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CN117417962B - 一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用 - Google Patents

一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用，属于基因工程药物领域。本发明通过在穿梭载体插入hTERT启动子、E1A基因区、55kD E1B相关片段和p53基因构建得到改造穿梭载体，对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造得到改造腺病毒载体，并将改造穿梭载体和改造腺病毒载体共转染细胞后表达获得多靶点溶瘤腺病毒。本发明的多靶点溶瘤病毒对肿瘤细胞杀伤力强，且对正常细胞安全性高，能够在肿瘤模型小鼠体内有效的抑制肿瘤的生长，有很好的临床应用前景。

Description

一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用。
背景技术
溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，可以通过细胞表面受体分子入侵到肿瘤细胞中，具有肿瘤治疗潜力。现有溶瘤病毒治疗的有效策略是改造出具有特异性的溶瘤病毒，并靶向肿瘤细胞中过度表达的特异性受体，将病毒入侵到肿瘤细胞中并行使后续的各项功能。
溶瘤病毒介导的基因治疗对肿瘤细胞杀伤效率高、特异性好、安全性高、副作用小、成本低廉，是一种新兴肿瘤免疫治疗模式。但溶瘤病毒疗法并非十全十美，目前其最大的挑战，依然在于如何提高产品的安全性和有效性。
申请号为201010621084.2的中国专利中公开了一种人工改造人类5型腺病毒(Ad5)的构建方案，以及用该方案获取的一种新型溶瘤腺病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途，属于医学基因工程技术领域。用PCR扩增定点缺失、酶切、连接、克隆、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得的一种重组腺病毒构建体，特征在于：Ad5基因组E1A保守序列2(CR2)区缺失27个碱基；E3区ADP基因的29477-29714nt缺失；同时在该缺失区插入HSV-TK基因的全长编码序列(1131bp)。该构建体是一种具有更高的肿瘤选择性复制能力的新型溶瘤腺病毒载体，其利用HSV-TK的自杀基因作用和溶瘤病毒溶解肿瘤细胞的双重杀伤效应在肿瘤的生物治疗中具有独特的实用价值。但其肿瘤杀伤能力有限。
申请号为201910462073.5的中国专利中公开了：重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物，涉及生物技术领域。公开的重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰RNA表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒。该重组溶瘤病毒的繁殖或复制受到其基因组序列上所插入的外源元件调控，通过这些外源元件的调控，使得该重组溶瘤病毒可以在不同类型的细胞中选择性繁殖或复制，通过选择性的繁殖或复制进而可选择性地杀死第二细胞即靶细胞(例如肿瘤细胞)而对第一细胞即非靶细胞(例如正常细胞)不造成伤害。制备的重组瘤病毒作用不稳定，且肿瘤杀伤能力有进一步提升的空间。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用AdMax复制缺陷型的Ad5型腺病毒载体进行基因工程改造，获得一款利用多重机制提高溶瘤病毒安全性和有效性的溶瘤病毒。
本发明对腺病毒骨架载体(以pBHGloxΔE1,3Cre为例)和穿梭载体(以pDC316为例)分别进行了改构，并利用改构后的两种载体共转染表达细胞(以293细胞为例)以制备溶瘤腺病毒。
AdMax系统的骨架载体pBHGloxΔE1,3Cre缺失了Ad5型腺病毒的E1基因和E3基因，所以和穿梭载体如pDC316共转染293细胞制备的腺病毒不具有复制能力，即丢失了溶瘤病毒的特征。通过下面的改造，本发明恢复了病毒的复制能力，并且增强了溶瘤病毒在肿瘤杀伤作用中的高效性和安全性。
一方面，本发明提供了一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法。
