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CN117821513A - 治疗退行性眼部疾病的药物组合物及方法 - Google Patents

治疗退行性眼部疾病的药物组合物及方法 Download PDF

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CN117821513A
CN117821513A CN202311672536.3A CN202311672536A CN117821513A CN 117821513 A CN117821513 A CN 117821513A CN 202311672536 A CN202311672536 A CN 202311672536A CN 117821513 A CN117821513 A CN 117821513A
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Lingang National Laboratory
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Abstract

本发明涉及用于治疗退行性眼部疾病的药物组合物及其方法，具体提供一种核酸构建物，包含视锥细胞特异性启动子、RD3L蛋白的编码序列。本发明的药物组合物能延缓视网膜色素变性中视锥细胞的死亡，延长病人昼间视觉功能，可以用于视网膜退行性疾病的治疗。

Description

治疗退行性眼部疾病的药物组合物及方法
技术领域
本发明涉及生物分子领域，尤其涉及治疗退行性眼部疾病的药物组合物及方法。
背景技术
视网膜色素变性(RP)是发病率最高的一类遗传性视网膜退行疾病，世界范围内约每4000人中就有一位患者。目前已知约有100个基因(如RHO，PDE6B)突变会导致RP。受基因突变的影响，视杆细胞首先发生自主变性死亡；其后视锥细胞因未知原因跟随视杆细胞死亡，即非自主变性死亡，病人视野逐渐缩小、最终导致中心视力逐渐丧失。迄今为止，只有极少数几种针对极个别致病基因的治疗方法且其远期效果还正在进行观察中，绝大多数RP尚不能得到有效治疗。
RP视锥非自主性变形死亡机制尚不完全清楚，且在动物模型中没有检测到对RP视锥具有完全保护效力的方法。目前，通用型基因治疗RP的研究主要集中于在视网膜细胞(例如：视锥)中过表达的RDCVF，NRF2，TGFB1，CX3CL1，CD47，TXNIP等基因。这其中只有RDCVF相关基因治疗产品进入到临床试验阶段，但其有效性尚存疑。针对视锥细胞的非自主变性死亡，设计RP通用基因疗法药物，将惠及更多病患。
发明内容
本发明发现，RD3L基因表达量的提高对RP视锥细胞具有保护作用。因此，本申请提供一种对RP视锥细胞有保护效力的基因治疗产品。
本发明第一方面提供一种核酸构建物，包含视锥细胞特异性启动子和RD3L蛋白的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包括多聚腺苷酸化信号。在一个实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号选自：人生长激素多聚腺苷酸化信号、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和SV40多聚腺苷酸化信号。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物依次包含视锥细胞特异性启动子、RD3L蛋白的编码序列和多聚腺苷酸化信号。所述RD3L蛋白的编码序列与视锥特异性启动子、多聚腺苷酸化信号可操作性地连接。
在一个或多个实施方案中，所述RD3L蛋白具有SEQ ID NO:6或7所示的序列或与SEQ ID NO:6或7所示的序列具有至少80％、至少90％、至少99％序列同一性的序列。
在一个或多个实施方案中，所述RD3L蛋白的编码序列具有SEQ ID NO:4或5所示的序列或与SEQ ID NO:4或5所示的序列具有至少80％、至少90％、至少99％序列同一性的变体。
在一个或多个实施方案中，所述视锥特异性启动子是RedO启动子、SynP136启动子、GNAT2启动子、SynPVI启动子或mCAR启动子。
在一个或多个实施方案中，RedO启动子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。在一个或多个实施方案中，SynP136启动子的序列如SEQ ID NO:10所示。在一个或多个实施方案中，SynPVI启动子的序列如SEQ ID NO:11所示。在一个或多个实施方案中，mCAR启动子的序列如SEQ ID NO:12所示。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE(如SEQ ID NO:13所示)或其变体WPRE3(如SEQ ID NO:14所示)。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包括ITR区，包括5’ITR和3’ITR。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物从5’到3’依次为可操作性连接的5’ITR、本文任一实施方案所述的视锥特异性启动子、本文任一实施方案所述的RD3L蛋白的编码序列、本文任一实施方案所述的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件和本文任一实施方案所述的多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述核酸构建物从5’到3’依次为可操作性连接的5’ITR、RedO启动子、RD3L蛋白的编码序列、WPRE3和SV40多聚腺苷酸化信号。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体为克隆载体、整合载体或表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体为AAV载体、慢病毒载体或腺病毒载体，优选为AAV载体。
