CN117616134A - 用于空间条形码编码和测序的unit-dna组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提供多核苷酸分子的方法，所述多核苷酸分子包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，所述第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，所述多核苷酸的第二链的相应的凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将所述封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。
Description
技术领域
本发明涉及空间测序技术。目的是确定mRNA在组织区域或组织内单个细胞中的分布。
背景技术
空间测序是允许在组织环境中直接对细胞的mRNA内容进行测序的方法的统称。这些方法一方面可以用于在高度多重荧光原位杂交(FISH)测定中分析细胞的mRNA表达谱。
另一方面，原位测序还可以使用特定mRNA结合探针读出mRNA序列信息，该探针可以占据特定mRNA或cDNA序列的预定义部分的副本(“缺口填充挂锁探针(Gap-fill padlockprobe)”，Ke等人，Nature Methods 2013，doi:10.1038/nmeth.2563)。最近还发表了原位基因组测序(IGS)方法(In situ genom e sequencing resolves DNA sequence andstructure in intact biological samples”，AC Payne等人，Science 10.1126/science.aay3446(2020))。所有原位测序方法都需要信号放大步骤，该信号放大步骤在大多数情况下通过mRNA或cDNA结合探针的环化或通过发夹连接gDNA插入物环化和随后的滚环扩增(RCA)来进行，从而产生含探针和/或靶序列的多个拷贝的DNA分子，即所谓的纳米球、圆形克隆(Rolony)或滚环扩增产物(RCP)。由于这些是纳米或微米级大小的大分子，因此一个细胞内可以形成的圆形克隆的数量严格受到该细胞大小的限制。
此外，如果细胞内圆形克隆的密度太高，则在测序过程的光学检测步骤期间对单个mRNA信号的辨别力被严重削弱。由于这是该技术的主要缺点，因此已经开发了各种技术来规避这一点，例如设计更小的圆形克隆或生成和清除组织-水凝胶复合物(Asp等人，BioEssays 2020，DOI：10.1002/bies.201900221)或者扩展细胞靶标，称为扩展测序(Alon等人，Science 371，eaax2656(2021))。
然而，这些方法仍然没有完全规避原位测序固有的空间限制。另一种方法避免了原位信号放大：原位捕获依赖于将mRNA分子从组织转移到涂有条形码引物斑点的表面上，从而允许将非原位获得的序列信息回溯到从中提取测序mRNA的特定组织区域。然而，该方法也受到限制，这是因为由于条形码捕获斑点的尺寸相对较大，RNA捕获效率受到限制并且分辨率较差(无单细胞分析)(Asp等人，BioEssays 2020，DOI:10.1002/bies.201900221)。
发明内容
本发明涉及一种使用光学方法将条形码插入多核苷酸(优选DNA序列)的方法。该代码可用于检索执行编码的位置。本文的目的是在很大程度上克服现有原位测序方法在原位可测量的mRNA序列数量以及表达动力学方面的局限性。光学编码可以具有1μm范围内的分辨率和足以使每个细胞在典型尺寸的组织切片中接收其自己代码的代码可变性。所提出的编码和解码工作流程如图1所示。
本文公开的基本原理是基于通过通用模板指导的DNA合成对核酸进行空间条形码编码。该方法随后将被称为UNIT-DNA(UNIversal Template DNA，通用模板DNA)。
因此，本发明的目的是一种提供多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，并且所述多核苷酸的第二链的相应凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。
封闭基团的去除可以通过为封闭基团提供合适的可光裂解单元或通过添加由光照射而活化的或以其活性形式提供的裂解试剂来完成。
在该方法的第一变体中，通过提供裂解试剂通过光照射从掺入的核苷酸中去除封闭基团，其中裂解试剂是通过用光照射裂解试剂的前体来提供的。