所述构建方法中包括：
(1)在穿梭载体插入hTERT启动子、E1A基因区、55kD E1B相关片段和p53基因构建得到改造穿梭载体，其中：所述E1A基因区为缺少CR2区片段的E1A基因；所述55kD E1B相关片段包括缺失19kD片段的E1B基因和E1B基因启动子区，所述的缺失19kD片段的E1B基因为SEQ ID NO.1；
(2)对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造得到改造腺病毒载体：
将Ad5腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft序列替换成Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列；并将hGM-CSF基因插入骨架载体的E3缺失区；
(3)改造穿梭载体和改造腺病毒载体共转染细胞后表达。
具体地，所述的步骤(1)中：
所述的hTERT启动子为SEQ ID NO.2；
所述的CR2区片段为SEQ ID NO.3；
所述的E1B基因启动子区为SEQ ID NO.4；
所述的p53基因区序列为SEQ ID NO.5。
优选地，所述的步骤(1)中：E1A基因区为SEQ ID NO.6。
优选地，所述的步骤(1)中：穿梭载体为pDC316。实际上，本领域技术人员对于穿梭载体的选择不局限于本发明所优选的类型，能够实现穿梭载体功能的均可。
所述的步骤(2)中Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列为SEQ ID NO.7。
所述的步骤(2)中hGM-CSF基因为SEQ ID NO.8。
步骤(2)中对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括：
1)构建含Cre酶识别位点、抗性筛选标记、Ad35型病毒Fiber基因上的Knob和Shaft功能区的载体，并通过抗性筛选获得阳性克隆；
2)利用表达Cre重组酶的大肠杆菌进行同源重组，将添加的筛选标记敲除；
3)将hGM-CSF基因插入骨架载体的E3缺失区。
所述的步骤1)中：抗性筛选标记包括抗性基因和启动子；所述的Cre酶识别位点为LoxP位点。
优选地，所述的步骤1)中：LoxP序列为SEQ ID NO.9所示。
所述的步骤3)中：hGM-CSF基因与AD5骨架序列共同插入，插入酶切位点为PacI。
在一些实施例中，所述的步骤(1)对穿梭载体进行的改构可以包括以下步骤：
插入人端粒酶逆转录酶hTERT启动子区和受其调控的E1A基因区，序列分别如SEQID NO.2和SEQ ID NO.6所示；
插入受E1A调控的缺失19kD E1B基因及E1B基因启动子区，即55kD E1B相关片段；序列为SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.1(表示二者连接)；
通过同源重组缺失E1A基因上CR2区段(24bp序列)；CR2区段如SEQ ID NO.3所示；
在载体多克隆位点插入p53基因。具体的序列为SEQ ID NO.5所示。
以上改造方式的作用在于：
(1)利用肿瘤特异性启动子来特异性表达E1A基因以及利用E1A基因缺失24bp序列的蛋白不能和RB分子结合的特点，进一步增强了溶瘤病毒在肿瘤细胞的特异性复制能力；
(2)通过缺失E1B基因的19kD分子，增强了溶瘤病毒诱导肿瘤细胞发生凋亡。
本发明的穿梭载体还包括：
在多克隆位点上插入了p53基因。p53是一种肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。在肿瘤细胞中过表达野生型p53能够阻滞肿瘤细胞周期，促进细胞凋亡以及抑制肿瘤的血管生成，进而发挥p53的抑癌功能。
在对于穿梭载体的改构中，本发明主要通过真核细胞一步法同源重组方法或者通过合适的酶切酶连的方法来实现。
优选地，本发明改造的穿梭载体pDC316的质粒图谱为图1：在穿梭载体PDC316基础上插入了E1A基因并在E1A上游插入肿瘤特异性启动子hTERT序列，插入了受E1A调控的缺失了19kD的55kD-E1B基因以及其转录调控区(启动子)，并且缺失了E1A基因CR2上的24bp碱基；在该载体的多克隆位点插入了p53基因，基因的表达是受CMV启动子调控。该穿梭载体命名为pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B-p53。
