CN117858960A

CN117858960A - 用于通过双靶标测定来检测丁型肝炎病毒的组合物和方法

Info

Publication number: CN117858960A
Application number: CN202280032750.XA
Authority: CN
Inventors: K·阿迪卡里; R·杜阿; S·杜根尼; M·黑尔; C·马诺; P·里维拉路易斯; 孙惊涛
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2022-05-04
Publication date: 2024-04-09
Also published as: EP4334472A1; JP2024517835A; US20240240273A1; WO2022233930A1

Abstract

本公开描述了用于快速检测生物学或非生物学样品中存在还是不存在丁型肝炎病毒(HDV)的方法。所述方法可包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，还提供了靶向HDV核酶结构域和HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因的引物、探针以及试剂盒，其经设计用于检测HDV。

Description

用于通过双靶标测定来检测丁型肝炎病毒的组合物和方法

技术领域

本公开涉及分子诊断领域，更具体地涉及通过双靶标聚合酶链反应(PCR)测定检测丁型肝炎病毒(Hepatitis Delta Virus,HDV)。

背景技术

丁型肝炎病毒(HDV)是乙型肝炎病毒(HBV)的卫星病毒，在估计全球负担为1500-2000万人中传输和传播。HDV颗粒直径为35-37nm，且具有被HBV包膜包围的核糖核蛋白复合物。核糖核蛋白由环状负链单链病毒RNA基因组(约1700个核苷酸)和HDV蛋白的两种同种型(小和大)组成。全长HDV基因组的系统发育分析将HDV分为八个基因型和许多亚基因型。HDV基因型显示出特定的地理差异和基因型间20％-30％以及亚基因型内15％的高序列多样性。

临床上，与单独感染HBV相比，HBV/HDV双重感染会带来更高的肝脏并发症和更高的死亡率的风险。为了管理较高的HDV感染风险，建议HDV血清学阳性患者通过HDV RNA检测进行主动HDV感染评估。已经开发出数十种家用和商用的逆转录聚合酶链式反应测定来对HDV RNA进行检测和定量。然而，各种测定缺乏标准化。一项评估各种HDV RNA检测测定的国际质量控制研究显示测定性能不太理想，分布在17个国家的28个实验室中，只有13个实验室(46.3％)显示出准确的HDV定量(参见Le Gal等人,Hepatology,2016,第64卷,第5期,第1483-1494页，并通过引用将其全部内容并入本文)。

与稳定的HDV定量相关的主要挑战包括(a)HDV基因组的高遗传多样性，(b)序列数量有限且时空收集倾斜，以及(c)HDV生物学联合编辑和重组，具有高突变率。因此，本领域需要一种快速、可靠、特异性和灵敏的方法来检测HDV基因型和亚基因型。

发明内容

本发明公开了一种用于检测和定量血液、血浆或血清样品中HDV的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)双靶标测定。通过检测计算机选择的具有高包容性的两种HDV靶标，即HDVRNA基因组上的核酶结构域和丁型肝炎抗原(HDAg)基因靶标区域，解决了与上述稳定的HDV检测相关的挑战。与仅检测单个HDV靶标的当前实验室开发和商业HDV测定相比，本发明中的两种高度包容性靶标的检测推动了该领域的发展，它额外的益处是准确地检测和量化HDV，以防由于病毒快速进化导致一种靶标检测失败。

本公开中的某些实施方案涉及用于例如通过单个试管中的实时RT-PCR进行HDV的多重检测来快速检测生物样品或非生物样品中存在还是不存在HDV的方法。实施方案包括检测HDV的方法，这些方法包括执行至少一个循环步骤，该循环步骤可包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括被设计用于在单管中检测HDV的引物、探针和试剂盒。所述检测方法旨在靶向核酶结构域和丁型肝炎抗原(HDAg)基因，从而使人们能够在单次测试中检测HDV。

一方面，提供了一种用于检测样品中HDV的至少两种靶核酸的方法，包括(a)提供样品；(b)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与至少两组引物接触以产生在HDV的至少两种靶核酸存在于所述样品中的情况下的扩增产物；(c)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使在HDV的至少两种靶核酸存在于所述样品中的情况下的所述扩增产物与至少两种探针接触；以及(d)执行检测步骤，所述检测步骤包括检测存在还是不存在所述扩增产物，其中存在所述扩增产物中的一者指示所述样品中存在HDV，并且其中不存在所述扩增产物指示所述样品中不存在HDV；并且其中所述至少两组引物和所述至少两种探针包括：(i)第一组引物，其包含含有SEQ ID NO:1至4或SEQ ID NO:1至4的任意组合的核酸序列或者由其组成的正向引物；和含有SEQ ID NO:5至6或其组合的核酸序列或者由其组成的反向引物；以及第一探针或第一组探针，其包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8或其互补序列的组合的核酸序列，或者由其组成；以及(ii)第二组引物，其包含一种含有SEQID NO:9至10或其组合的核酸序列或者由其组成的正向引物；和一种含有SEQ ID NO:11至12或其组合的核酸序列或者由其组成的反向引物；以及第二探针或第二组探针，其包含SEQID NO:13至15或其互补序列或者SEQ ID NO:13至15或其互补序列的任意组合的核酸序列，或者由其组成。在相关实施例中，所述样品是生物学样品。在另一个相关实施方案中，生物学样品为血液、血浆或血清。

