CN117586349B - 玉米谷蛋白源抗氧化活性肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了玉米谷蛋白源抗氧化活性肽及其制备方法与应用，属于生物活性肽技术领域。本发明提供的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1（VPWCPQ）、SEQ ID NO.2（ECVHDGWG）、SEQ ID NO.3（LPPPFY）所示的肽中的至少一种。本发明提供的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽是首次从玉米谷蛋白中分离得到的，为一种新的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽，具有良好的抗氧化活性，可以作为天然抗氧化剂用于食品、药品和/或化妆品中。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，尤其涉及玉米谷蛋白源抗氧化活性肽及其制备方法与应用。
背景技术
正常情况下，人体内的抗氧化防御系统能够有效的清除机体代谢产生的各种自由基，从而维持机体的动态平衡。当机体受到外界刺激时，平衡会被打破，导致机体内自由基水平升高，造成氧化应激反应。研究发现，通过外源补充具有抗氧化活性的物质就能够显著降低机体自由基水平，缓解氧化应激反应，增强机体的抗氧化能力。
与合成抗氧化剂相比，天然来源的食用抗氧化剂具有易吸收、安全等优点，成为了研究热点。抗氧化肽是以蛋白质为原料，采用酶法水解的方式获得的，由多个氨基酸组成的一类物质，其具有安全、高效且价格低廉等优点。
玉米谷蛋白富含疏水性氨基酸，且其蛋白序列结构中存在许多具有抗氧化活性的肽序列。因此，从玉米谷蛋白中分离具有抗氧化活性的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽对丰富抗氧化功能食品种类，保护人类健康具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽。
本发明的另一目的在于提供所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽的制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了玉米谷蛋白源抗氧化活性肽，所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1（VPWCPQ）、SEQ ID NO.2（ECVHDGWG）、SEQ ID NO.3（LPPPFY）所示的肽中的至少一种。本发明所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽分离自玉米谷蛋白水解物中，具有良好的抗氧化活性。
本发明还提供了一种玉米谷蛋白酶解液，所述玉米谷蛋白酶解液含有上述的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽。在本发明所述玉米谷蛋白酶解液中，优选的含有上述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽中的两种以上。
本发明还提供了上述玉米谷蛋白酶解液的制备方法，包括如下步骤：用碱性蛋白酶酶解玉米谷蛋白，得到所述玉米谷蛋白酶解液；所述酶解的温度为60℃，所述酶解的时间为150min，所述酶解的pH为8.0。
本发明对于玉米谷蛋白和碱性蛋白酶的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述碱性蛋白酶的用量以玉米谷蛋白的重量计，为每100g玉米谷蛋白添加3g碱性蛋白酶。
本发明还提供了一种玉米谷蛋白源抗氧化活性肽的制备方法，在上述制备方法的基础上，还包括如下步骤：对所述玉米谷蛋白酶解液进行分离纯化，收集小于1000Da且抗氧化活性最高的组分，进行质谱测序，经数据库序列比对，化学合成即得上述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽。
在本发明中，所述分离纯化的方式优选的包括凝胶色谱分离、离子交换色谱分离和反向色谱分离；所述凝胶色谱分离的填料为Sephadex G-25；所述离子交换色谱分离的填料为Q-Sepharose Fast Flow；所述反向色谱分离的色谱柱为Pronto SIL C18。本发明优选的采用LC-MS/MS进行质谱测序。本发明对质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规质谱测序步骤即可。
本发明还提供了上述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽、上述玉米谷蛋白酶解液、上述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽制备方法或上述玉米谷蛋白酶解液制备方法在制备抗氧化产品中的应用。
在本发明中，所述抗氧化产品优选的包括抗氧化药品、食品抗氧化剂或化妆品。
本发明还提供了一种抗氧化产品，所述抗氧化产品的活性成分包括上述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽或上述玉米谷蛋白酶解液。在本发明中，所述抗氧化产品优选的还包括辅料和/或其他活性成分，本发明对于所述辅料和/或其他活性成分的种类没有特殊限定，采用所要制备的产品常规辅料或其他活性成分即可。
