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CN117305466B - 一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法 - Google Patents

一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法 Download PDF

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CN117305466B CN202311607291.6A CN202311607291A CN117305466B CN 117305466 B CN117305466 B CN 117305466B CN 202311607291 A CN202311607291 A CN 202311607291A CN 117305466 B CN117305466 B CN 117305466B
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Abstract

本文提供了一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法，包括：1)利用所述样品中DNA分子构建DNA文库，经转化后获得甲基化文库；2)对所述甲基化文库进行杂交捕获，以构建靶向甲基化文库；以及3)对所述靶向甲基化文库进行测序，并与未经转化的所述DNA分子的碱基序列进行比较，以确定所述DNA分子的甲基化状态，其中所述杂交捕获在包括至少一种单链寡核苷酸封闭试剂的杂交体系中进行，所述寡核苷酸封闭试剂的序列选自：Tn、(GT)p和(TA)q，其中n为15‑18的整数，p为6‑8的整数，q为6‑8的整数。本文还提供了检测样品中DNA分子的甲基化状态的试剂盒。

Description

一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法
技术领域
本申请涉及检测样品中DNA分子的甲基化状态的方法，还涉及用于检测样品中DNA分子的甲基化状态的试剂盒。
背景技术
DNA甲基化与很多生理的、病理的因素相关，承载着大量生物学信息。癌症的发生、发展伴随着DNA甲基化模式的改变，包括了逆转录元件、着丝粒及原癌基因的DNA低甲基化，以及与基因抑制相关的关键基因调控元件(如远端增强子和启动子转录起始的重叠区域)的甲基化。正常基因组中的大部分CpG位点都携带着5mC，而远端增强子元件及CpG岛区域对甲基转移酶DNMT的活性具有抗性，抑癌基因低表达和DNA损伤修复基因的沉默是癌症发生的重要机制。癌细胞主要表现特征为整体范围的失去甲基化遗传学修饰，反而增强子和启动子区域内出现异常的甲基化位点。这种甲基化分布的改变，导致了肿瘤抑癌基因的表达受抑制，并伴随着原癌基因表达的增加，从而进一步推动了肿瘤的发生、发展，因此，基因甲基化的检测更适合于作为癌症检测的标记物。
在检测技术方面，传统的焦磷酸测序被认为是甲基化检测的“金标准”，焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。4种酶分别为：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，反应底物为5′-磷酰硫酸(APS)、荧光素，反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列目的。但由于焦磷酸测序模板基于亚硫酸氢盐转化后的序列，其引物设计较难，对于部分甲基化位点无法设计合适的引物进行检测，同时对于低甲基化水平的样本(<10%)检测的实际水平差异较大。
除此之外，基于液相杂交捕获靶向甲基化检测技术是一种高通量的、精准的甲基化检测方法。与全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)相比它能够更加准确地识别甲基化位点，并获得更深入的甲基化信息。但液相杂交捕获流程非常耗时，从核酸提取到捕获文库的获取需要2-4天的时间；同时杂交捕获涉及的试剂种类较多、操作流程异常的繁琐，对于操作人员的技术要求较高，中途任何一个环节出现问题，均会影响捕获文库的表现。这些环节成为制约液相杂交捕获发展的关键技术瓶颈。
发明内容
在一方面，本文提供了检测样品中DNA分子的甲基化状态的方法，包括：
1) 利用所述样品中DNA分子构建DNA文库，经转化后获得甲基化文库；
2) 对所述甲基化文库进行杂交捕获，以构建靶向甲基化文库；以及
3) 对所述靶向甲基化文库进行测序，并与未经转化的所述DNA分子的碱基序列进行比较，以确定所述DNA分子的甲基化状态，
