CN117721123B - OsHD3基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及OsHD3基因及其编码蛋白与应用。本发明通过敲除，失活或弱化水稻内源的基因OsHD3而获得抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种，具有培育水稻新品种方面的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及OsHD3基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
我国是亚洲栽培稻的起源和分化中心之一，稻作历史悠久，稻作区分布辽阔。抽穗期是决定水稻种植地区适应性、影响产量的重要农艺性状，通过调控水稻抽穗期，可以扩大水稻种植面积、调整收获时间及建立适当的耕作制度，能有效地提高水稻产量。随着水稻功能基因组学的迅猛发展，水稻抽穗期的遗传基础研究取得较大进展，成功克隆了一批与水稻抽穗期相关的基因，抽穗期的分子机制正在逐步得到解析。但目前可应用于水稻育种的抽穗期基因还十分有限。
因此，发掘和利用水稻抽穗期相关基因，可为水稻基因组设计育种提供新的基因资源。
发明内容
本发明通过研究发现水稻基因OsHD3（LOC_Os03g06240）与水稻的抽穗期长短和粒径长度有关，因而完成本发明。
本发明提供一种水稻基因OsHD3在培育抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种中的应用。
具体地，所述水稻基因OsHD3的核苷酸序列编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明尤其提供一种培育抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种的方法，其是通过敲除，失活或弱化水稻内源的基因OsHD3而实现。
具体地，所述水稻基因OsHD3的核苷酸序列编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述敲除，失活或弱化水稻内源的基因OsHD3的靶标序列是所述基因含有9个外显子，更具体地，SEQ ID No.3中第1-383为第一外显子、第736-821为第二外显子、第943-1063为第三外显子、第1257-1330为第四外显子、第1687-2226为第五外显子、第2333-2950为第六外显子、第3037-3249这第七外显子、第3338-3484为第八外显子，第3582-4551为第九外显子。
优选地，所述敲除，失活或弱化水稻内源的基因OsHD3的靶标序列是所述基因的第三个外显子。
更具体地，针所述在基因OsHD3的第三外显子51-70 bp处设计一个Cas9识别位点，优选地识别靶序列为：GTCCATCACGCCAGTGCTTC。
在具体实施方式中，sgRNA的编码序列如SEQ ID No.4所示，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，sgRNA的靶序列如SEQ ID No.6所示。
任选地，通过农杆菌浸染法转化水稻愈伤组织，然后进行分化再生培养，然后进行生根培养，得到再生植株。
此外，还包括进一步筛选得到纯化突变的植物，或者通过自交进一步获得纯合突变体的种子形成纯合水稻品种。
本发明通过敲除，失活或弱化水稻内源的基因OsHD3而获得抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种，具有培育水稻新品种方面的实际应用价值。
附图说明
图1为水稻基因的序列分析及基因OsHD3编辑靶点设计。
图2为重组质粒SG1420的结构示意图。
图3为hd3-1和hd3-2植株的测序结果。
图4为供试植株的照片。
图5为供试植株的抽穗期（A）和籽粒长（B）的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水稻基因的序列分析及基因编辑靶点设计
利用全基因组关联分析，定位到与水稻抽穗期相关的候选基因LOC_Os03g06240，命名为OsHD3。该基因编码序列全长为2127 bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码由708个氨基酸组成的OsHD3蛋白质，OsHD3蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
OsHD3基因的序列分析显示（如SEQ ID No.3所示），该基因含有9个外显子，分别为序列表中第1-383（第一外显子）、第736-821（第二外显子）、第943-1063（第三外显子）、第1257-1330（第四外显子）、第1687-2226（第五外显子）、第2333-2950（第六外显子）、第3037-3249（第七外显子）、第3338-3484（第八外显子）和第3582-4551（第九外显子）。
本发明实施例所采用实验品种为中花11材料，在基因OsHD3的第三外显子51-70bp处设计一个Cas9识别位点，如图1所示。识别靶序列为：GTCCATCACGCCAGTGCTTC。
实施例2、载体构建及水稻遗传转化
一、构建重组质粒
构建重组质粒SG1420。重组质粒SG1420的结构示意图见图2。重组质粒SG1420中，sgRNA的编码序列如SEQ ID No.4所示。相应的，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，sgRNA的靶序列如SEQ ID No.6所示。
二、进行遗传转化并获得再生植株
将步骤一得到的重组质粒SG1420导入农杆菌（EHA105）中，得到重组农杆菌。采用农杆菌浸染法，将重组农杆菌对水稻品种中花11的胚性愈伤组织进行遗传转化，然后筛选抗性愈伤组织（抗性筛选采用50 mg/L潮霉素），然后进行分化再生培养，然后进行生根培养，得到再生植株。
