且处于相同相对位置的核酸或氨基酸的百分比。因此，一个序列与另一个序列相比具有一定百分比的序列同一性。对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。本领域普通技术人员将理解，如果两个序列在对应的位置含有相同的残基，则它们通常被认为是“基本上相同的”。在实施方案中，序列之间的序列同一性可使用尼德曼-翁施算法来确定(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，该算法在EMBOSS软件包的Needle程序实现(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，Trends Genet.(2000),16:276-277)中实现，采用在提交日期时存在的版本。所用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比并且如下计算：(相同残基×100)/(比对长度-比对空位总数)
在其他实施方案中，序列同一性可使用史密斯-沃特曼算法确定，采用在提交日期时存在的版本。
如本文所用，“序列同源性”是指两个多肽序列之间的同源且处于相同相对位置的氨基酸的百分比。因此，一个多肽序列与另一个多肽序列相比具有一定百分比的序列同源性。如本领域普通技术人员将理解的那样，如果两个序列在对应的位置含有同源残基，则它们通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。另选地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不同残基。例如，如本领域普通技术人员众所周知的那样，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链，并且一个氨基酸取代另一个相同类型的氨基酸通常可被认为是“同源”取代。
如本领域众所周知的那样，氨基酸序列可使用多种算法中的任一种来比较，包括可在商用计算机程序中获得的那些，诸如BLASTP、gapped BLAST和PSI-BLAST，其在提交日期时存在。此类程序描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.,(1990),215(3):403-410；Altschul等人，Nucleic Acids Res.(1997),25:3389-3402；Baxevanis等人，Bioinformatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人，(编),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999。除了鉴定同源序列之外，上述程序通常会提供同源性程度的指示。
如本文所用，“细胞靶向部分”是指特异性地结合靶细胞表面上的分子诸如受体的分子或大分子。在实施方案中，细胞表面分子仅在靶细胞的表面上表达。在实施方案中，细胞表面分子也存在于一种或多种非靶细胞的表面上，但细胞表面分子表达的量在靶细胞的表面上更高。细胞靶向部分的示例包括但不限于抗体、肽、蛋白质、适体或小分子。
如本文所用，术语“反义化合物”和“AC”可互换使用，是指与其(该AC)杂交的靶核酸分子至少部分地互补的聚合核酸结构。AC可以是短的(在实施方案中，少于50个碱基)多核苷酸或多核苷酸同系物，其包含与靶序列互补的序列。在实施方案中，AC是包含与靶前mRNA链中的靶序列互补的序列的多核苷酸或多核苷酸同系物。AC可由天然核酸、合成核酸、核酸同系物或它们的任何组合形成。在实施方案中，AC包括寡核苷。在实施方案中，AC包括反义寡核苷酸。在实施方案中，AC包含缀合基团。AC的非限制性示例包括但不限于引物、探针、反义寡核苷酸、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA、寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物和这些的嵌合组合。因此，这些化合物可以单链、双链、环状、支链或发夹的形式引入，并且可含有结构元件诸如内部或末端凸起或环。寡聚双链化合物可以是杂交形成双链化合物的两条链，或者是具有足够自身互补性以允许杂交和形成完全或部分双链化合物的单链。在实施方案中，AC调节(增加、减少或改变)靶核酸的表达。
如本文所用，术语“靶向”是指治疗性部分例如反义化合物与靶核酸分子或靶核酸分子的区域的缔合。在实施方案中，治疗性部分包括能够在生理条件下与靶核酸杂交的反义化合物。在实施方案中，反义化合物靶向靶核酸内的特定部分或位点，例如靶核酸的具有至少一个可鉴定的结构、功能或特征的部分，诸如特定的外显子或内含子，或外显子或内含子内的选定核碱基或基序，诸如剪接元件或顺式作用剪接调控元件。
如本文所用，术语“靶核酸序列”和“靶核苷酸序列”是指与治疗性部分诸如反义化合物结合或杂交的核酸序列或核苷酸序列。靶核酸包括但不限于靶转录物的一部分、靶RNA(包括但不限于前mRNA和mRNA或其部分)、来源于此类RNA的靶cDNA的一部分以及靶非翻译RNA(诸如miRNA)的一部分。例如，在实施方案中，靶核酸可以是靶细胞基因(或从此类基因转录的mRNA)的一部分，其表达与特定病症或疾病状态相关。术语“部分”是指核酸的限定数量的连续(即，连接)核苷酸。
如本文所用，术语“转录物”或“基因转录物”指从DNA转录的RNA分子，并且包括但不限于mRNA、前mRNA和部分加工的RNA。
术语“靶转录物”和“靶RNA”是指与治疗性部分结合的前mRNA或mRNA转录物。靶转录物可包含靶核苷酸序列。在一个实施方案中，靶转录物包含剪接位点。
术语“靶基因”和“感兴趣的基因”是指需要或想要调节其表达和/或活性的基因。靶基因可以被转录成包括靶核苷酸序列的靶转录物。靶转录物可被翻译成感兴趣的蛋白质。
术语“靶蛋白”是指由靶转录物(例如，靶mRNA)编码的多肽或蛋白质。
如本文所用，术语“mRNA”是指编码蛋白质的RNA分子，并且包括前mRNA和成熟mRNA。“前mRNA”指紧接在DNA转录后新合成的真核mRNA分子。在实施方案中，前mRNA用5'帽加帽，用3'多聚A尾修饰，并且/或者剪接以产生成熟mRNA序列。在实施方案中，前mRNA包含一个或多个内含子。在一个实施方案中，前mRNA经历称为剪接的过程以去除内含子和连接外显子。在实施方案中，前mRNA包含一个或多个剪接元件或剪接调控元件。在实施方案中，前mRNA包含聚腺苷酸化位点。
如本文所用，术语“表达”、“基因表达”、“基因的表达”等是指基因中编码的信息在细胞中转化成功能性基因产物(诸如多肽或非编码RNA)的所有功能和步骤。非编码RNA的示例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA。多肽的基因表达包括基因的转录以形成前mRNA，前mRNA的加工以形成成熟mRNA，成熟mRNA从细胞核易位到细胞质，成熟mRNA翻译成多肽，以及编码多肽的组装。表达包括部分表达。例如，基因的表达在本文中可称为基因转录物的生成。成熟mRNA的翻译在本文中可称为成熟mRNA的表达。
如本文所用，“基因表达的调节”等是指与基因表达相关的一个或多个过程的调节。例如，基因表达的修饰可包括基因转录、RNA加工、RNA从细胞核到细胞质的易位和mRNA翻译成蛋白质中的一者或多者的修饰。
如本文所用，术语“基因”是指包含与基因产物的表达相关的5'启动子区以及与基因产物的表达相关的任何内含子区和外显子区和3'非翻译区(“UTR”)的核酸序列。
术语“免疫细胞”是指造血来源的并且在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞)、天然杀伤(NK)细胞和骨髓细胞。术语“骨髓细胞”包括单核细胞、巨噬细胞和粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)。单核细胞是在血液中循环1-3天的淋巴细胞，在这段时间后，它们迁移到组织中并分化为巨噬细胞或炎性树突状细胞或死亡。如本文所用的术语“巨噬细胞”包括胚胎来源的巨噬细胞(其也可称为驻留组织巨噬细胞)和来源于已从血流迁移到体内组织中的单核细胞的巨噬细胞(其可称为单核细胞来源的巨噬细胞)。根据巨噬细胞所处的组织，其被称为库普弗细胞(肝)、肾小球内系膜细胞(肾)、肺泡巨噬细胞(肺)、窦组织细胞(淋巴结)、霍夫鲍尔细胞(胎盘)、小神经胶质细胞(脑和脊髓)或朗格汉斯细胞(皮肤)等。
如本文所用，关于AC和剪接调控元件的“接近”意指AC结合在剪接调控元件的约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸内的核酸序列，所述剪接调控元件包括例如5'剪接位点(5'ss)、分支点序列(BPS)、聚嘧啶(Py)束或3'剪接位点(3'ss)。
如本文所用，“剪接调控元件(SRE)”和“剪接元件(SE)”可互换使用，并且是指转录物内的发生剪接或促进、抑制或改变剪接的任何核苷酸序列。剪接元件的示例包括末端茎环序列(TLS)、分支点序列(BPS)、聚嘧啶序列(Py)、5'剪接位点(5'ss)、3'剪接位点(3'ss)和顺式调控元件，诸如内含子剪接沉默子(ISS)序列、内含子剪接增强子(ISE)序列、外显子剪接增强子(ESE)序列、外显子剪接沉默子(ESS)序列和包含外显子/内含子连接的序列。
如本文所用，术语“剪接”是指转录后前mRNA的修饰，其中去除内含子并连接外显子。剪接发生在由大RNA-蛋白质复合物催化的一系列反应中，所述大RNA-蛋白质复合物包含五个小核核糖核蛋白(snRNP)，称为剪接体。剪接调控元件包括3'剪接位点、5'剪接位点和分支位点。5'剪接位点被U1 snRNP结合，随后被U6 snRNP结合。RNA结合蛋白SF1结合分支点序列，但随后被U2 snRNP置换(参见例如Ward和Cooper(2011)“The pathobiology ofsplicing,”J.Pathol.220(2):152-163)。
