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CN117551612B - 一种视网膜类器官及其制备方法和应用 - Google Patents

一种视网膜类器官及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117551612B CN202410046845.8A CN202410046845A CN117551612B CN 117551612 B CN117551612 B CN 117551612B CN 202410046845 A CN202410046845 A CN 202410046845A CN 117551612 B CN117551612 B CN 117551612B
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Abstract

本发明涉及一种视网膜类器官及其制备方法和应用，其中，所述制备方法包括以下步骤：S1：在含有Y‑27632和SAG的视网膜分化培养基中悬浮培养诱导多能干细胞，从而形成细胞聚集体；S2：将S1步骤获得的细胞聚集体转移至24孔培养板中继续培养，获得成熟的视网膜类器官；其中，控制Y‑27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为8~12μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为25~35nM，控制所述24孔培养板的每个单孔中含有一个细胞聚集体。本发明提供的方法不仅可以得到具有功能且适合移植的视网膜类器官，而且本方法快速、高效、分化效率高。

Description

一种视网膜类器官及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种视网膜类器官及其制备方法和应用。
背景技术
年龄相关黄斑变性、视网膜变性疾病等会导致感光细胞功能损伤及数量减少，引起视力受损，最终导致失明。黄斑病变或视网膜变性的治疗，目前现代医学并没有特效的治疗方法，临床也常根据病程的阶段，在疾病早期使用抗血管新生、抗氧化、维生素以及视神经营养类药物进行治疗，以延缓病情进程，但这些治疗方式对于中晚期的视网膜退行性疾病是无法治愈或逆转病情发展的。
类器官是体外培养的自组织结构，由成群基因在时间与空间的迭代，互相牵制和协调，定时开启和关闭而发育形成。目前，不同实验室使用干细胞在体外自发形成符合体内发育规律，具有生理结构的视网膜类器官。但这些类器官诱导分化能力不足、异质性较差，还产生了很大一部分眼组织以外的其他组织和细胞，难以还原原生组织细胞组成、形态结构等特征。特别是现有的分化方法存在时间较长、效果不稳定、效率低的问题。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷而提供一种诱导多能干细胞向视网膜类器官分化的方法和应用，本发明提供的方法不仅可以得到具有功能且适合移植的视网膜类器官，而且本方法快速、高效、分化效率高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一方面，本发明提供一种视网膜类器官的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：在含有Y-27632和SAG的视网膜分化培养基中悬浮培养诱导多能干细胞，从而形成细胞聚集体；
S2：将S1步骤获得的细胞聚集体转移至24孔培养板中继续培养，获得成熟的视网膜类器官；
其中，控制Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为8~12μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为25~35nM，控制所述24孔培养板的每个单孔中含有一个细胞聚集体。
优选地，控制所述Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为10μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为30nM。
优选地，S1步骤具体包括：
S1.1 消化分解人诱导多能干细胞，获得单细胞悬液；
S1.2 重悬步骤S1.1获得的单细胞悬液于含有所述Y-27632和SAG视网膜分化培养基中；
S1.3 接种步骤S1.2获得的细胞悬液于U/V型低粘附培养材料上，培养至第三天；
S1.4 从第3天开始更换为含有终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基进行培养，之后每2~3天更换一次新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基，直至第15~18天；
定义S1步骤开始的当天为第0天，次日记为第1天，以此类推。
进一步优选地，S1.4步骤中，控制新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基中BMP4的浓度以减少40~60%的比例逐步降低。
进一步优选地，所述S1.3步骤中接种的细胞密度为8000~12000细胞/孔。
更进一步优选地，所述S1.3步骤中接种的细胞密度为10000细胞/孔。
进一步优选地，所述S1.3步骤中接种细胞于U/V型低粘附培养材料上后，对其进行离心。
更进一步优选地，控制所述离心的离心力为50~150g。
更进一步优选地，控制所述离心的时间为2~5min。
优选地，所述视网膜分化培养基为包含有血清替代物、硫代甘油、青霉素-链霉素、脂质浓缩物的IMDM/F12培养基。