在又一个实施方案中，所述第一组引物产生第一靶核酸的由所述第一探针或所述第一组探针检测的一种或多种扩增产物，并且所述第二组引物产生第二靶核酸的由所述第二探针或所述第二组探针检测的一种或多种扩增产物。在一个实施方案中，第一靶核酸为HDV核酶结构域并且第二靶核酸为HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因。

另一方面，提供了用于检测样品中HDV的方法，包括(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与对HDV核酶结构域具有特异性的一种或多种正向引物和一种或多种反向引物接触以产生在HDV存在于所述样品中的情况下的所述核酶结构域的扩增产物；以及使样品与对HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因具有特异性的一种或多种正向引物和一种或多种反向引物接触以产生在HDV存在于所述样品中的情况下的所述HDAg基因的扩增产物；(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使核酶结构域扩增产物与对所述核酶结构域具有特异性的一种或多种可检测探针接触，以及使HDAg基因扩增产物与对所述HDAg基因具有特异性的一种或多种可检测探针接触；以及(c)检测存在还是不存在所述核酶结构域扩增产物和/或所述HDAg基因扩增产物，其中存在所述核酶结构域扩增产物或所述HDAg扩增产物或这两种扩增产物指示样品中存在HDV，并且其中不存在所述核酶结构域扩增产物和所述HDAg扩增产物这两者指示样品中不存在HDV；其中一种或多种核酶结构域正向引物包含选自SEQ ID NO:1至4或SEQ ID NO:1至4的任意组合的核苷酸序列或者由其组成；并且一种或多种核酶结构域反向引物包含选自SEQ ID NO:5至6或其组合的核苷酸序列或者由其组成；并且所述一种或多种可检测核酶结构域探针包含选自SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8的组合或其互补序列的组合的核苷酸序列，或者由其组成；并且其中一种或多种HDAg基因正向引物包含选自SEQ ID NO:9至10或其组合的核苷酸序列或者由其组成；并且一种或多种HDAg基因反向引物包含选自SEQ ID NO:11至12或其组合的核苷酸序列或者由其组成；并且一种或多种可检测HDAg基因探针包含选自SEQ ID NO:13至15或其互补序列或者SEQ IDNO:13至15或其互补序列的任意组合的核苷酸序列，或者由其组成。

在一个实施方案中，核酶结构域靶标的扩增包括使用包含SEQ ID NO:1至4的核苷酸序列或者由其组成的所有正向引物，以及包含SEQ ID NO:5至6的核苷酸序列或者由其组成的两种反向引物，以及核酶结构域扩增产物的检测包括使用包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列的核苷酸序列或者由其组成的两种可检测探针。在另一个实施方案中，HDAg基因靶标的扩增包括使用包含SEQ ID NO:9至10的核苷酸序列或者由其组成的两种正向引物，以及包含SEQ ID NO:11至12的核苷酸序列或者由其组成的两种反向引物，以及HDAg基因扩增产物的检测包括使用包含SEQ ID NO:13至15或其互补序列的核苷酸序列或者由其组成的所有可检测探针。在一个实施例中，样品是生物学样品。特别地，生物学样品为血液、血浆或血清。

其他方面提供了包含选自SEQ ID NO:1至20或其互补序列的核苷酸序列或者由其组成的寡核苷酸，该寡核苷酸具有50个或更少的核苷酸。在另一个实施方案中，本公开提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1-20中的一个或其互补序列具有至少70％序列一致性(例如，至少75％、80％、85％、90％或95％等)的核酸，该寡核苷酸具有50个或更少的核苷酸。一般来讲，在这些实施例中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在某些实施方案中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸、20个或更少的核苷酸、15个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸，例如，以改变相对于未经修饰的核苷酸的核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一种标记部分和任选地至少一种猝灭剂部分。在一些实施方案中，至少一种标记部分和至少一种猝灭剂部分为荧光部分。在一些实施例中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个核苷酸或小百分比的核苷酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。

一方面，扩增可以使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因此，标记部分和猝灭剂部分，即第一荧光部分和第二荧光部分，可以沿着探针长度彼此相距不超过8个核苷酸。另一方面，核酶结构域和/或HDAg基因探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构形成通常会导致第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。

在一个方面，核酶结构域和HDAg探针可以用充当报告物的荧光染料进行标记。探针还可具有充当猝灭剂的第二染料。报告物染料在定义的波长下测量，从而允许检测和区分扩增的HDV核酶结构域和HDAg基因靶标。完整探针的荧光信号被猝灭剂染料抑制。在PCR扩增步骤期间，探针与特异性单链DNA模板的杂交导致DNA聚合酶的5'到3'核酸酶活性的切割，从而导致报告物染料和淬灭剂染料分离，并生成荧光信号。随着每个PCR循环，生成越来越多数量的经切割的探针，并且报告物染料的累积信号也随之增加。任选地，一种或多种另外的探针(例如，诸如内部参考对照或其他靶向探针(例如，其他病毒核酸))也可以用报告物荧光染料标记，其独特并且不同于与核酶结构域和HDAg基因探针相关联的荧光染料标记。在这种情况下，因为特异性报告物染料是在定义的波长下测量的，所以可以同时检测和区分经扩增的靶标以及一种或多种另外的探针。