在该方法的第二变体中，其中核苷酸具有可光裂解的封闭基团，将该封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。此类试剂是已知的，例如“Cy5-TEC P”，其通过用光照射而裂解成活性裂解试剂“Cy5”。
在下文中，术语“多核苷酸”是指双链核酸，如DNA、RNA、DNA-RN A、c-DNA、ssDNA和类似物，例如PNA或LNA。
附图说明
图1示出了本发明的一般工作流程，包括样品制备、组织染色和成像(透射、荧光)、分割或聚类分析以及用于结构化照射和单细胞测序的掩模计算。
图2示出了具有至少一个5’突出端的双链多核苷酸分子的一般结构，‘其具有至少一个通用碱基。
图3示出了本发明的条形码编码的基本过程。
图4：用光对三个细胞进行结构化照射。
图5示出了A-H所示的本发明的实施方案。
图6示出了模板转换寡核苷酸(TSO)与实施方案H的组合。
图7示出了本发明实施方案H的一般工作流程，其通过标记直接用于测序的分子来进行体外测序。
图8示出了环状ssDNA与UNIT-DNA的组合实施方案H。
图9示出了靶向DNA扩增与UNIT-DNA组合的实施方案H。
具体实施方式
对于根据实施方案A的编码工作流程，图1中描绘了的所提出的UNIT-DNA工作流程。样品制备、组织染色和成像(透射、荧光)之后是分割或聚类分析以及用于结构化照射的掩模计算。对于图1中描绘的使用UNIT-DNA的解码工作流程，向组织切片提供细胞的空间条形码编码，其由结构化照射和核苷酸的循环掺入引导(未示出在细胞释放之前将编码的UNIT-DNA固定到组织上)。从组织切片中释放细胞并封装细胞以进行单细胞测序。
对于图7中描绘的根据使用UNIT-DNA的实施方案H的解码工作流程，向组织切片提供由结构化照射和核苷酸的循环掺入引导的目标分子的空间条形码编码。将针对靶mRNA获得的序列以及空间条形码注释到图像中。生物信息学分析以及结果与初始样品来源结果的关系完成了工作流程。
所述UNIT-DNA的方法由以下组成：提供一种双链DNA分子，所述双链DNA分子包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，具有至少一个5’突出端，其中5’突出端包括至少一个通用碱基，并且凹陷的3’末端具有游离的3’-OH。
图2示出了通过本发明的方法获得的9bp双链核酸(N)和6个通用碱基(B)5’突出端的组合物的实例。双链核酸的bp数量或单链5’突出端的通用碱基数量在长度上可以变化。
术语“通用碱基”是指能够与所有天然核苷酸结合的核苷酸。这种通用碱基设计在文献中主要被描述为简并引物或探针的一部分，因为它们具有与所有天然碱基配对的特性(例如Loakes，Nucleic Acid Research，2001，第29卷，第12期，2437-2447)。
通过本发明的方法获得的UNIT-DNA组合物如图2所示，由具有至少一个5’突出端的双链核酸组成，其中5’突出端包括至少一个通用碱基并且凹陷的3’末端具有游离的3’-OH。这里作为实例，显示了9bp双链核酸和5个通用碱基5’突出端的UNIT-DNA组成。N代表天然碱基(G或C或T或A)，B代表通用碱基。
图3示出了UNIT-DNA方法编码的基本原理。在聚合酶(未示出)的支持下，第二链的凹陷的游离3’-OH掺入所提供的核苷酸(G)。由此，凹陷的3’-OH第二链被第一核苷酸延伸并由其编码。只要第一链的5’突出端包含支持通用模板指导的DNA合成的通用碱基，所提供的任何核苷酸都将与组合物配对。当核苷酸的3’末端被封闭时，凹陷的3’-OH仅延伸一个核苷酸。下一步，被封闭的3’-OH将被裂解试剂解封闭，从而允许发生下一个编码循环。
掺入任选被荧光标记的3’-OH封闭核苷酸(其随后通过裂解试剂解封闭)也可从边合成边测序(Chen等人，Genomics,Proteomics&Bioinformatics，第11卷，第1期，2013年2月，第34-40页)获知。与边合成边测序相反，UN IT-DNA方法用于写入DNA代码，而不是读取DNA代码。
为了写入空间多核苷酸条形码，结构化照射可以用作编码工作流程的一部分，其已经在图1中概念性地介绍。在图4中详细示出了通过光(例如UV光)对单个细胞的结构化照射如何在空间上以化学方式释放裂解试剂(例如TCEP)。之前已描述过UV光照射Cy5-TCEP缀合物后释放TCEP的化学反应(Vaughan等人，J Am Chem Soc.，2013年1月30日，135(4)，1197-1200)。
总之，通过UNIT-DNA方法写入的空间代码的序列取决于所提供的核苷酸的顺序以及光对裂解试剂的空间激活。UNIT-DNA可以写入的空间代码总数取决于允许核苷酸掺入的5’突出端内通用碱基的数量(例如10个通用碱基将转化为～1百万个代码(410))。编码原理的空间分辨率取决于照射光的分辨率(对于UVB，～300nm)以及释放的裂解试剂的局部反应动力学，因此很容易实现细胞(～10μm)或亚细胞(～lμm)分辨率水平。