进一步优选地，所述血清替代物的体积分数为8~12%。
进一步优选地，所述脂质浓缩物的体积分数为0.5~1.5%。
进一步优选地，所述青霉素-链霉素的体积分数为0.5~1.5%。
进一步优选地，所述硫代甘油的浓度为400~500μM。
另一方面，本发提供根据上述任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官。
再一方面，本发明提供根据上述任一项所述的制备方法或根据上述任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官或如上述所述的视网膜类器官在制备治疗视网膜相关产品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明通过优化视网膜分化培养基中组分和浓度以及将早期不成熟的视网膜组织转移至更大且独立的培养空间继续后续培养，进而获得分化效率高，且耗时短的由诱导多能干细胞向视网膜类器官分化的方法。
附图说明
图1为本发明诱导多能干细胞向视网膜类器官分化流程图；
图2为本发明实施例1中在不同浓度Y27632培养条件下分化第2天、第3天、第7天、第13天、第14天的细胞形态图；
图3为本发明实施例2中不同接种起始细胞量在分化第1天、3天、4天、6天的细胞分化的形态变化图，从左至右依次为每孔接种1000个细胞、3000个细胞、5000个细胞、8000个细胞和10000个细胞；
图4为本发明实施例3中自然沉降和离心之后观察结果图，其中A组为自然沉降1h后结果图，B组离心之后结果图；
图5为本发明实施例3中自然沉降和离心后分化第3天获得的细胞聚集体的显微镜图，其中A组为自然沉降后分化第三天的细胞形态图，B组离心后分化第三天的细胞形态图；
图6为本发明实施例5中转板至培养皿后分化第34天获得的视网膜类器官的显微镜图；
图7为本发明实施例5中转板至24孔培养板后分化第41天获得的视网膜类器官的显微镜图；
图8为本发明实施例5中转板至24孔培养板后分化第49天获得的视网膜类器官的显微镜图；
图9为本发明实施例6中从诱导多能干细胞分化为成熟视网膜类器官的显微镜图；
图10为本发明实施例7中qPCR对第6天和第14天获得的细胞聚集体的特异性指标进行检测的结果示意图；
图11为本发明实施例7中qPCR对第40天获得的视网膜类器官的特异性指标进行检测的结果示意图；
图12为本发明实施例7中qPCR对第72天获得的视网膜类器官的特异性指标进行检测的结果示意图；
图13为本发明实施例7中分化第30天的细胞免疫荧光图；
图14为本发明实施例7中分化第42天的细胞免疫荧光图；
图15为本发明实施例7中分化第94天的细胞免疫荧光图；
图16为本发明实施例7中分化第117天的细胞免疫荧光图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
本文所用术语“约”涵盖给定数值的±25％幅度的范围值。在其他实施方案中，术语“约”涵盖给定数值的±20％、±15％、±10％或±5％幅度的范围值。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7-3.3克（即3克±10％）等的值。
类似地，虽然产生视网膜类器官细胞的方法包括有序的、连续的事件，但事件的时机可以改变例如至少25％。例如，虽然在一个实施方案中可以将具体步骤公开为持续一天，但该事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可包括约18至约30小时的时间段。在其他实施方案中，时间段可以按该时间段的±20％、±15％、±10％或±5％变化。指示为多天的时间段可 以是“一天”的倍数，例如两天可以跨越约36小时到约60小时的时间段等。在另一个实施方案中，可以减少时间变化，例如，第2天是从第0天开始的48±3小时；第4天是从第0天开始的96±3小时，第5天是从第0天开始的120小时±3小时。
如本文所用，“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指衍生自成体细胞的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常相似的特征，但避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC不是衍生自胚胎。相反，iPSC通常衍生自已经“重编程”回多能状态的完全分化的成体细胞。该重编程步骤通常涉及以特定时间间隔和以某些浓度使用重编程因子。将成体细胞重编程回多能状态的一些示例性方法涉及使用施用于成体细胞培养物的RNA、蛋白质或其他小分子。或者，人类iPSC系也可商业获得。
如本文所用，本申请所用的iPSC为iPSC-CNTB。
如本文所用，“分化”是指细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程，特别是较少特化类型的细胞变成更特化类型的细胞。
如本文所用，“培养基（medium）”或其复数“培养基（media）”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。一方面，本发明提供一种视网膜类器官的制备方法，涉及流程图如图1所示，所述制备方法包括以下步骤：
S1：在含有Y-27632和SAG的视网膜分化培养基中悬浮培养诱导多能干细胞，从而形成细胞聚集体；
S2：将S1步骤获得的细胞聚集体转移至24孔培养板中继续培养，获得成熟的视网膜类器官；