本发明还提供一种核酸递送试剂，包含本文任一实施方案所述的核酸构建物和递送运载体，所述递送运载体包括病毒(例如AAV、慢病毒或腺病毒)、病毒类似颗粒(例如PEG10)、脂质纳米颗粒(LNP)。
本发明第二方面提供一种AAV病毒，包含本文第一方面所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述AAV病毒还包含具有AAV病毒所需基因的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，AAV病毒所需基因包括选自以下的一种或多种：Rep、Cap、E2A、E4和VA基因。
本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文第一方面所述的核酸构建物或第二方面所述的AAV病毒。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是293T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述RD3L蛋白具有SEQ ID NO:6或7所示的序列或与SEQ ID NO:6或7所示的序列具有至少80％、至少90％、至少99％序列同一性的序列。
在一个或多个实施方案中，所述RD3L蛋白的编码序列具有SEQ ID NO:5或6所述的序列或与SEQ ID NO:5或6所述的序列具有至少80％、至少90％、至少99％序列同一性的变体。
本发明还提供一种制备本文所述AAV病毒的方法，所述方法包括步骤：(1)用作为AAV载体的本文所述的核酸构建物与辅助质粒转染细胞，(2)孵育细胞产生AAV病毒，和(3)收集病毒。
在一个或多个实施方案中，所述辅助质粒包含rep基因和cap基因。优选地，rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52和/或Rep40；cap基因编码VP1、VP2和/或VP3。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：
(1)将本文任一实施方案中所述的RD3L蛋白的编码序列(如SEQ ID NO:4或5)克隆到AAV-RO1.7的空载体上，得到质粒AAV-RO1.7-mRD3L；
(2)将(1)中质粒与Helper质粒和AAV8衣壳质粒转染293T细胞，包装到AAV8衣壳中；和
(3)从细胞培养物中收集病毒。
在一个或多个实施方案中，所述细胞培养物包括细胞或其培养上清。
本发明还提供本文任一实施方案所述的核酸构建物、AAV病毒、宿主细胞在制备用于治疗退行性眼部疾病或其症状、或由RD3L表达降低引起的疾病或其症状的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老龄黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良。
在一个或多个实施方案中，所述由RD3L表达降低引起的疾病是由RD3L表达降低引起的眼部疾病。
本发明还提供一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的AAV病毒。
在一个或多个实施方案中，所述辅料包含黏度诱导剂。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物适用于眼内给药。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物适用于玻璃体内或视网膜下、玻璃体下、结膜下、肌腱下、眼周、球后、脉络膜上和/或巩膜内给药。
本发明还提供一种试剂盒，包含本文任一实施方案所述的核酸构建物、AAV病毒、宿主细胞和药物组合物中的任一种或多种。
本发明还提供一种治疗或预防受试者的退行性眼部疾病或其症状、或由RD3L表达降低引起的眼部疾病或其症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的核酸构建物、AAV病毒或药物组合物中的任何一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述施用是眼内给药。
在一个或多个实施方案中，所述眼内给药选自玻璃体内或视网膜下、玻璃体下、结膜下、肌腱下、眼周、球后、脉络膜上和/或巩膜内给药。
在一个或多个实施方案中，所述退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老龄黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良。
本发明还提供一种延缓患有退行性眼部疾病的受试者的功能性视力丧失的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的核酸构建物、AAV病毒或药物组合物中的任何一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述施用是眼内给药。
在一个或多个实施方案中，所述眼内给药选自玻璃体内或视网膜下、玻璃体下、结膜下、肌腱下、眼周、球后、脉络膜上和/或巩膜内给药。
在一个实施方案中，所述退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老年黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良。
本发明还提供本文任一实施方案所述的核酸构建物、AAV病毒、宿主细胞在制备用于延缓患有退行性眼部疾病的受试者的功能性视力丧失的药物中的应用。