如本文所用，“剪接位点”是指前mRNA分子中外显子与内含子之间的连接。“隐蔽剪接位点”是通常不使用的剪接位点，但是可以在常用剪接位点被阻断或不可用时或者在突变导致正常非活性位点变成活性剪接位点时使用。“异常剪接位点”是由天然DNA和mRNA中的突变产生的剪接位点。“靶向剪接位点”的反义化合物是指与包含剪接位点的靶核苷酸序列的至少一部分杂交的化合物，或与剪接位点附近的内含子或外显子杂交从而调节mRNA的剪接的化合物。靶向剪接位点可以是常见剪接位点、隐蔽剪接位点或异常剪接位点。
如本文所用，“剪接供体位点”可与术语“5'剪接位点”互换使用，是指直接围绕内含子5'端的外显子-内含子边界的核苷酸序列。术语“剪接受体位点”可与术语“3'剪接位点”互换使用，是指直接围绕内含子3'端的内含子-外显子边界的核酸序列。已经表征了许多剪接供体和受体位点(参见例如Ohshima等人(1987)“Signals for the selection of asplice site in pre-mRNA:computer analysis of splice junction sequences andlike sequences,”J.Mol.Biol.,195:247-259(1987))。
如本文所用，术语"寡核苷酸"是指包含多个连接的核苷酸或核苷的寡聚化合物。寡核苷酸的一个或多个核苷酸可被修饰。寡核苷酸可包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。寡核苷酸可由天然和/或经修饰的核碱基、糖和共价核苷间连接组成，并且可进一步包括非核酸缀合物。
如本文所用，术语“核苷”是指包含核碱基和糖的葡基胺。核苷包括但不限于天然核苷、脱碱基核苷、经修饰的核苷和具有模拟碱基和/或糖基的核苷。“天然核苷”或“未修饰的核苷”是包含天然核碱基和天然糖的核苷。天然核苷包括RNA和DNA核苷。
如本文所用，术语“天然糖”是指核苷的糖，其未对其在RNA(2'-OH)或DNA(2'-H)中天然存在的形式进行修饰。
如本文所用，术语“核苷酸”是指具有与糖共价连接的磷酸基团的核苷。核苷酸可用多种取代基中的任一种取代基修饰。
如本文所用，术语“核碱基”是指核苷或核苷酸的碱基部分。核碱基可包含能够与另一核酸的碱基氢键合的任何原子或原子团。天然核碱基是未对其在RNA或DNA中天然存在的形式进行修饰的核碱基。
如本文所用，术语“杂环碱基部分”是指包含杂环的核碱基。
如本文所用，“核苷间连接”是指相邻核苷之间的共价连接。
如本文所用，“天然核苷间连接”是指3'至5'磷酸二酯连接。
如本文所用，术语“经修饰的核苷间连接”是指除天然存在的核苷间连接之外的核苷或核苷酸之间的任何连接。
如本文所用，术语“嵌合反义化合物”是指具有至少一个糖、核碱基和/或核苷间连接的反义化合物，其与相同寡聚化合物内的其他糖、核碱基和核苷间连接相比以不同方式修饰。糖、核碱基和核苷间连接的其余部分可以独立地被修饰或未被修饰。一般来讲，嵌合寡聚化合物将具有经修饰的核苷，该经修饰的核苷可以位于分离的位置或在将限定特定基序的区域中聚集在一起。修饰和/或模拟基团的任何组合可包括如本文所述的嵌合寡聚化合物。
如本文所用，术语“混合主链反义寡核苷酸”是指其中反义寡核苷酸的至少一个核苷间连接不同于反义寡核苷酸的至少一个其他核苷间连接的反义寡核苷酸。
如本文所用，术语“核碱基互补性”是指能够与另一个核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在实施方案中，互补核碱基是指反义化合物的能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的特定位置处的核碱基能够与靶核酸的特定位置处的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合位置被认为在该核碱基对处是互补的。
如本文所用，术语“非互补核碱基”是指彼此不形成氢键或以其他方式支持杂交的一对核碱基。
如本文所用，术语“互补”是指寡聚化合物通过核碱基互补性与另一寡聚化合物或核酸杂交的能力。在实施方案中，当每个分子中足够数量的对应位置被核碱基占据时，反义化合物与其靶标彼此互补，所述核碱基可以彼此键合以允许反义化合物与靶标之间的稳定缔合。本领域技术人员认识到，在不消除寡聚化合物保持缔合的能力的情况下，包含错配是可能的。因此，本文所述的反义化合物可包含最多约20％的错配的核苷酸(即，不是与靶标的对应核苷酸互补的核碱基)。在实施方案中，反义化合物含有不超过约15％，例如不超过约10％，例如不超过5％的错配或无错配。其余的核苷酸是核碱基互补的或以其他方式不破坏杂交(例如，通用碱基)。本领域普通技术人员将认识到，本文提供的化合物与靶核酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％核碱基互补。
如本文所用，“杂交”意指互补寡聚化合物(例如，反义化合物及其靶核酸)的配对。尽管不限于特定机制，但最常见的配对机制涉及互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键合，其可以是沃森-克里克、胡斯坦或反向胡斯坦氢键合。例如，天然碱基腺嘌呤是与通过形成氢键进行配对的天然核碱基胸腺嘧啶和尿嘧啶互补的核碱基。天然碱基鸟嘌呤是与天然碱基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶互补的核碱基。杂交可在不同情况下发生。
如本文所用，术语“特异性杂交”是指寡聚化合物与一个核酸位点杂交的亲和力大于其与另一个核酸位点杂交的亲和力的能力。在实施方案中，反义寡核苷酸与多于一个靶位点特异性杂交。在实施方案中，寡聚化合物在严格杂交条件下与其靶标特异性杂交。
在核酸杂交的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes第I部分第2章“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays”Elsevier,New York(1993)。通常，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为在限定的离子强度和pH下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极严格条件被选择为等于特定探针的Tm。用于在Southern或Northern印迹中在过滤器上杂交具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列的严格杂交条件的示例是在42℃处50％甲酰胺与1mg肝素，其中杂交过夜进行。高严格性洗涤条件的示例是在72℃处用0.15M NaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的示例是在65℃处0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A laboratory Manual,3rd ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)。通常，在高严格性洗涤之前进行低严格性洗涤以去除背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤的示例是在45℃处1xSSC洗涤15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的示例是在40℃处4-6xSSC洗涤15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH 7.0至8.3下小于约1.0M Na离子、通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其他盐)的盐浓度，并且温度通常为至少约30℃。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。
如本文所用，术语“经2'-修饰的”或“2'-取代的”是指在2'位包含除H或OH之外的取代基的糖。经2'-修饰的单体包括但不限于BNA和具有2'-取代基的单体(例如，核苷和核苷酸)，所述取代基诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H或取代或未取代的C1-C10烷基。
如本文所用，术语“MOE”是指2'-O-甲氧基乙基取代基。
如本文所用，术语“经高亲和力修饰的核苷酸”是指具有至少一个经修饰的核碱基、核苷间连接或糖部分的核苷酸，使得修饰增加包含经修饰的核苷酸的反义化合物对靶核酸的亲和力。高亲和力修饰包括但不限于BNA、LNA和2'-MOE。
如本文所用，术语“模拟物”是指取代AC中的糖、核碱基和/或核苷间连接的基团。通常，使用模拟物代替糖或糖-核苷间连接组合，并且维持核碱基以与所选靶标杂交。糖模拟物的代表性示例包括但不限于环己烯基或吗啉基。糖-核苷间连接组合的模拟物的代表性示例包括但不限于通过不带电荷的非手性连接进行连接的肽核酸(PNA)和吗啉基团。在一些情况下，使用模拟物代替核碱基。代表性核碱基模拟物是本领域众所周知的，包括但不限于三环吩嗪类似物和通用碱基(Berger等人，Nuc Acid Res.2000,28:2911-14，以引用方式并入本文)。糖、核苷和核碱基模拟物的合成方法是本领域技术人员众所周知的。
如本文所用，术语“双环核苷”或“BNA”是指其中核苷的呋喃糖部分包含连接呋喃糖环上的两个原子的桥从而形成二环环系的核苷。BNA包括但不限于α-L-LNA、β-D-LNA、ENA、氧氨基BNA(2'-O-N(CH3)-CH2-4')和氨氧基BNA(2'-N(CH3)-O-CH2-4')。
如本文所用，术语“4'至2'二环核苷”是指其中连接呋喃糖环的两个原子的桥将呋喃糖环的4'碳原子和2'碳原子桥接从而形成二环环系的BNA。
如本文所用，“锁核酸”或“LNA”是指经修饰使得核糖基糖环的2'-羟基基团经由亚甲基基团连接到糖环的4'碳原子从而形成2'-C,4'-C-氧亚甲基连接的核苷酸。LNA包括但不限于α-L-LNA和β-D-LNA。
如本文所用，术语“帽结构”或“末端帽部分”是指已在AC的任一端掺入的化学修饰。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指出以引用方式并入一样。