本公开提供了检测来自个体的生物学样品中存在还是不存在HDV或HDV核酸的方法。这些方法可用于检测生物样品例如血清、血浆、全血、肝组织或被认为存在HDV的其他生物材料中存在还是不存在HDV或HDV核酸，以用于诊断测试。此外，本领域技术人员可使用相同的测试来评估其他样品类型，以检测HDV或HDV核酸。此类方法通常包括执行逆转录步骤和至少一个循环步骤，所述至少一个循环步骤包括扩增步骤以及或者检测探针结合步骤或者染料结合步骤。通常，扩增步骤包括使样品与多对寡核苷酸引物接触以产生在核酸分子存在于所述样品中的情况下的一种或多种扩增产物，探针结合步骤包括使扩增产物与一种或多种对扩增产物具有特异性的可检测探针接触,并且染料结合步骤包括使扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测存在还是不存在双链DNA结合染料结合到扩增产物中，其中存在结合指示样品中存在HDV或HDV核酸，且其中不存在结合指示样品中不存在HDV或HDV核酸。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。其他核酸结合染料包括DAPI、和花青染料，诸如/>和/>Green。此外，此类方法还可以包括确定扩增产物和双链DNA结合染料之间的解链温度，其中解链温度确认存在还是不存在HDV或HDV核酸。

另一方面，提供了一种用于检测HDV的一种或多种靶核酸的试剂盒。在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的HDV的第一靶核酸和HDV的第二靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含扩增试剂，所述扩增试剂包含：(a)DNA聚合酶，其具有5'至3'核酸酶活性；(b)核苷酸单体；(c)用于检测所述HDV的第一靶核酸的第一组引物以及第一探针或第一组探针，其中第一组引物以及第一探针或第一组探针包含：至少正向引物，所述正向引物包含SEQID NO:1至4和SEQ ID NO:1至4的任意组合的核酸序列或者由其组成；和至少反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:5至6或其组合的核酸序列或者由其组成；以及所述第一探针或所述第一组探针，其包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8或其互补序列的组合的核酸序列，或者由其组成；以及(d)用于检测所述HDV的第二靶核酸的第二组引物以及第二探针或第二组探针；其中所述第二组引物以及所述第二探针或第二组探针包含至少正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:9至10或其组合的核酸序列或者由其组成；和至少反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:11至12或其组合的核酸序列或者由其组成；以及所述第二探针或所述第二组探针，其包含SEQ ID NO:13至15或其互补序列或者SEQ IDNO:13至15或其互补序列的任意组合的核酸序列。在一个实施方案中，第一靶核酸为HDV核酶结构域并且第二靶核酸为HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因。在进一步的实施方案中，提供了一种用于检测HDV的一种或多种靶核酸的试剂盒。该试剂盒可以包括对核酶结构域靶标和/或HDAg基因靶标的扩增具有特异性的多组核酶结构域和/或HDAg基因引物；以及一种或多种对检测相应的扩增产物具有特异性的可检测的核酶结构域和/或HDAg基因探针。所述试剂盒可包括已经用供体和相应的受体荧光部分标记，或者可包括用于标记探针的荧光部分。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶、和核酸聚合酶功能所需的缓冲液。该试剂盒还可包括使用引物、探针和荧光部分来检测样品中存在还是不存在HDV的包装说明书和说明。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本主题的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有歧义，以本专利说明书(包括定义)为准。

本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和详细描述以及权利要求中显而易见。

附图说明

图1示出了用于扩增和检测HDV核酶结构域靶标的引物和探针相对于GenBank登录号AF098261(HDV基因型1)的相对位置。

图2示出了用于扩增和检测HDV HDAg基因靶标的引物和探针相对于GenBank登录号AF098261的相对位置。

图3示出了实施例4中描述的实验结果，该实验使用WHO HDV NAT确定测定灵敏度，浓度为25IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL、1IU/mL和0.5IU/mL，每个浓度进行24次重复测试。

图4示出了实施例4中描述的实验结果以确定测定线性，其中在100拷贝/mL至10¹⁰拷贝/mL之间的每个浓度对HDV装甲RNA(arRNA)进行8次重复测试。

图5示出了实施例4中描述的实验结果以确定测定线性，其中对来自阳性血浆样品的HDV RNA在2.3E+00IU/mL和2.3E+05IU/mL之间每10倍稀释度进行3次重复测试。

图6示出了实施例4中描述的实验结果，使用如实施例3中所述的核酶结构域和HDAg基因的体外转录的HDV基因型1至8序列确定双靶标测定的包容性。每种基因型均在10³拷贝至10⁷拷贝之间的4对数浓度范围内进行测试。

具体实施方式

通过核酸扩增诊断HDV感染提供了一种快速且准确地检测细菌感染的方法。本文描述了用于检测样品中HDV的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定。提供了用于检测HDV的引物和探针，以及包含此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比，实时PCR检测HDV的灵敏度更高，以及实时PCR具有改进的特征，包括样品容纳和扩增产物的实时检测，使该技术在临床实验室中用于HDV感染的常规诊断变得可行。