在一个实施方案中，所述退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老龄黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良。
本发明还提供本文任一实施方案所述的核酸构建物、AAV病毒、宿主细胞在制备用于延缓视网膜色素变性中视锥细胞的死亡和/或延长病人昼间视觉功能的药物中的应用。
本发明优点：
(1)本发明能延缓视网膜色素变性中视锥细胞的死亡，延长病人昼间视觉功能，可以用于其他相关视网膜退行性疾病的治疗，对其他视网膜/眼致盲性退行疾病中的视锥细胞存活和病人昼间视觉有保护作用，例如：老年黄斑变性；
(2)本发明通过在RP动物模型(rd1)的视锥细胞中特异性过表达RD3L基因，对疾病模型鼠的视锥细胞存活具有显著性保护作用。
附图说明
图1：RD3L表达框示意图。
图2：AAV-RO1.7-RD3L载体示意图。
图3：过表达RD3L的RD1小鼠的视网膜的代表性图像。
图4：过表达RD3L的RD1小鼠的视网膜的1/2视网膜半径内的视锥计数的统计。
具体实施方式
除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等编辑，1994)；A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas等，2001)。
术语“疾病和/或状况”是指与本文所述疾病和/或状况相关联的受试者的身体状态。
术语“受试者”或“患者”可指接受本发明药物组合物以治疗、预防、改善和/或缓解本发明疾病或状况的患者或其他动物，尤其是哺乳动物，例如人、狗，猴子、牛、马等。
RD3L基因的具体序列虽然已经公开(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/217874)，但其功能未有相关文献报道。本发明首次发现，RD3L基因表达量的提高对RP视锥细胞具有保护作用，能延缓视网膜色素变性中视锥细胞的死亡，延长病人昼间视觉功能，可以用于视网膜退行性疾病的治疗，由此完成本发明。
核酸构建物、病毒和细胞
本发明首先提供一种核酸构建物(例如表达框或载体)，依次包含视锥特异性启动子、RD3L核苷酸序列。所述核酸构建物可包括多聚腺苷酸化信号。因此，本文的一种核酸构建物依次包含视锥细胞特异性启动子、RD3L蛋白的编码序列和多聚腺苷酸化信号，所述RD3L蛋白的编码序列与视锥特异性启动子、多聚腺苷酸化信号可操作性地连接。
本文中，多聚腺苷酸化信号可以是人生长激素多聚腺苷酸化信号、牛生长激素多聚腺苷酸化信号或SV40多聚腺苷酸化信号。
本文中，视锥特异性启动子可以是本领域已知的能在视锥中特异性启动蛋白表达的任何启动子，例如RedO启动子、SynP136启动子、GNAT2启动子、SynPVI启动子或mCAR启动子。RedO启动子的序列如SEQ ID NO:8(RedO-1.7kb)或SEQ ID NO:9(RedO-2kb)所示。SynP136启动子的序列如SEQ ID NO:10所示。SynPVI启动子的序列如SEQ ID NO:11所示。mCAR启动子的序列如SEQ ID NO:12所示。
本文中，小鼠RD3L蛋白序列具有SEQ ID NO:6所示的序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的变体；人RD3L蛋白序列具有SEQ ID NO:7所示的序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的变体。
本文中，小鼠RD3L核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的变体；人RD3L核苷酸序列具有SEQ ID NO:5所示的序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的变体。
本发明所述氨基酸序列的变体与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性并保留来源序列的生物学功能(例如RD3L蛋白变体具有RD3L蛋白的功能)。本发明所述核酸序列的变体与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性，并且，核酸序列的变体所编码的氨基酸序列与来源序列所编码的氨基酸序列相同或虽然不同但保留来源序列所编码的氨基酸序列的生物学功能(例如RD3L蛋白的核酸序列的变体编码的蛋白与RD3L蛋白相同或虽然不同但具有RD3L蛋白的功能)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，如BLASTP或BLASTN。
本发明的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory)、Ausubel等(1989,Short Protocols in Molecular Biology,Wiley)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述多核苷酸和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的多核苷酸的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的融合多肽。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％同一性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本文所述的核酸构建物可以是表达盒，根据不同的表达情况，表达盒可由视锥细胞特异性启动子、RD3L蛋白的编码序列和多聚腺苷酸化信号组成。在一些实施方案中，表达盒还包括5’ITR和3’ITR。