在一些实施例中，所述的步骤(2)对腺病毒的骨架载体pBHGloxΔE1,3Cre进行的改构主要包括两个位置：
1)将Ad5型腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft序列替换成Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列；
2)通过同源重组的方法将hGM-CSF基因插入E3缺失区，并且通过基因组内源性的启动子来调控hGM-CSF的表达，启动子序列如SEQ ID NO.10所示。
以上改造方式的作用在于：
因为Ad5型腺病毒入侵细胞的第一步需要和肿瘤细胞相互作用，这种相互作用是通过病毒的Fiber蛋白识别肿瘤表面表达的CAR(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)来实现的，但是在一些肿瘤细胞中由于缺乏CAR的表达或者低表达，继而限制了Ad5型溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的识别和入侵。某些B组腺病毒如35型腺病毒可以通过非CAR受体如CD46来感染肿瘤细胞。CD46是一种广泛表达的膜蛋白。为了使溶瘤病毒能够对各种肿瘤产生抗肿瘤作用，本发明建立嵌合型的腺病毒Fiber分子，可以和肿瘤细胞表面的CD46结合，从而实现对许多CAR阴性表达的肿瘤细胞的侵袭。
五型腺病毒的骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre完全缺失了E3基因的表达，这一段基因片段的缺失可以让我们插入外源功能基因hGM-CSF。hGM-CSF通过调节哺乳动物骨髓细胞生成以促进巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和吞噬细胞增殖。在免疫效应中，hGM-CSF作用细胞主要是抗原提呈细胞APC(antigen presenting cell)，通过增强APC对抗原的处理和表达，以维持和增强适应性免疫反应。
由于五型腺病毒的骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre大小达到了34kb以上，所以用真核同源重组或者酶切酶连进行改构的技术方法是行不通的。
本发明优选地，通过组合多种细菌同源重组的技术进行了改构工作。
pBHGloxΔE1,3Cre改构具体如下：
(1)通过两步同源重组技术，将5型腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft功能区替换成35型腺病毒上的Knob and Shaft功能区：
第一步是通过SW102菌同源重组将35型腺病毒上的Knob和Shaft功能区替换5型腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft功能区，这一步在病毒骨架质粒上携带了一种卡那霉素抗性，在筛选标记的两端带有一对LoxP序列-Lox2272(SEQ ID NO.9)。有关卡那霉素抗性基因完整序列如SEQ ID NO.11所示。
第二步利用表达Cre重组酶的大肠杆菌进行Cre-loxP同源重组，将添加的筛选标记卡那霉素抗性基因给敲除下来，仅保留一段Lox2272序列。所构建的Fiber嵌合体的病毒骨架简称为Ad5F35型。
(2)在骨架缺失E3区插入hGM-CSF是通过PacI酶切Fiber嵌合体构建成功的载体Ad5F35，在大肠杆菌BJ5183中通过同源重组直接将hGM-CSF基因插入骨架载体上的PacI酶切位点前。
在一些具体实施例中，载体质粒图谱为图2。
用五型腺病毒的骨架载体pBHGloxΔE1,3Cre改构后主要是形成了Fiber基因的嵌合体，简称Ad5F35；在E3缺失区插入了hGM-CSF基因。将该骨架载体最后命名为pBHGloxΔE1,3Cre-hGM-CSF-Ad5F35-Lox2272。
所述的步骤(3)中共转染为转染具有表达功能的细胞，所述的细胞可以根据本领域技术人员的公知常识进行选择，本发明中优选为293细胞。事实上还可以是其他表达细胞的类型，如A549细胞或者稳定表达ADP基因的293细胞。
又一方面，本发明提供了前述的构建方法构建的多靶点溶瘤腺病毒。
又一方面，本发明还提供了前述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明同时保护含前述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物。
