CN117431171A - 一种抑制霉菌和吸附降解黄曲霉毒素b1的短乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种抑制霉菌和吸附降解黄曲霉毒素b1的短乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种抑制霉菌和吸附降解黄曲霉毒素B1的短乳杆菌及其应用。该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND‑1已于2023年6月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.27664。本发明提供的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND‑1主要通过细胞壁的物理吸附作用去除AFB1，在PBS溶液中脱毒效率为71.38％。菌株DN‑1具有良好的生长速率及产酸性能，可以作为青贮接种剂的备选菌株。在洗涤3次后，脱毒率仍保持高效。菌株DN‑1脱毒AFB1的最适条件为：接种量2.5％，初始pH6.0，温度36℃，培养时间4h。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种抑制霉菌和吸附降解黄曲霉毒素B1的短乳杆菌及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于食品及饲料中。AFB1是迄今为止发现的性质最稳定、毒性最强的霉菌毒素，长期摄入可引发肝癌，并引起其他器官如肾、肺、胃肠等癌变，已经被国际癌症研究机构归为Ⅰ级致癌物。近年来，关于青贮饲料中AFB1污染造成重大损失的相关报道也在增加。青贮饲料是奶牛和肉牛等反刍动物日粮最为重要的组成部分，占总日粮的50-75％，主要通过乳酸菌在厌氧条件下产生有机酸来降低饲料pH，从而抑制有害菌增殖，有储存时间长、营养价值高等优点。相比于其它常规饲料，青贮饲料由于其贮藏环境的高温高湿更容易受到AFB1的污染。一项调查显示，玉米青贮饲料是检出毒素的主要来源，且对奶牛霉菌毒素摄入的影响是其他饲料的3倍。奶牛和肉牛等反刍动物采食被AFB1污染的青贮饲料会损害机体健康，容易引起免疫力降低、产奶量减少、生殖和发育障碍等问题，且随着采食时间的延长，危害越大。
目前来说，去除食品及饲料中AFB1的方法主要分为物理法、化学法和生物法等三种方法。物理方法主要包括紫外线、电离辐射等；化学方法是用能够破坏霉菌毒素结构的试剂。这些方法长期使用会促使产毒真菌产生耐药性，并且成本高、损害环境和人类健康等问题限制了其应用。不同于前两个方法，生物法主要是通过微生物本身和其分泌物达到脱毒效果，即微生物的降解作用和吸附作用，基于这一绿色安全的特性生物法被广泛研究应用。在青贮饲料生产中乳酸菌常被用作饲料添加剂，同时关于乳酸菌脱除AFB1的研究不断增加，表明了乳酸菌在去除AFB1方面的巨大潜力。在脱除AFB1方面，Zhu等从发酵食品中分离出一株植物乳杆菌，对AFB1的脱毒率为89.5％。Guan等从中国西南地区的牧草和青贮饲料中分离出鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)XH753，将该菌株接种到青贮饲料上可以延长有氧稳定性并降低AFB1的含量。
乳酸菌作为一种安全的生物添加剂已经获得认证。关于乳酸菌作为青贮饲料添加剂的研究也在不断增加，这些乳酸菌的来源通常是发酵食品及动物肠道，然而在霉菌毒素污染的青贮饲料及采食霉菌毒素的青贮饲料的牛粪便中筛选具有脱毒AFB1的乳酸菌的研究鲜有报道。
发明内容
本发明针对黄曲霉毒素B1的去除所存在的技术问题，提出一种抑制霉菌和吸附降解黄曲霉毒素B1的短乳杆菌及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1，该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1已于2023年6月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏编号为CGMCC No.27664。
该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1在制备抑制黄曲霉毒素B1的饲料添加剂中应用。
该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1在制备吸附降解黄曲霉毒素B1的短乳杆菌的饲料添加剂中应用。
本发明还提供一种饲料添加剂，包含上述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1的活细胞或热灭活细胞。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1主要通过细胞壁的物理吸附作用去除AFB1，在PBS溶液中脱毒效率为71.38％。菌株DN-1具有良好的生长速率及产酸性能，可以作为青贮接种剂的备选菌株。在洗涤3次后，脱毒率仍保持高效。菌株DN-1脱毒AFB1的最适条件为：接种量2.5％，初始pH6.0，温度36℃，培养时间4h。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1不同菌株AFB1脱毒效率图；