在一些实施方案中，核酸构建物是载体。载体可以是质粒、粘粒、病毒、病毒载体。载体包括克隆载体、整合载体、也可以是表达载体。除本发明所述的核苷酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。能有效在人体内，尤其是视锥细胞中表达蛋白的载体优选用于本发明，包括但不限于AAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体等。
表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的蛋白的核酸的多连接子区和可选标记元件。
载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于融合多肽的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸(诸如6His)或另一种“标签”，诸如FLAG、HA或myc。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测蛋白的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可随后通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的蛋白除去。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊锥动物或无脊锥动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。
在一些实施方案中，本发明的融合多肽通过重组AAV(rAAV)载体系统表达。本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”包括与该名称相关的病毒类别的成员，该病毒类别属于Dependoparvovirus属，Parvoviridae科。腺相关病毒是一种单链DNA病毒，它只在细胞中生长，其中某些功能是由共同感染的辅助病毒提供的。AAV的一般信息和综述可参见例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷，第169-228页。已知该病毒的多种血清型适于基因递送，各种血清型在结构上和功能上密切相关。所有AAV血清型显然都表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；并且都携带三种相关的衣壳蛋白。AAV血清型是本领域已知的，例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV7m8、AAVPHP.B或AAVrh74。可用于本文所公开方法的非限制性示例性血清型包括这些血清型中的任一种，例如AAV2、AAV8、AAV9。本发明中提供的AAV病毒，包含本文任一实施方案所述RD3L核苷酸序列或核酸构建物。
本文所用的“AAV载体”指包含一个或多个本文融合多肽的编码序列和一个或多个AAV反向末端重复(ITR)、基本上由其组成或由其组成的载体。当存在于提供rep和cap基因产物功能性的宿主细胞中时，这种AAV载体可被复制并包装到感染性病毒颗粒中；例如通过转染宿主细胞。在一个或多个实施方案中，AAV载体含有启动子、编码RD3L的至少一种核酸、和/或包装到感染性AAV颗粒的侧翼ITR内的增强子和/或终止子。含有AAV载体的质粒也可含有用于制备用途的元件，例如抗生素抗性基因等。在一个或多个实施方案中，所述AAV病毒包含SEQ ID NO:3所示的序列。
如本文所用，关于病毒或质粒的术语“辅助者”或“辅助质粒”是指用于提供本文公开的任一种AAV载体复制和包装所必需的额外组分的病毒或质粒。辅助病毒编码的组分可以包括病毒粒子组装、包壳、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒或质粒可编码病毒基因组复制所必需的酶。适合与AAV构建体一起使用的辅助病毒和质粒的非限制性实例包括pHELPer(质粒)、腺病毒(病毒)或疱疹病毒(病毒)。在一些实施方案中，一种或更多种辅助质粒包括包含rep基因和cap基因的第一辅助质粒和包含E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是源自AAV2的rep基因，并且cap基因源自AAV44.9。辅助质粒和制备这样的质粒的方法是本领域中已知的并且是市售可得的。示例性的辅助质粒如SEQ ID NO:16所示的Helper质粒和/或如SEQ IDNO:17所示AAV8衣壳质粒。
如本文所用，术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质外壳或衣壳。衣壳的功能是包壳、保护、转运病毒基因组，并将其释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质的寡聚结构亚基(“衣壳蛋白”)组成。如本文所用，术语“包壳”是指被包含在病毒衣壳内。AAV的病毒衣壳包含下列三种主要病毒蛋白、基本上由下列三种主要病毒蛋白组成、或由下列三种主要病毒蛋白组成：VP1、VP2和VP3。
产生和使用AAV病毒的方法是本领域中已知的。产生AAV病毒和异源核酸的方法也是本领域中已知的并且是市售的(参见例如US2007/0015238和US2012/0322861，其通过引用整体并入本文)。例如，可将包含RD3L核酸序列的质粒与一种或更多种辅助质粒(例如包含rep基因(例如编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和/或VP3)组合并转染或永久整合到生产细胞系中，使得AAV病毒可包装并随后纯化。在一些实施方案中，细胞系是哺乳动物细胞系，例如人胚肾(HEK)293细胞系。本文提供了包含本文公开的AAV载体和/或AAV病毒中的任一种的细胞。