其中所述杂交捕获在包括至少一种单链寡核苷酸封闭试剂的杂交体系中进行，所述寡核苷酸封闭试剂的序列选自：Tn、(GT)p和(TA)q，其中n为15-18的整数，p为6-8的整数，q为6-8的整数。
在一些实施方案中，所述单链寡核苷酸封闭试剂为序列为Tn和(GT)p的单链寡核苷酸封闭试剂的组合。
在一些实施方案中，所述单链寡核苷酸封闭试剂包括一个或更多个锁核酸碱基或桥核酸碱基，优选5-8个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
在一些实施方案中，所述杂交捕获采用μCaler形式的捕获探针进行，所述μCaler形式的捕获探针包括靶特异性序列、位于所述靶特异性序列5’端的第一探针结合序列和位于所述靶特异性序列3’端的第二探针结合序列，所述第一探针结合序列至少部分地互补于所述第二探针结合序列，使得两个或更多个所述μCaler形式的捕获探针以相邻方式结合其各自的靶序列时，它们之间能够通过所述第一探针结合序列和所述第二探针结合序列形成互补结合。
在一些实施方案中，所述第一探针结合序列和第二探针结合序列的长度为8-30nt。
在一些实施方案中，所述靶特异性序列的长度为20-80nt。
在一些实施方案中，每种所述单链寡核苷酸封闭试剂在所述杂交体系中的浓度为100μM。
在一些实施方案中，所述捕获探针在所述杂交体系中的用量为1 fmol/rxn。
在一些实施方案中，所述杂交体系还添加有接头封闭试剂和Human Cot DNA。
在一些实施方案中，所述DNA分子来自基因组DNA、血浆游离DNA或FFPE样本。
另一方面，本文提供了杂交捕获试剂盒，其包括捕获探针和至少一种单链寡核苷酸封闭试剂，其中所述寡核苷酸封闭试剂的序列选自：Tn、(GT)p和(TA)q，其中n为15-18的整数，p为6-8的整数，q为6-8的整数。
在一些实施方案中，所述单链寡核苷酸封闭试剂为序列为Tn和(GT)p的单链寡核苷酸封闭试剂的组合。
在一些实施方案中，所述单链寡核苷酸封闭试剂包括一个或更多个锁核酸碱基或桥核酸碱基，优选5-8个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
在一些实施方案中，所述捕获探针为μCaler形式探针，所述μCaler形式探针包括靶特异性序列、位于所述靶特异性序列5’端的第一探针结合序列和位于所述靶特异性序列3’端的第二探针结合序列，所述第一探针结合序列至少部分地互补于所述第二探针结合序列，使得两个或更多个所述μCaler形式探针以相邻方式结合其各自的靶序列时，它们之间能够通过所述第一探针结合序列和所述第二探针结合序列形成互补结合。
在一些实施方案中，所述第一探针结合序列和第二探针结合序列的长度为8-30nt。
在一些实施方案中，所述靶特异性序列的长度为20-80nt。
在一些实施方案中，所述杂交捕获试剂盒还包括接头封闭试剂和Human Cot DNA。
本文提供的甲基化检测方法和试剂盒能够提高捕获的中靶率，提高测序深度，增强检测稳定性，并且适合于多样本的混合杂交检测。
附图说明
图1：甲基化文库的构建及靶向甲基化捕获文库的制备流程。
图2：比较传统靶向甲基化捕获测序和本申请甲基化捕获测序流程。
图3：比较传统杂交捕获方法与本申请杂交捕获方法的性能差异。
图4 ：不同样本检测到的甲基化水平。
图5：不同探针使用量情况下的CpG位点覆盖深度比较。
图6：不同组的CpG位点覆盖深度比较。
图7：不同组的CpG位点覆盖深度比较。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
“DNA分子”在本文中指脱氧核糖核酸，为脱氧核糖核苷酸的聚合物。其可为双链形式，也可为单链形式，或者对于DNA分子群体而言，其中可包括双链DNA分子，还可包括单链DNA分子。DNA分子可为任意长度，例如可为基因组DNA、DNA片段或细胞外游离DNA。游离DNA是指游离于细胞外或细胞核外的DNA，可以提取自多种体液、体外细胞培养液、自然环境等生物材料，包括但不限于：外周血、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、脑脊液、淋巴液等。游离DNA可以经过提取、纯化得到。“DNA片段”在本文中指较短的DNA分子，例如长度在50 bp至700bp之间，例如100 bp至500 bp，尤其是100 bp至350 bp。生物样品中包含的DNA片段通常是不均一的，即长度不等，相应地，上述长度可指这些DNA片段的长度均值。这些DNA片段可能具有不同的序列，例如来自同一生物体基因组的不同区域，或者甚至来自不同的生物体。DNA片段可以是带有单链切口的，也可以是平末端或非平齐末端(带有3’突出或5’突出)。