其中，控制Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为8~12μM（优选为8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5μM、11μM、11.5μM等），SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为25~35nM（优选为25.5nM、26nM、26.5nM、27nM、27.5nM、28nM、28.5nM、29nM、29.5nM、30nM、30.5nM、31nM等），控制所述24孔培养板的每个单孔中含有一个细胞聚集体。
在某些实施方式中，控制所述Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为9~11μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为28~32nM。
在某些实施方式中，控制所述Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为10μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为30nM。
在某些实施方式中，所述S1步骤中所述诱导多能干细胞的汇合度为70~80%。
在某些实施方式中，所述S1步骤具体包括：
S1.1 消化分解人诱导多能干细胞，获得单细胞悬液；
S1.2 重悬步骤S1.1获得的单细胞悬液于含有所述Y-27632和SAG视网膜分化培养基中；
S1.3 接种步骤S1.2获得的细胞悬液于U/V型低粘附培养材料上，培养至第三天；
S1.4 从第三天开始更换为含有终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基进行培养，之后每2~3天更换一次新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基，直至第15~18天；
定义S1步骤开始的当天为第0天，次日记为第1天，以此类推。
在某些实施方式中，所述S1.3接种所述步骤S1.2获得的细胞悬液于96孔V型低粘附培养板中。
在本申请中，96孔板转移到24孔板严格按照1对1的放大培养，可以很好的检测每一个组织在分化过程中的变化状况。并且在关键时间点可以更好的取样进行相关的检测，包括但不限于可以在视网膜分化各个时间段进行取样进行qPCR检测其视网膜相关特异性mRNA表达的情况，更好的分析其分化方向的正确性、可以在关键时间点取样进行免疫染色，观察视网膜前体细胞、光感受器前体细胞以及视锥细胞标记的表达及分布情况。
在某些实施方式中，所述S1.4步骤中，控制新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基中BMP4的浓度以减少40~60%的比例逐步降低。
在某些实施方式中，所述S1.4步骤中，控制新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基中BMP4的浓度以减少50%的比例逐步降低。
在某些实施方式中，所述S1.3步骤中接种的细胞密度为8000~12000细胞/孔。
在某些实施方式中，所述S1.3步骤中接种的细胞密度为10000细胞/孔。
在某些实施方式中，所述S1.3步骤中接种细胞于U/V型低粘附培养材料上后，对其进行离心。
在某些实施方式中，控制所述离心的离心力为50~150g，例如60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g等。
在某些实施方式中，控制所述离心的离心力为80~120g。
在某些实施方式中，控制所述离心的时间为2~5min，例如2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min。
在某些实施方式中，控制所述离心的时间为2~4min，在本申请，重悬单细胞悬液后，对其进行离心操作，使细胞紧密聚集在孔底，方便快速形成细胞聚集体，以利于后续分化。
在某些实施方式中，所述视网膜分化培养基为包含有血清替代物、硫代甘油、青霉素-链霉素、脂质浓缩物的IMDM/F12培养基。
在某些实施方式中，所述血清替代物的体积分数为8~12%，优选为8%、9%、10%、11%、12%。
在某些实施方式中，血清的替代物可包括适当含有白蛋白（如富含脂质的白蛋白、白蛋白替代品如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解物）、转铁蛋白（或其他铁转运蛋白）、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体的材料、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或其等价物。如本文所用，所述血清替代物为KSR。
如本文所用，“化学成分明确的脂质浓缩物”和“脂质浓缩物”在本文中可互换使用，“硫代甘油”和“单硫代甘油”在本文中可互换使用。
在某些实施方式中，脂质浓缩物的体积分数为0.5~1.5%，优选为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%。
在某些实施方式中，脂质浓缩物的体积分数为0.8~1.2%。
在某些实施方式中，所述青霉素-链霉素的体积分数为0.5~1.5%，优选为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%。
在某些实施方式中，所述青霉素-链霉素的体积分数为0.8~1.2%。
在某些实施方式中，所述硫代甘油的浓度为400~500μM，优选为410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM等。
