CN117567597B - 一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒，涉及医药生物领域。本发明的抗凝血酶Ⅲ基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种抗Xa活性检测试剂盒，含有如前所述的抗凝血酶Ⅲ。本发明突变后的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难，而在肝素存在下，则更容易与Xa结合，不与凝血酶结合，从而在实现抑制Xa活性的同时不会抑制凝血酶的活性；突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性；检测试剂盒的灵敏度得到了提升。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒。
背景技术
抗凝血酶（antithrombin，AT）曾称为抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ），是由肝细胞和血管内皮细胞分泌的一种相对分子质量约58.2kD的糖蛋白，是一种丝氨酸蛋白酶的抑制物，属于α2球蛋白，其生理半衰期为17.5～26.5小时，它是血浆中重要的生理性抗凝因子，其作用约占抗凝系统总活性的70%～80%。抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ,AT Ⅲ）。AT Ⅲ是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。肝素与抗凝血酶Ⅲ结合以后可以使抗凝血酶Ⅲ的构型发生改变，抗凝血酶Ⅲ的活性部位就会被充分的暴露，暴露以后能够更好的跟凝血因子相结合，从而抑制凝血因子肝素可诱导抗凝血酶发生构象改变，使其更易与凝血酶结合，大大提升抗凝血酶Ⅲ的抗凝作用。肝素与AT结合后，使AT与凝血酶迅速且稳定结合。它与凝血酶通过精氨酸－丝氨酸肽键相结合，形成抗凝血酶Ⅲ-凝血酶复合物而使凝血酶灭活，肝素可使这一反应加速千倍以上。
现有检测肝素浓度的试剂盒，大致可分为两种：一种是试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ，另一种是抗凝血酶Ⅲ作为一个单独组份存在。前者由于试剂中不含含抗凝血酶Ⅲ，利用样本中的抗凝血酶Ⅲ来抑制Xa的活性，达到检测肝素浓度的目的。如果样本中抗凝血酶Ⅲ含量偏低，导致对肝素的检测结果不准确。后者试剂盒若存放时间过长，可能存在试剂盒灵敏度降低的问题，这样导致一般检测中，还需要和抗凝血酶Ⅲ活性一起检测，增加了实验和患者的检测成本。而后者则增加了操作步骤，操作过程繁琐。
发明内容
为解决上述问题，本发明目的在于提供一种重组的抗凝血酶Ⅲ，该重组的抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变，425位的脯氨酸变成组氨酸，237位的谷氨酸变成苯丙氨酸，146位的赖氨酸变成精氨酸。通过这三个氨基酸的突变，让抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难，而在肝素存在下，抗凝血酶Ⅲ更容易与Xa结合，而不与凝血酶结合，而从而在实现抑制Xa的活性同时而不会抑制凝血酶的活性（小分子肝素本来就不让抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性）。本发明还提供了一种抗Xa活性检测试剂盒，该试剂盒直接将抗凝血酶Ⅲ置于试剂盒的试剂中，相对于现有测定盒来说，具有较高的灵敏度、操作简易性，此外还降低了成本花费。
本发明通过下述技术方案实现：
一种抗凝血酶Ⅲ，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
一种抗Xa活性检测试剂盒，含有如前所述的抗凝血酶Ⅲ。
如前所述的试剂盒，抗凝血酶Ⅲ添加在检测试剂中。
人抗凝血酶Ⅲ全长氨基酸序列
本发明就是通过重组方法改变抗凝血酶Ⅲ的的某些氨基酸进行定点突变。如上述序列所示，该抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变，425位的脯氨酸变成组氨酸，237位的谷氨酸变成苯丙氨酸，146位的赖氨酸变成精氨酸。突变后的抗凝血酶Ⅲ相对于突变前具有两个不同点：
1、突变后的抗凝血酶Ⅲ在没有肝素情况下，不与Xa或凝血酶或其它凝血因子结合，而突变前的抗凝血酶Ⅲ是能够与Xa或凝血酶或其它凝血因子结合的，虽然结合比较缓慢，但是在长时间后，抗凝血酶Ⅲ还是可以抑制Xa或凝血酶的活性。
2、在肝素存在下，肝素与突变后的抗凝血酶Ⅲ结合后，能够迅速与Xa结合，抑制Xa的活性，而与凝血酶结合缓慢。
本发明的试剂盒是将氨基酸突变后的抗凝血酶Ⅲ加入到肝素浓度检测的试剂中（抗Xa活性检测）具有明显的优势：
1、突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性。现有检测肝素浓度的试剂盒中，要么试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ，要么抗凝血酶Ⅲ作为一个单独的组份。试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ，利用的是样本中的抗凝血酶Ⅲ来抑制Xa的活性，当样本中抗凝血酶Ⅲ缺乏时，导致不能准确测量肝素的浓度。一般需要和抗凝血酶Ⅲ活性一起检测，这样增加了实验和患者的检测成本。而将抗凝血酶Ⅲ作为一个单独的组份，增加了操作步骤。
2、突变后的抗凝血酶Ⅲ在试剂盒中，由于在肝素存在下，突变后的抗凝血酶Ⅲ不与凝血酶反应，抑制凝血酶的活性。因此，在肝素浓度较低的情况下，突变后的抗凝血酶Ⅲ尽可能与Xa作用，这样就提高了检测的灵敏度。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明突变后的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难，而在肝素存在下，则更容易与Xa结合，而不与凝血酶结合，而从而在实现抑制Xa的活性同时而不会抑制凝血酶的活性。
2、突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性。
3、检测试剂盒的灵敏度得到了提升。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1突变后的抗凝血酶Ⅲ的制备