“DNA甲基化”在本文中指DNA分子或DNA片段中碱基被甲基化修饰，尤其是胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶(5mC)。脊椎动物中的DNA甲基化一般发生在CpG位点(即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)，经DNA甲基转移酶催化将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因组中大多CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的CpG岛则通常未被甲基化。CpG甲基化可影响相关基因的转录活性，例如，甲基化可抑制抑癌基因，而去甲基化则刺激某些癌基因的表达，这些情况下都有可能导致癌症发生。另外，尽管发生率低于5mC，也有少数胞嘧啶碱基被修饰为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基化(5fC)、5-羧基化(5caC)。本文中提到甲基化时，也可以指修饰为5hmC、5fC、5caC，除非上下文另有说明。
“胞嘧啶碱基甲基化状态”或 “DNA甲基化状态” ，在本文中指关于DNA分子或DNA片段中甲基化状况的信息，包括但不限于，甲基化位点、甲基化水平、甲基化方式(如5mC或5hmC)等。“甲基化水平”，也可称为“甲基化程度”，指样本中某一特定甲基化位点被甲基化修饰的比例(或频率)。可通过多种方式来检测一个位点是否被甲基化。常用方法包括化学或酶转化法，在转化过程中甲基化胞嘧啶和未甲基的胞嘧啶中的一种转化为尿嘧啶(U)或者在碱基配对方式上基本上等同于尿嘧啶的碱基(例如二氢尿嘧啶，DHU)。在随后的扩增过程中，对应的尿嘧啶作为胸腺嘧啶(T)与腺嘌呤(A)配对，最终结果是该甲基化位点的胞嘧啶或甲基化胞嘧啶在检测结果(如测序结果)中以胸腺嘧啶体现出来。通过与参考序列对比，就能够确定DNA分子或DNA片段中的胞嘧啶是否被甲基化。该参考序列可以为来自相同样品但不经上述转化的序列，或者健康群体中的对应序列。还可通过一些方法来对5mC和5hmC进行区分。目前，已经将DNA甲基化信息广泛用于癌症(例如，肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌等)筛查和诊断中，尤其是早期筛查和诊断。另外，对甲基化状态的鉴定也可以用于非诊断(或治疗)目的，例如用于科学研究，如分析影响甲基化的因素，甲基化对基因功能的影响，或者用于甲基化标准品的检测，等等。
“捕获探针”或“杂交捕获探针”在本文中指用于与转化后的靶DNA分子(或其片段)杂交的单链DNA片段。在本申请的优选实施方案中，捕获探针为μCaler形式的探针(关于μCaler探针的设计可参见中国专利公开CN116083423A或CN114891859A，在此通过引用将其全文并入本文)，这种探针包括靶特异性序列、位于所述靶特异性序列5’端的第一探针结合序列和位于所述靶特异性序列3’端的第二探针结合序列，第一探针结合序列至少部分地互补于第二探针结合序列，使得两个捕获探针或更多个捕获探针以相邻方式结合所述靶序列时，相邻的捕获探针之间能够通过所述第一探针结合序列和所述第二探针结合序列形成互补结合。在优选的实施方案中，第一探针结合序列和第二探针结合序列的长度为8-30nt；所述靶特异性序列的长度为20-80nt。相对于普通捕获探针(如下文实施例中提到的常规120碱基探针)，使用μCaler形式的探针的好处至少在于可显著提高探针与靶标结合能力，提高靶标区域的杂交捕获效率、提高整体的覆盖均一性以及稳定性。捕获探针通常可带有可分离标签，如生物素等，以便分离与探针结合的靶DNA分子。分离出的不同靶DNA分子(视情况可进行PCR扩增)可通过测序获得其序列信息，从而确定甲基化状态。
“DNA文库”在本文中指对样本DNA分子进行了末端修复和接头(如甲基化接头)连接而构成的文库。 视情况，可以在末端修复前进行DNA分子的片段化处理，以形成200-250bp的DNA片段。“甲基化文库”在本文中指经转化的DNA文库。 这里“转化”包括上文提到的化学或酶转化，其目的是区分甲基化和未甲基化胞嘧啶碱基。“靶向甲基化文库”在本文中指甲基化文库进一步经杂交捕获处理而获得的能够与所用的捕获探针结合的DNA分子集合。对靶向甲基化文库进行测序可以在降低测序成本情况下获得更高的测序深度、均一性等。
“单链寡核苷酸封闭试剂”、“甲基化封闭试剂(MeBlocker)”或“封闭试剂”在本文中指用于与转化后产生的重复序列特异性结合的单链寡核苷酸，其可防止捕获探针与这些重复度高的区域结合，从而改善杂交捕获效率。单链寡核苷酸封闭试剂可具有不同的核苷酸序列，它们可单独或组合使用。