丁型肝炎病毒(HDV)是一种依赖乙型肝炎病毒(HBV)形成病毒颗粒的传染原。HDV基因组是一种小单链RNA，长度约为1700个核苷酸，呈环状构象。基因组RNA能够利用约74％的碱基配对折叠形成无分支的棒状结构。HDV基因组的复制通过涉及RNA中间体的对称滚环机制进行，并导致新基因组和称为反基因组的互补RNA种类的积累。在典型的HDV感染中，HDV基因组复制期间，每个受感染细胞会积累多达300,000个基因组拷贝和100,000个反基因组拷贝。据信，基因组和反基因组RNA环充当产生两种极性的多聚链的模板，其大于1700个核苷酸单位长度。由于基因组和反基因组中都存在位点特异性核酶序列，这些RNA被加工成单位长度的RNA。核酶切割后，单位长度的RNA连接形成新的环状RNA。由于HDV不编码其自身的复制酶并且可以在其宿主中自主复制，因此一种或多种宿主RNA聚合酶被重定向以进行其复制(Taylor和Pelchat,FutureMicrobiol 5:393-402,2010)。

在经典的HDVHBV感染中，每个感染细胞也产生大约500拷贝的第三种HDV RNA，长度约为900个核苷酸，且具有反基因组极性。该RNA的开放阅读框编码长度为195个氨基酸的蛋白质，且被称为小δ抗原(S-HDAg)，以及在本公开中简称为HDAg。在复制过程中，作用于dsRNA的腺苷脱氨酶将HDAg终止密码子中的腺苷转化为肌苷。这种氨基酸转换导致mRNA的产生，其中终止密码子编码色氨酸，从而产生第二种病毒蛋白，其C端长19个氨基酸，称为大δ抗原(L-HDAg)(Taylor和Pelchat,Future Microbiol 5:393-402,2010)。

对众多分离株的广泛序列分析已将HDV分类为至少八个具有不同地理分布的不同分支。基因型1在世界范围内流行，其他基因型在世界不同地区流行。基因型2存在于东南亚、中国和日本。基因型3是亚马逊河流域特有的。基因型4存在于中国台湾地区。另外，基因型4也存在于日本。最后，基因型5至8普遍存在于非洲。

所公开的方法可包括执行至少一个循环步骤，所述循环步骤包括使用一对或多对核酶结构域引物和/或一对或多对HDAg基因引物来扩增来自样品的HDV核酶结构域核酸靶标和HDV HDAg基因核酸靶标的一个或多个部分。本文所用的“核酶结构域引物”或“HDAg引物”是指分别与核酶结构域和HDAg基因中的核酸序列特异性退火并在适当条件下由其启动合成DNA的寡核苷酸引物。所讨论的核酶结构域或HDAg基因引物中的每一种与相应的靶核酸分子内或邻近的靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。产生核酶结构域扩增产物和/或HDAg基因扩增产物中的一者或多者，条件是样品中存在核酶结构域核酸和/或HDAg基因核酸中的一者或多者，因此存在扩增产物中的一者或多者指示样品中存在HDV。扩增产物应含有与核酶结构域或HDAg基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与核酶结构域或HDAg基因的一种或多种可检测探针接触以检测样品中存在还是不存在HDV。

如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如，HDV核酶结构域或HDVHDAg基因)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，Taq)和适当的缓冲液和/或聚合酶最佳活性的辅助因子(例如，MgCl₂和/或KCl)。

如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，并且指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3'-端提供游离3'-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3’至5’磷酸二酯键，其中使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。

术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。

术语“5'到3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5'末端去除核苷酸。

术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3'末端处起始，并且沿着模板链以5'至3'方向前进。已从黄栖热菌(Thermusflavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。

术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。

当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3'末端添加核苷酸的聚合酶。

在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性(例如，如使用技术人员可用的序列比较算法中的一种或通过视觉检查所测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适于测定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是在例如以下文献中描述的BLAST程序：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215:403-410；Gish等人(1993)“Identification of protein codingregions by database similarity search”Nature Genet.3:266-272；Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms”Nucleic Acids Res.25:3389-3402；以及Zhang等人(1997)“PowerBLAST:A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation”Genome Res.7:649-656，这些文献各自以引用方式并入本文。

寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，为寡核苷酸提供所需的特性。在本文所述的寡核苷酸中，可被取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-O-甲基核糖-U、2'-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中，经修饰的核苷酸取代相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施例中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001,611(通过引用并入本文)中描述。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001,611(通过引用并入本文)中描述。

本公开提供了通过扩增例如HDV核酶结构域核酸序列和/或HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因核酸序列的一部分来检测丁型肝炎病毒(HDV)的方法。可获得HDV各种基因型和亚基因型的核酸序列(例如，基因型1的GenBank登录号为AF098261，基因型2为AF104264，基因型3为AB037948，基因型4为AB118820，基因型5为AM183326，基因型6为AM183332，基因型7为AM183333，基因型8为AM183330)。具体地，通过本公开中的实施例提供了用于扩增和检测核酶结构域和HDAg基因核酸分子靶标的引物和探针。

为了检测HDV，提供了用于扩增核酶结构域和/或HDAg基因的引物和探针。除了本文例举的那些HDV核酸之外的HDV核酸也可用于检测样品中的HDV。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能变体可以包括例如本文公开的HDV核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。