实施例
实施例1.细胞穿透肽-反义化合物缀合物的构建
被设计成结合IRF-5和/或GYS1并阻断其表达的SEQ ID NO:155至333和/或340中任一者的反义化合物(AC)被构建为具有C6-硫醇5'修饰的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)。被设计成生成DUX4的无毒同种型的SEQ IS NO:344至364中任一者的反义化合物被构建为具有C6-巯醇5'修饰的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)。
配制包含CCP的EEV。使用Fmoc化学配制细胞穿透肽并与AC缀合，例如，如2021年12月21日由Entrada Therapeutics,Inc.提交的名称为“COMPOSITIONS FOR DELIVERY OFANTISENSE COMPOUNDS”的国际申请号PCT/US20/66459中所述，该国际申请的公开内容全文据此并入本文。在实施方案中，cCPP包含氨基酸序列FfΦRrRrQ(SEQ ID NO:78)。在实施方案中，EEV包含具有序列KKKRKV(SEQ ID NO:33)的环外肽。在实施方案中，EEV包含KKKRKV-PEG2-K-(环(FfΦRrRrQ))-PEG12-K(N3)(SEQ ID NO:33-PEG2-K-(环(SEQ ID NO:78))-PEG12-K(N3))。在实施方案中，使用点击化学将AC化合物与EEV缀合。在实施方案中，化合物包含KKKRKV-PEG2-K-(环(FfΦRrRrQ))-PEG12-K-接头-3'-AC-5'(SEQ ID NO:33-PEG2-K-(环(SEQ ID NO:78))-PEG12-K-接头-3'-AC-5')，其中接头包括应变促进的叠氮化物与环辛炔之间点击反应的产物。接头还可包括其他基团，诸如碳链、PEG链、氨基甲酸酯、脲等。
实施例2.经由外显子跳跃敲低GYS1表达
EEV-PMO用于诱导外显子6的外显子跳跃，导致GYS1靶转录物的提前终止密码子和无义介导的衰变。所用的EEV是(Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG2-K(N3)-NH2)(SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:135])-PEG2-K(N3)-NH2))。PMO序列是TCACTGTCTGGCTCA CATACC CATA(SEQ ID NO:327)。使用叠氮化物-炔点击化学将PMO和EEV缀合。
当与GAA单敲除小鼠相比时，GYS1/GAA双敲除小鼠表现出心脏和骨骼肌中糖原量的显著减少、溶酶体肿胀和自噬积聚的显著降低。这些细胞级变化导致心脏肥大校正、葡萄糖代谢正常化和肌萎缩校正。尽管不存在GAA，但GYS1的消除可发挥重要作用，对iGAA敲除小鼠(GAA-/-)注射单次IV剂量的13.5mg/kg的EEV-PMO、27mg/kg的EEV-PMO、27mg/kg的PMO或阴性对照(媒介物)。注射后一周测量GYS1 mRNA和蛋白水平。在13.5mg/kg EEV-PMO的IV剂量后一周、两周、四周和八周，还评估了GYS1的水平。
图7A至图7D示出了在EEV-PMO组而不是仅PMO组中的横膈膜和心肌中GYS1表达的显著敲低。这种药效学结果是值得注意的，因为这是以非常低的剂量施用的单剂量实验，并且表明GYS1是可寻址的靶标。另外，在心脏、横膈膜、四头肌和三头肌中注射时，GYS1蛋白水平和mRNA持续长达八周(图8A至图8D和图9A至图9D)。蛋白水平是相对于总蛋白而言的。mRNA水平是相对于小鼠β-肌动蛋白和小鼠GAPDH(两种对照管家基因)而言的。
实施例3.经由外显子跳跃敲低IRF5表达
使用四种EEV-PMO缀合物诱导外显子4的外显子跳跃，以引入提前终止密码子，从而导致IRF-5靶转录物的无义介导的衰变。四种缀合物各自的PMO序列是5'-AGA ACG TAATCA TCA GTG GGT TGG C-3'(SEQ ID NO:340)。所用的EEV是Ac-PKKKRKV-miniPEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH(EEV#1，1120)(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)；Ac-PKKKRKV-miniPEG2-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG12-OH(EEV#2，1113)(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:135])-PEG12-OH)；Ac-PKKKRKV-miniPEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH(EEV#4；1184)(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)；以及1185：Ac-PKKKRKV-miniPEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH(EEV#4，1185)(Ac-SEQ ID NO:42-miniPEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)。使用酰胺缀合化学将EEV与PMO缀合。
对于体内研究，在第0天和第3天用两个剂量的EEV#1-PMO处理野生型小鼠。在第7天收集样品用于qPCR以测量mRNA水平。对于体外研究，如下处理小鼠巨噬细胞：用EEV#1-PMO处理，或用2μM EEV-PMOs#1-4预处理4小时，随后用R848(一种咪唑并喹啉化合物，其是toll样受体(TLR)7/8的特异性激活剂)刺激过夜。处理后24小时，收获细胞并通过Western印迹进行评价。
在用EEV#1-PMO处理后，在肝脏(图10A)、小肠(图10B)和胫骨前肌(图10C)中观察到IRF5水平的显著敲低。在所有组织中，敲低是剂量依赖性的。另外，在30μM、10μM和3μM的剂量下，用EEV#1-PMO处理的小鼠巨噬细胞具有IRF5蛋白水平的统计学显著降低(图11A)。然而，当与EEV#1-PMO相比时，用EEV#2-PMO、EEV#3-PMO和EEV#4-PMO预处理再用R848刺激的小鼠巨噬细胞在相对效力方面具有显著改善，如通过IRF-5蛋白表达所测量(图11B)。mRNA水平是相对于被设定为100％的媒介物对照而言的。
实施例4.经由外显子跳跃体外敲低GYS1
评估了PMO 220和PMO-EEV 220-814在小鼠细胞系中敲低mGYS1水平的有效性。PMO被设计成诱导小鼠GYS1的外显子6的外显子跳跃，以引入提前终止密码子，从而导致IRF-5靶转录物的无义介导的衰变。构建体220-814是与具有Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-K(N3)-NH2(EEV 814)(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-K(N3)-NH2)序列的EEV缀合的PMO 220(5'-TCACTGTCTGGCTCACATACCCATA-3'；SEQ IDNO:327)。使用点击化学将PMO与EEV缀合。
野生型小鼠成肌细胞系C2C12和野生型小鼠成纤维细胞系3T3用不同浓度的PMO220和PMO-EEV 220-814经由Endoporter转染(6μL/ml；6μM)进行处理。处理后两天，评价细胞系的GYS1 mRNA水平。
PMO 220和PMO-EEV 220-814均显示出C2C12成肌细胞系中GYS1mRNA水平的降低(图12和图13A)。PMO 220还显示出3T3成纤维细胞系中GYS1 mRNA水平的降低(图13B)。
实施例5.靶向GYS1的PMO-EEV构建体的体内评价
使用庞贝氏症模拟小鼠模型确定PMO-EEV构建体(EEV-PMO 220-814)在调节GYS1水平和Pompe表型方面的体内有效性。PMO-EEV 220是与EEV 814(Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FfΦCit-r-Cit-rQ])-PEG12-K(N3)-NH2)(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:79])-PEG12-K(N3)-NH2)缀合的PMO 220(5'-TCACTGTCTGGCTCACATACCCATA-3'；SEQ ID NO:327)。
将野生型B6-129小鼠和酸性α-葡糖苷酶(GAA)敲除小鼠(GAA-/-)经由静脉内注射用单剂量的27mpk PMO 220、20mpk PMO-EEV 220-814或40mpk PMO-EEV 220-814进行处理。处理后一周，处死小鼠，收集组织用于蛋白质印迹和RT-qPCR分析。使用点击化学将PMO与EEV缀合。
在用PMO-EEV 220-814处理后观察到心肌和骨骼肌中小鼠GYS1mRNA的有效敲低，但在仅用PMO 220处理后未观察到(图14A至图14D)。
GYS2是肝脏中最普遍的GYS蛋白。PMO 220和PMO-EEV 220-814治疗在低于30mpk的治疗水平下不影响GYS2 mRNA的水平(图15)，这指示选择性GYS1靶接合。40mpk 220 814处理组在肝脏中显示出较高的GYS2 mRNA水平。这可能是由于GYS1与GYS2之间的反馈回路，其中GYS1的下调导致GYS2的上调。
使用对GYS1非特异性的GYS抗体测量四头肌和三头肌中的GYS1水平(图25A至图25B)。在用EEV-PMO构建体处理后，观察到四头肌中的GYS1蛋白减少(图25A)。由于上样中的凝胶不一致，不能得出三头肌中GYS1蛋白水平的结论(图25B)。