本文提供了一种新型靶向甲基化文库杂交捕获的方法，其流程包含甲基化文库构建到靶向甲基化文库的制备，提供一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法。其中，该检测方法包括：甲基化文库的构建及新型靶向甲基化文库杂交捕获的步骤，新型靶向甲基化文库杂交捕获包括取甲基化文库加样，甲基化文库杂交，甲基化文库捕获，甲基化文库常温洗脱，靶向甲基化文库扩增和靶向甲基化文库纯化，纯化完成的靶向甲基化文库即为靶向甲基化测序文库。本申请方法不仅能够用于多种来源的核酸样本中单碱基甲基化状态的检测，而且缩短实验时间，简化实验流程，有效提高了单碱基甲基化状态的准确性。
在一些实施方案中，向杂交捕获体系中添加甲基化封闭试剂(MeBlocker)，提高转化后文库的杂交捕获效率。封闭试剂是由核酸序列组成，核酸序列能够与转化后的重复序列特异性结合。封闭试剂序列可包括5-7个LNA或者BNA修饰的碱基，这种修饰碱基可以提高序列与靶标的结合效率。一些高GC的区域转化后，变成AT rich的区域，探针会与这些重复度高的区域结合，捕获较多的非靶标区域。
在一些实施方案中，所述封闭试剂序列为连续T碱基，T碱基长度为15-18个；或者是重复GT序列，重复数量6-8个；或者是重复TA碱基，重复数量为6-8个。封闭试剂序列可包括5-7个LNA或者BNA修饰碱基。
在一些实施方案中，在杂交捕获系统对于捕获探针的使用方案做了优化，甲基化探针终浓度为1-2fmol，最优浓度为1fmol。
在一些实施方案中，所述杂交体系中包含捕获探针、1× Hyb Buffer、1×Enhance、1ug Human Cot-1，以及100pmmol的Blocker封闭接头序列以及100um的MeBlocker。
与焦磷酸测序相比，焦磷酸测序由于针对于BS转化后序列(序列复杂度低，重复碱基多)进行引物设计，其设计较难。本方法针对于小Panel (＜10kb)进行设计，可针对于不同基因的启动子区域包含的甲基化位点进行设计，因此所检测的甲基化位点数量多，通量高，且甲基化水平准确性高。
与传统靶向甲基化杂交捕获测序相比，本检测方法优化了实验流程，缩短了实验时间，可在4h内完成靶向甲基化杂交捕获操作，系统流程时长缩短了14~15h，且可在一日内靶向甲基化杂交捕获文库的构建。本申请检测方法流程包含甲基化文库构建到靶向甲基化捕获文库的制备。
甲基化文库的构建及靶向甲基化捕获文库的制备流程参见图1。本流程适用于基因组DNA、血浆游离DNA或FFPE样本的甲基化文库构建。现对该流程简述如下：
甲基化文库的构建：基因组DNA使用超声打断的方式，打断至200-250bp的DNA片段；对基因组DNA、血浆游离DNA或FFPE样本进行末端修复、甲基化接头连接，接头连接产物的转化，使用重亚硫酸氢盐转化模块对接头连接产物进行转化，使用能够识别U碱基的扩增酶(如KAPA HiFi HotStart Uracil Mix)进行PCR扩增，Qubit定量试剂对甲基化文库进行定量。
靶向甲基化捕获文库的制备：选择符合要求的甲基化文库，进行杂交、链霉亲和素磁珠捕获和洗脱步骤，洗脱完毕进行PCR扩增，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送Illumina Nova-Seq测序仪进行测序。与传统的靶向甲基化杂交捕获测序相比，本申请方法优化了实验流程，缩短了实验时间。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：
使用本申请检测方法，并设计常规120碱基探针进行靶向甲基化杂交捕获，比较不同检测方法的优劣(实验过程参见图2)。
(1) 甲基化文库的构建
基因组DNA使用超声打断的方式，打断至200-250bp的DNA片段；取50ng打断后的样本，使用NadPrep®甲基化文库构建试剂盒(for Illumina) #1002141构建甲基化文库。对打断后的基因组DNA进行末端修复&加A、甲基化接头连接，接头连接产物的转化。该连接产物作为以下实施例中的DNA文库进行转化，转化产物进行PCR扩增，PCR扩增循环数均为11，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送Illumina Nova-Seq测序仪进行全基因组测序。
(2) 甲基化文库质检
确保转化效率达到标准，进行靶向甲基化杂交捕获和本申请检测方法。
(3) 传统靶向甲基化杂交捕获
使用NadPrep®Hybrid Capture Reagents#1005102进行杂交捕获，取500ng构建的甲基化文库，操作步骤依次是甲基化文库真空浓缩，杂交，链霉亲和素磁珠捕获与文库洗脱，洗脱完毕进行PCR扩增，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送IlluminaNova-Seq测序仪进行测序，常规120碱基探针设计参照中国专利公开CN114891859A《一种液相杂交捕获方法及其试剂盒》进行。