所述的肿瘤包括但不限于消化系统肿瘤或呼吸系统肿瘤。
所述的消化系统肿瘤包括但不限于：食管癌、胰腺癌、肠癌、胃癌、肝癌等。
所述的呼吸系统骨肿瘤包括但不限于：肺癌、鼻咽癌、喉癌。
优选地，所述的药物用于治疗肠癌或肺癌。
进一步优选地，所述肠癌包括但不限于：大肠癌、结直肠癌、十二指肠癌，优选为结直肠癌。
所述的肠癌可以是隆起型、溃疡型、浸润型。
优选地，所述的药物为靶向药物。
所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的有益效果：
1.插入肿瘤特异性hTERT启动子，缺失E1A上的24bp序列，病毒将在RB蛋白突变的肿瘤细胞中特异性复制，提高了安全性；
载体缺失E1B基因上的19KD蛋白，增强溶瘤病毒对凋亡的诱导能力；表达p53和hGM-CSF细胞因子，提高溶瘤病毒对机体的免疫调控作用；将5型腺病毒的Fiber基因改变为和35型腺病毒Fiber嵌合型的病毒，改变了病毒感染肿瘤细胞的途径，通过和CD46的作用增强对CAR表达阴性肿瘤细胞的感染能力。以上操作起到了增强有效性的效果。
2.本发明制备的溶瘤腺病毒对肿瘤细胞有很好的杀伤抑制作用，优于现有技术，且对正常细胞安全性高。
3.本发明的溶瘤腺病毒能够在肿瘤模型小鼠体内有效的抑制肿瘤的生长，有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为改构成功的穿梭载体pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B-p53结构图。
图2为改构成功的pBHGloxΔE1,3Cre-hGM-CSF-AD5F35-Lox2272结构图。
图3多靶点溶瘤腺病毒E10K-1A基因组结构图。
图4多靶点溶瘤腺病毒E10K-1A基因组PCR鉴定电泳图。
图5溶瘤腺病毒E10K-1A携带的p53基因在肿瘤细胞中表达检测。
图6溶瘤腺病毒E10K-1A携带的hGM-CSF基因在肿瘤细胞中表达检测。
图7溶瘤腺病毒E10K-1A对肿瘤细胞和正常细胞的体外杀伤作用。
图8溶瘤腺病毒E10K-1A抑制人结肠癌SW620裸鼠移植瘤增殖的效果。
图9溶瘤腺病毒E10K-1A抑制人非小细胞肺癌NCI-H1299裸鼠移植瘤增殖的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
“hTERT”指人端粒酶逆转录酶。其启动子，即hTERT启动子可以转录调控E1A基因区。
本发明中，“SW102”为整合有重组酶的大肠杆菌。
实施例1pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B-p53的构建
(1)在pDC316上插入以下序列：
hTERT启动子：SEQ ID NO.2；
E1A基因区：SEQ ID NO.6；
55kD E1B相关片段：SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.1。
其中，hTERT指人端粒酶逆转录酶，其启动子即hTERT启动子。
E1A基因区受hTERT启动子转录调控。
55kD E1B相关片段上包括缺失19kD E1B基因(E1B-55kD，SEQ ID NO.1)和病毒基因组上调控55kD-E1B转录的启动子区(E1B基因启动子区，SEQ ID NO.4)，缺失19kD E1B基因受E1A调控。
具体操作：
提取HepG2细胞的基因组DNA，PCR扩增得到hTERT的核心启动子序列，该序列N端带有pDC316载体XbaI酶切位点左侧的同源臂；扩增引物为hTERT-F-pDC316(SEQ ID NO.12)和hTERT-R(SEQ ID NO.13)。
293细胞提取RAN反转录得到cDNA序列，扩增出需要的E1A基因序列，该序列N端具有和hTERT启动子C端的同源臂，C末端含有和E1B基因启动子区的同源臂，扩增引物为E1A-F(SEQ ID NO.14)和E1A-R(SEQ ID NO.15)；
合成55kD E1B相关片段(E1B基因启动子区和E1B-55kD序列)后通过PCR进一步扩增，55kD E1B相关片段E1B基因启动子区以及55kD-E1B序列的C端带有pDC316载体XbaI酶切位点右侧的同源臂，扩增引物为E1B-55kD-Promoter-F(SEQ ID NO.16)和E1B-55kD-R-pDC316R(SEQ ID NO.17)；