在某些实施方式中，所述硫代甘油的浓度为430~480μM。
在某些实施方式中，控制所述S1步骤培养约14~18天。
在某些实施方式中，控制所述S1步骤培养14~18天。
在某些实施方式中，本发明的制备方法还包括培养诱导多能干细胞。
在某些实施方式中，所述培养诱导多能干细胞的步骤包括：在干细胞完全培养基中培养iPSC-CNTB，当汇合度为45~55%时，更换为添加了SB和SAG的干细胞完全培养基进行预处理。
如本文所用，“SB”和“SB431542”在本文中可互换使用，是一种有效的转化生长因子β（TGFβ）信号传导的小分子抑制剂。
在某些实施方式中，所述干细胞完全培养基为添加了体积分数为1%青霉素-链霉素的E8培养基。
在某些实施方式中，控制所述SB浓度为5μM。
在某些实施方式中，控制所述SAG浓度为300nM。
在某些实施方式中，所述S2步骤包括依次在视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基、和神经视网膜分化培养基、RMM-A和RMM-B按照等体积混合成的培养基以及RMM-A培养基培养步骤S1获得的聚集体以获得成熟的视网膜类器官。
在某些实施方式中，所述视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基为添加了终浓度为3μM的CHIR99021、终浓度为5μM的SU5402、体积分数为1%的N2补充剂、体积分数为1%的青霉素-链霉素的DMEM/F12-glutamaX培养基。
在某些实施方式中，所述神经视网膜分化培养基（NRM）为包含有体积分数为1%的N2补充剂、体积分数为1%的青霉素-链霉素、体积分数为10%的胎牛血清（FBS）和终浓度为100μM的牛磺酸的DF12培养基。
在某些实施方式中，所述RMM-A培养基为添加了终浓度为60nM的3,3',5-三碘-甲状腺激素（T3）和终浓度为0.5μM的视黄酸（RA）的神经视网膜分化培养基。
在某些实施方式中，所述RMM-B培养基为包含有体积分数为2%的B27补充剂、体积分数为1%的GlutaMAX、体积分数为1%的青霉素-链霉素、体积分数为10%的胎牛血清（FBS）、终浓度为60nM的3,3',5-三碘-甲状腺激素（T3）和终浓度为100μM的牛磺酸的Neurobasal培养基。
在某些实施方式中，控制利用视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基培养周期为2天。
在某些实施方式中，控制利用神经视网膜分化培养基培养约20~25天。
在某些实施方式中，控制利用神经视网膜分化培养基培养20~25天。
在某些实施方式中，控制利用RMM-A和RMM-B按照等体积混合成的培养基培养约18~22天。
在某些实施方式中，控制利用RMM-A和RMM-B按照等体积混合成的培养基培养18~22天。
在某些实施方式中，控制分化第58~65天开始更换为RMM-A培养基进行培养。
另一方面，本发提供根据上述任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官。
再一方面，本发明提供根据上述任一项所述的制备方法或根据上述任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官或如上述所述的视网膜类器官在制备治疗视网膜相关产品中的应用。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，本文中若未特殊说明，“%”代表体积百分比。下述实施例中的材料和试剂，如无特殊说明，均为本领域常用材料或试剂，均可从商业途径得到或由已知方法合成。下列实施案例中未注明条件的实验方法，通常按照常规实验条件或相关试剂（盒）的制造厂商所建议的条件进行。
实施例
材料和方法
在以下实施例中使用的培养基如下所示：
视网膜分化培养基（RDM）的组分如表1：
表1
视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基组分如表2：
表2
神经视网膜分化培养基（NRM）组分如表3：
表3
视网膜维持培养基A（RMM-A）为含有60nM 3,3',5-三碘-甲状腺激素（T3，STEMCELL货号为：100-0548）和0.5μM视磺酸（RA，默克，货号为：R2625-500MG）神经视网膜分化培养基（NRM）。
视网膜维持培养基B（RMM-B）组分如表4：
表4
实施例1
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将经过预处理且汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后分别使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬或使用含20μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E5细胞/mL，并按照10000个细胞每个孔接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用100g、3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体，细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养第3天将培养基调整为终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mL BMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第14天。分化期间观察细胞形态。