本发明的有益效果：
本发明提供的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽是首次从玉米谷蛋白中分离得到的，为一种新的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽，具有良好的抗氧化活性，可以作为天然抗氧化剂用于食品、药品和/或化妆品中。
附图说明
图1为本发明实施例的技术路线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、玉米谷蛋白酶解液的制备
将玉米谷蛋白加入到pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，底物浓度为5%（w/v），按3%（w/w）的加酶量加入碱性蛋白酶（购自丹麦诺维信公司的Alcalase 2.4 L），60℃条件下水浴振荡150min，水解过程中，滴加1mol/L的NaOH溶液维持反应溶液的pH恒定为8.0，待反应结束后，将悬浮液置于沸水中灭酶15min，酶解物在4000r/min离心10min并弃去沉淀，所得上清液为玉米谷蛋白酶解液。
测定所得玉米谷蛋白酶解液的抗氧化活性，确认其为具有高抗氧化活性的多肽混合物。抗氧化活性测定的方法如下：
（1）玉米谷蛋白酶解液清除DPPH自由基能力的测定：取2mL不同浓度的待测样品溶液（以水溶解待测样品制备待测样品溶液），加入2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应30min，在517nm处测其吸光值（Ai）；取2mL待测样品溶液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值（Aj）；取2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液（0.1 mmol/L）和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值（A0）。样品对DPPH自由基的清除率K按式（1）计算：
式中：
K-对DPPH自由基的清除率，%；
A0-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇在517nm下的吸光值；
Ai-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；
Aj-2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。
（2）玉米谷蛋白酶解液清除ABTS自由基能力的测定：准确配制7.0mmol/L ABTS溶液及2.45mmol/L过硫酸钾水溶液，混匀，室温避光条件下静置12~16h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.023，并在30℃下平衡30min，即得ABTS+工作液。分别取2.0mL不同浓度的待测样品溶液和2.0mL ABTS+工作液加入试管中，混匀，室温下避光放置20min，于734nm处测定吸光值。以去离子水替代待测样品溶液同体积的反应混合液为对照，设3个重复，求平均值。根据下列公式计算多肽溶液对ABTS自由基的清除率。
清除率（%）=（1-A样品/A空白）×100，其中，A样品为添加样品后溶液的吸光值；A空白为未添加样品溶液的吸光值。
（3）玉米谷蛋白酶解液清除羟基自由基能力的测定：
按表1在10mL离心管中加入2 mL待测样品溶液、2mL 6mmol/L FeSO4溶液和2mL2mmol/L H2O2溶液，震荡摇匀后室温下静置10min，加入2mL 6mmol/L水杨酸，震荡混匀后室温静置30 min，立即倒入石英比色皿中，在510nm波长下用紫外可见分光光度计测得吸光值，重复测定三次。
表1 加样表
按下公式计算：
式中Ai是待测样品组的吸光度值；
Aj是用蒸馏水代替水杨酸后吸光度值；
A0是用蒸馏水代替待测样品后的吸光度值。
经测定，所得玉米谷蛋白酶解液对DPPH自由基清除能力的IC50值为2.397mg/mL，对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.324mg/mL，对羟基自由基的清除能力的IC50值为0.723mg/mL。
2、玉米谷蛋白酶解液的凝胶色谱分离
所使用的凝胶色谱柱为Sephadex G-25预装柱，将步骤1中所得的玉米谷蛋白酶解液采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度为20mg/mL，上样量为5mL；洗脱液为pH 7.4的20mM PBS缓冲液；洗脱液的流速为2mL/min；检测波长为214nm。测定收集得到的各组分的抗氧化活性（具体检测方法同步骤1中的抗氧化活性测定的方法，即同步骤1中的（1）、（2）和（3）步骤），得到最高抗氧化活性且分子量小于1000Da的组分。收集小于1000Da且抗氧化活性最高的组分用于离子交换色谱分离。
3、离子交换色谱分离
将凝胶色谱所得分子量小于1000Da且具有最高抗氧化活性的组分过0.22μm的微孔滤膜，使用强阴离子交换剂为Q-Sepharose Fast Flow分离。上样浓度40mg/mL，上样量为5mL；洗脱液A为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM，pH值为8.0；洗脱液B为pH 8.0的含1mol/L NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速为2mL/min，检测波长为214nm，梯洗体积120mL，峰组分收集的体积为6mL/管；测定各管收集液的抗氧化活性（具体检测方法同步骤1中的抗氧化活性测定的方法，即同步骤1中的（1）、（2）和（3）步骤），收集抗氧化活性均最高的组分，即为组分A用于反向色谱分离。