更具体地，寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO:1至20、其基本上相同的变体(其中该变体与SEQ ID NO:1至20中的一者或SEQ ID NO:1至20的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性)以及变体的序列的核酸。

表I：核酶结构域引物和探针

TABLE 2:丁型肝炎抗原(HDAg)引物和探针

在一个实施方案中，使用上述HDV核酶结构域和HDAg基因引物和探针组以便检测怀疑含有HDV的生物样品中的HDV。引物和探针组可包括对核酶结构域或对HDAg基因核酸序列具有特异性的引物和探针或者由这些引物和探针组成，这些引物和探针含有SEQ ID NO:1至20的核酸序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酶结构域和HDAg基因靶标的引物和探针含有SEQ ID NO:1至15的任何引物和探针的功能活性变体或者由其组成。

可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO:1-20的任何引物和/或探针的功能活性变体。SEQ ID NO:1至20中任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及与SEQ ID NO:1至20的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。

变体可例如由于一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如SEQ ID NO:1-20的相应序列的5'端和/或3'端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ ID NO:1-20的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-去氮杂嘌呤替换，其中也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。

可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade,Colo.)来设计扩增核酶结构域或HDAg基因核酸序列的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。例如，寡核苷酸引物的长度可以长达30、35或40个核苷酸。

除了一组引物之外，这些方法还可使用一个或多个探针以便检测HDV的存在或不存在。术语“探针”是指通过设计或选择含有特异性核苷酸序列的合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，该特异性核苷酸序列允许它们在限定的预定严格性下与“靶核酸”(在本发明的情况下与HDV核酶结构域(靶标)核酸和/或HDV HDAg基因(靶标)核酸)特异性(即，优先)杂交。“探针”可以称为“检测探针”，意思是它检测靶核酸。

在一些实施方案中，所述核酶结构域和HDAg基因探针可用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施方案中，核酶结构域和HDAg基因探针可用供体荧光部分(例如荧光染料)和相应的受体荧光部分(例如猝灭剂)标记。在一个实施方案中，探针包括荧光部分或由其组成，并且核酸序列含有SEQ ID NO:7、8、13、14和15或由其组成。

设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。在一些情况下，寡核苷酸探针的长度可长达30、35或40个核苷酸。

包含HDV核酸分子的构建体可在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可将裸DNA直接递送到细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施方案中有用的引物包括能够充当所述HDV核酶结构域核酸序列(例如，SEQ ID NO:1至6)和HDVHDAg基因核酸序列(例如，SEQ ID NO:9至12)内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单链的，但引物可以是双链的。首先使双链引物变性(即对其进行处理)以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。一种分离核酸链的方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。

如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的核酶结构和HDAg基因核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

PCR测定可采用HDV核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，例如人类细胞中包含的HDV核酸。HDV核酸分子可通过常规技术从生物学样品中提取，所述常规技术诸如Diagnostic Molecular Microbiology:Principlesand Applications(Persing等人(编),1993,American Society for Microbiology,Washington D.C.)中所描述的那些技术。核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物，例如植物或动物。

寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO:1至6和9至12)在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。

新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。链分离、退火和伸长步骤可根据需要重复多次，以产生所需数量的与靶标核酶结构域和/或HDAg基因核酸分子相对应的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地重复至少一次循环步骤(即变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。

在一个示例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在两种荧光部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers^TM(BHQ)(BiosearchTechnologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)、BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。

在另一个实例中，两个寡核苷酸探针(各自包含荧光部分)可在由寡核苷酸探针与HDV靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在从约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。

荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文关于供体和相应的受体荧光部分所用，“相应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。

通常针对以下项选择荧光供体和对应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(>100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(>600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(>600nm)中的发射的对应的受体荧光部分。

可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4'-异硫基-氰酸茋-2,2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City,Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得。

供体和受体荧光部分可以通过接头臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约/>至约/>接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。

受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City,Calif.)或Glen Research(Sterling,VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland,Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(SanRamon,Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3'-氨基-CPGs。

丁型肝炎病毒的检测

本公开提供了用于检测生物学样品或非生物学样品中存在还是不存在丁型肝炎病毒(HDV)的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，该循环步骤包括使用多对核酶结构域和/或HDAg基因引物从样品中扩增HDV核酶结构域和/或HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因靶核酸分子的一部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中。可以使用核酶结构域和/或HDAg基因引物和探针来执行方法以检测HDV的存在，并且检测到HDV核酶结构域和/或HDV HDAg基因指示样品中存在HDV。

如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用技术来检测存在还是不存在扩增产物，并且因此检测存在还是不存在HDV。/>技术利用一种单链杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI/>7700序列检测系统(Applied Biosystems)使用/>技术，并且适合于进行本文所述的用于检测样品中存在还是不存在HDV的方法。

也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，诸如/>-Red 640(LC Red 640)或-Red 705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，HDV基因组的数目)相关。如果HDV靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

通常，存在FRET指示样品中存在HDV，并且不存在FRET指示样品中不存在HDV。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测到FRET指示HDV感染。

可用于实践这些方法的代表性生物学样品包括但不限于血液、血浆、血清、肝脏样品、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放HDV核酸，或者在一些情况下，可使生物样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。