图2为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1菌落形态以及革兰氏染色剂图，其中，图2a为菌落形态，图2b为革兰氏染色结果，图2c为霉菌抑制图，图2d为无抑制对照图；
图3为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1的系统发育树；
图4为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1增长速度图；
图5为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1造酸性物质能力图；
图6为菌株的不同活性成分以及不同处理对黄曲霉毒素B1解毒效率的影响图，其中，图6a为菌株上清液、裂解内容物和灭活细胞对AFB1脱毒效率图
图6b为尿素、溶菌酶和酸处理的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1对AFB1脱毒效率的影响图；
图7为用水和甲醇溶液反复洗涤菌体-AFB1复合物后AFB1解吸率；
图8a为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1随着接种量变化对AFB1的脱毒效率图；
图8b为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1随着时间变化对AFB1的脱毒效率图；
图8c为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1随着PH值变化对AFB1的脱毒效率图；
图8d为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1随着温度变化对AFB1的脱毒效率图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例，本实施例提供一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1
1材料与方法
1.1样品采集
样品采集自通辽市周边霉菌污染严重的养殖场，主要包括玉米青贮、FTMR以及饲喂上述饲料的牛粪便等。
1.2主要试剂及培养基
0.01M的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，AFB1标准品(上海源叶生物科技有限公司)，细菌生化鉴定管，AFB1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海优选生物科技有限公司)MRS液体培养基(北京金克隆生物技术有限公司，pH为6.2±0.1)；MRS琼脂培养基(北京金克隆生物技术有限公司,pH为6.2±0.2)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，将培养基在121℃灭菌30min；黄曲霉和寄生曲霉标准菌购自上海源叶生物有限公司。
1.3菌株筛选
1.3.1乳酸菌的分离纯化
在超净工作台中分别称取5g处理后的样品加入到含有95mL无菌水的锥形瓶中，密封，置于37℃、180r/min恒温摇床中振荡富集3h。吸取1ml不同样品上清液稀释至10-5接种到MRS液体培养基，置于37℃培养48h。培养结束各取100μL培养液加入到900μL无菌水中，涡旋振荡，以此梯度稀释至10-8、10-9、10-10三个梯度，分别取不同梯度的菌液100μL涂布于MRS固体培养基中，37℃培养48h。根据菌落形态、颜色、大小等挑取单菌落在培养基上划线，以此方法纯化3次，纯化后的菌株与等体积的甘油混合，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.3.2脱毒AFB1乳酸菌的筛选
将分离纯化获得的乳酸菌株在MRS液体培养基中进行培养，使菌体细胞浓度达到2.0×1010CFU/mL，培养液10000r/min离心10min后弃去上清液，将菌体沉淀用5ml PBS洗涤两次后重悬于含有AFB1的PBS溶液中，以不接菌的含有AFB1的PBS溶液为空白对照。在37℃条件下培养2h后10000r/min离心10min(10℃)，收集上清液500μL保存在-20℃冰箱中待ELISA试剂盒检测。按照ELISA试剂盒提供的方法，计算菌株脱毒效率。
1.3.3抑制产毒真菌乳酸菌的筛选
采用双层平板法对筛选出具有脱毒作用的乳酸菌进行抑制产毒真菌的测定。先将MRS固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，凝固后用接种环蘸取活化至对数期的乳酸菌液在平板上化2条2-3cm的平行线，37℃培养48h至长出菌苔。将含有真菌孢子浓度为106个/ml的PDA培养基倒入培养基中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，30℃条件下培养72h，检测乳酸菌生长条带周围的抑菌圈大小，选择抑菌效果良好的乳酸菌进行后期试验。
1.4菌株鉴定
1.4.1菌落及细菌鉴定
对分离出的乳酸菌菌落形态进行观察，挑取单菌落革兰氏染色后用油镜观察观察菌株形态。挑取菌落并滴加3％过氧化氢溶液，有气泡产生表示为阳性，无气泡产生表示为阴性,并对筛选出的菌株做生理生化试验。
1.4.2菌株16S rRNA鉴定