XbaI酶切获得线性化的pDC316载体(购自Microbix Biosystems Inc，货号PD-01-64)，利用诺唯赞公司的一体化超快速克隆试剂盒(货号：C115-01)，将hTERT启动子和E1A基因和55kD E1B相关片段(55kD-E1B-启动子-基因片段)同时同源重组整合至pDC316载体的XbaI酶切位点。
同源重组反应体系：
组分 用量
线性化载体pDC316 100ng
hTERT启动子片段 10ng
E1A基因片段 20ng
55kD-E1B-启动子-基因片段 40ng(E1B)
2×ClonExpress Mix 2μL
ddH2O 补充至10μL
重组反应条件，50℃，15min；然后降至4℃或立即置于冰上冷却，再转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行PCR筛选和测序，得到pDC316-hTERT-E1A-55kD E1B穿梭载体。经KasI酶切得到线性化穿梭载体。
(2)通过同源重组缺失E1A基因上CR2区段的24bp序列(SEQ ID NO.3)。
具体操作：为了缺失E1A基因CR2区段的24bp序列，首先用两对引物扩增出E1A的两条序列，分别命名为Delta24E1A-A(扩增引物Delta24E1A-F：SEQ ID NO.18；Delta24E1A-A-R：SEQ ID NO.19)和Delta24E1A-C(扩增引物Delta24E1A-C-F：SEQ ID NO.20；Delta24E1A-C-R：SEQ ID NO.21)。这两条序列连接处就缺失了CR2区段的24bp序列，再通过快速重组试剂盒(诺唯赞，货号：C115-01)将这两条PCR序列和经KasI酶切线性化的穿梭载体pDC316-hTERT-E1A-55kD-E1B进行同源重组，筛选后得到新的穿梭载体，命名为pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B。同源重组反应体系：
组分 用量
线性化穿梭载体 100ng
Delta24E1A-A 10ng
Delta24E1A-C 20ng
2×ClonExpress Mix 2μL
ddH2O 补充至10μL
重组反应条件，50℃，15min；降至4℃或立即置于冰上冷却，转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行PCR筛选和测序，最后确定穿梭载体pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B构建成功。EcoRI和SalI双酶切获得线性化载体。
(3)构建穿梭载体pDC316-hTERT-del24E1A-55kD-E1B-p53
具体操作：合成p53基因序列(SEQ ID NO.5)，两端带有EcoRI和SalI酶切位点。将序列酶切后克隆插入pDC316-hTERT-del24E1A-55kD-E1B多克隆位点EcoRI和SalI之间(即与步骤(2)获得的线性化载体连接)，改造后的穿梭载体命名为pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B-p53，质粒图谱见图1。
实施例2pBHGloxΔE1,3Cre-hGM-CSF-Ad5F35-lox2272的构建
通过两步同源重组技术，将5型腺病毒Fiber分子上的knob和shaft功能区替换成35型腺病毒上的Knob和Shaft功能区：
(1)第一步是通过SW102菌同源重组将Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft功能区替换5型腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft功能区，这一步在病毒骨架质粒上携带了一种卡那霉素抗性筛选标记，在筛选标记的两端带有一对LoxP序列-Lox2272。
具体操作如下：合成一段序列包括Ad35型病毒Fiber基因上的Knob和Shaft功能区(SEQ ID NO.7)，一段Lox2272序列(SEQ ID NO.9)、调控卡那霉素表达的氨苄启动子(SEQID NO.22)、卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO.11)和另一段Lox2272序列(SEQ ID NO.9)。该段序列N端是和AD5型病毒Fiber基因Tail序列的50bp同源臂(SEQ ID NO.23)，C端是和AD5型病毒Fiber基因C端骨架基因组上300bp的同源臂(SEQ ID NO.24)。