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CN117904344A - 用于构建大径材美洲黑杨dna指纹图谱的snp分子标记组合及其应用 - Google Patents

用于构建大径材美洲黑杨dna指纹图谱的snp分子标记组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及其应用和方法，属于美洲黑杨的生物育种领域。本发明公开的用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，由8个SNP分子标记组成，其核苷酸序列分别对应SEQ ID NO.1‑8。本发明以24个大径材美洲黑杨DNA为模板，采用筛选出的20对SNP引物进行PCR扩增后进行高通量测序比对，最终确定了8个SNP分子标记作为构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，最终得到了由8个SNP位点组成的大径材美洲黑杨的DNA指纹图谱。使用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够在生产中应用。

Description

用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及 其应用
技术领域
本发明涉及用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及其应用，属于美洲黑杨的生物育种领域。
背景技术
杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种。自20世纪七十年代初引进I-69、I-72、I-63、I-214等美洲黑杨及其杂种无性系以来，经过半过多世纪的发展，杨树资源构成了江苏省森林资源的主体。美洲黑杨及其杂种具有生长快、出材率高、轮伐期短、适应性广等优点，不仅是大径级优质工业资源材培育的首选树种，也是城乡绿化造林的先锋树种。美洲黑杨更是苏北区域经济的重要产业，在缓解我国木材供需矛盾，维护生态平衡，实现农业增效、农民增收等方面发挥着极为重要的作用。
美洲黑杨为杨柳科杨属植物，共包括五大杨派100余种，在世界范围内广泛分布，以30°～60°N的温带或暖温带地区较为常见，是短期轮伐的造林树种，对解决生态环境治理和木材短缺问题有利。目前中国林业发展中推广的美洲黑杨新优品种主要来源于人工杂交选育，具有早期速生、材质好、抗性强等特点，创造了巨大的生态效益、经济效益以及社会效益。因此杂交育种仍然是目前乃至今后培育美洲黑杨良种的重要手段。美洲黑杨原产于北美密西西比河下游地区，是中国引种的南方型平原地区重要速生工业用材树种和绿化造林树种之一，是人工杂交选育新品种的常用亲本。目前美洲黑杨的发展过程中也存在着一些急需解决的问题，如品种单一，低产林分多，良种化率不高，飘絮严重等，严重影响长江中下游平原地区美洲黑杨的生产与发展，亟待选育出适合本地速生、优质、高产及无絮的南方型美洲黑杨新品种进行更新换代。因此，开发一种高效、准确的大径材美洲黑杨鉴别技术手段，对我国大径材美洲黑杨的选育具有重要意义。
以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映DNA。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是指单个核苷酸的变异引起的基因组水平上DNA序列的多态性,SNP分子标记具有数量多、分布广泛、遗传稳定性高、共显性等特点，是目前分子遗传学研究中重要的技术手段。应用SNP构建的DNA指纹能从本质上反映生物个体差异，具有高度个体特异性和环境稳定，能够准确、快速的对新品种及现存品种进行鉴定。因此，针对市场上的大径材的美洲黑杨，构建基于SNP分子标记的DNA指纹图谱具有非常积极的作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及其应用，用于快速、准确鉴定杨树大径材无性系基因型。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，由8个SNP分子标记组成，其核苷酸序列分别对应SEQ ID NO.1-8。
每个SNP分子标记对应一个SNP位点：
第一个SNP分子标记对应SNP位点SNP2：5_5078225；
第二个SNP分子标记对应SNP位点SNP3：5_5468930；
第三个SNP分子标记对应SNP位点SNP5：8_43714；
第四个SNP分子标记对应SNP位点SNP7：9_8513188；
第五个SNP分子标记对应SNP位点SNP8：9_8784110；
第六个SNP分子标记对应SNP位点SNP10：11_986759；
第七个SNP分子标记对应SNP位点SNP11：11_18422946；
第八个SNP分子标记对应SNP位点SNP14：13_276618。
用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合的构建方法，步骤包括：
1)初步筛选与生长性状具有显著关联的20个SNP位点作为候选位点；
2)根据候选SNP位点的位置设计20对SNP引物；
3)以24个大径材美洲黑杨DNA为模板，采用筛选出的20对SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)将PCR扩增产物纯化后进行高通量测序确定SNP位点的基因型；
5)根据SNP位点的基因分型结果，最终确定了8个SNP分子标记作为构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合。
SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合，包括：
SNP2-F：5’-GGCCACAAAATGAATTTCAGAAG-3’，
SNP2-R：5’-GCTATCACAGTTGCAAATTGTCA-3’；
SNP3-F：5’-GTTTATTGATTGGGTGTTGTTTG-3’，
SNP3-R：5’-GATGAAATGCGCTAAAAATCC-3’；
SNP5-F：5’-AGTCTACACGAGCCCTTCATTT-3’，
SNP5-R：5’-ATGGAAGCAAGATGGCTAGACT-3’；
SNP7-F：5’-GTCCCTGGATTTCAATCTCA-3’，
SNP7-R：5’-TACGAATCCCATATGTACCTCC-3’；
SNP8-F：5’-TGATATTATCAGCTGTGTTGGGG-3’，
SNP8-R：5’-TCCTGGTTCTGAAGTTAGCTTCT-3’；
SNP10-F：5’-ACTGCTTTAACCAGCTTGTATCCT-3’，
SNP10-R：5’-CTCAACCCAAATCCACACAATA-3’；
SNP11-F：5’-TTAGGCTGAGAGAACCTCGTG-3’，
SNP11-R：5’-TTCCTCGTATACCGCTCTCTA-3’；
SNP14-F：5’-GGAATTCAAGAACCTGCAATCA-3’，
SNP14-R：5’-TTCAATTGCTAGAACTCTGGGTC-3’。
用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合在构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱中的应用。
用于扩增SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合在构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱中的应用。
用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合在制备用于筛选大径材美洲黑杨的试剂盒中的应用。
用于扩增SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合在制备用于筛选大径材美洲黑杨的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：
本发明筛选出与生长性状具有显著关联的20个SNP位点作为候选位点；根据候选SNP位点的位置设计20对SNP引物；以24个大径材美洲黑杨DNA为模板，采用筛选出的20对SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将PCR扩增产物纯化后进行高通量测序确定SNP位点的基因型；根据SNP位点的基因分型结果，最终确定了8个SNP分子标记作为构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，最终得到了由8个SNP位点组成的大径材美洲黑杨的DNA指纹图谱。使用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够在生产中应用。
附图说明
图1为20个SNP位点的基因型分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本申请所述的大径材美洲黑杨是指小头去皮直径至少达到24cm、长2.5m以上的原木。
实施例1
1、初步筛选先前GWAS研究(Xu et al:A computational framework for mappingthe timing of vegetative phase change.New Phytol 2016.)中与生长性状具有显著关联的20个SNP位点，将这些位点作为候选位点，其详细信息如下：
表1候选SNP位点的相关信息
2、根据候选SNP位点的位置，利用Primer 5.0软件设计20对SNP引物。设计的方法如下：首先确定SNP位点所在序列的位置，然后在SNP位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-23bp；Tm 59℃-61℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃；GC含量在40-60％(45-55％最佳)；PCR产物大小为350-400bp。引物序列如下所示：
表2 20个SNP的引物序列信息
3、选取江苏省宿迁市泗阳县泗阳农场的24个大径材美洲黑杨无性系为材料(分别命名为MY1-24)，每个无性系选取3-5片完整并且没有病虫害的叶片进行采集用于DNA提取，并放置于干冰盒中保存运送至南京林业大学实验室，转移至-80℃超低温冰箱保存备用。根据TIANGEN(DP360)试剂盒的说明书进行24个美洲黑杨无性系样品DNA的提取。提取后，在1.0％的琼脂糖凝胶上检测DNA的降解和污染。使用分光光度计(Implen，WestlakeVillage，CA，USA)检查DNA纯度。提取好的DNA样品放置-20℃超低温冰箱保存。