依据细菌DNA提取试剂盒说明书提取目标菌株DNA，采用试剂盒提供的通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′),1492R(5′-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系50μL：5.0μL 10×Ex Taq buffer、4.0μL 2.5mM dNTP Mix、2.0μL10p Primer 1、2.0μL10p Primer 2、0.5μL 5u Ex Taq、2.0μL Template、34.5μL ddH2O。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min30s，共24个循环；72℃终延伸10min。将PCR产物送到北京美优安诺生物科技有限公司测序，测序结果提交到NCBI进行BLAST分析，用MEGA软件中的N-J法构建系统发育树。
1.5菌株生物学特性测定
将高效降解的菌株活化接种于MRS液体培养基中，37℃条件下恒温培养，在第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28、32、36h测定菌株发酵液的OD600值，以菌株培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株生长曲线。按照上述方法培养菌株，在第0、2、4、6、8、12、16、24、36、48、72h测定菌液pH，以菌株培养时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制产酸速率曲线。
1.6菌株对AFB1吸附降解情况研究
选择对AFB1脱毒能力最高的菌株DN-1作为后续试验菌，将菌株接种于MRS液体培养基中活化至菌体浓度为2.0×1010CFU/ml，将菌液等体积分成3份。其中一份置于4℃冰箱中保存待用，一份DN-1培养液于10000r/min条件下离心20min，上清液用0.22μm水系滤膜过滤后保存备用，菌体沉淀用无菌PBS冲洗2次后重悬于PBS溶液中，利用手持超声细胞破碎仪破碎菌体，4℃、10000r/min离心20min，上清液用0.22μm水系滤膜过滤，得到细胞内容物。最后一份在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌处理20min。将上述各组菌液于10000r/min条件下离心10min，弃掉上清，用PBS溶液清洗菌体沉淀2次，再用含有AFB1(10μg/mL)的等量无菌PBS重新悬浮菌体，以含有AFB1(10μg/mL)的等量无菌PBS为空白对照，于37℃恒温条件下培养2h，每个样品设置3个重复。培养结束后离心收集上清液用于检测AFB1含量。
1.7不同处理及复合物稳定性研究
将菌株沉淀接种于含有AFB1的PBS溶液中后对其用HCI、尿素和溶菌酶进行不同处理。处理后在37℃条件下培养2h后离心收集上清液测定脱毒率。
将菌株分为活细胞处理组和灭活细胞处理组，经脱毒试验后10000r/min离心10min得到沉淀，分别以0.5mLPBS(pH7.4)溶液和甲醇溶液重新悬浮菌体，振荡5min提取菌体吸附的AFB1，10000r/min离心20min收集上清液待检测，重复上述步骤3次。
1.8培养条件对菌株AFB1脱毒效率的影响
研究不同培养条件对菌株AFB1降解效率的影响，分别设置如下培养条件：接种量(2％、4％、6％、8％、10％)；温度(22、27、32、37、42℃)；初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)；培养时间(1、2、4、8、12、16、20、24、28h)。每个样品设置3个重复，检测AFB1含量变化。
2结果和讨论
2.1 AFB1脱毒菌株的分离筛选
近年来，乳酸菌脱毒AFB1受到广泛关注，其中多种乳酸菌被证实具有高效AFB1脱毒能力。本试验经连续分离，从样品中共分离到60株乳酸菌株，其中8株具有脱毒AFB1的能力，这8个菌株对AFB1的脱毒能力明显不同，如图1所示。其中菌株DN-1与其它菌株相比表现出最强的脱毒活性(71.38％)，QZ-11(64.43％)，FY-12(53.13％)，FT-9(20.88％)，DN-3(45.53％)，DN-7(10.57％)，FT-1(4.45％)，FJ-4(33.47％)。
本试验中筛选出的菌株脱毒效率高于上述菌株，这可能是由于菌种差异及霉菌毒素类型不同造成的，另外培养条件的不同也会导致一定差异。
2.2 DN-1对产毒真菌的抑制能力
随后对8株菌株进行抑制真菌试验，结果显示，DN-1菌株和FY-12菌株对黄曲霉和寄生曲霉均表现出良好的抑制能力，在真菌附近形成抑菌圈。但由于FY-12菌株对AFB1脱毒率显著低于DN-1菌株(p<0.05)，因此选择DN-1菌株进行后续研究。
表1抑制真菌活性乳酸菌的筛选
Note:Strong inhibition+++(formation ofstrong inhibition zonesaroundthe LAB culture)；inhibition++(formation ofinhibition zones around theLAB culture)；some inhibition+(LAB were not overlaidbythe fungi)；absenceofinhibition-(LAB were completely overlaidby fungal growth).