解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子比具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自各自扩增产物的核酶结构域和HDAg基因探针的解链温度可证实样品中存在还是不存在HDV。

在每个热循环仪运行中，也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。

在一个实施例中，该方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。

可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施方案中，使用仪器。以下专利申请描述了如/>技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

可使用PC工作站操作，并且可利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。

作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，Green或/>(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

应当理解，本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。

制品/试剂盒

本公开的实施例还提供了用于检测HDV的制品或试剂盒。制品可包括用于检测HDV的引物和探针，以及合适的包装材料。用于检测HDV的代表性引物和探针能够与HDV靶核酸分子(例如HDV核酶结构域和/或HDV HDAg基因)杂交。此外，试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增HDV靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性实例。

制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分，可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制品可包括用于标记HDV核酶结构域和/或HDV HDAg基因探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。

制品还可包含包装说明书或包装标记，其上具有使用HDV核酶结构域和/或HDVHDAg基因引物和探针来检测样品中的HDV的说明。制品可另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如，缓冲剂、聚合酶、辅因子、或防止污染的药剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。

本公开的实施例将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实例

提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本主题的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

实例1

HDV基因靶标

图1示出了用于扩增和检测HDV核酶结构域靶标的引物和探针相对于GenBank登录号AF098261(HDV基因型1)的相对位置。图2示出了用于扩增和检测HDV HDAg基因靶标的引物和探针相对于GenBank登录号AF098261的相对位置。

实例2

PCR实验条件

使用6800/8800系统(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton,CA)进行核酶结构域靶标或HDAg基因的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示：

表III PCR扩增试剂

下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线：

表IV PCR温度曲线

Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。

实例3

材料和方法

样品：研究中使用HDV装甲RNA(arRNA)、商业获得的HDV阳性血浆和血清样品、WHOHDV IS标准(PEI代码号7657/12)、定制收集的人类志愿捐献者HBV/HCV/HIV阴性混合血浆以及人类志愿捐献者HBV/HCV/HIV阴性混合血清(SeraCare)。HDV阳性血清和血浆样品获自Boca Biologics。

HDV RNA测定：对于测定设计，选择了HDV RNA基因组上的核酶和HDAg靶区域(图1和图2)。HDV序列从Genbank下载、比对并设计包含基因型的引物和探针。在6800系统(Roche Molecular Systems,Inc.)上提取0.5mL的样品体积。提取的样品在50μL中洗脱。在/>6800系统上使用通用RNA主混合物和通用温度曲线对25μL样品进行扩增。使用算法测试框架(ATF)软件对数据进行分析，该软件具有针对HDV测定定制优化的参数。

体外RNA转录：从Genbank下载HDV序列(基因型1至8)。将生成核酶和HDAg靶标的序列克隆到pSP6-polyA载体(Integrated DNA technologies,Inc.)中。克隆的序列经DNA测序所验证。使用基于SP6启动子的MegaScript扩增试剂盒(ThermoFisher)将具有克隆序列的质粒用于体外转录反应。体外RNA转录本通过MegaClear试剂盒(ThermoFisher)纯化，并通过HDV液滴数字PCR测定确定拷贝数。

HDV测定性能研究：使用HDV arRNA和HDV阳性血浆样品确定测定线性。使用WHOHDV NAT标准品作为校准品来报告以IU/mL为单位的线性。通过多项式回归分析线性数据。使用WHO HDV NAT标准品确定检测限(LOD)方面的测定灵敏度，在25IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL、1IU/mL和0.5IU/mL的浓度，每个浓度进行24次重复测试。使用HBV/HCV/HIV阴性混合血浆作为对照。通过probit分析LOD数据。使用HBV/HCV/HIV阴性混合血浆和阴性混合血清的多次重复(n＝92)确定测定特异性。

计算机的包容性和排他性：从Genbank下载通过HDV双靶标测定在计算机中检测到的HDV序列，进行比对，并使用Geneious生物信息学软件(genious biologics)构建系统发育分析(bootstrap＝100)。对于排他性，HDV双靶标测定引物和探针与本地数据库中的HAV、HBV、HCV、HEV和HIV序列进行了交叉反应性的比对。

血浆分离卡(PSC)：在EDTA样品收集管中收集全血。在全血中掺入指定浓度的HDV装甲对照、HDV血浆和HDV WHO IS等样品。为了制备PSC样品，将140mL全血(掺入或不掺入HDV)点样到点样区域的1cm圆圈上。样品点样后，PSC在室温下放置4h，然后与4g干燥剂一起保存在自封袋中。在分析前，所有带有PSC的袋子均储存在不同温度(环境温度、-20℃、45℃)下。

实例4

实验结果

通过多种方法评估双靶标测定的性能。使用WHO HDV NAT标准品确定测定灵敏度，在25IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL、1IU/mL和0.5IU/mL的浓度，每个浓度进行24次重复测试，参见Le Gal等人,Hepatology,2016,第64卷,第5期,第1483-1494页。图3示出了该实验结果，根据命中率和概率曲线拟合确定的检测限(LOD)为1.11IU/mL。