不同浓度Y27632培养之后，分化第2天、第3天、第7天、第13天、第14天的细胞形态图见图2，结果显示，当Y27632在RDM培养基中浓度为10μM时，其分化形成的细胞聚集体形态规则，不发生黏连，并展现出边缘光滑明亮的早期视网膜结构。当Y27632在RDM培养基中浓度为20μM时，其分化形成的细胞聚集体结构紊乱欠佳，且聚集体边缘明亮的视网膜结构不够明显。
实施例2
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E4细胞/mL、3E4细胞/mL、5E4细胞/mL、8E4细胞/mL、1E5细胞/mL，分别取100μL（1000个细胞、3000个细胞、5000个细胞、8000个细胞、10000个细胞）接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用100g、3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体，细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养第3天将培养基调整为终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mL BMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第14天。
分别在分化第1天、3天、4天、6天测量不同接种细胞密度细胞分化的形态变化情况，随机选取不同接种细胞量形成的细胞聚集体并通过倒置显微镜的测量工具测量其长轴直径，部分测量结果见表5。
表5
结果如图3所示，不同接种起始细胞量直接影响到聚集体的大小，细胞接种量太少的细胞量在96孔板内形成的聚集体不够紧实，且形态不够规则，容易形成各种不规则形态，如棒状等一些不规则形态。
实施例3
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E5细胞/mL，并按照10000个细胞每个孔接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用自然沉降1h或100g、3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体，细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养第3天将培养基调整为终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mL BMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第14天。
接种96孔板之后自然沉降和低速离心后观察结果如图4所示，自然沉降1h后细胞并未完全沉淀汇聚在孔底，周围仍然悬浮着很多单个细胞，如图4中A组所示；100g离心3min之后细胞紧密的聚集在一起，如图4中B组所示。分化第3天发现自然沉降聚集形成的细胞聚集体结构较为松散，会形成大量的（约70%）空泡状态结构，如图5中A组所示，不利于视网膜组织的长期分化。离心组3天后均可以正常的形成细胞聚集体，未发生空泡状现象，如图5中B组所示。
实施例4
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E5细胞/mL，并按照10000个细胞每个孔接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用100g、3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体，细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养至第3天，吸弃50μL培养上清并加入50μL含有110ng/mL BMP4的RDM，调整BMP4浓度为55ng/mL，进行分化培养；分化第6天吸弃50μL培养上清，加入50μL不含BMP4的RDM。之后隔天进行一次上述半量换液操作，直到第14天。
或者，细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养至第3天，将培养基调整为终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mLBMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第14天。第15天观察细胞形态。
第3天更换为BMP4浓度半量递减半换液的方案第15天分化的组织结构松散混杂无规则，且无视网膜结构出现。而第3天更换为BMP4浓度半量递减全换液的方案第15天局部出现视杯样结构。
实施例5
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E5细胞/mL，并按照10000个细胞每个孔接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用100g，3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体。
细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养第3天将培养基调整为终浓度为55ng/mLBMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mL BMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第17天。