本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术：
天然抗凝血酶Ⅲ mRNA序列
通过PCR引入碱基突变
436-438 aaa突变成aga，709-711 gaa突变成ttt，1273-1275由cca突变成cac。
其中，正向引物序列：atgtattcca atgtgatagg；
突变引物序列1：ctgagagaac atctgatcag；
突变引物序列2：ttccctcgtt tgccatcaatg ag；
突变引物序列3：aagtccaaac tccacggtat tg；
反向引物序列：aacccttgtg ttaagtaa。
突变后的抗凝血酶Ⅲ核酸全长序列为：
将突变后的核酸序列构建到表达载体pcDNA™3.1 (+)上，通过细胞系CHO进行表达，即可得到突变后的抗凝血酶Ⅲ蛋白，再经过亲和纯化得到纯度95%以上的重组抗凝血酶Ⅲ蛋白。该抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变，425位的脯氨酸变成组氨酸，237位的谷氨酸变成苯丙氨酸，146位的赖氨酸变成精氨酸。
实施例2
实验1、突变后的抗凝血酶Ⅲ 对凝血酶抑制检测
实验设计：试剂1为分别添加不同浓度的突变后的抗凝血酶Ⅲ和没有突变的抗凝血酶Ⅲ到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2% PEG8000，凝血酶500u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.1%的凝血酶底物S-2238。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应60min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应2min，检测读数，得到吸光度。结果如表1所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ没有抑制凝血酶活性。
实验2：在试剂中添加普通肝素，检测抗凝血酶Ⅲ对凝血酶的抑制
实验设计：
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2%PEG8000，凝血酶500u/ml。
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实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应60min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应2min，检测读数，得到吸光度。结果如表2所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下没有抑制凝血酶活性，而天然人抗凝血酶Ⅲ在肝素存在下明显凝血酶活性。
实验3、突变后的抗凝血酶Ⅲ 对Xa活性抑制检测
实验设计：试剂1为分别添加不同浓度的突变后的抗凝血酶Ⅲ和没有突变的抗凝血酶Ⅲ到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2% PEG8000，Xa5000u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300, 0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应60min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应2min，检测读数，得到吸光度。结果如表3所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ没有抑制Xa活性。
实验4：在试剂中添加普通肝素，检测抗凝血酶Ⅲ对Xa的抑制及线性比较
实验设计：
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2%PEG8000，Xa 5000u/ml，500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300, 0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应5min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应1min，检测读数，得到吸光度。结果如表4所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下都可抑制Xa活性，且没有明显差异，且线性都为0.99。
实验5：在试剂中添加小分子肝素，检测抗凝血酶Ⅲ对Xa的抑制及线性比较
实验设计：
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的小分子肝素到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2%PEG8000，Xa 5000u/ml，500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300， 0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应5min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应1min，检测读数，得到吸光度。结果如表5所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下都可抑制Xa活性，且没有明显差异，且线性都为0.99。
实验6：突变人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在凝血酶存在下检测不同肝素的浓度的对比
实验设计：
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列，该系列缓冲液还含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300,0.5%的蔗糖，0.2%PEG8000，Xa 5000u/ml，500ng/ml抗凝血酶Ⅲ，凝血酶500u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300， 0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，37℃反应5min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应1min，检测读数，得到吸光度。结果如表6所示。