通过两端同源臂设计PCR扩增引物(AD35F：SEQ ID NO.25；AD35R：SEQ ID NO.26)，经PCR扩增得到全长的待插入Ad5型骨架的序列片段(SEQ ID NO.27)。将该片段100ng与pBHGloxΔE1,3Cre载体(即Ad5型骨架，购自Microbix Biosystems Inc，PD-01-64)20ng共电转SW102感受态细胞(明舟生物，B98002)，然后加入1mL无抗LB培养基恢复2h，涂卡那霉素抗性平板筛选并测序，最后获得改构成功的骨架载体，命名为pBHGloxΔE1,3Cre-Ad5F35-lox2272-kana-lox2272。该改构的骨架载体用Ad35型腺病毒Fiber基因上的Knob和Shaft序列替换了Ad5型腺病毒Fiber基因上的相对应序列，但是也引入了卡那霉素抗性基因、调控其转录的启动子以及两端的LoxP序列，所以需要继续将多余的基因序列敲除下来。
(2)第二步利用表达Cre重组酶的大肠杆菌进行Cre-LoxP同源重组，将添加的筛选标记给敲除下来。具体操作如下：电转50ng pBHGloxΔE1,3Cre-Ad5F35-lox2272-kana-lox2272至表达Cre重组酶的大肠杆菌感受态细胞中，涂氨苄平板后进行菌落PCR筛选鉴定并测序，最终得到将卡那霉素抗性基因、调控其转录的启动子和一段lox2272敲除的骨架载体，命名为pBHGloxΔE1,3Cre-Ad5F35-lox2272，简称为Ad5F35骨架载体。
(3)在Ad5F35骨架载体E3缺失区插入hGM-CSF基因。
这一步通过PacI酶切(购自NEB公司，R0547V)线性化Ad5F35骨架载体，转导大肠杆菌感受态BJ5183(购自唯地生物公司，DL1075S)后通过同源重组直接将hGM-CSF基因插入骨架载体。具体操作如下：
合成一段DNA序列，该序列包括：
Ad5F35骨架载体PacI酶切位点上游1kb的同源臂：SEQ ID NO.28；
一段Ad5型骨架序列：SEQ ID NO.29；(原Ad5型骨架自有，载体构建过程中敲除，因此重新构建入载体中)；
hGM-CSF表达基因：SEQ ID NO.8；
PacI酶切位点下游260bp的同源臂：SEQ ID NO.30。
以此序列设计引物(hGM-CSF Primer F：SEQ ID NO.31；hGM-CSF Primer R：SEQID NO.32)扩增出片段，和经PacI酶切线性化的Ad5F35骨架载体共转入大肠杆菌感受态BJ5183，涂氨苄平板后进行PCR克隆鉴定和测序分析，最终获得在Ad5F35载体E3缺失位置插入了hGM-CSF基因的改构的骨架载体，命名为pBHGloxΔE1,3Cre-hGM-CSF-Ad5F35-lox2272。
载体构建已经完成，并且测序正确。最终质粒图谱为图2。
实施例3多靶点溶瘤腺病毒的包装、制备和鉴定
(1)采用实施例1和实施例2构建的2种载体，共转染293细胞，制备多靶点溶瘤腺病毒，具体方法如下：
将以上构建好的穿梭载体pDC316-hTERT-del24E1A-55kDE1B-p53(简称改造穿梭载体)与嵌合型的骨架载体pBHGloxΔE1,3Cre-hGM-CSF-Ad5F35-lox2272(简称改造腺病毒载体)共转染HEK293细胞进行溶瘤病毒的包装。转染前一天，将5×105个HEK293细胞接种于6cm培养皿中，培养基为DMEM+10％FBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
第二天当细胞密度达到80％左右更换新鲜的含10％FBSDMEM培养基继续培养2小时。取3.2μg改造腺病毒载体和0.8μg改造穿梭载体用TurboFect转染试剂(ThermoFisher，货号R0533)按照使用说明书进行共转染。转染后第二天，将长满的细胞传代于T25细胞培养瓶中，用含5％FBS的DMEM培养基继续培养，待细胞长满再传入T75细胞培养瓶中。期间不换液，添加部分的培养基，大约20天细胞出毒，表现为细胞呈现葡萄状，开始从培养瓶壁大量脱落。将出毒的细胞用培养液洗脱下来后，500g离心10分钟，弃上清，细胞用2mL PBS重悬，先后置于-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次。12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液保存待用。将获得的溶瘤病毒命名为E10K-1A，图3为E10K-1A基因组结构示意图。