还将GYS1特异性抗体用于测量横膈膜、心脏和三头肌中的GYS1蛋白水平(图26)。在用EEV-PMO构建体处理后，观察到横膈膜和心脏中GYS1减少的明显趋势。三头肌中的GYS21水平没有明显降低。值得注意的是，未处理动物的蛋白水平存在大的波动，并且使用GYS1特异性抗体在肝脏中未观察到GYS1信号，这可能是由于肝脏中的低GYS1表达。实施例6.靶向GYS1的第二PMO-EEV构建体的体内评价
使用庞贝氏症模拟小鼠模型确定PMO-EEV构建体220-1055的体内有效性。构建体220-1055是与EEV 1055(Ac-PKKKRKV-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG2-K(N3)-NH2)(Ac-SEQ ID NO:42-K(SEQ ID NO:77)-PEG2-K(N3)-NH2)缀合的PMO 220(5'-TCACTGTCTGGCTCACATACCCATA-3'；SEQ ID NO:327)。使用点击化学将PMO与EEV缀合。
使用与实施例5相同的敲除小鼠模型。经由静脉内注射用单剂量的15mpk PMO220、10mpk PMO-EEV 220-1055或20mpk PMO-EEV 220-1055处理小鼠。处理后一周、2周、4周或8周处死小鼠。收获组织用于蛋白质印迹、RT-qPCR和糖原贮存分析。在2周和8周处死之前，将小鼠禁食过夜。
在用PMO-EEV 220-1055处理后1周、2周和4周，在心脏中观察到Gys1 mRNA水平的降低(图16A)。在用PMO-EEV 220-1055处理后8周，在心脏中观察到GYS1 mRNA水平的轻微降低(图16A)。在用PMO-EEV 220-1055处理后1周、2周、4周和8周观察到横膈膜(图16B)、四头肌(图16C)和三头肌(图16D)中GYS1 mRNA水平的降低。
与RNA水平类似，在PMO-EEV 220-1055处理后2周和4周，心脏(图17A)、横膈膜(图17B)、三头肌(图17C)和四头肌(图17D)均显示出GYS1蛋白水平的大大降低。GYS1的降低似乎随时间推移而变强，直至治疗后4周，然后变弱。
在用PMO-EEV 220-1055处理后1周至8周，心脏(图18A)、横膈膜(图18B)、三头肌(图18C)和四头肌(图18D)中的药物暴露降低。然而，对于分析的所有肌肉组织，可在注射后8周检测到药物暴露。
使用AMPLEX red葡萄糖/葡萄糖氧化酶测定试剂盒(得自ThermoFischer,Waltham,MA)测定所选组织中的糖原贮存水平。通过从来自用α-淀粉葡萄糖苷酶消化的相同样品的葡萄糖水平中减去葡萄糖水平来确定糖原水平。
在用PMO-EEV 220-1055处理后1周、2周和4周，在心脏、横膈膜、三头肌和四头肌中观察到糖原的轻微但非显著的减少。处理后8周进行类似的观察。糖原水平降低的缺乏可能是由于当处理小鼠时糖原贮存表型未完全发育。例如，野生型小鼠和GAA敲除小鼠的比较显示，心脏、横膈膜、四头肌和三头肌中的糖原贮存水平随年龄增长而增加。这一发现与文献一致(Raben,N.等人，Journal of Biological Chemistry(1998),273(30),pg.19086)。如果当处理小鼠时糖原表型仍在发育，则在测试时小鼠可能未准确地反映庞贝氏症模型。
实施例7.靶向GYS1的第三PMO-EEV构建体的体内评价
使用庞贝氏症模拟小鼠模型确定PMO-EEV构建体220-1120的体内有效性。构建体220-1120是与EEV 1120Ac-PKKKRKV-AEEA-Lys(环[FGFGRGRQ]-PEG12-OH)(Ac-SEQ ID NO:42-AEEA-Lys(环[SEQ ID NO:82]-PEG12-OH))缀合的PMO 220(5'-TCACTGTCTGGCTCACATACCCATA-3'；SEQ ID NO:327)。使用酰胺缀合化学将PMO与EEV缀合。
使用与实施例5相同的小鼠模型。将野生型小鼠和GAA敲除小鼠经由静脉内注射用单一剂量的40mpk PMO 220、5mpk PMO-EEV 220-1120、10mpk PMO-EEV 220-1120、20mpkPMO-EEV 220-1120或40mpk PMO-EEV 220-1120处理。处理后2周处死小鼠。收获组织用于蛋白质印迹分析、RT-qPCR和糖原贮存。在处死之前，将小鼠禁食过夜。
在用PMO-EEV 220-1120处理的小鼠的三头肌(C)和四头肌(D)中观察到GYS1 mRNA(图19)和蛋白水平(图20)的剂量依赖性敲低。在心脏(A)和横膈膜(B)中观察到GYS1 mRNA和蛋白水平的适度敲低，可能是因为测试的小鼠数量有限。
进行类似研究，但小鼠接受多剂量的PMO-EEV 220-1120。简而言之，将GAA敲除小鼠经由静脉内注射每两周给予7mpk PMO 220或10mpk PMO-EEV 220-1120，持续8周(PMO的总剂量＝35mpk；PMO-EEV的总剂量＝50mpk)。第一次处理后十周，处死小鼠。收获组织用于蛋白质印迹、RT-qPCR和糖原贮存分析。在第一次处理前、第三次处理后和最后一次处理后，探查小鼠的握力、挂线时间和心脏功能(经由超声心动图)。
在心肌和骨骼肌中均观察到稳健的GYS1 mRNA敲低(图21A至图21C)。GYS1和GYS2的mRNA水平在肝脏中不受影响(图22A至图22B)。
在心脏和四头肌中观察到稳健的糖原合酶活性敲低。然而，重复剂量的EEV-PMO220-1120未减少骨骼和肌肉组织中的组织糖原贮存。另外，与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中未观察到握力或前肢悬挂时间的显著变化。
实施例8：使用两个剂量的EEV-PMO小鼠研究的IFR-5消融
使用两剂量小鼠研究来研究PM-EEV 278-1120的有效性。在第零天和第三天，给予小鼠40毫克/千克(mpk)或20mpk的PMO 278(AGA ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGG C；SEQ IDNO:340)或EEV-PMO化合物278-1120。PMO-EEV 278-1120包含与EEV 1120(Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH)(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)缀合的PMO 278。第二次给药后五天，处死小鼠，收集血液和组织。
图23A至图23C示出了处理后各种组织中的IRF-5表达水平。在小鼠TiA和肝脏组织中观察到IRF-5表达敲低，但在小肠组织中未观察到。
实施例9：使用单剂量的EEV-PMO小鼠研究的IFR-5消融
使用单剂量小鼠研究来研究PM-EEV 278-1120的有效性。PMO-EEV 278-1120是与EEV 1120(Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH)(Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)缀合的PMO 278(AGA ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGG C；SEQID NO:340)。在第零天，给予小鼠80毫克/千克(mpk)PMO 278；经由IV的40mpk或80mpk的PMO-EEV 278-1120；皮下(SC)120mpk PMO-EEV 278-1120。第二次给药后七天，处死小鼠，收集血液和组织。
图24示出了在80mpk PMO 278的情况下肝脏(A)、肾脏(B)和胫骨前肌(C)组织中的IRF-5表达水平；A是80mpk PMO，B是经由IV递送的40mpk PMO-EEV 278-1120；C是经由IV递送的80mpk PMO-EEV278-1120；并且D是皮下递送的120mpk PMO-EEV 278-1120。单剂量施用40mpk和80mpk的278-1120，小鼠肝脏组织中的IRF-5蛋白表达显著降低，分别对应于40％和53％的降低(A)。肾组织中的IRF-5水平与所检查的其他组织相比较低。数据显示出波动，可能是由于难以定量条带强度与背景。另外，由于样品在凝胶上运行不好，观察到胫骨前肌组织数据的波动(数据未示出)。总的来说，数据显示出肾脏与肝脏中类似的趋势；单剂量施用后IRF-5蛋白水平显著降低。
实施例10：靶向IRF-5的各种EEV-PMO的体外外显子跳跃的评价
在用两种EEV-PMO化合物277-1120和278-1120处理后，使用未刺激的RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞评价IRF-5表达和外显子跳跃。PMO-EEV 277-1120是通过酰胺缀合化学与EEV 1120Ac-PKKKRKV-AEEA-Lys-(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:42-AEEA-Lys-环(SEQ ID NO:82)-PEG12-OH)缀合的PMO序列ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGG CTC T(SEQID NO:365)。PMO-EEV 278-1120是通过酰胺缀合化学与EEV 1120Ac-PKKKRKV-AEEA-Lys-(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH(Ac-SEQ ID NO:42-AEEA-Lys-环(SEQ ID NO:82)-PEG12-OH)缀合的PMO序列AGA ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGG C(SEQ ID NO:340)。简而言之，将150K个细胞/孔接种在24孔板的0.5ml DMEM中。4小时后，向细胞中添加EEV-PMO化合物，得到500μL的总体积。然后将细胞孵育24小时。孵育后，收集细胞培养基用于细胞因子、IL6和TNF-α检测。提取RNA并用于IRF-5转录物定量。使用蛋白裂解物测量IRF-5蛋白水平变化。IRF-5表达水平相对于β-微管蛋白确定。