编码完成后，可以从组织样品中分离所有细胞(或细胞核和细胞器)并进行单细胞测序。原则上，该方法在同时检查的细胞数量方面不受限制。同时单独检查的细胞数量取决于5’突出端内通用碱基的数量，以提供唯一的空间条形码。真正的限制最终仅在于测序仪的容量和通量。
UNIT--DNA空间条形码编码的实施方案
用于空间条形码编码的本发明方法的实施方案总结于图5中并称为实施方案A至H。如虚线框所示，保留了UNIT-DNA方法的核心功能元素。通过修饰3’和5’末端引入了额外的功能，并将用于空间条形码编码的核心UNIT-D NA组合物与进一步的核酸操作工作流程相结合。
下面对实施方案进行更详细的描述。
图6示出了UNIT-DNA实施方案H(图5)的实例，其用作单细胞测序工作流程中模板转换寡核苷酸过程的一部分(Picelli等人，Nat Methods 2013年11月；10(ll):1096-8。doi:10.1038/nmeth.2639.电子发表日2013年9月22日))。通过UNIT-DNA生成空间DNA条形码后，可以使用唯一分子标识符(UMI)通过测序进一步分析所得核酸，以进行纠错。
值得一提的是，图6所示的TSO不包括细胞标识符。UNIT-DNA组合物提供空间条形码，在选择结构照射分辨率与细胞分辨率水平一致的情况下，该空间条形码可用作细胞标识符。
图7更新了实施方案H中使用UNIT-DNA衍生物的编码和解码工作流程。编码后，制备测序文库并对空间条形码以及靶核酸进行测序。当空间条形码与靶核酸物理连接时，可以通过体外测序导出靶序列的空间信息，并提供结果与初始样品来源的关系。
用于靶核酸的空间条形码编码的UNIT-DNA组合物H还可用于产生环状ssDNA的挂锁工作流程(参见图8)或用于靶向DNA工作流程(参见图9)。编码后，所得核酸将进行测序，以确定空间条形码和连接的靶核酸。
根据分子工作流程，可以使用不同的UNIT-DNA实施方案来将空间编码与测序和解码工作流程组合。如图5所示的UNIT-DNA实施方案还可用于多模式靶向RNA和DNA工作流程或固体支持物工作流程(未示出)。
UNIT-DNA方法可以在循环过程内执行，其通过在每个循环中用另一种空间结构化光模式对组织样品进行处理而由其结构化照射来触发。“结构化照射”和“空间结构化光模式”是指仅照射样品的一部分或选定区域。
图4示出了通过光(如由雷声符号指示)对三个细胞进行结构化照射，在被照射的细胞中释放裂解试剂TCEP(三(2-羧乙基)膦)。Cy5-TECP缀合物用作光诱导裂解试剂释放的底物。
此外，在图1中示出了如何从组织供体001获得组织切片002(任选地被染色)，然后对其进行成像100，允许分割或聚类分析，即选择要通过本发明的方法进一步研究的样品的部分。这种分割/聚类/选择使得能够计算结构化照射和/或空间结构化光模式的掩模。
在本发明方法的更下游，光处理期间利用针对结构化照射和/或针对空间结构化光模式获得的信息进行UNIT-DNA代码生成(102)，这产生编码的UNI T-DNA，其与细胞mRNA和单细胞标记试剂(202)一起封装，以用于随后的测序(104)。借助于结构化照射，只有样品106的具有空间条形码的选定区域/细胞通过下一代测序(104)和序列分析(106)进行空间解码。
测序
本发明方法中的一个步骤涉及确定UNIT-DNA探针上编码的核苷酸序列，其通过测序(104)读出。一种测序方法可以是边合成边测序(SBS)。为了增加读出信号，可以进行UNIT-DNA探针序列的扩增。克隆扩增的一种方法可以是对编码的UNIT-DNA探针进行滚环扩增(RCA)，该方法在圆形克隆上开始测序过程之前进行。
在本发明的一个变体中，UNIT-DNA代码的序列可以与靶基因的序列分开读取。这可以通过将测序过程分成使用两种不同测序引物的两次运行来实现。
本发明的实施方案
图5示出了UNIT-DNA方法的八个实施方案(A-H)。对于所有实施方案，都保留了UNIT-DNA组合物的核心元素(如虚线框所示)。添加到UNIT-D NA 5’末端和3’末端的附加元素如下。
(A)第二5’突出端，所述突出端内具有封闭的3’末端。在实施方案A和B中，第一链在其3’末端进一步具有封闭基团。
(B)双链的5’末端与双链的3’末端连接。
(C)通过天然碱基延伸5’通用碱基突出端的5’末端。在实施方案C中，第一链的突出端在其5’末端具有第一寡核苷酸。
(D)通过天然碱基延伸的5’通用碱基突出端的5’末端与双链的3’末端连接。在实施方案D中，第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与第一链的3’末端连接，从而形成环。所述寡核苷酸桥可以具有5至100个核苷酸的长度。