随后对溶瘤病毒E10K-1A的基因组上相关基因进行了PCR鉴定。具体操作如下：取50μL E10K-1A病毒液，加入2μL蛋白酶K，50℃消化30min释放病毒基因组，以此为模版PCR扩增E1A/p53/hGM-CSF的基因序列。所用的鉴定引物如下：
AD-E1A-F：SEQ ID NO.33；
AD-E1A-R：SEQ ID NO.34；
AD-p53-F：SEQ ID NO.35；
AD-p53-R：SEQ ID NO.36；
AD-hGMCSF-F：SEQ ID NO.37；
AD-hGMCSF-R：SEQ ID NO.38。
PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示均能扩增到单一目的条带，片段大小正确。具体电泳结果如图4所示。
溶瘤病毒上的插入外源基因p53和hGM-CSF表达鉴定：取MOI 0.05溶瘤病毒E10K-1A感染A549和SW620肿瘤细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)后，72小时收取细胞培养上清，ELISA方法(上海碧云天生物技术有限公司hGM-CSF Elisa kits(货号PG355))检测hGM-CSF的表达；取溶瘤病毒E10K-1AMOI为2感染H1299肿瘤细胞(p53阴性细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司)，24小时后收取细胞裂解后通过Western-Blot(p53抗体购自CellSignaling公司，货号为2524T)检测p53蛋白的表达，结果如图5和图6所示这两个外源基因都能够在肿瘤细胞中正常表达。
实施例4溶瘤病毒E10K-1A对肿瘤细胞和小鼠肿瘤模型的功能分析
(1)溶瘤腺病毒E10K-1A对肿瘤细胞的特异性杀伤抑制作用：
通过CCK8实验研究了溶瘤病毒E10K-1A对多种肿瘤细胞以及正常细胞的杀伤作用，并且和一种非复制型的5型腺病毒为载体表达p53的ADv-p53病毒进行了比较(商品名：今又生，深圳市赛百诺基因技术有限公司生产)。
取对数生长期的A549、SW620和H1299肿瘤细胞以及正常BJ细胞1×10 4细胞/孔接种96孔细胞培养板，24小时后细胞贴壁良好，根据96孔板中的每孔细胞接种数及各溶瘤病毒的滴度，将溶瘤病毒E10K-1A或者ADv-p53病毒以不同的感染复数(MOI 0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1)感染各种细胞系，每个MOI做3个复孔，空白组不加病毒。细胞加毒后将96孔板放入细胞培养箱继续培养。病毒感染72h后，向96孔培养板的每孔中加入10μLCCK-8溶液，将培养板继续放入培养箱中培养2小时后将96孔板取出，用酶标仪测定各孔细胞在450nm处的吸光度，计算细胞存活率(用试验组的吸光值除以对照组的吸光值，计算出细胞存活率)，绘制细胞生存曲线。
结果如图7显示，溶瘤病毒E10K-1A对这三种肿瘤细胞均有很好的杀伤抑制作用，并且和病毒感染滴度密切相关，而且E10K-1A要显著优于ADv-p53病毒对肿瘤细胞的杀伤作用。对正常BJ细胞来说，溶瘤病毒在相同的MOI下的杀伤作用均低于肿瘤细胞，体现出良好的安全性。
(2)E10K-1A抗人结直肠腺癌的小鼠动物模型实验
15只4周龄健康纯种雄性BALB/C裸鼠，购自珠海百事通生物科技有限公司，合格证号NO.44822700013148。取对数生长期人结直肠腺癌细胞SW620悬液200μL注射至BALB/c裸鼠背部皮下。接种后7天当肿瘤达到平均100mm3随机分为3组(PBS对照组、E10K-1A组、ADv-P53组)，每组5只。2个病毒治疗组给予相应瘤内多点注射，每次每只剂量为2.95×107pfu/100μL，隔天一次，共注射5次；空白对照组同步注射PBS，每次每只100μL。治疗后，隔天定期用数显游标卡尺测量肿瘤的短径和长径，长径×短径2×0.5计算肿瘤的体积并且绘制肿瘤生长曲线。
实验从接种SW620后第7天开始给药，观察至第21天发现E10K-1A溶瘤病毒给药组和ADv-P53给药组相对PBS对照组，均能够显著抑制肿瘤的增殖，E10K-1A相对PBS组在第11天开始肿瘤大小有显著性差别，至第21天肿瘤增殖的抑制率到达50％左右；而E10K-1A溶瘤病毒给药组和ADv-P53给药组相比，对肿瘤的增殖的抑制作用有显著性的差异。这说明溶瘤病毒E10K-1A能够有效的抑制结直肠癌肿瘤的生长(图8)。
(3)E10K-1A抗人非小细胞肺癌小鼠动物模型实验