使用两种类型的样品确定测定线性。首先，以100拷贝/mL至10¹⁰拷贝/mL之间的每个浓度重复8次测试HDV装甲RNA(arRNA)。结果如图4所示。平均Ct值范围为9.0(10¹⁰拷贝/mL)到34.96(100拷贝/mL)，并且可以在>8logs的宽泛的范围内观察到准确的定量。接下来，以2.3E+00IU/mL和2.3E+05IU/mL之间的每10倍稀释度重复3次测试来自阳性血浆样品的HDV RNA。如图5所示，平均Ct值范围在20.38至36.49之间，并且可以在宽泛的范围(>5logs)内观察到临床HDV样品的HDV准确定量。

如实施例3中所述，使用核酶结构域和HDAg基因的体外转录的HDV基因型1至8序列进行双靶标测定的包容性的实验检测。每种基因型均在10³拷贝至10⁷拷贝之间的4对数浓度范围内进行测试。结果如图6所示，并证明了本发明的双靶标测定能够检测所有八种HDV基因型，不同于许多实验室开发的HDV测试。进行了In silico包容性和排他性研究，结果表明本发明的双靶标测定将检测所有HDV基因型(1至8)，但预计HAV、HBV、HCV、HEV和HIV不会发生交叉反应(数据未显示)。

虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文档全文以引用方式并入以用于所有目的，其程度如同每项单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文档被单独地指示通过引用并入以用于所有目的。

序列表

<110> F.霍夫曼-罗氏公司

罗氏诊断有限公司

罗氏分子系统有限公司

<120> 用于检测丁型肝炎病毒的组合物和方法

<130> P36851-WO-HS

<150> US 63/185,176

<151> 2021-05-06

<160> 20

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-GS2-FP1-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (22)..(22)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 1

aactggctct cccttagcca tc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-GS2-FP3-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (23)..(23)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 2

gactgggcat tccctttgcc atc 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-GS3-FP2 正向引物

<400> 3

ggtggatctc cctttgccat c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-GS2-FP4-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (22)..(22)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 4

agctggcact cccttagcca tc 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-R6M-TBB 反向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (19)..(19)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 5

gtcggcatgg catctccac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-R6M_2-TBB 反向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (19)..(19)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 6

gtcggcatgg gatctccac 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1-P.1-N 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<400> 7

atgcccaggt cggaccgcga gg 22

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV1_P2_4_RD 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<400> 8

ctccttcgga tgcccaggtc ggaccacg 28

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-F1-M-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (17)..(17)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 9

cgggccggct gttcttc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-F2-M-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (17)..(17)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 10

cgggccggct actcttc 17

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-R-TBB 反向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (20)..(20)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 11

aaggaaggcc ctcgagaaca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-R2-NONTBB 反向引物

<400> 12

aaagaaggcc ctggagaaca 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-PROPN-PROBE1 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (7)..(8)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (10)..(11)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (15)..(15)

<223> C5-丙炔基-dC

<400> 13

cttcttcctc cctgctga 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-PROPYN-PROBE2 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> GHQ-2 猝灭剂

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (7)..(8)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (10)..(11)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (15)..(15)

<223> C5-丙炔基-dC

<400> 14

cttcttcctc cttgctga 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS-PROPYN-PROBE3 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (7)..(8)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (10)..(10)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (11)..(11)

<223> C5-丙炔基-dU

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (15)..(15)

<223> C5-丙炔基-dC

<400> 15

cttcttcctc ttggctga 18

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV-R3-D3-FP1-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (14)..(14)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 16

gggacgaagc cgcc 14

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV-R3-D3-FP2-TBB 正向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (14)..(14)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 17

ggcacgaagc cccc 14

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV-R3-D3-RP1-TBB 反向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (18)..(18)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 18

aagaagagta gccggccc 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV-R3-D3-RP2-TBB 反向引物

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (18)..(18)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 19

aagaagaaca gccggccc 18

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDV_R3_D3_PR1 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3`磷酸盐

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (8)..(8)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (9)..(9)

<223> C5-丙炔基-dU

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (10)..(13)

<223> C5-丙炔基-dC

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (14)..(14)

<223> C5-丙炔基-dU

<220>

<221> 经修饰的_碱基

<222> (15)..(15)

<223> C5-丙炔基-dC

<400> 20

ccgggcgctc ccctc 15

Claims

1.一种用于检测样品中丁型肝炎病毒(HDV)的至少两种靶核酸的方法，所述方法包括：

(a)提供样品；

(b)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与至少两组引物接触以产生在HDV的所述至少两种靶核酸存在于所述样品中的情况下的扩增产物；

(c)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使在HDV的所述至少两种靶核酸存在于所述样品中的情况下的所述扩增产物与至少两种探针接触；以及

(d)执行检测步骤，所述检测步骤包括检测存在还是不存在所述扩增产物，其中存在所述扩增产物中的一者指示所述样品中存在HDV，并且其中不存在所述扩增产物指示所述样品中不存在HDV；并且

其中所述至少两组引物和所述至少两种探针包括：

(i)第一组引物，其包含至少一种含有SEQ ID NO:1至4或SEQ ID NO:1至4的任意组合的核酸序列的正向引物；和至少一种含有SEQ ID NO:5至6或其组合的核酸序列的反向引物；以及第一探针或第一组探针，其包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8或其互补序列的组合的核酸序列；以及