（3）诱导逆转培养
在分化培养后第18天将96孔板中分化得到的含有早期视网膜组织的细胞聚集体转移到24孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-90240Z）中，24孔板每一个孔转移一个细胞聚集体，并将培养基更换为视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基，24孔板每个孔添加1mL RPE诱导培养基；
或者，在分化培养后的第18天将96孔板中分化得到的含有早期视网膜组织的细胞聚集体转移到10mm低细胞吸附的培养皿中，每个皿32~48个组织进行长期的视网膜分化工作，具体为：使用1000μL宽口移液枪头（瑞宁，货号为：30389218），将96孔板的视网膜类器官连带培养基一起吸出并依次转移到一个新的10mm低细胞吸附的培养皿中，32~48个组织转移至一个培养皿中，并补充视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基至10mL。进行为期2天（48小时）的诱导培养。
两天后（分化培养第20天）将培养基更换为神经视网膜分化培养基（NRM）进行培养至第39天，培养过程中每2~3天对细胞进行一次换液操作，以维持视网膜类器官的长期分化培养。
转移至10mm培养皿中的细胞聚集体在分化第34天时，10mm培养皿中的组织在分化过程中会发生互相粘连的现象，形成一个更大的组织，不利于后续细胞分化，容易造成局部坏死凋亡，如图6所示。而且分化效率较低，仅30%左右。
转移至24孔低细胞吸附的培养板的细胞聚集体在分化第41天（图7所示）和第49天（图8所示）观察到24孔板中的每一个孔均分化出视网膜结构，图7中可以看出其含有视网膜上皮细胞和神经视网膜，分化效率提高达60%。因此采用转移至24孔低细胞吸附的培养板的方法进行后续实验。
实施例6
本实施例公开一种制备视网膜类器官的方法，具体包括如下步骤：
（1）维持培养
将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基进行维持培养，使其会汇合度为50%左右。
分化前的预处理：将iPSC-CNTB使用Essential 8（赛默飞，货号为：A1517001）添加1%青霉素-链霉素（赛默飞，货号为：15140-122）的干细胞完全培养基并添加了5μM SB（Tocris，货号为：1614）、300nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的预处理培养基进行预处理，预处理时间24小时左右。
（2）视网膜早期分化培养（D0~D14）
定义本步骤开始的当天为第0天（D0），次日记为第1天（D1），以此类推。
首先将汇合度80%左右的iPSC-CNTB用酶细胞分离培养基（accutase，赛默飞，货号为：00-4555-56）成单个细胞悬液，200g，5min离心去上清后使用含有10μM Y27632（Tocris，货号为：1254）以及30nM SAG（STEMCELL，货号为：73412）的视网膜分化培养基（RDM）重悬，并通过NC202细胞计数仪计数后用RDM调整细胞密度到1E5细胞/mL，并按照10000个细胞每个孔接种到96孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-9096VZ）每个孔中，并使用100g，3min的低速离心条件使细胞聚集在孔底，以便其能够在37℃，5%CO2培养条件下快速形成细胞聚集体。
细胞聚集体在96孔板中悬浮分化培养第3天将培养基调整为终浓度为55ng/mLBMP4的视网膜分化培养基，分化第6天将培养基全换液为含有终浓度为27.5ng/mL BMP4的视网膜分化培养基。之后隔天进行一次全换液操作，视网膜分化培养基中BMP4终浓度隔天进行半量的递减一直到第14天。
（3）诱导逆转培养（D15~D39）
在分化培养后第15天将96孔板中分化得到的含有早期视网膜组织的细胞聚集体转移到24孔低细胞吸附的培养板（Sumibe，货号为：MS-90240Z）中，24孔板每一个孔转移一个细胞聚集体。并将培养基更换为视网膜色素上皮细胞（RPE）诱导培养基进行为期2天（48小时）的诱导培养，24孔板每个孔添加1mL RPE培养基。
两天后（分化培养第17天）将培养基更换为神经视网膜分化培养基（NRM）进行培养至第39天，培养过程中每2~3天对细胞进行一次换液操作，以维持视网膜类器官的长期分化培养。
（4）成熟培养（D40+）
分化第39天后（分化培养第40天到59天）将培养基更换为RMM-A:RMM-B为体积比为1：1混合的培养基，每2~3天进行换液维持其长期的分化培养，24孔板每个孔1mL进行换液处理。
分化59天后（分化培养第60天）进行视网膜的长期维持培养，使用培养基调整为RMM-A。每2~3天进行换液维持其长期的维持成熟培养，24孔板每个孔1mL进行换液处理，分化得到视网膜类器官。
分化培养的第0天、3天、6天、8天、15天、20天、24天、27天、30天的具体细胞形态图见图9。测量第三天细胞长轴直径为450μm，在分化第15~20天左右，早期的视网膜结构开始分化出明亮的视杯样结构，第24天左右，明亮光滑且整齐排列的视网膜结构逐渐增大，在第27天左右，大部分细胞聚集体均能分化出视网膜结构，在第30天左右，视网膜类器官的长轴直径约为1000μm。
实施例7
本实施例对实施例6获得的视网膜分化0天、6天、14天、30天、42天、72天、94天以及117天的类器官进行鉴定
（1）使用qPCR检测实施例6中视网膜类器官分化过程中的相关特异性mRNA表达情况，操作具体如下：使用实时定量PCR仪测定mRNA，其中以GAPDH作为内参，ΔΔCt测定分化样本相对iPSC的mRNA表达量。