对于外显子跳跃研究，如上所述处理细胞。在用EEV-PMO化合物孵育后，用新鲜培养基洗涤细胞，然后孵育过夜。在第二次孵育后，收获RNA并使用检测IRF-5基因中外显子5跳跃的引物进行RT-PCR。
277-1120和278-1120均显示出RAW 264.7小鼠巨噬细胞/单核细胞中的靶接合，并且以剂量依赖性方式显著降低了IRF-5蛋白水平(图27A)。化合物277-1120在30μM下显著消耗IRF-5蛋白水平约80％，在10μM下显著消耗约50％，并且在3.3μM的较低剂量下未观察到显著变化。化合物278-1120对IRF-5消耗的影响比277-1120强。化合物278-1120在30μM下使IRF-5蛋白水平降低约80％，在10μM下降低约65％。即使在3.3μM的较低剂量下，278-1120也具有约40％的IRF-5蛋白消耗。
EEV-PMO化合物0278-1120在暴露后30分钟就诱导部分外显子跳跃，效力随着暴露时间的增加而增加(图27B)。
对另外的EEV-PMO化合物进行类似的实验，其中PMO是PMO 278(AGA ACG TAA TCATCA GTG GGT TGG C；SEQ ID NO:340)。使用酰胺缀合化学将PMO 278与EEV缀合，各种EEV包括Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH(EEV#1，1120，Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:82])-PEG12-OH)；Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG12-OH(EEV#2，1113，Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:135])-PEG12-OH)；Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFGRRRQ])-PEG12-OH(EEV#3；1184，Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:84])-PEG12-OH)；以及Ac-PKKKRKV-PEG2-K(环[FGFRRRRQ])-PEG12-OH(EEV#4，1185，Ac-SEQ ID NO:42-PEG2-K(环[SEQ ID NO:85])-PEG12-OH)。
使用如上所述的类似方法，不同的是用EEV-PMO化合物预处理细胞，然后用R848刺激过夜。R484是Toll样受体激动剂，并引起IRF-5表达的诱导。总处理时间为24小时。
R848显著增加RAW264.7细胞中的IRF-5蛋白表达。当与用R848刺激的细胞相比时，所有测试浓度的所有EEV-PMO处理的样品显示出IRF-5蛋白表达的显著降低(图28A)。当与用R848刺激的细胞中的IRF-5水平相比时，EEV-PMO化合物278-1113、278-1184和278-1185的效力平均是278-1120的5倍，在低至2μM的浓度下IRF-5蛋白减少约80％。
EEV-PMO化合物278-1113、278-1184和278-1185在5μM下表现出比278-1120更高的外显子跳跃(图12B)。在278-1113、278-1184和278-1185之间未观察到外显子跳跃的显著差异。
实施例11：人THP1细胞中各种EEV-PMO化合物的评价
在用各种PMO化合物和各种EEV-PMO化合物处理后，使用人THP1细胞评价IRF-5表达和外显子跳跃。所测试的PMO化合物包含344(TTGGCAACATCCTCTGCAGCTGAAG；SEQ ID NO:366，Hs-IRF-5-E4N6)；345(GCAACATCCTCTGCAGCTG；SEQ ID NO:367，Hs-IRF-5-E4N3)；346(TCAGGCTTGGCAACATCCTCTGCAG；SEQ ID NO:368，Hs-IRF-5-E5P0；IRF5-E4N3(TAATCATCAGTGGGTTGGCTCTCTG，SEQ ID NO:369)；278(AGA ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGGC；SEQ ID NO:340，Hs-IRF-5-E4P3)，以及277(ACG TAA TCA TCA GTG GGT TGG CTC T；SEQID NO:365，Hs-IRF-5-E4PO)。包括PMO 344、345和346的EEV-PMO化合物经由酰胺缀合化学分别与EEV 1120(Ac-PKKKRKV-AEEA-Lys-(环[FGFGRGRQ])-PEG12-OH)(Ac-SEQ ID NO:42—AEEA-Lys-环(SEQ ID NO:82)-PEG12-OH)缀合。
简而言之，对于仅PMO的研究，使用核转染方法将PMO化合物转染到THP1细胞中。在核转染后将细胞铺板在含有PMA的培养基中，并在收获前孵育24小时。收获RNA，并使用检测IRF-5基因中外显子4和外显子5跳跃的引物进行RT-PCR。
简而言之，对于EEV-PMO研究，THP1细胞通过PMA分化过夜。然后用各种EEV-PMO缀合物处理细胞，并在收获前孵育24小时。收获RNA，并使用检测IRF-5基因中外显子5跳跃的引物进行RT-PCR。
图29A示出了用各种PMO化合物处理后的外显子4和外显子5跳跃水平。在小鼠细胞中效果良好的PMO化合物不一定翻译成人细胞。例如，对于Hs-IRF-5-E4P3(PMO 278)和Hs-IRF-5-E4PO(PMO 277)，观察到低水平的外显子跳跃。对于Hs-IRF-5-E5N6(PMO 344)、Hs-IRF-5-E5N3(PMO 345)和Hs-IRF-5-E5P0(PMO 346)，观察到外显子跳跃。
图29B示出了用各种PMO-EEV化合物处理后的外显子5跳跃水平。结果表明，EEV-PMO缀合物可诱导THP1细胞中的外显子跳跃和靶基因的下调。
本文已经描述了多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案也在以下权利要求书的范围内。

Claims (135)

1.一种化合物，所述化合物包含：
环状细胞穿透肽(cCPP)；以及
反义化合物(AC)，所述AC包含与靶基因的靶转录物的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述AC与所述靶核苷酸序列特异性杂交并且调节所述靶转录物的剪接以下调由所述靶转录物表达的蛋白质的表达或活性。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述AC包含外显子跳跃。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述外显子跳跃引入移码。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述AC包含与剪接元件的至少一部分互补或与所述剪接元件足够接近以调节所述靶转录物的剪接的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述剪接元件是末端茎环序列、分支点序列、聚嘧啶序列、5'剪接位点、3'剪接位点和内含子剪接沉默子序列、内含子剪接增强子序列、外显子剪接增强子序列、外显子剪接沉默子序列和包含外显子/内含子连接的序列中的一者或多者。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中所述剪接元件是5'剪接位点或3'剪接位点。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的化合物，其中所述AC包含与所述剪接元件的至少一部分互补的核苷酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述靶基因参与疾病的发病机制。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中所述AC具有约5至约1000、约5至约500、约5至约100、约5至约50、或约5至约25个核苷酸的长度。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中所述AC包含至少一种经修饰的核苷酸或核酸，所述经修饰的核苷酸或核酸包括硫代磷酸酯(PS)核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、包含经2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的主链的核苷酸、2'-O-甲氧基-乙基(2'-MOE)核苷酸、2',4'-约束乙基(cEt)核苷酸、2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2'F-ANA)或它们的组合。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中所述AC包含一种或多种二氨基磷酸酯吗啉代核苷、2'-O-甲基化核苷、锁核酸(LNA)或它们的组合。
12.根据权利要求1至11所述的化合物，所述化合物还包含将所述cCPP与所述AC缀合的接头。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述接头与所述cCPP的氨基酸的化学反应性侧链缀合。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中所述cCPP的所述化学反应性侧链包括胺基团、羧酸、酰胺、羟基基团、巯基基团、胍基、酚基团、硫醚基团、咪唑基团或吲哚基团。