本文的制备AAV病毒的方法具体包括：(1)将本文所述的RD3L核苷酸序列(如SEQID NO:4或5)或核酸构建物克隆到AAV-RO1.7的空载体上，得到质粒AAV-RO1.7-mRD3L；(2)将(1)中质粒和Helper质粒、AAV8衣壳质粒共转染293T细胞，包装到AAV8衣壳中；(3)从细胞培养物中收集病毒(例如72h后使用碘克沙醇梯度收集病毒)。
本问还提供了将目标基因导入受试者细胞的方法，包括使细胞与有效量的本文任一种AAV病毒颗粒接触，其中所述颗粒含有本文任一种包含RD3L编码序列的AAV载体。
本发明还包括宿主细胞，其包含、表达和/或分泌本发明任一实施方式所述的RD3L核苷酸或多肽，或包含本文所述的核酸构建物或所述的AAV病毒。所述核酸构建物或AAV病毒通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。适当的宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：本发明所述的核酸构建物、本发明所述的AAV病毒、宿主细胞。通常，施用药物组合物以用于疗法。
如本文所述，药物组合物可通过药理学领域已知或开发的任何方法配制，所述方法包括但不限于使活性成分(例如病毒颗粒或重组载体)与赋形剂或其它辅助成分接触，将产物划分或包装为剂量单位。本文的病毒颗粒可以配制为具有期望的特征，例如增加的稳定性、增加的细胞转染、持续或延迟的释放、生物分布或向性、体内编码蛋白的调节或增强的翻译、以及体内编码蛋白的释放特征谱。
因此，药物组合物可以进一步包含盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米粒子模拟物或其组合。在一些实施方案中，药物组合物被配制为纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子是自组装的核酸纳米粒子。
根据本文的药物组合物可以以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量制备、包装和/或散装销售。活性成分的量通常等于将被施用给受试者的活性成分的剂量和/或这样的剂量的合宜比率，例如这样的剂量的一半或三分之一。
如本文所用，术语“药学上可接受的辅料”涵盖任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油/水或水/油乳液，及各种类型的润湿剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、黏度诱导剂。辅料的实例参见Martin(1975)Remington's Pharm.Sci.第15版(MackPubl.Co.,Easton)。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种赋形剂，各赋形剂的量一起增加病毒载体的稳定性，增加细胞转染或病毒载体转导，增加病毒载体编码的蛋白质的表达，和/或改变病毒载体编码的蛋白质的释放特征谱。赋形剂的非限制性实例包括溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含冷冻保护剂。术语“冷冻保护剂”是指能够在冷冻期间减少或消除对物质的损害的试剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、棉子糖和/或甘露醇。
递送运载体
本发明还提供一种核酸递送试剂，包含本文所述的核酸构建物(例如表达盒或载体)和递送运载体，所述递送运载体包括病毒(例如AAV、慢病毒或腺病毒)、病毒类似颗粒(例如PEG10)、脂质纳米颗粒(LNP)。脂质纳米颗粒是由磷脂双层组成的球形囊泡，通常由四种成分组成：阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG脂质。示例性的脂质纳米颗粒例如BioNTech的BNT162b2和Moderna的mRNA-1273。
方法和用途
本发明提供了预防或治疗病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是退行性眼部疾病或由RD3L表达降低引起的眼部疾病。在一个实施方案中，退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老龄黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良。
本文所用“治疗”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，退行性眼部疾病)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。如本文所用，受试者中疾病的“治疗”是指(1)预防受试者中发生的症状或疾病，所述受试者易患或尚未表现出疾病的症状；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善或引起疾病或疾病症状的消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。有益或期望的结果可以包括一种或多种，但不限于，减轻或改善无论可检测的还是不可检测的一种或多种症状、减轻病状(包括疾病)的程度、病状(包括疾病)的稳定(即，不恶化)状态、延缓或减缓病状(包括疾病)、进展、改善或减轻病状(包括疾病)、状态和缓解(无论部分或全部)。
诊断或治疗的“受试者”是细胞或动物，例如哺乳动物或人。受试者不限于特定物种，包括接受诊断或治疗的非人动物和接受感染或动物模型的那些动物，包括但不限于猿、鼠、大鼠、犬或兔类物种，以及其它家畜、运动类动物或宠物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