(4) 本申请检测方法
取500ng构建的甲基化文库，操作步骤依次是甲基化文库杂交， 链霉亲和素磁珠捕获与文库洗脱，洗脱完毕进行PCR扩增，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送IlluminaNova-Seq测序仪进行测序，μCaler捕获探针设计参照中国专利公开CN114891859A《一种液相杂交捕获方法及其试剂盒》进行。Human Cot DNA应用于封闭人类基因组中的重复序列；μCaler® NanoBlockers (for Illumina®)用于封闭接头序列，不同测序平台(主要分Illumina或者MGI平台)的接头序列会有调整，本文仅展示Illumina平台的测试表现。使用μCaler Methylation® Panel甲基化杂交捕获探针，与转化后的靶标序列结合，链霉亲和素磁珠与探针的生物素结合，抓捕靶标。MeBlocker用于封闭转化后的串联重复序列；μHyb#1以及μHyb#2为杂交捕获缓冲液，提供最适杂交捕获条件。
以下为该具体实验流程：
(a)文库杂交(组分参见表1)
表1 文库杂交组分
。
* 包括MeBlockerA：TTT+TTT+TTT+TTT+TT+TT (SEQ ID NO：1)；和MeBlockerB：GTG+TGT+GT+GT+GTGT (+代表其后碱基为LNA修饰碱基) (SEQ ID NO: 2)。MeBlockerA和MeBlockerB封闭试剂工作液浓度均为100μM。
涡旋混匀杂交反应混合液 10 sec 以上，瞬时离心后，将反应混合液收集至 PCR管底部 (避免产生气泡)。将 PCR 管放进 PCR 仪中，按照表2启动反应程序。
表2 杂交程序
。
(b) 磁珠清洗
将Streptavidin Beads涡旋15 sec，确保完全混匀。
取n×25 μL Streptavidin Beads于0.2 mL离心管中混合清洗(n为总捕获反应数，且n ≤ 5)。将Streptavidin Beads置于磁力架上静置约2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
将离心管从磁力架上移出，加入150 μL预热的Wash buffer 1 (5×SSPE、1%SDS)，轻柔吹吸混匀10 次以上。
将离心管置于磁力架上静置约2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
将离心管从磁力架上移出，加入150 μL预热的Wash buffer 1，轻柔吹吸混匀10次以上。
将离心管置于磁力架上静置约2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
将离心管瞬时离心后置于磁力架上静置10 sec，用10 μL吸头将管底部的Washbuffer 1全部弃除。
取n×8 μL μHyb #1重悬Streptavidin Beads，轻柔吹洗混匀10次以上。
(c) 磁珠捕获
2 hr杂交反应后，进入捕获环节，维持PCR仪运行状态。
保持PCR管放置在PCR仪中的状态下，取8 μL 重悬的Streptavidin Beads立即加入各杂交反应液中，轻柔吹吸混匀10次以上。
60 ℃孵育10 min。
孵育结束后从PCR仪上取下PCR管置于磁力架上静置2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清 (尽量将上清去除干净)。
(d) 洗脱
将上一步PCR管从磁力架上移出，加入150 μL预热的Wash Buffer 1，轻柔吹吸混匀10次以上 (避免产生气泡)。
将PCR管置于磁力架上静置2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
加入Wash Buffer 2 (2×SSPE、0.1% SDS)，轻柔吹吸混匀10次以上(室温操作，避免产生气泡)。将反应液转移至新的PCR管中。
将PCR管放进PCR仪中，61 ℃孵育15 min。
孵育结束后从PCR仪上取下PCR管置于磁力架上静置2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
将PCR管从磁力架上移出，加入150 μL预热的Wash Buffer 1，轻柔吹吸混匀10次以上 (避免产生气泡)。
将PCR管放进PCR仪中，61℃ 孵育3 min。
孵育结束后从PCR仪上取下PCR管置于磁力架上静置2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