15.根据权利要求13或14所述的化合物，其中与所述AC缀合的所述cCPP的所述氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、高谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或色氨酸。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的化合物，其中所述接头与所述AC的5'端、3'端缀合。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的化合物，其中所述接头包含一个或多个D或L氨基酸，所述D或L氨基酸各自任选地被取代；亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代；或-(R1-J-R2)z"-，其中R1和R2在每种情况下各自独立地选自亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基和杂环基，每个J独立地是NR3、-NR3C(O)-、S和O，其中R3独立地选自H、烷基、烯基、炔基、碳环基和杂环基，它们各自任选地被取代，并且z"是1至50的整数；或它们的组合。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述cCPP包含4-12个氨基酸，其中
至少两个氨基酸是精氨酸，
至少两个氨基酸包含疏水侧链，
并且至少1个氨基酸是D氨基酸。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(A)：
或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R1、R2和R3中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；
R4、R5、R6、R7独立地是H或氨基酸侧链；
R4、R5、R6、R7中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N,N-二甲基精氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；
AASC是氨基酸侧链；并且
q是1、2、3或4。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I)：
或其质子化形式或盐，
其中每个m独立地是0-3的整数。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的化合物，其中R1、R2和R3独立地是H或包含芳基基团的侧链。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的化合物，其中所述包含芳基基团的侧链是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸或3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的化合物，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的化合物，其中R1、R2和R3中的两者是苯丙氨酸的侧链。
25.根据权利要求19至25中任一项所述的化合物，其中R1、R2、R3和R4中的两者是H。
26.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-1)，
或其质子化形式或盐。
27.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-2)：
或其质子化形式或盐。
28.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-3)：
或其质子化形式或盐。
29.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-4)：
或其质子化形式或盐。
30.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-5)：
或其质子化形式或盐。
31.根据权利要求19所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(I-6)：
或其质子化形式或盐。
32.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(II)：
其中：
AASC是氨基酸侧链；
R1a、R1b和R1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d独立地是氨基酸侧链；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是 或其质子化形式或盐；
R2a、R2b、R2c和R2d中的至少一者是胍或其质子化形式或盐；
每个n"独立地是0至5的整数；
每个n'独立地是0至3的整数；并且
如果n'是0，则R2a、R2b、R2b或R2d不存在。
33.根据权利要求32所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(II-1)：
34.根据权利要求32或33所述的化合物，其中R1a、R1b和R1c各自独立地选自由苯基、萘基和蒽基组成的组。
35.根据权利要求32所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(IIa)：
36.根据权利要求32至35中任一项所述的化合物，其中R2a、R2b、R2c
是胍或其质子化形式或盐。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的化合物，其中R2a、R2b、R2c
是胍或其质子化形式或盐。
38.根据权利要求32所述的化合物，其中所述环肽具有下式(IIb)：
39.根据权利要求32至38中任一项所述的环肽，其中R2a和R2c各自是
40.根据权利要求32所述的化合物，其中所述cCPP具有下式(IIc)：
或其质子化形式或盐。
41.根据权利要求19至40中任一项所述的化合物，其中AASC是天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、高谷氨酸残基或高谷氨酸盐残基的侧链。
42.根据权利要求19至40中任一项所述的化合物，其中AASC是谷氨酸残基的侧链。
43.根据权利要求19至40中任一项所述的化合物，其中AASC是：其中t是0至5的整数。
44.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述cCPP具有以下结构：
或其质子化形式或盐，其中氨基酸侧链的至少一个原子被治疗性部分或接头替换或者至少一个孤对形成与所述治疗性部分或所述接头的键。
45.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述cCPP具有以下结构：
或其质子化形式或盐，其中氨基酸侧链的至少一个原子被治疗性部分或接头替换或者至少一个孤对形成与所述治疗性部分或所述接头的键。
46.根据权利要求19至45中任一项所述的化合物，其中所述AASC上的至少一个原子被所述治疗性部分或接头替换或者至少一个孤对形成与所述治疗性部分或所述接头的键。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其中所述接头包含-(OCH2CH2)z'-亚基，其中z'是1至23的整数。
48.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其中所述接头包含：
(i)-(OCH2CH2)z-亚基，其中z'是1至23的整数；
(ii)一个或多个氨基酸残基，诸如甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸或它们的组合的残基；或
(iii)(i)和(ii)的组合。
49.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其中所述接头包含：
(i)-(OCH2CH2)z-亚基，其中z是2至20的整数；
(ii)一个或多个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合的残基；或
(iii)(i)和(ii)的组合。
50.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其中所述接头包含二价或三价C1-C50亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-N(C1-C4烷基)-、-N(环烷基)-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(C1-C4烷基)-、-S(O)2N(环烷基)-、-N(H)C(O)-、-N(C1-C4烷基)C(O)-、-N(环烷基)C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(C1-C4烷基)、-C(O)N(环烷基)、芳基、杂芳基、环烷基或环烯基替换。
51.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其中所述接头具有以下结构：
其中：
x'是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与所述AASC的附接点，并且AASC是所述环肽的氨基酸残基的侧链；并且M是结合基团。
52.根据权利要求51所述的化合物，其中z'是11。
53.根据权利要求51或52所述的化合物，其中x'是1。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的化合物，所述化合物还包含与所述cCPP缀合的环外肽。
55.根据从属于权利要求51的权利要求54所述的化合物，其中所述环外肽在所述接头的氨基端与所述接头缀合。