三、获得转基因植株及其后代植株
将步骤二得到的再生植株进行如下鉴定：取叶片，提取基因组DNA，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。引物序列如下：
F：5’-TCACAGCGCTAACAAATAGGA-3’；
R：5’-TGCTCTTGGTTTTCTGTCGGT-3’。
通过以上鉴定，从步骤二得到的再生植株中筛选得到二个纯合突变型植株（即两条染色体发生的突变一致），命名为hd3-1和hd3-2植株。
经测序鉴定，与水稻品种中花11（用ZH11表示）的基因组DNA相比，hd3-1植株的差异仅在于在编码OsHD3蛋白的基因中发生了7bp的碱基缺失，该缺失碱基位于SEQ ID No.1第262-268位，从而发生移码突变，该突变位点及其周边碱基的测序结果见图3。
经测序鉴定，与水稻品种中花11（用ZH11表示）的基因组DNA相比，hd3-2植株的差异仅在于在编码OsHD3蛋白的基因中发生了1bp的碱基插入，该碱基的插入位置为SEQ IDNo.1第268位和第269位之间，从而发生移码突变，该突变位点及其周边碱基的测序结果见图3。
hd3-1和hd3-2植株自交并收获种子，将种子培育为植株，即为T1代植株。T1代植株自交并收获种子，即为T2代种子。hd3-1和hd3-2植株及其自交后代，称为hd3-1和hd3-2株系。
实施例3、水稻表型鉴定
供试种子：水稻品种中花11种子、hd3-1和hd3-2株系的T2代种子。
在平行条件下培养供试植株，具体步骤如下：取种子，在温室萌发并育苗（从露白开始计时，共培养3周），得到3周幼苗；将3周幼苗移栽至北京顺义的大田并正常栽培管理。在大田中栽培管理成熟后调查记载各株系的农艺性状。每个材料至少调查中间10株，取平均值作为统计单元。按国家资源平台项目中制定的“水稻种质资源描述规范和数据标准”进行鉴定评价（水稻种质资源描述规范和数据标准. 韩龙植等编著. 北京：中国农业出版社，2006.4）。
供试植株的穗部照片见图4，农艺性状的统计结果见图5。图4和图5中，ZH11表示水稻品种中花11，hd3-1和hd3-2分别表示hd3-1和hd3-2株系。
水稻中花11植株的平均抽穗期为103天，hd3-1和hd3-2株系植株的平均抽穗期分别为114天和116天。结果表明，与水稻中花11植株相比，hd3-1和hd3-2株系植株的抽穗期均显著增加，增加幅度分别为10.7％和12.6％。
水稻中花11植株的平均粒长为6.45mm，hd3-1和hd3-2株系植株的平均粒长分别为6.77 mm和6.82 mm。结果表明，与水稻中花11植株相比，hd3-1和hd3-2株系植株的粒长均显著增加，增加幅度分别为4.9％和5.7％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种水稻基因OsHD3在培育抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种中的应用，其特征在于，通过敲除，失活或弱化水稻内源基因OsHD3以培育抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种；所述水稻基因OsHD3的核苷酸序列编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻内源基因OsHD3的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
3.一种培育抽穗期增长和/或籽粒长增长的水稻品种的方法，其特征在于，是通过敲除，失活或弱化水稻内源基因OsHD3而实现，且所述水稻内源基因OsHD3的核苷酸序列编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水稻内源基因OsHD3的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述敲除，失活或弱化水稻内源基因OsHD3的靶标序列是所述基因含有如下9个外显子任意之一：SEQ ID No.3中第1-383为第一外显子、第736-821为第二外显子、第943-1063为第三外显子、第1257-1330为第四外显子、第1687-2226为第五外显子、第2333-2950为第六外显子、第3037-3249这第七外显子、第3338-3484为第八外显子、第3582-4551为第九外显子。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述敲除，失活或弱化水稻内源基因OsHD3的靶标序列是所述基因的第三外显子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，针对所述水稻内源基因OsHD3的第三外显子51-70 bp处设计Cas9识别位点。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，sgRNA的编码序列如SEQ ID No.4所示，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，sgRNA的靶序列如SEQ ID No.6所示。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过农杆菌浸染法转化水稻愈伤组织，然后进行分化再生培养，然后进行生根培养，得到再生植株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括进一步筛选得到纯化突变的植物，或者通过自交进一步获得纯合突变体的种子形成纯合水稻品种。
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