向PCR管中加入150 μL室温放置的Wash Buffer 3 (0.1×SSPE、0.01% SDS)，轻柔吹吸混匀10次以上。
将PCR管置于磁力架上静置2 min，待液体完全澄清，使用移液器弃上清。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上，使用10 µL吸头移去少量残留液体，注意勿吸到磁珠。
加入22.5 μL Nuclease Free Water，轻柔吹洗10次以上重悬磁珠。
(e) 杂交捕获文库PCR扩增
取出NadPrep® 2X HiFi PCR Master Mix与NadPrep® Amplification PrimerMix Ⅱ置于冰上自然融解， 使用移液器或涡旋混匀仪混合混匀，瞬时离心备用。
按照表3配置PCR反应体系，将配置好的PCR反应体系加入步骤(d)含有磁珠的PCR反应管中。
表3 PCR反应体系
。
将PCR管放入PCR仪中按表4启动扩增程序，热盖温度设定为105 ℃。
表4 PCR程序
。
(f) 扩增文库纯化
向扩增反应产物PCR管中加入50 µL的NadPrep® SP Beads，使用移液器或涡旋混匀仪混合均匀，室温孵育10 min。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上静置5 min，待液体完全澄清后，使用移液器吸取移弃上清。
沿PCR管侧壁缓慢加入150 µL 80%乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30 sec，使用移液器吸取移弃上清。
沿PCR管侧壁缓慢加入150 µL 80%乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30 sec，使用移液器吸取移弃上清。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上，使用10 µL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠；
打开PCR管管盖，并于室温静置约2-5 min，至乙醇挥发完全。
将PCR管从磁力架上移出，加入20 μL TE Solution，使用移液器或涡旋混匀仪将磁珠悬浮均匀，室温孵育5 min。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上2 min，待液体完全澄清后，使用移液器小心将上清转移至一个新的0.2 mL PCR管或1.5 mL离心管中进行保存，注意勿吸到磁珠。
结果: 实验结果参见图3，采用本申请检测方法，不仅优化了实验流程，节省了实验时间成本，还能够提高靶向甲基化捕获文库中靶率，原始深度以及去重后的深度，同时Fold 80远小于常规120nt探针数据。
实施例2：
使用本申请检测方法，与焦磷酸测序比较对甲基化水平检测的准确性
构建甲基化文库，文库构建步骤参见实施例1，将100％Human Methylated DNA与Non-Methylated DNA的两个标准品按照一定的比例混合，准备甲基化水平分别为0%、2%、10%、50%以及100%的样本，分别取50ng不同甲基化水平的样本使用本申请实验方案检测靶区域CpG位点的甲基化水平，取50ng样本不同甲基化水平的样本交于上海捷兰生物科技有限公司用于焦磷酸测序，每个样本做3个重复，样本信息见表5。
表5 配制的样本信息
。
(1) 杂交捕获以及焦磷酸测序覆盖的靶标序列信息参见表6：
表6 所覆盖的靶标序列信息
。
(2) 甲基化文库质检
参见实施例1。
(3) 磁珠清洗
参见实施例1。
(4) 洗脱
参见实施例1。
(5) 杂交捕获文库PCR扩增
参见实施例1。
(6) 扩增文库纯化
参见实施例1。
结论：结果如图4所示。从图中可知，新型杂交捕获测序较焦磷酸测序检测数据更接近样本的理论甲基化水平。对于甲基化水平低于10%的样本，焦磷酸测序检测结果偏离理论值。本申请的甲基化检测方案适用于0-100%水平样本的检测。
实施例3：
在液相杂交捕获中，探针浓度是影响捕获效果的重要因素之一。当探针浓度较低时，可能会导致探针与目标序列结合的机会减少，从而影响捕获效果。在液相杂交中，适当的探针浓度可以提高特异性和灵敏度，但过高的浓度可能会导致非特异性结合和背景信号的增加。因此，在选择探针浓度时需要权衡捕获效果和背景信号的平衡。通常，通过实验优化探针浓度，以获得最佳的捕获效果。
(1) 甲基化文库的构建
参照实施例1。
(2) 靶向甲基化文库构建