2.3菌株的鉴定
DN-1菌株的菌落呈乳白色，表面光滑湿润，半透明，中央凸起，菌落大小为0.2～0.6mm，无芽孢(图2a)。经鉴定DN-1为革兰氏阳性杆菌(图2b)。DN-1的生化特征列于图2中，
通过NCBI数据库中的BLAST搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对获得的16S rRNA基因序列进行分析。
短乳杆菌16S测序结果：
AGTCGAACGAGCTTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTCAACAATGAAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAATCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACAAAATCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTGAGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTTGCGAAGTCGTGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGATAACCTTCGGGAGTCAGCCGTCTAAGGTGA
结果显示，菌株DN-1与短乳杆菌的16S rRNA序列相似度达到99％以上。同时系统发育树结果也显示DN-1与短乳杆菌位于同一分支(图3)，因此鉴定为短乳杆菌。
表2.菌株DN-1生理生化实验结果
Note:“+”,positive；“-”,negative.
2.4菌株生物学特性测定
DN-1菌株的生长曲线显示，1-14h为指数生长期，在14h后生长缓慢进入稳定期(图4)。此外，DN-1菌株在发酵0-16h时pH快速下降，在16h时菌液pH较低(<4.0)，在发酵0-2h时pH下降速度最快，已经降至5.0以下(图5)。DN-1菌株显示出了良好的生长速率及产酸能力，具有良好的青贮潜力。生长速率和产酸性能是用来评价青贮用乳酸菌的重要指标。生长速度和产酸速度快有利于乳酸菌成为青贮饲料中优势菌种，促进乳酸生成，迅速降低pH，从而抑制其他菌种快速繁殖。植物乳杆菌和短乳杆菌是较常见的青贮用乳酸菌添加剂，前者是同型发酵乳酸菌，能快速产生乳酸降低pH值，后者属于异型发酵乳酸菌，可以产生大量乳酸，有效抑制霉菌生长。
2.5吸附降解情况研究
菌株去除AFB1的方式主要有两种，通过生物降解或是细胞壁吸附，为了明确脱毒方式，进行由图6a可知，菌株DN-1活细胞的AFB1脱毒率显著高于培养物上清液和裂解内容物(p<0.01)，在2h内活细胞脱除了71.79％的AFB1，而培养物上清液和裂解内容物仅分别去除了12.20％和7.79％，这说明在培养过程中菌株DN-1很少分泌降解AFB1的活性物质。同时菌株DN-1灭活细胞反应体系降解率(74.68％)高于活细胞体系，这表明菌株DN-1对AFB1的脱毒方式主要是细胞壁的吸附作用，并且菌株浓度越高，吸附的AFB1越多。乳酸菌通过吸附的方式脱除AFB1。灭活细胞有更高的脱毒率，原因可能是高温灭活导致细胞壁蛋白变性和孔隙变化，从而使更多的活性吸附位点暴露。研究显示，肠黏膜对灭活细胞的吸附性小，基于此这些细胞-毒素复合物可以轻易从肠道清除，并不会残留在肠道。
为了进一步阐明细菌细胞壁的作用，对活细胞进行酸处理、尿素处理和溶菌酶处理。结果显示与活细胞相比，酸处理后的细胞结合AFB1的能力增加至78.35％。尿素和溶菌酶处理后细胞的降解能力显著降低(p<0.01)(图6b)，这说明细胞壁对于吸附过程是必要的。研究发现，细胞壁中的肽聚糖、磷壁酸等成分在结合霉菌毒素方面起重要作用，同时细胞壁疏水特性也发挥关键作用。尿素处理后，AFB1的去除率仅为16.27％，原因可能是尿素的抗疏水特性干扰了氢键结合。此外，溶菌酶处理的细胞对AFB1的去除率从71.73％下降到12.35％，这可能与上文提到的肽聚糖三维网络结构完整性有关。
2.7吸附稳定性研究
为了评价活细胞及热灭活细胞与AFB1之间形成的复合物的稳定性，用水和甲醇溶液反复洗涤菌体-AFB1复合物，并检测AFB1解吸率。由图7可知，第1次洗涤过程中AFB1释放量最大，分别为23.07％、34.45％、39.94％和47.39％。相较于活细胞，热灭活细胞具有更高的释放量。而相较于水溶液，甲醇溶液能够释放更多的AFB1。洗脱3次后,菌体AFB1复合物释放量趋于平衡，再洗脱只有微量的AFB1释放出来，菌株DN-1的解吸率维持在40％-50％，说明还具有较高的吸附率。许多研究也证明了乳酸菌与AFB1的结合是一个可逆的过程。