本文所用术语“有效量”旨在意指足以达到所需效果的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论的病症的类型和严重性以及个体受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因疗法的背景下，在一些实施方案中，有效量是足以导致在受试者中缺陷的基因恢复部分或全部功能的量。在其它一些实施方案中，AAV病毒的有效量是足以导致基因在受试者中表达的量。熟练的技术人员将能够根据这些和其它因素确定合适的量。
在一些实施方案中，有效量将取决于所讨论的应用的大小和性质。它还取决于目标受试者的性质和敏感性以及使用的方法。本领域技术人员将能够基于这些和其它考虑来确定有效量。根据实施方案，有效量可以包括组合物的一次或多次施用、基本上由组合物的一次或多次施用组成或由组合物的一次或多次施用组成。
如本文所用，术语“施用”旨在表示将物质递送至受试者，诸如动物或人。施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗的受试者的年龄、健康或性别而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择，或者在宠物和其它动物的情况下，由治疗兽医选择。本文中，所述施用是眼内给药。在一个或多个实施方案中，所述眼内给药选自玻璃体内或视网膜下、玻璃体下、结膜下、肌腱下、眼周、球后、脉络膜上和/或巩膜内给药。
剂量和施用
确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的和被治疗的受试者而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择。剂量可能受施用途径的影响。合适的剂量制剂和施用所述试剂的方法是本领域已知的。这种合适剂量的非限制性实例可以是每次施用低至10E9个载体基因组至至多10E17个载体基因组。
适用于本发明核酸递送试剂、AAV病毒或药物组合物的施用包括眼内给药，例如玻璃体内或视网膜下、玻璃体下、结膜下、肌腱下、眼周、球后、脉络膜上和/或巩膜内给药。
本发明的AAV病毒或药物组合物的施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地实现。在一些实施方案中，本发明的AAV病毒或药物组合物通过注射进行眼内施用。本发明的AAV病毒和组合物可与用于治疗的病症的其它已知治疗组合施用。
试剂盒
在一些实施方案中，本文所述的试剂、载体或组合物可以组装成药物或诊断或研究试剂盒以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的使用。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括本文所述的核酸构建物、AAV病毒、宿主细胞或药物组合物中的任一种。
在一些实施方案中，试剂盒还包括使用说明书。具体地，这样的试剂盒可以包括一种或多种本文所述的试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。在一些实施方案中，试剂盒可以包括关于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。在一些实施方案中，试剂盒中的试剂是适合于特定应用和试剂的施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的试剂盒可以含有用于进行各种实验的适当浓度或量的组分。
试剂盒可以设计成便于使用本文所述的方法，并且可以采取许多形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的或另外可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其它物质(例如，水或细胞培养基)，其可以或可以不与试剂盒一起提供。在一些实施方案中，组合物可以在保存溶液(例如，冷冻保存溶液)中提供。保存溶液的非限制性实例包括DMSO、多聚甲醛。在一些实施方案中，保存溶液含有一定量的金属蛋白酶抑制剂。
在一些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。因此，在一些实施方案中，试剂盒可以包括容纳本文所述的试剂的容器。所述试剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。所述试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷冻运输。或者，它们可以容纳在小瓶或其它容器中以便储存。第二容器可以具有无菌制备的其它试剂。或者，试剂盒可以包括预混合的活性剂，并在注射器、小瓶、管或其它容器中运输。试剂盒可以具有将试剂施用于受试者所需的一种或多种或所有组分，例如注射器、局部施用装置或IV针管和袋。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：AAV载体构建