其中，RX（RAX）+、CHX10（VSX2）+为神经视网膜祖细胞的指标；CRX+、RCVRN（Recoverin）+为光感受器前体细胞的指标；RXRG+为视锥细胞前体细胞的指标；NANOG+、OCT4+为ipsc多能干细胞的指标；MITF+为视网膜色素上皮细胞的指标。
随机选取分化前iPSC，分化第6天的细胞聚集体，分化第14天的细胞聚集体、分化第40天的细胞聚集体（2个）以及分化第72天的视网膜类器官（3个）分别提取其中的RNA，分别检测iPSC多能干细胞标记—NANOG+、神经视网膜祖细胞标记—RX（RAX）+和CHX10（VSX2）+、光感受器前体细胞标记—CRX+和RCVRN（Recoverin）+、视锥细胞前体细胞标记—RXRG+、或者视网膜色素上皮细胞标记—MITF+的基因表达情况，具体数据见图10至图12。
图10结果显示，在分化开始的第6天和第14天NANOG表达情况下降，CRX/RAX/RCVRN/RXRG均呈现不同程度的表达上升的趋势，说明在分化开始的第6天和第14天有明显的视网膜分化趋势。
图11结果显示，分化开始的第40天，CRX/RAX/RCVRN/RXRG均显示高表达，NONOG不表达。
图12结果显示，分化开始的第72天，NANOG几乎不表达，CRX/RAX/RCVRN/RXRG均显示表达，MITF表达差异性较大，说明分化组织间视网膜色素上皮细胞的分化程度不同。
（2）对分化第30天、42天、94天、117天的细胞随机选取3-10个视网膜组织进行石蜡包埋免疫组化染色，通过荧光显微镜进行CRX/Recoverin表达分析（石蜡切片染色）。
用CRX抗体（亚诺法生技股份有限公司，Abnova，货号为H00001406-M02）、Recoverin抗体（赛默飞，货号为：PA5-110287），二抗选取羊抗兔AF647（赛默飞，货号为：A-21244）、羊抗鼠lgG2aAF488（赛默飞，货号为A-21131），利用DAPI对细胞进行核染色。
结果见图13至图16，可以看出，实施例6的细胞分化过程中，在分化开始的第30天（图13所示）、第42天（图14所示）、第94天（图15所示）和第117天（图16所示）表达CRX和Recoverin，符合视网膜色素上皮细胞的分子特征，获得视网膜色素上皮细胞，最终获得具有功能的且可用于移植的视网膜类器官。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (7)

1.一种视网膜类器官的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：在含有Y-27632和SAG的视网膜分化培养基中悬浮培养诱导多能干细胞，从而形成细胞聚集体；
S2：将S1步骤获得的细胞聚集体转移至24孔培养板中继续培养，获得成熟的视网膜类器官；
其中，控制Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为8~12μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为25~35nM，控制所述24孔培养板的每个单孔中含有一个细胞聚集体；
所述S1步骤具体包括：
S1.1 消化分解人诱导多能干细胞，获得单细胞悬液；
S1.2 重悬步骤S1.1获得的单细胞悬液于含有所述Y-27632和SAG视网膜分化培养基中；
S1.3 接种步骤S1.2获得的细胞悬液于U/V型低粘附培养材料上，培养至第3天；
S1.4 从第3天开始更换为含有终浓度为55ng/mL BMP4的视网膜分化培养基进行培养，之后每2~3天更换一次新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基，直至第15~18天；
定义S1步骤开始的当天为第0天，次日记为第1天，以此类推；
所述S1.4步骤中，控制新鲜的含有BMP4的视网膜分化培养基中BMP4的浓度以减少40~60%的比例逐步降低；
所述S1.3步骤中接种的细胞密度为8000~12000细胞/孔；
所述S1.3步骤中接种细胞于U/V型低粘附培养材料上后，对其进行离心；控制所述离心的离心力为50~150g；
所述视网膜分化培养基为包含有血清替代物、硫代甘油、青霉素-链霉素、脂质浓缩物的IMDM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制所述Y-27632在所述视网膜分化培养基中的浓度为10μM，SAG在所述视网膜分化培养基中的浓度为30nM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1.3步骤中接种的细胞密度为10000细胞/孔。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制所述离心的时间为2~5min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血清替代物的体积分数为8~12%；和/或，所述脂质浓缩物的体积分数为0.5~1.5%；和/或，所述青霉素-链霉素的体积分数为0.5~1.5%；和/或，所述硫代甘油的浓度为400~500μM。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官。
7.根据权利要求1~5中任一项所述的制备方法或根据权利要求1~5中任一项所述的制备方法获得的视网膜类器官或如权利要求6所述的视网膜类器官在制备治疗视网膜疾病相关产品中的应用。
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