15只4周龄健康纯种雄性BALB/C裸鼠，购自珠海百事通生物科技有限公司，合格证号NO.44822700013576。取对数生长期人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞悬液200μL注射至BALB/c裸鼠背部皮下。接种后4周左右当肿瘤达到平均100mm3随机分为3组(PBS对照组、E10K-1A组、ADv-P53组)，每组5只。2个病毒治疗组给予相应瘤内多点注射，每次每只剂量为2.95×107pfu/100μL，隔天一次，共注射5次；空白对照组同步注射PBS，每次每只100μL。治疗后，隔天定期用数显游标卡尺测量肿瘤的短径和长径，长径×短径2×0.5计算肿瘤的体积并且绘制肿瘤生长曲线。
实验观察从给药第1天至第19天的治疗效果发现，E10K-1A相对PBS组在首次给药后第5天开始肿瘤大小有显著性差别，至第19天肿瘤增殖的抑制率到达90％左右；ADv-P53给药组相对PBS组在第5天开始肿瘤大小有显著性差别，至第19天肿瘤增殖的抑制率到达70％左右，对肿瘤的增殖的抑制作用有显著性的差异。同时发现E10K-1A给药组相对ADv-P53给药组对肿瘤的增殖的抑制作用有显著性的差异。这说明溶瘤病毒E10K-1A能够有效的抑制非小细胞肺癌的生长(图9)。

Claims (8)

1.一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括：
（1）在穿梭载体插入hTERT启动子、E1A基因区、55kD E1B相关片段和p53基因构建得到改造穿梭载体，其中：所述E1A基因区为缺少CR2区片段的E1A基因；所述55kD E1B相关片段包括缺失19kD片段的E1B基因和E1B基因启动子区，所述的缺失19kD片段的E1B基因为SEQID NO.1；
（2）对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造得到改造腺病毒载体：
将Ad5腺病毒Fiber分子上的Knob和Shaft序列替换成Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列；并将hGM-CSF基因插入骨架载体的E3缺失区；
（3）改造穿梭载体和改造腺病毒载体共转染细胞后表达；
所述的步骤（1）中，所述的hTERT启动子为SEQ ID NO.2；所述的E1A基因区为SEQ IDNO.6；所述的p53基因区序列为SEQ ID NO.5；
所述的步骤（1）中穿梭载体为pDC316；
所述的步骤（2）中Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列为SEQ ID NO.7；
所述的步骤（2）中hGM-CSF基因为SEQ ID NO.8。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括：
1）构建含Cre酶识别位点、抗性筛选标记、Ad35型病毒Fiber基因上的Knob和Shaft功能区的载体，并通过抗性筛选获得阳性克隆；
2）利用表达Cre重组酶的大肠杆菌进行同源重组，将添加的筛选标记敲除；
3）将hGM-CSF基因插入骨架载体的E3缺失区。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1）中：抗性筛选标记包括抗性基因和启动子；所述的Cre酶识别位点为LoxP位点。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤3）中：hGM-CSF基因与AD5骨架序列共同插入，插入酶切位点为PacI。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1）中：LoxP序列为SEQ IDNO.9所示。
6.权利要求1-5任一项所述的构建方法构建的多靶点溶瘤腺病毒。
7.权利要求6所述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤，包括乳腺癌、肝癌、胆囊癌、胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、大肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌或头颈癌。
8.含权利要求6所述的多靶点溶瘤腺病毒的抗肿瘤药物。
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