RD3L小鼠全长cDNA购于生工生物工程(上海)股份有限公司，通过正向引物F(SEQID NO:1)：5‘-ggacagggctttccatagcAtATGCCACTTTTTAGCTGGGT；反向引物R(SEQ ID NO:2):5‘-GGTTGATTATCTCGAGCGGGTCAGCTTGGTGGGTAATAGT，进行PCR反应，将得到的RD3L cDNA(SEQID NO:4)，通过Gibson Assembly Master Mix(New England BioLabs)克隆到有SpeI和EcoRI酶切位点的AAV-RO1.7(SEQ ID NO:15)的空载体(来源自已发表文章：Xue Y,WangSK,Rana P,West ER,Hong CM,Feng H,Wu DM,Cepko CL.AAV-Txnip prolongs conesurvival and vision in mouse models of retinitis pigmentosa.Elife.2021Apr 13；10:e66240)上，获得的AAV载体如SEQ ID NO:3所示。反应温度为50摄氏度，反应时间为20分钟，得到质粒AAV-RO1.7-mRD3L。经Sanger测序、标志性酶切、全质粒测序等方法确认其表达框和载体图分别如图1和图2所示。
实施例2：动物实验
首先是将构建成功的质粒AAV-RO1.7-mRD3L通过293T细胞和Helper质粒(SEQ IDNO:16)、AAV8衣壳质粒(SEQ ID NO:17)进行共转染，包装到AAV8衣壳中，72h后，使用碘克沙醇梯度纯化病毒。在rd1小鼠(携带Pde6b基因缺失突变的小鼠，维通利华售FVB品系)P0(出生第0天)时进行实验。首先将动物分组，其中实验组动物14只，对照组动物11只，将AAV和PBS混合，按1×109vg/eye进行视网膜下注射，并用AAV8-RedO-H2BGFP病毒(H2BGFP序列如SEQ ID NO:18所示)共注射以特异性标记视锥细胞核。对照组仅注射相同剂量的AAV8-RedO-H2BGFP病毒以特异性标记视锥细胞核。等到小鼠P50时，收集视网膜将其摊平并用一个已发表的matlab脚本程序(Xue Y,Wang SK,Rana P,West ER,Hong CM,Feng H,Wu DM,Cepko CL.AAV-Txnip prolongs cone survival and vision in mouse models ofretinitis pigmentosa.Elife.2021Apr 13；10:e66240.)对其1/2半径内视锥细胞(cone)进行计数，统计结果。结果如图3和图4所示。
图3的左图是在只注射AAV-RedO-H2BGFP的对照组中选取的有代表性的原始影相图，4175是该图对应的1/2半径中视锥的计数结果；右图是共注射AAV8-RO1.7-RD3L和AAV-RedO-H2BGFP组中选取的有代表性的原始影相图，7652是该图对应的1/2半径中视锥的计数结果。图4显示了对照组和实验组中rd1小鼠1/2半径中视锥细胞计数的整体分布情况，图中每个数据点来自单个视网膜计数结果，经统计发现注射AAV8-RO1.7-RD3L(n＝14个视网膜)的实验组中视锥存活率相较于对照组(n＝11个视网膜)高40％。图3中的4175和7652分别对应图4两组数据中的一个数据点。
实施例3：其他RP小鼠实验
rd10:携带Pde6b基因点突变的小鼠
在rd10小鼠P0时将AAV和PBS混合，按1×109vg/eye进行视网膜下注射，并用AAV8-RedO-H2BGFP共注射以特异性标记视锥细胞核。在P30-P60期间，进行小鼠视动反射行为学实验，检测小鼠昼间视力。等到小鼠P130时，收集视网膜将其摊平，并用上述matlab脚本程序对其1/2半径视锥细胞进行计数，统计结果。结果显示，AAV8-RO1.7-RD3L治疗组视网膜的视锥细胞计数结果高于对照组计数。
Rho-/-：Rho基因敲除小鼠
在Rho-/-小鼠P0时将AAV和PBS混合，按1×109vg/eye进行视网膜下注射，并用AAV8-Redo-H2BGFP共注射以特异性标记视锥细胞核。在P140左右，进行小鼠视动反射行为学实验，检测小鼠昼间视力。等到小鼠P150时，收集视网膜将其摊平并用上述matlab脚本程序对其1/2半径视锥细胞进行计数，统计结果。结果显示，AAV8-RO1.7-RD3L治疗组视网膜的视锥细胞计数结果高于对照组计数。
实施例4：动物视力检测
在背景光大约为70cd/m2下，用OptoDrum系统(Striatech)测量小鼠明视视动反应(两项参数检测：空间频率反应阈值与对比度反应阈值)。空间频率反应阈值检测：光栅的对比度设置为100％，时间频率为1.5Hz，测试者在不了解对照组和实验组的情况下，测试小鼠空间频率阈值。在每次测试期间，格栅的移动方向(顺时针或逆时针)是随机的，并且每个测试片段的空间频率由软件算法确定,直到软件算法自动确定被测小鼠的空间频率反应阈值。对比度阈值检测：空间频率设置为0.128c/d，时间频率为1.5Hz，测试者在不了解对照组和实验组的情况下，测试小鼠对比度阈值。在每次测试期间，格栅的移动方向(顺时针或逆时针)是随机的，并且每个测试片段的空间频率由软件算法确定,直到软件算法自动确定被测小鼠的对比反应阈值。对rd10和Rho-/-小鼠进行视动测试，但不对rd1品系进行测试，因该品系在年纪很小的时候视力已丧失，无法进行任何有意义的视力测试。结果显示，AAV8-RO1.7-RD3L治疗组视网膜的视动反应结果优于对照组结果(即：空间频率反应阈值更高，对比度反应阈值更低)。
本文部分序列
SEQ ID NO:4：小鼠RD3L核苷酸序列
atgccactttttagctgggtgaaatggccaagaaattattcctacaaacaaacacgctacgctggctctgaggtagtgacaaagactctgcttcgggagttaaaatggcatttgaaggagcgcgagagattaatacatgagatcgaaaatgaacagaaagtgaaaaagacaggcgtggactacaactggctgagaagttaccagacttctcacacaatgatcccagctaccgaacaaagacaactggaagttctgtgctcacaagtacaaccttgtcaagctggaaccgttctcagcagatttagagaacttttggcagaaaacgatgtacttccctgggaaattgtctacatcttcaagcaagttctgaaagactttctcagcagtcctgccagagggggtcaccatgctggcctatgggactctgacatcaccggtccccctacccctgcgctcccaggtgaaagctctgagaggccagacaaagaggagatacccacgatttcaagctatgtagacaaacatgccaagaacaggtttcccccctgttcacacagagtatggaacctgccatactattacccaccaagctga