(E)通过天然碱基延伸5’通用碱基突出端的5’末端形成天然碱基的双链。在实施方案E中，第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得具有平末端和在至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸。
(F)通过天然碱基延伸5’通用碱基突出端形成天然碱基双链的5’末端与相邻双链的3’末端连接。
在实施例F中，第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得具有平末端和在至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中所述平末端直接或通过寡核苷酸桥彼此连接。所述寡核苷酸桥可以具有5至100个核苷酸的长度。
(G)通过天然碱基延伸5’通用碱基突出端的5’末端形成具有封闭的3’末端的天然碱基双链，同时所述5’末端与所述双链的相对3’末端连接形成环。在实施例G中，第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得具有平末端和在至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与第一链的3’末端连接，从而形成环，并且杂交的相应核苷酸的3’末端含有不可裂解的封闭基团。所述寡核苷酸桥可以具有5至100个核苷酸的长度。
(H)双链的5’末端与相对双链的3’末端连接，形成挂锁样结构，其中双链的3’末端被封闭。在实施例G中，第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得具有平末端和在至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，并且其中杂交的相应核苷酸的3’末端直接或通过寡核苷酸桥与第二链的5’末端连接，从而形成环，并且第一链的3’末端含有不可裂解的封闭基团。所述寡核苷酸桥可以具有5至100个核苷酸的长度。
实施方案H可以如图6所示的第一变体进行。此处，本发明的UNIT-D NA方法与模板转换寡核苷酸(TSO)过程相结合。
如图6所示的变体包括：(A)mRNA通过寡核苷酸dT引物逆转录(原位)，产生在3’末端具有三个C的cDNA。(B)具有5’PCR柄(显示为N)、唯一分子标识符(UMI)和3’末端的三个G的TSO。(C)cDNA(来自A)与TSO(来自B)的原位模板转换的结果生成捕获的cDNA，两末端均带有PCR柄(未示出任选的用于增加原位敏感性的原位PCR扩增)。(D)包含通用碱基的寡核苷酸与PCR柄的杂交导致UNIT-DNA衍生物H的形成(如虚线框所示)。
实施方案H的另一变体示于图8中。此处，本发明的UNIT-DNA方法与环状ssDNA组合。
如图8所示的变体包括：(A)环状ssDNA(包括捕获的靶序列、唯一分子标识符(UMI)和PCR柄(显示为N))。UMI在扩增前添加，通常在NGS工作流程中使用，以减少扩增引入的误差和定量偏差。环状ssDNA可以已通过挂锁(无缺口)、挂锁(缺口)或直接(FISSEQ)方法原位生成，如Chen等人所述(Nucleic Acids Research，2018，第46卷，第4e22期)。(B)寡核苷酸杂交将生成双链，并允许限制性核酸内切酶消化，如(B)所示，以生成线性ssDNA(C)(未示出任选的用于提高灵敏度的原位PCR扩增)。(D)包含通用碱基的寡核苷酸与PCR柄的杂交导致UNIT-DNA衍生物H的形成(如虚线框所示)。
实施方案H的另一变体示于图9中。此处，本发明的UNIT-DNA方法与靶向DNA扩增相结合，例如通过QIAGEN的靶向DNA工作流程，如QIAs eq靶向DNA小组手册(QIAseq TargetedDNA Panel Handbook)03/2021中公开的，图2中被修改为与用于空间的UNIT-DNA衍生物H相结合。(B)衔接子包括唯一分子标识符(UMI)和PCR柄(N)。(C)为了富集，连接的靶序列通过基因特异性引物(带有PCR柄的GSP)和通用引物(显示为N)进行几个循环的原位靶向PCR。(D)包含通用碱基的寡核苷酸与PCR柄的杂交导致UNIT-DNA衍生物H的形成(如虚线框所示)。
图1和7的术语表
001 组织供体
002 染色的组织切片
003 细胞
004 细胞核
005 细胞质中的mRNA
006 mRNA(与UNIT-DNA组合物相关)
100 成像