使用本申请靶向甲基化文库构建方式进行杂交捕获，取500ng构建的甲基化文库，操作步骤依次是甲基化文库杂交，链霉亲和素磁珠捕获与文库洗脱，洗脱完毕进行 PCR 扩增，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送 Illumina Nova-Seq 测序仪进行测序，demoPanel 的处理见表7。以下为该实验具体流程：
表7 分组信息
。
(a)文库杂交
参照实施例1。
(b) 磁珠清洗
参照实施例1。
(c) 磁珠捕获
参照实施例1。
(d) 洗脱
参照实施例1。
(e) 杂交捕获文库 PCR 扩增
参照实施例1。
(f) 扩增文库纯化
参照实施例1。
(3) 结论：如表8所示，本申请靶向甲基化检测方法中探针的最佳用量应为 1fmol/rxn。在测试的几种条件中，基本 QC 数据的比较无差异，中靶率全部都达到 40% 以上，与参考基因组的对比率(Mappability)高达 98%，且1 fmol/rxn 的探针用量下 CpG 位点的探针覆盖深度更高(图5)。所以本申请靶向甲基化测序的探针用量推荐为 1 fmol/rxn每条探针。
表8 探针用量实验结果
。
实施例4：
本申请杂交捕获系统针对转化后的文库进行捕获，转化方式包括重亚硫酸氢盐(BS)转化方式或者EM转化方式，无论使用哪种转化方式，转化后的序列复杂度大大降低。一些高GC的区域转化后，变成AT rich的区域，还有一些区域会出现连续的碱基T，杂交捕获的探针具有一定的容错性，探针与靶标序列的同源性＞60%即可将靶标捕获下来，这是液相杂交捕获技术的优势。针对转化后的文库，探针会与这些重复度高的区域结合，捕获较多的非靶标区域，导致脱靶的比例升高。杂交捕获体系中添加封闭试剂，提高转化后文库的杂交捕获效率。所述封闭试剂序列为连续T碱基，T碱基长度为15-18个；或者是重复GT序列，重复数量6-8个；或者是重复TA碱基，重复数量为6-8个。序列含有4-7个LNA(锁核酸)或者BNA(桥核酸)修饰碱基。这种修饰碱基可以提高序列与靶标的结合效率。本实施例使用的封闭序列为MeBlockerA：TTT+TTT+TTT+TTT+TT+TT；MeBlockerB：GTG+TGT+GT+GT+GTGT (+代表其后碱基为LNA修饰碱基)。封闭试剂工作液浓度为100μM。本实施例中加入或者是不加入封闭序列比较杂交捕获系统的稳定性，所述封闭序列为MeBlockerA与MeBlockerB等比例混合，单种封闭序列在体系中的终浓度为100μM。
(1)甲基化文库的构建
参照实施例1。
(2)靶向甲基化文库构建
参照实施例1。
在本实施例中，demo panel 为自主研发设计的包含 620 多个 CpG 位点的杂交探针，大小为 5.8 kb。
在本实施例中，一些分组中使用Me-Blocker (见表9)。以下为该实验的具体流程：
表9 实验分组
。
* N 指未使用Me-Blocker
(a) 文库杂交
参照实施例1。
(b) 磁珠清洗
参照实施例1。
(c) 磁珠捕获
参照实施例1。
(d) 洗脱
参照实施例1。
(e) 杂交捕获文库 PCR 扩增
参照实施例1。
(f) 扩增文库纯化
参照实施例1。
(3) 结论：如表10所示，本申请靶向甲基化检测方法中，添加 Me-Blocker 能够提高捕获的中靶率，提高测序深度，且稳定性也一并增强。在测试的 2 组条件中，基本 QC 数据的比较无差异，全基因组的数据对比率达到 99%，Fold 80 (表示平均深度/80%以上区域被覆盖的深度。Fold 80 越大，均一性越差，一般2以内均一性较好)在 1.4 左右。中靶率方面，添加 Me-Blocker 的实验组中靶率比对照组高出约 5%，并且其 CpG 位点的探针覆盖深度更高(图6)。所以本申请靶向甲基化测序实验中会通过添加 Me-Blocker提升系统的稳定性。
表10 添加Me-Blocker实验结果
。
实施例5
液相杂交捕获中多样本混合杂交(Multiplexed Hybridization)是指将多个样本同时进行杂交捕获的一种策略。它具有以下几个特点：节约成本和时间、减少技术差异、提高数据可比性等。本申请靶向甲基化检测方法，能够同时满足 6 个样本的混合杂交(杂交投入量为6*500 ng)，数据稳定可靠。
(1) 甲基化文库的构建
参照实施例1。
(2) 靶向甲基化文库构建
参照实施例1。
在本实施例中，实验分组信息见表11。以下为该实验的具体流程：
表11 实验分组
。
(a) 文库杂交
参照实施例1。
(b) 磁珠清洗
参照实施例1。
(c) 磁珠捕获
参照实施例1。
(d) 洗脱
参照实施例1。
(e) 杂交捕获文库 PCR 扩增
参照实施例1。
(f) 扩增文库纯化
参照实施例1。
(3) 结论：如表12所示，本申请靶向甲基化检测方法对6个独立样本的混杂有着良好的表现。6个独立样本在两种杂交方式下，QC 数据的比较基本无差异；6个单杂样本中，出现两例中靶率在 40%，其余的在 50% 以上，出现轻微技术差异，而在混杂测试中所有的样本都能达到 50% 以上的中靶率；且与参考基因组的对比率以及 CpG 位点的探针覆盖深度，两种杂交方式结果高度一致(图7)。所以本申请靶向甲基化测序系统同时适用于单样本以及多样本混合杂交。