4、以24个大径材美洲黑杨DNA为模板，采用筛选出的20个SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；反应结束后，取3μL的PCR产物加入4μLLoading buffer，再加3μL ddH2O，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体。10μL的LA-taq酶PCR反应体系如下：5μL的Premix Taq(LA Taq Version2.0plus dye)；0.2μmol/L SNP引物；40ng DNA模版；剩余ddH2O补齐。PCR的反应程序为：预变性94℃3min；35循环的94℃30s，最佳Tm温度30s，72℃30s；延伸72℃1min，最终4℃保存。
5、将PCR产物进行纯化后，使用Illumina Miseq进行双端250×的高通量测序。获得FASTQ格式的原始数据(raw reads)首先利用FASTP软件对质量过滤，从原始数据读取的低质量来获取干净的数据(clean reads)。对所有样本的测序数据进行统计，通过质控共获得166897条clean reads，GC含量基本保持在40.35％-46.82％，各样品的Q20碱基百分比均大于89.86％，Q30碱基含量均不小于86.8％，表明各样品数据质量合格。然后使用bwa-mem2(v2.2.1)将干净的数据与参考序列进行比对。使用SAMtools(v1.9)对候选SNPs进行基因分型。使用IGV(Integrative ge-nomics viewer，v2.11.0)手动检查BAM文件的SNP位点。24个美洲黑杨的基因型分型如图1所示。
6、利用Perl程序最终确定了8个SNP分子标记的集合能区分大径材美洲黑杨无性系，用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合。分子标记组合如下所示：
第一个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，Y为C或T；
第二个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，R为A或G；
第三个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，R为A或G；
第四个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，R为A或G；
第五个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中，R为A或G；
第六个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中，K为T或G；
第七个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，W为T或A；
第八个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中，Y为C或T。
每个SNP分子标记对应一个SNP位点，第一个SNP分子标记对应SNP2(5_5078225)，第二个SNP分子标记对应SNP3(5_5468930)，第三个SNP分子标记对应SNP5(8_43714)，第四个SNP分子标记对应SNP7(9_8513188)，第五个SNP分子标记对应SNP8(9_8784110)，第六个SNP分子标记对应SNP10(11_986759)，第七个SNP分子标记对应SNP11(11_18422946)，第八个SNP分子标记对应SNP14(13_276618)。
实施例2
根据SNP分子标记对表2中8个SNP位点在24个大径材美洲黑杨的分型一致性进行检测(测序的数据库中SNP信息)，构建大径材美洲黑杨的指纹图谱，结果如表3所示。SNP分子标记按照顺序构成每个品种的分子身份证。如美洲黑杨MY1无性系(美洲黑杨T20)的SNP分子身份证为CARRAKWT。
表3 24个大径材美洲黑杨无性系的DNA指纹图谱
其中，R为A或G，Y为C或T，M为A或C，K为G或T，S为G或C，W为A或T。
MY1-24对应的美洲黑杨品种分别为：
MY1为美洲黑杨NLT2-20；MY2为美洲黑杨NL-T2；MY3为美洲黑杨NL-T120；MY4为美洲黑杨NL-T1；MY5为美洲黑杨NL-S392；MY6为美洲黑杨NL-S3907；MY7为美洲黑杨NL-S3814；MY8为美洲黑杨国家级良种NL-S3804；MY9为美洲黑杨NL-S3801；MY10为美洲黑杨NL-S372；MY11为美洲黑杨NL-S3702；MY12为美洲黑杨NL-S3700；MY13为美洲黑杨NL-S3261；MY14为美洲黑杨NL-S3244；MY15为美洲黑杨NL-S3240；MY16为美洲黑杨NL-S3239；MY17为美洲黑杨NL-S3236；MY18为美洲黑杨NL-S3229；MY19为美洲黑杨NL-S3201；MY20为美洲黑杨NL-S3183；MY21为美洲黑杨NL-S3121；MY22为美洲黑杨NL-S3109；MY23为美洲黑杨NL-S3503；MY24为美洲黑杨NL-S3016。
实施例3
一种用于筛选大径材美洲黑杨的试剂盒，该试剂盒包括如下所示分子标记组合：
第一个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；第二个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，R为A或G；第三个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示，其中，R为A或G；第四个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，R为A或G；第五个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中，R为A或G；第六个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中，K为T或G；第七个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，W为T或A；第八个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示，其中，Y为C或T。