56.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含2至10个氨基酸残基。
57.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含4至8个氨基酸残基。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的化合物，其中所述环外肽包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式或盐的侧链。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的化合物，其中所述环外肽包含2、3或4个赖氨酸残基。
60.根据权利要求59所述的化合物，其中每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团被三氟乙酰基(-COCF3)、烯丙氧基羰基(Alloc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)或(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基-3)-甲基丁基(ivDde)基团取代。
61.根据权利要求54至60中任一项所述的化合物，其中所述环外肽包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸残基。
62.根据权利要求61所述的化合物，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。
63.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH、KHKK、KKHK、KKKH、KHKH、HKHK、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、HBHBH、HBKBH、RRRRR、KKKKK、KKKRK、RKKKK、KRKKK、KKRKK、KKKKR、KBKBK、RKKKKG、KRKKKG、KKRKKG、KKKKRG、RKKKKB、KRKKKB、KKRKKB、KKKKRB、KKKRKV、RRRRRR、HHHHHH、RHRHRH、HRHRHR、KRKRKR、RKRKRK、RBRBRB、KBKBKB、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG，其中B是β-丙氨酸。
64.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含以下序列之一：PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。
65.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。
66.根据权利要求54或55所述的化合物，其中所述环外肽包含PKKKRKV。
67.根据权利要求66所述的化合物，其中所述环外肽包含以下序列之一：NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK或RKCLQAGMNLEARKTKK。
68.根据权利要求1至21中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有下式(C)：
或其质子化形式或盐，
其中：
R1、R2和R3各自独立地是H或包含芳基或杂芳基基团的侧链，其中R1、R2和R3中的至少一者是包含芳基或杂芳基基团的侧链；
R4和R7独立地是H或氨基酸侧链；
EP是环外肽；
每个m独立地是0-3的整数；
n是0-2的整数；
x'是1-23的整数；
y是1-5的整数；
q是1-4的整数；
z'是1-23的整数；并且
货物是所述治疗性部分。
69.根据权利要求68所述的化合物，其中R1、R2和R3是H或包含芳基基团的侧链。
70.根据权利要求68或69所述的化合物，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的化合物，其中R1、R2和R3中的两者是苯丙氨酸的侧链。
72.根据权利要求68至70中任一项所述的化合物，其中R1、R2、R3和R4中的两者是H。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的化合物，其中z'是11。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的化合物，其中x'是1。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2至10个氨基酸残基。
76.根据权利要求68至74中任一项所述的化合物，其中所述EP包含4至8个氨基酸残基。
77.根据权利要求68至76中任一项所述的化合物，其中所述EP包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式或盐的侧链。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少1个赖氨酸残基。
79.根据权利要求68至77中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2、3或4个赖氨酸残基。
80.根据权利要求68至78中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸。
81.根据权利要求80所述的化合物，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸残基。
82.根据权利要求68至74中任一项所述的化合物，其中所述EP包含以下序列之一：PKKKRKV、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。
83.根据权利要求68至74中任一项所述的化合物，其中所述EP具有以下结构：Ac-PKKKRKV。
84.根据权利要求1至21中任一项所述的化合物，所述化合物包含式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：
或其质子化形式或盐，
其中EP是环外肽，并且
寡核苷酸是所述治疗性部分，其是寡核苷酸。
85.根据权利要求84所述的化合物，其中所述EP包含2至10个氨基酸残基。
86.根据权利要求84所述的化合物，其中所述EP包含4至8个氨基酸残基。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的化合物，其中所述EP包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式或盐的侧链。
88.根据权利要求84至87中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少1个赖氨酸残基。
89.根据权利要求84至87中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2、3或4个赖氨酸残基。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸。
91.根据权利要求90所述的化合物，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸残基。
92.根据权利要求84所述的化合物，其中所述EP包含以下序列之一：PKKKRKV、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。
93.根据权利要求84所述的化合物，其中所述EP具有以下结构：Ac-PKKKRKV。
94.根据权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中所述化合物下调糖原合酶的表达。
95.根据权利要求94所述的化合物，其中所述化合物下调GYS1的表达。
96.根据权利要求94或95的化合物，其中所述化合物诱导GYS1转录物中外显子的外显子跳跃。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的化合物，其中所述AC与所述靶核苷酸序列杂交，其中所述靶核苷酸序列包含GYS1转录物的至少一部分，并且所述AC诱导所述GYS1转录物中外显子的跳跃。
98.根据权利要求97所述的化合物，其中所述外显子的跳跃诱导所述GYS1转录物中的移码。
99.根据权利要求98所述的化合物，其中所述移码得到编码具有降低活性的糖原合酶的GYS1转录物。
100.根据权利要求98所述的化合物，其中所述移码得到截短的或非功能性的糖原合酶。
101.根据权利要求98所述的化合物，其中所述移码导致在所述GYS1转录物中引入提前终止密码子。
102.根据权利要求98所述的化合物，其中所述移码导致所述GYS1转录物通过无义介导的衰变而降解。
103.根据权利要求96中任一项所述的化合物，其中所述化合物被设计成跳过框外外显子，诸如GYS1外显子2、GYS1外显子5、GYS1外显子6、GYS1外显子7、GYS1外显子8、GYS1外显子10或GYS1外显子12。
104.根据权利要求103所述的化合物，其中跳过所述框外外显子导致所述GYS1转录物中的移码。
105.根据权利要求96至104中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含以下中的一个或多个序列：
序列(5'-3')
ctgtgggcccaagcgtgtgagggca
ACCCActgtgggcccaagcgtgtga
ATGCCACCCActgtgggcccaagcg
TGTAGATGCCACCCActgtgggccc
CACCGTGTAGATGCCACCCActgtg
TGCAGCACCGTGTAGATGCCACCCA
CTTGCAGCCCTTGCTGTTCATGGAA
cccacCTTGCAGCCCTTGCTGTTCA