表12 单杂和混杂实验结果
本文提供的一种能够识别单碱基甲基化状态的检测方法优点包括但不限于：
1. 所需的时间短。例如，常规靶向甲基化文库的制备需要2-3天，而本检测方法在一天内就可完成靶向文库制备，大大节约了时间成本。同时，本检测方法提高了靶向甲基化捕获文库中靶率，原始深度以及去重后的深度，同时Fold 80远小于常规120nt探针数据。
2. 对甲基化水平检测的准确性高，与“金标准”焦磷酸测序进行对比，该检测方法更接近标准品及配置样品的理论甲基化水平。
3. 本方法添加MeBlocker能够封闭转化后的重复序列提高靶标的捕获效率，保证该系统对于小Panel的捕获性能更加稳定。
4. 本方法适用于单样本或者多样本混合杂交，多样本混合杂交的数据表现与但样本的结果一致性较高。使用本系统做临床上的队列研究，可以采用多样本混合杂交的方案。

Claims (11)

1.检测样品中DNA分子的甲基化状态的方法，包括：
1) 利用所述样品中DNA分子构建DNA文库，经转化后获得甲基化文库；
2) 对所述甲基化文库进行杂交捕获，以构建靶向甲基化文库；以及
3) 对所述靶向甲基化文库进行测序，并与未经转化的所述DNA分子的碱基序列进行比较，以确定所述DNA分子的甲基化状态，
其中所述杂交捕获在包括至少一种单链寡核苷酸封闭试剂的杂交体系中进行，所述至少一种单链寡核苷酸封闭试剂为序列为Tn和(GT)p的单链寡核苷酸封闭试剂的组合，其中n为15-18的整数，p为6-8的整数，
所述杂交捕获采用μCaler形式的捕获探针进行，所述μCaler形式的捕获探针包括靶特异性序列、位于所述靶特异性序列5’端的第一探针结合序列和位于所述靶特异性序列3’端的第二探针结合序列，所述第一探针结合序列至少部分地互补于所述第二探针结合序列，使得两个或更多个所述μCaler形式的捕获探针以相邻方式结合其各自的靶序列时，它们之间能够通过所述第一探针结合序列和所述第二探针结合序列形成互补结合，所述第一探针结合序列和第二探针结合序列的长度为8-30nt，所述靶特异性序列的长度为20-80nt。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单链寡核苷酸封闭试剂包括一个或更多个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述单链寡核苷酸封闭试剂包括4-7个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
4.如权利要求1所述的方法，其中每种所述单链寡核苷酸封闭试剂在所述杂交体系中的浓度为100μM。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述捕获探针在所述杂交体系中的用量为1 fmol/rxn。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述杂交体系还添加有接头封闭试剂和Human CotDNA。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA分子来自基因组DNA、血浆游离DNA或FFPE样本。
8.杂交捕获试剂盒，包括捕获探针和至少一种单链寡核苷酸封闭试剂，其中所述至少一种单链寡核苷酸封闭试剂为序列为Tn和(GT)p的单链寡核苷酸封闭试剂的组合，其中n为15-18的整数，p为6-8的整数；所述捕获探针为μCaler形式探针，所述μCaler形式探针包括靶特异性序列、位于所述靶特异性序列5’端的第一探针结合序列和位于所述靶特异性序列3’端的第二探针结合序列，所述第一探针结合序列至少部分地互补于所述第二探针结合序列，使得两个或更多个所述μCaler形式探针以相邻方式结合其各自的靶序列时，它们之间能够通过所述第一探针结合序列和所述第二探针结合序列形成互补结合，所述第一探针结合序列和第二探针结合序列的长度为8-30nt，所述靶特异性序列的长度为20-80nt。
9.如权利要求8所述的杂交捕获试剂盒，其中所述单链寡核苷酸封闭试剂包括一个或更多个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
10.如权利要求9所述的杂交捕获试剂盒，其中所述单链寡核苷酸封闭试剂包括4-7个锁核酸碱基或桥核酸碱基。
11. 如权利要求8所述的杂交捕获试剂盒，还包括接头封闭试剂和Human Cot DNA。
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