每个SNP分子标记对应一个SNP位点，第一个SNP分子标记对应SNP2(5_5078225)，第二个SNP分子标记对应SNP3(5_5468930)，第三个SNP分子标记对应SNP5(8_43714)，第四个SNP分子标记对应SNP7(9_8513188)，第五个SNP分子标记对应SNP8(9_8784110)，第六个SNP分子标记对应SNP10(11_986759)，第七个SNP分子标记对应SNP11(11_18422946)，第八个SNP分子标记对应SNP14(13_276618)。
每个SNP位点对应表2中所示的相应SNP引物。
从而能够在不同环境及不同生长季节简单、准确鉴定出不同的美洲黑杨大径材品种，并预测其生长发育状况，加速美洲黑杨遗传改良进程，缩短育种周期。

Claims (8)

1.用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，由8个SNP分子标记组成，其核苷酸序列分别对应SEQ ID NO.1-8。
2.根据权利要求1所述的用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，其特征在于，每个SNP分子标记对应一个SNP位点：
第一个SNP分子标记对应SNP位点SNP2：5_5078225；
第二个SNP分子标记对应SNP位点SNP3：5_5468930；
第三个SNP分子标记对应SNP位点SNP5：8_43714；
第四个SNP分子标记对应SNP位点SNP7：9_8513188；
第五个SNP分子标记对应SNP位点SNP8：9_8784110；
第六个SNP分子标记对应SNP位点SNP10：11_986759；
第七个SNP分子标记对应SNP位点SNP11：11_18422946；
第八个SNP分子标记对应SNP位点SNP14：13_276618。
3.权利要求1所述的用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合的构建方法，步骤包括：
1)初步筛选与生长性状具有显著关联的20个SNP位点作为候选位点；
2)根据候选SNP位点的位置设计20对SNP引物；
3)以24个大径材美洲黑杨DNA为模板，采用筛选出的20对SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)将PCR扩增产物纯化后进行高通量测序确定SNP位点的基因型；
5)根据SNP位点的基因分型结果，最终确定了8个SNP分子标记作为构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合。
4.权利要求1所述的SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合，包括：
SNP2-F：5’-GGCCACAAAATGAATTTCAGAAG-3’，
SNP2-R：5’-GCTATCACAGTTGCAAATTGTCA-3’；
SNP3-F：5’-GTTTATTGATTGGGTGTTGTTTG-3’，
SNP3-R：5’-GATGAAATGCGCTAAAAATCC-3’；
SNP5-F：5’-AGTCTACACGAGCCCTTCATTT-3’，
SNP5-R：5’-ATGGAAGCAAGATGGCTAGACT-3’；
SNP7-F：5’-GTCCCTGGATTTCAATCTCA-3’，
SNP7-R：5’-TACGAATCCCATATGTACCTCC-3’；
SNP8-F：5’-TGATATTATCAGCTGTGTTGGGG-3’，
SNP8-R：5’-TCCTGGTTCTGAAGTTAGCTTCT-3’；
SNP10-F：5’-ACTGCTTTAACCAGCTTGTATCCT-3’，
SNP10-R：5’-CTCAACCCAAATCCACACAATA-3’；
SNP11-F：5’-TTAGGCTGAGAGAACCTCGTG-3’，
SNP11-R：5’-TTCCTCGTATACCGCTCTCTA-3’；
SNP14-F：5’-GGAATTCAAGAACCTGCAATCA-3’，
SNP14-R：5’-TTCAATTGCTAGAACTCTGGGTC-3’。
5.权利要求1所述的用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合在构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱中的应用。
6.权利要求4所述的用于扩增SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合在构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱中的应用。
7.权利要求1所述的用于构建大径材美洲黑杨DNA指纹图谱的SNP分子标记组合在制备用于筛选大径材美洲黑杨的试剂盒中的应用。
8.权利要求4所述的用于扩增SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合在制备用于筛选大径材美洲黑杨的试剂盒中的应用。
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