101 分割或聚类分析、结构化照射的掩模计算102用于UNIT-DNA代码生成的光处理
103 单细胞封装
104 测序
105 循环条形码编码
106 序列分析
200 编码前的UNIT-DNA组合物
201 编码后的UNIT-DNA组合物
202 单细胞标记试剂
203 UNIT-DNA组合物H
204 具有空间条形码的线性化模板转换的cDNA
205 源自cDNA的测序文库
实施例。
Claims (13)
1.一种提供多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，所述第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，并且所述多核苷酸的所述第二链的相应凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将所述封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过提供裂解试剂通过光照射从掺入的核苷酸中去除所述封闭基团，其中所述裂解试剂是通过用光照射所述裂解试剂的前体来提供的。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中所述核苷酸具有可光裂解的封闭基团，将该封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一链在其3’末端进一步具有封闭基团。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一链的所述突出端在其5’末端具有第一寡核苷酸。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与所述第一链的3’末端连接，从而形成环。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸链。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中所述平末端直接或通过寡核苷酸桥彼此连接。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中所述第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与所述第一链的3’末端连接，从而形成环，并且杂交的相应核苷酸的3’末端含有不可裂解的封闭基团。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸链，其中杂交的相应核苷酸的3’末端直接或通过寡核苷酸桥与所述第二链的5’末端连接，从而形成环，所述第一链的3’末端含有不可裂解的封闭基团。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸链是通过mRNA链的模板转换提供的，是以下步骤的结果：a)通过寡核苷酸dT引物逆转录mRNA来合成第一链，导致3’末端的C核苷酸添加至捕获的靶序列，然后b)模板转换寡核苷酸与3’末端的相应G核苷酸杂交，产生模板转换的cDNA，c)将上述模板转换的cDNA与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’OH和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA链是由产生环状ssDNA模板的挂锁工作流程提供的，是以下步骤的结果：a)作为挂锁探针杂交(包括用于缺口填充挂锁探针的缺口填充反应)和连接的结果，具有捕获的靶序列的环状ssDNA；b)寡核苷酸与环状ssDNA杂交，以允许dsDN A限制，产生线性ssDNA，C)将上述线性ssDNA与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’OH和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA链是通过靶向DNA扩增来提供的，是以下步骤的结果：a)DNA片段化和衔接子连接；b)通过使用基因特异性引物(具有PCR柄)和通用引物的PCR来富集连接的靶序列，产生线性ssDNA，C)将上述线性ssDNA与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’OH和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。
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