SEQ ID NO:5：人RD3L核苷酸序列
atgccactttttggctggatgaaatggcccaaaaacgattcctacaaacccacacactatcctggctcagacatagtgacaaagactctgcttcgggaattaaaatggcacctaaaggagcgagagagattaatacaagaaatcgaaaatgaacaaaaagtgaaaaaaacaggtgtggattacaactggctcagaaactaccagaatccccacacaactatcccagtgactgaacaaagacaacttgaagttctttgctcacaagttcaaccttgccaaactggaactattctcagcagatttcgagaagttttggcagaaaatgatgtactgccatgggaaatagtctacatcttcaagcaagttctgaaagacttcctaagcagctctgacagagggagtgagcaagaggacctggaggactcagggagcatggactgctctgctccttctgtgatccaaggtgacagctccaagagggcagacaaagatgaaatacccaccatttccagttacgtagacaaaaacacaaaggacaggttcccagtgttctcacacagaatatggaacctaccatattatcacccatctagttaa。

Claims (10)

1.一种核酸构建物，包含视锥细胞特异性启动子、RD3L蛋白的编码序列和任选的多聚腺苷酸化信号。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于：
所述多聚腺苷酸化信号选自：人生长激素多聚腺苷酸化信号、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和SV40多聚腺苷酸化信号；和/或
所述RD3L蛋白具有SEQ ID NO:6或7所示的序列或与SEQ ID NO:6或7所示的序列具有至少80％序列同一性的序列；和/或
所述RD3L蛋白的编码序列具有SEQ ID NO:4或5所示的序列或与SEQ ID NO:4或5所示的序列具有至少80％序列同一性的变体；和/或
所述视锥特异性启动子选自RedO启动子、SynP136启动子、GNAT2启动子、SynPVI启动子和mCAR启动子；和/或
所述核酸构建物还包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE或其变体WPRE3；和/或
所述核酸构建物还包括ITR区。
3.如权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述RedO启动子的序列如SEQ ID NO:8或9所示，所述SynP136启动子的序列如SEQ ID NO:10所示，所述SynPVI启动子的序列如SEQ ID NO:11所示，所述mCAR启动子的序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述核酸构建物包含SEQ ID NO:3所示的序列。
4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是载体，优选为AAV载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
5.一种核酸递送试剂，包含权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物和递送运载体，
优选地，所述递送运载体选自病毒、病毒类似颗粒和脂质纳米颗粒。
6.一种AAV病毒，包含权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物或权利要求6所述的AAV病毒。
8.权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物、权利要求6所述的AAV病毒、权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗退行性眼部疾病或其症状、或由RD3L表达降低引起的疾病或其症状的药物中的应用，或在制备用于延缓患有退行性眼部疾病的受试者的功能性视力丧失的药物中的应用，或在制备用于延缓视网膜色素变性中视锥细胞的死亡和/或延长病人昼间视觉功能的药物中的应用，
优选地，所述退行性眼部疾病选自视网膜色素变性、老龄黄斑变性、锥杆细胞营养不良和杆锥细胞营养不良，
优选地，所述由RD3L表达降低引起的疾病是由RD3L表达降低引起的眼部疾病。
9.一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料和选自以下的一种或多种：权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物、权利要求6所述的AAV病毒。
10.一种试剂盒，包含权利要求1-4中任一项所述的核酸构建物、权利要求6所述的AAV病毒、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求9所述的药物组合物中的任一种或多种。
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