4、反向色谱分离
得到所述组分A后，采用反向色谱对所述组分A进行分离。采用Pronto SIL C18（Φ10×250mm，10μm）进行分离的条件：上样量为0.5mL；流动相A为含0.065%TFA的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.05%TFA的80%乙腈水溶液；洗脱方法见表2，洗脱液的流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，峰组分收集的体积为3mL/管；测定收集得到的各组分的抗氧化活性（具体检测方法同步骤1中的抗氧化活性测定的方法，即同步骤1中的（1）、（2）和（3）步骤），得到抗氧化活性最强的组分，即为组分B。备用。
表2 洗脱方法
5、LC-MS/MS质谱测序
将步骤4中得到的组分B脱盐冻干后进行质谱测序（委托北京百泰派克生物科技有限公司进行），经数据库序列比对，得到氨基酸序列为VPWCPQ（SEQ ID NO.1）、ECVHDGWG（SEQID NO.2）和LPPPFY（SEQ ID NO.3）的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽。
实施例2
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1中得到的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽VPWCPQ（SEQ ID NO.1）、ECVHDGWG（SEQ ID NO.2）和LPPPFY（SEQ ID NO.3），测定其抗氧化活性。
玉米谷蛋白源抗氧化活性肽清除DPPH自由基能力的测定方法同实施例1步骤1中的（1），结果显示：VPWCPQ对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.554 mg/mL。LPPPFY对DPPH自由基清除能力的IC50值为1.532mg/mL。ECVHDGWG对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.509mg/mL。
玉米谷蛋白源抗氧化活性肽清除ABTS自由基能力的测定方法同实施例1步骤1中的（2），结果显示：VPWCPQ对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.016mg/mL。LPPPFY对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.017mg/mL。ECVHDGWG对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.015 mg/mL。
玉米谷蛋白源抗氧化活性肽清除羟基自由基能力的测定方法同实施例1步骤1中的（3），结果显示：VPWCPQ对羟基自由基清除能力的IC50值为0.969mg/mL。LPPPFY对羟基自由基清除能力的IC50值为0。ECVHDGWG对羟基自由基清除能力的IC50值为3.534mg/mL。
玉米谷蛋白源抗氧化活性肽还原力能力的测定：
按表3在10mL离心管中加入2mL多肽溶液（0.5mg/mL）、2mL pH 6.6 0.2mol/L PBS缓冲溶液和2mL 1% (w/v) K3Fe(CN)6溶液，震荡摇匀后50℃水浴20min，加入2mL 10% (w/v)三氯乙酸(TCA)溶液，震荡混匀后4000r/min离心10min，取上清2mL、蒸馏水2mL和0.4mL0.1% (w/v) FeCl3溶液，震荡摇匀后50℃水浴10min，立即倒入石英比色皿中，在700nm波长下用紫外可见分光光度计测得吸光值，重复测定三次（还原力测定即比较相同蛋白浓度下的吸光度值），表3中的Ai代表加样管，A0代表调零管。
表3 加样表
结果显示，在多肽浓度0.5mg/mL下，VPWCPQ还原力能力值为0.716。在多肽浓度0.5mg/mL下，LPPPFY还原力能力值为0。在多肽浓度0.5mg/mL下，ECVHDGWG还原力能力值为0.501。
由以上实施例可以得出，本发明提供的玉米谷蛋白源抗氧化活性肽具备抗氧化活性。
本发明上述实施例的技术路线如图1所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.玉米谷蛋白源抗氧化活性肽，其特征在于，所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽为氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的肽中的至少一种。
2.权利要求1所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽在制备抗氧化产品中的应用，所述抗氧化产品为食品抗氧化剂或化妆品。
3.一种抗氧化产品，其特征在于，所述抗氧化产品的活性成分包括权利要求1所述玉米谷蛋白源抗氧化活性肽。
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