cacgtcccacCTTGCAGCCCTTGCT
tgggccacgtcccacCTTGCAGCCC
tgggctgggccacgtcccacCTTGC
tgccctgggctgggccacgtcccac
ctgggtgggaggggacagcagtccg
TTGAActgggtgggaggggacagca
CCACGTTGAActgggtgggagggga
CTTGTCCACGTTGAActgggtggga
GCTTCCTTGTCCACGTTGAActggg
CCCCTGCTTCCTTGTCCACGTTGAA
CTGGTTTCCTCTTGAGCAAGTGCTG
cctacCTGGTTTCCTCTTGAGCAAG
cagcccctacCTGGTTTCCTCTTGA
cagcccagcccctacCTGGTTTCCT
gacttcagcccagcccctacCTGGT
ctggggacttcagcccagcccctac
ctgggattgggggtgagggtcccat
AATATctgggattgggggtgagggt
GTCACAATATctgggattgggggtg
TGGGGGTCACAATATctgggattgg
CCCATTGGGGGTCACAATATctggg
TTCAGCCCATTGGGGGTCACAATAT
CCATAAAAATGGCCCCGCACAAACT
cgtacCCATAAAAATGGCCCCGCAC
ccccacgtacCCATAAAAATGGCCC
atatgccccacgtacCCATAAAAAT
taggtatatgccccacgtacCCATA
agacctaggtatatgccccacgtac
ctaaagaacccacaaggcacggtaa
GATGCctaaagaacccacaaggcac
GTCCAGATGCctaaagaacccacaa
TTGAAGTCCAGATGCctaaagaacc
CCAAGTTGAAGTCCAGATGCctaaa
CTTGTCCAAGTTGAAGTCCAGATGC
TCTGAGCAGATAGTTGAGCCGAGCC
ctcacTCTGAGCAGATAGTTGAGCC
caggcctcacTCTGAGCAGATAGTT
tagcccaggcctcacTCTGAGCAGA
cctcatagcccaggcctcacTCTGA
tgtcccctcatagcccaggcctcac
ctgcgcagaaagaaaggagggggag
TTCACctgcgcagaaagaaaggagg
TGCCGTTCACctgcgcagaaagaaa
CTCGCTGCCGTTCACctgcgcagaa
GTCTGCTCGCTGCCGTTCACctgcg
CCACTGTCTGCTCGCTGCCGTTCAC
CAAAGCTGTTTGCGCACAGCTTGGC
ctaacCAAAGCTGTTTGCGCACAGC
ggctgctaacCAAAGCTGTTTGCGC
gcgagggctgctaacCAAAGCTGTT
ccggagcgagggctgctaacCAAAG
aggggccggagcgagggctgctaac
ctgcaaggcaagcaggggcatgcat
TCCCActgcaaggcaagcaggggca
AAGGCTCCCActgcaaggcaagcag
TCGGGAAGGCTCCCActgcaaggca
TCATGTCGGGAAGGCTCCCActgca
CTTGTTCATGTCGGGAAGGCTCCCA
CTGCGTTGCAAAGATGGCTCTCTTC
catacCTGCGTTGCAAAGATGGCTC
caatccatacCTGCGTTGCAAAGAT
aggtccaatccatacCTGCGTTGCA
cacagaggtccaatccatacCTGCG
ctctgcacagaggtccaatccatac
ctggtagtgaaaaagaaggactcag
ATCACctggtagtgaaaaagaagga
GGAAAATCACctggtagtgaaaaag
CGGGTGGAAAATCACctggtagtga
AACTCCGGGTGGAAAATCACctggt
AGAGGAACTCCGGGTGGAAAATCAC
CCGGTGTGTAGCCCCAAGGCTCATA
ctcacCCGGTGTGTAGCCCCAAGGC
ctacactcacCCGGTGTGTAGCCCC
gcccactacactcacCCGGTGTGTA
cccctgcccactacactcacCCGGT
gctgtcccctgcccactacactcac
ctgtggaggccaggacccaggttca
GATACctgtggaggccaggacccag
ATGTAGATACctgtggaggccagga
CAAGAATGTAGATACctgtggaggc
CCGGTCAAGAATGTAGATACctgtg
AACCGCCGGTCAAGAATGTAGATAC
CCGGCCTAGGTATTTCCAGTCCAGA
cctacCCGGCCTAGGTATTTCCAGT
ggggtcctacCCGGCCTAGGTATTT
aagtgggggtcctacCCGGCCTAGG
taggaaagtgggggtcctacCCGGC
gaggataggaaagtgggggtcctac
106.根据权利要求94或95所述的化合物，其中所述化合物包含被设计成与GYS1的起始密码子杂交的部分。
107.根据权利要求106所述的化合物，其中所述化合物包含以下中的一个或多个序列：
序列(5'-3')
GCGGTTTAAAGGCATGGCTGGCGCA
TGGACAAAGTGCGGTTTAAAGGCAT
GTGAGGACATGGACAAAGTGCGGTT
CAGTCCTGGCAGTGAGGACATGGAC
CCAGTCCTCCAGTCCTGGCAGTGAG
CACCTGGGATTCTTAAATATAGATG
108.根据权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中所述化合物下调干扰素调节因子5(IRF-5)的表达。
109.根据权利要求108所述的化合物，其中所述化合物诱导IRF-5mRNA转录物中外显子的外显子跳跃。
110.根据权利要求108或109所述的化合物，其中所述AC与所述靶核苷酸序列杂交，其中所述靶核苷酸序列包含IRF-5转录物的至少一部分，并且所述AC诱导所述IRF-5转录物中外显子的跳跃。
111.根据权利要求108所述的化合物，其中所述外显子的跳跃诱导所述IRF-5转录物中的移码。
112.根据权利要求111所述的化合物，其中所述移码得到编码具有降低活性的IRF-5的IRF-5转录物。
113.根据权利要求111所述的化合物，其中所述移码得到截短的或非功能性的IRF-5。
114.根据权利要求111所述的化合物，其中所述移码导致在所述IRF-5mRNA转录物中引入提前终止密码子。
115.根据权利要求111所述的化合物，其中所述移码导致所述IRF-5mRNA转录物通过无义介导的衰变而降解。
116.根据权利要求108至115中任一项所述的化合物，其中所述化合物被设计成跳过框外外显子，诸如IRF-5外显子3、IRF-5外显子4、IRF-5外显子5或IRF-5外显子8。
117.根据权利要求116所述的化合物，其中跳过所述框外外显子导致所述IRF-5mRNA转录物中的移码。
118.根据权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中所述化合物下调双同源盒4(DUX4)的表达。
119.根据权利要求118所述的化合物，其中所述靶转录物是DUX4，并且其中所述AC诱导所述靶转录物中的选择性剪接。
120.根据权利要求119所述的化合物，其中所述选择性剪接上调DUX4-s的表达。
121.根据权利要求119所述的化合物，其中外显子跳跃下调DUX4-fl的表达。
122.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至121中任一项所述的化合物和药学上可接受的载剂。
123.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至121中任一项所述的化合物。
124.一种下调细胞中的靶蛋白的活性的方法，所述方法包括将根据权利要求1至121中任一项所述的化合物或根据权利要求121所述的药物组合物施用于所述细胞。
125.一种下调患者中的靶蛋白的活性的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至121中任一项所述的化合物或根据权利要求122所述的药物组合物施用于所述患者。
126.一种治疗患者的与靶基因相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1至121中任一项所述的化合物或根据权利要求122所述的药物组合物。
127.根据权利要求124至126中任一项所述的方法，其中所述靶基因包含干扰素调节因子5(IRF-5)。
128.根据权利要求124至126中任一项所述的方法，其中所述靶基因包含糖原合酶(GYS1)。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述疾病或病症包括糖原贮积病。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述糖原贮积病与肌肉组织中的糖原积累相关。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述糖原贮积病与心肌组织中的糖原积累相关。
132.根据权利要求130所述的方法，其中所述糖原贮积病与骨骼肌组织中的糖原积累相关。
133.根据权利要求130所述的方法，其中所述糖原贮积病包括II型糖原贮积病。
134.根据权利要求129所述的方法，其中所述糖原贮积病包括庞贝氏症。
135.根据权利要求129所述的方法，其中所述糖原贮积病包括安德森氏症、麦卡德尔病、拉福拉病或塔里乌病。
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