结果分析：突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ检测不同浓度的肝素，突变后的人抗凝血酶Ⅲ灵敏度明显比天然人抗凝血酶Ⅲ要高。
实验7：突变后的人抗凝血酶Ⅲ37℃加速破坏稳定性研究
实验设计：
试剂1为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.2% PEG8000，Xa 5000u/ml。
试剂2为 50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300, 0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
将试剂1和试剂2分成两部分，一部分放置2-8℃冰箱，一部分放置37℃恒温箱。37℃放置1天，3天，5天，7天，9天，12天，14天，15天待检测。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，分别加入肝素浓度位0.1IU/ml或1IU/ml的样本，37℃反应5min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应1min，检测读数，得到吸光度。结果如表7所示。
实验结果分析：从实验结果可以看出，突变后的抗凝血酶Ⅲ比天然的抗凝血酶Ⅲ在37℃加速破坏条件下更稳定。突变后的抗凝血酶Ⅲ在37℃放置15天，抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性下降幅度低于15%，而天然抗凝血酶Ⅲ下降幅度超过20%。
实验8：突变后的人抗凝血酶Ⅲ2-8℃放置条件下稳定性研究
实验设计：
试剂1为50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300,0.5%的蔗糖，0.2% PEG8000，Xa 5000u/ml，500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为 50mM的TRIS缓冲液，该缓冲液含0.5%的BSA，0.1%tween20，1%的甘氨酸，0.2%PC300，0.5%的蔗糖，0.1%的Xa底物S-2765。
将试剂1和试剂2放置2-8℃冰箱。放置时间为3个月，6个月，9个月，12个月，15个月，18个月，20个月，21个月待检测。
实验反应：取试剂1体积100ul加入到反应杯中，分别加入肝素浓度位0.5IU/ml或1IU/ml的样本，37℃反应5min，在加入试剂2体积100ul，37℃反应1min，检测读数，得到吸光度。结果如表8所示。
实验结果分析：从实验结果可以看出，突变后的抗凝血酶Ⅲ比天然的抗凝血酶Ⅲ在2-8℃实时条件下更稳定。突变后的抗凝血酶Ⅲ在2-8℃放置21个月，抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性下降幅度低于15%，而天然抗凝血酶Ⅲ下降幅度超过20%。
实验9：突变后的人抗凝血酶Ⅲ与天然抗凝血酶Ⅲ检测临床结果对比
实验设计：用含有突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒（已定标)和不含抗凝血酶Ⅲ的试剂盒同时在全自动凝血分析仪上检测含普通肝素（或小分子肝素）的样本。样本中的肝素用试剂盒检测并做了确认。然后用检测的值与样本理论值进行相关性比较，来判定含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒的检测准确性。结果如表9所示。
结果分析：普通肝素标本和小分子肝素标本各检测了50份。从实验结果可以看出，含有突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果和样本理论值相关性R在0.999以上，而不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果和样本理论值相关性R在0.9366和0.9454。进一步分析数据，不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒在0.1IU/ml以下的标本检测偏高，说明灵敏度偏低。对于有些高值的标本，不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果偏低，用抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒对这些样本检测，发现这些样本都是抗凝血酶Ⅲ活性偏低，知道样本中的肝素检测值偏低。
总结：根据以上实验数据，发现在抗Xa活性检测试剂盒中试剂R1中添加了含突变氨基酸的抗凝血酶Ⅲ，不仅稳定性更好，而且灵敏度高，测试结果更准确，不需要进行抗凝血酶Ⅲ活性检测，既简化了检验实验又节约了成本。
实施例3 试剂盒的使用方法
抗Xa因子检测法
标本中的肝素与抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）结合形成复合物，抑制剂试剂盒中过量添加的Xa因子。测量剩余Xa因子的活性，剩余的Xa因子可以催化发色底物，获得黄色的对硝基苯胺（pNA），在405nm波长下测定的游离pNA的OD值，与血浆中的肝素活性成反比。以此计算样本中抗凝剂肝素的浓度。
ATⅢ（过量）+肝素==>ATⅢ-肝素复合物
ATⅢ-肝素+Xa（过量）==>ATⅢ-肝素-Xa复合物+Xa（剩余）
底物-pNA+Xa（剩余）==>三肽+pNA
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗凝血酶Ⅲ，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种抗Xa活性检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗凝血酶Ⅲ。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，抗凝血酶Ⅲ添加在检测试剂中。
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