(ii)第二组引物，其包含至少一种含有SEQ ID NO:9至10或其组合的核酸序列的正向引物；和至少一种含有SEQ ID NO:11至12或其组合的核酸序列的反向引物；以及第二探针或第二组探针，其包含SEQ ID NO:13至15或其互补序列或者SEQ ID NO:13至15或其互补序列的任意组合的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

所述杂交步骤包括使所述扩增产物与各自用供体荧光部分和对应的受体部分标记的两种或更多种探针接触；并且

所述检测步骤包括检测所述探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间存在还是不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在还是不存在荧光指示所述样品中存在还是不存在HDV。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物学样品为血液、血浆或血清。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一组引物产生第一靶核酸的由所述第一探针或所述第一组探针检测的一种或多种扩增产物，且/或所述第二组引物产生第二靶核酸的由所述第二探针或所述第二组探针检测的一种或多种扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一靶核酸为HDV核酶结构域并且所述第二靶核酸为HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因。

8.一种用于检测样品中丁型肝炎病毒(HDV)的方法，所述方法包括：

(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与对HDV核酶结构域具有特异性的一种或多种正向引物和一种或多种反向引物接触以产生在HDV存在于所述样品中的情况下的所述核酶结构域的扩增产物；以及使所述样品与对HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因具有特异性的一种或多种正向引物和一种或多种反向引物接触以产生在HDV存在于所述样品中的情况下的所述HDAg基因的扩增产物；

(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使核酶结构域扩增产物与对所述核酶结构域具有特异性的一种或多种可检测探针接触，以及使HDAg基因扩增产物与对所述HDAg基因具有特异性的一种或多种可检测探针接触；以及

(c)检测存在还是不存在所述核酶结构域扩增产物和/或所述HDAg基因扩增产物，其中存在所述核酶结构域扩增产物或所述HDAg扩增产物或这两种扩增产物指示所述样品中存在HDV，并且其中不存在所述核酶结构域扩增产物和所述HDAg扩增产物这两者指示所述样品中不存在HDV；

其中一种或多种核酶结构域正向引物包含选自SEQ ID NO:1至4或SEQ ID NO:1至4的任意组合的核苷酸序列；并且一种或多种核酶结构域反向引物包含选自SEQ ID NO:5至6或其组合的核苷酸序列；并且一种或多种可检测核酶结构域探针包含选自SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8或其互补序列的组合的核苷酸序列；并且

其中一种或多种HDAg基因正向引物包含选自SEQ ID NO:9至10或其组合的核苷酸序列；并且一种或多种HDAg基因反向引物包含选自SEQ ID NO:11至12或其组合的核苷酸序列；并且

一种或多种可检测HDAg基因探针包含选自SEQ ID NO:13至15或其互补序列或者SEQID NO:13至15或其互补序列的任意组合的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种核酶结构域正向引物包含SEQ IDNO:1至4的所有四种核苷酸序列，所述一种或多种核酶结构域反向引物包含SEQ ID NO:5至6的两种核苷酸序列，并且所述一种或多种可检测核酶结构域探针包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列的两种核苷酸序列。

10.根据权利要求8和9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种HDAg基因正向引物包含SEQ ID NO:9至10的两种核苷酸序列，所述一种或多种HDAg基因反向引物包含SEQ IDNO:11至12的两种核苷酸序列，并且所述一种或多种可检测HDAg基因探针包含SEQ ID NO:13至15或其互补序列的所有三种核苷酸序列。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中：

所述杂交步骤包括使所述扩增产物与各自用供体荧光部分和对应的受体部分标记的所述可检测探针接触；并且

所述检测步骤包括检测所述可检测探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间存在还是不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在还是不存在荧光指示所述样品中存在还是不存在HDV。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物学样品为血液、血浆或血清。

15.一种用于检测样品中的HDV的第一靶核酸和HDV的第二靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包含：

(a)DNA聚合酶，其具有5'至3'核酸酶活性；

(b)核苷酸单体；

(c)用于检测所述HDV的第一靶核酸的第一组引物以及第一探针或第一组探针，

其中所述第一组引物以及所述第一探针或第一组探针包含：至少正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:1至4和SEQ ID NO:

1至4的任意组合的核酸序列；和至少反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO:5至6或其组合的核酸序列；以及所述第一探针或所述第一组探针，其包含SEQ ID NO:7至8或其互补序列或者SEQ ID NO:7至8或其互补序列的组合的核酸序列；以及

(d)用于检测所述HDV的第二靶核酸的第二组引物以及第二探针或第二组探针，

其中所述第二组引物以及所述第二探针或第二组探针包含：至少正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO:9至10或其组合的核酸序列；和至少反向引物，所述反向引物包含SEQID NO:11至12或其组合的核酸序列；以及所述第二探针或所述第二组探针，其包含SEQ IDNO:13至15或其互补序列或者SEQ ID NO:13至15或其互补序列的任意组合的核酸序列。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一靶核酸为HDV核酶结构域并且所述第二靶核酸为HDV丁型肝炎抗原(HDAg)基因。

17.根据权利要求15和16中任一项所述的试剂盒，其中所述第一探针和所述第二探针以及所述第一组探针和所述第二组探针用供体荧光部分和对应的受体部分来标记。

18.一种寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1至20或其互补序列的核苷酸序列，所述寡核苷酸具有50个或更少的核苷酸。