这种差异表现除了洗涤液不同，影响霉菌毒素复合物稳定性的因素还包括菌株的种类和菌株结合毒素含量。不同的菌株结合毒素位点具有特异性，同样菌株结合毒素含量越多，菌株吸附稳定性相对较好。结果显示DN-1菌体吸附AFB1是一个可逆的过程,该菌株在洗脱3次后，仍保留较高的去除率。菌体AFB1复合物的稳定性取决于菌株自身的结合能力，具有菌株特异性，在本研究中观察到菌体DN-1吸附AFB1具有较好的稳定性。
2.8细胞浓度、温度、pH、时间对AFB1脱毒率的影响
研究发现，DN-1菌株接种量在0.5％-2.5％时，AFB1的脱毒效率随着接种量增加而增加，最大可达到78.66％，菌株浓度越高，脱毒AFB1越多。而当接种量超过2.5％时脱毒率显著降低(p<0.05)(图8a)。这可能是因为当菌株到达最佳接种量后，继续添加菌株无法充分利用培养基中的能量满足自身生长，从而导致菌株AFB1脱毒率有所降低。因此，菌株DN-1的最佳接种量为2.5％。
图8b显示，在0-4h内，DN-1的脱毒率随时间的增加而增加，在4-28h内趋于稳定。AFB1脱毒率在4h和28h之间无显著性差异(p>0.05)，结果表明，DN-1菌株的最佳培养时间为4h。在整个试验的28h过程中，超过80％AFB1在前1h被吸附，这说明菌株DN-1吸附AFB1是一个快速的过程，可以在短时间内完成。
由图8c可知，菌株DN-1能在酸性pH范围内保持较高的AFB1脱毒活性。在pH为4.0-6.0时，随着pH的增大，菌株脱毒效率随之增大。当pH为6.0时，菌株DN-1对AFB1的脱毒率达到最大，为69.13％。当pH大于6.0时，AFB1降解率显著下降(p<0.05)。因此，培养基初始pH为6.0时，菌株DN-1能够发挥最大AFB1降解活性。
图8d显示，当温度处于36℃和40℃时DN-1菌株显示出较高的脱毒率，脱毒率分别为：73.84％、73.27％。两组间AFB1脱毒率无显著性差异(p>0.05)。
3结论
本实施例分离得到了一株能够高效脱毒AFB1的乳酸菌DN-1，经鉴定为短乳杆菌。菌株DN-1主要通过细胞壁的物理吸附作用去除AFB1，在PBS溶液中脱毒效率为71.38％。菌株DN-1具有良好的生长速率及产酸性能，可以作为青贮接种剂的备选菌株。在洗涤3次后，脱毒率仍保持高效。菌株DN-1脱毒AFB1的最适条件为：接种量2.5％，初始pH6.0，温度36℃，培养时间4h。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1，其特征在于，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1已于2023年6月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.27664。
2.如权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1在制备抑制黄曲霉毒素B1的饲料添加剂中应用。
3.如权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ND-1在制备吸附降解黄曲霉毒素B1的短乳杆菌的饲料添加剂中应用。
4.一种饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ND-1的活细胞。
5.一种饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ND-1的热灭活细胞。
6.一种饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ND-1的活细胞和热灭活细胞的混合菌株。
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2023
- 2023-08-22 CN CN202311056688.0A patent/CN117431171B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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