CN117295756A

CN117295756A - 一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用

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Publication number: CN117295756A
Application number: CN202280035290.6A
Authority: CN
Inventors: 谢良志; 孙春昀; 张延静
Original assignee: Sinocelltech Ltd
Current assignee: Sinocelltech Ltd
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2023-12-26
Also published as: WO2023001259A1

Abstract

一种可诱导广谱中和活性的重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗。重组蛋白成分包含但不限于B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株刺突蛋白(S蛋白)的胞外结构域(ECD)通过引入突变位点和三聚化辅助结构形成的同源三聚体蛋白。多价疫苗包含上述变异株的单一成分或任意组合成分的ECD三聚体蛋白以及药学上可接受的佐剂。该疫苗组合在小鼠显示出优异的免疫原性，可维持长时程的体液免疫和细胞免疫反应。所述多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗可用于预防由新冠病毒及其变异株感染引发的感染相关疾病。

Description

一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年07月23日提交的中国专利申请202110838359.6的权益，该申请的内容通过引用被合并于本文。

技术领域

本发明涉及分子疫苗学领域，涉及一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有较强的传播能力，安全有效的疫苗是控制疫情的最有力的技术手段。根据靶点和技术的不同，疫苗可以被分为以下几类：灭活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、RNA疫苗、减毒活疫苗和病毒样颗粒疫苗等。自SARS-CoV-2大流行以来，各国研制的新冠疫苗已达200多个。截止到2021年7月18日，16种疫苗已被批准使用或附条件使用，另外已有92种疫苗进入临床研究(https://www.covid-19vaccinetracker.org/#protein-subunit)。

SARS-CoV-2和SARS-CoV具有共同的宿主细胞受体蛋白，即血管紧张素转化酶2(ACE2)(Zhou,P.,et al.,Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin.BioRxiv,2020.)。病毒的三聚体刺突蛋白(Spike)同ACE2受体结合后被宿主蛋白酶切割为包含受体结合域(Receptor binding domain,RBD)的S1多肽和负责介导病毒同细胞膜融合的S2多肽(Hoffmann,M.,et al.,SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.Cell,2020.)。S蛋白是病毒包膜的主要成分，在受体结合，融合，病毒进入和宿主免疫防御方面具有重要的作用。S蛋白的RBD区含有主要的中和抗体表位，可刺激B细胞产生针对RBD的高滴度中和抗体。此外，S蛋白还含有丰富的T细胞表位，可诱导T细胞发生特异性CTL反应，清除病毒感染的细胞。因此，S蛋白是新冠疫苗设计的最关键抗原。目前设计的绝大多数疫苗都选择了S蛋白或RBD结构域蛋白作为核心免疫原。

SARS-CoV-2为RNA单链病毒，易发生缺失突变且这种突变多发生在S蛋白的重复缺失区(Recurrent deletion regions,RDRs)。缺失或突变可能改变S蛋白的构象，使得先前疫苗免疫诱导的抗体降低对突变S蛋白的结合和中和而导致疫苗免疫效果的下降和病毒的免疫逃逸。早期的D614G突变(B.1)增强了S蛋白同ACE2受体的亲和力，并迅速成为了流行株，但该突变未降低对中和抗体的敏感性(Korber,B.,et al.,Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2.bioRxiv,2020:p.2020.04.29.069054；Korber,B.,et al.,Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike:Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19Virus.Cell,2020.182(4):p.812-827.e19.)。然而，随着SARS-CoV-2的大流行，全球出现了4种高关注变异株(Variants of Concern,VOC)：Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)和Delta(B.1.617.2)以及多种需留意变异株(Variants of Interest,VOI)：Eta(B.1.525)、Iota(B.1.526)、Kappa(B.1.617.1)和Lambda(C.37)。研究表明这些高风险毒株可增加传播性、加重疾病发展(增加住院治疗或死亡率)、严重降低既往感染或免疫接种所产生的抗体中和作用、降低治疗或疫苗效用降低或使诊断检测失效(https:// www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.h tml)。Alpha(B.1.1.7)传播迅速，且可增加61％相关死亡风险(Davies,N.G.,et al.,Increased mortality in community-tested cases of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7.Nature,2021.)。中和效应研究结果表明，康复者血浆或疫苗免疫者血清对Alpha(B.1.1.7)株的中和能力基本保持不变，然而对Beta(B.1.351)株的中和能力却大幅下降(Cele,S.,et al.,Escape of SARS-CoV-2 501Y.V2 from neutralization by convalescent plasma.2021.；Zhou,D.,et al.,Evidence of escape of SARS-CoV-2 variant B.1.351 from natural and vaccine-induced sera.Cell,2021.；Tada,T.，2021. https://doi.org/10.1101/2021.02.05.430003；Wang,P.,et al.,Increased Resistance of SARS-CoV-2 Variants B.1.351 and B.1.1.7 to Antibody Neutralization.bioRxiv,2021.；Wadman,M.and J.Cohen,2021.https://doi.org/10.1136/bmj.n296；Wu,K.,et al.,mRNA-1273 vaccine induces neutralizing antibodies against spike mutants from global SARS-CoV-2 variants.2021.)。临床结果也表明，Alpha(B.1.1.7)株对疫苗的保护效果影响不大，而Beta(B.1.351)株则会大幅降低对轻症的保护效果(Madhi,S.A.,et al.,Efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 Covid-19 Vaccine against the B.1.351 Variant.2021.；Shinde,V.,et al.,Efficacy of NVX-CoV2373 Covid-19 Vaccine against the B.1.351 Variant.New England Journal of Medicine,2021.；Abu-Raddad,L.J.,H.Chemaitelly,and A.A.Butt,Effectiveness of the BNT162b2 Covid-19 Vaccine against the B.1.1.7 and B.1.351 Variants.2021.；Karim,S.S.A.,Vaccines and SARS-CoV-2 variants:the urgent need for a correlate of protection.Lancet,2021.397(10281):p.1263-1264.)。相比原始病毒和早期变异毒株，Delta(B.1.617.2)株变异的传播力更强，潜伏期短，发病进程快，目前已经传至90多个国家或地区，已成为全球流行毒株。以色列卫生部的一项初步研究表明，Delta不仅传播能力强，还能严重削弱疫苗的作用，BioNTech&辉瑞mRNA疫苗的完全接种者预防Delta变异毒株的有效率从94％降至64％。目前的疫苗均是基于早期流行株(基因组序列：GenBank Accession No.NC_045512)序列进行的设计，鉴于变异株的高传播性和对现有疫苗保护效果的不利影响，迫切需求对高风险变异株具有广谱性，高保护效果的第二代疫苗。

发明内容

基于以上对于新型冠状病毒SARS-CoV-2变异株具有高保护效果的疫苗的需求，本发明提供一种提高SARS-CoV-2突变毒株ECD抗原免疫原性/抗原三聚体稳定性的方法，该方法通过构建包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12所示的氨基酸序列或其免疫原性片段和/或免疫原性变体的ECD抗原，从而使得ECD为稳定的prefusion构象的三聚体形式。

在一个实施方式中，所述突变毒株为含有K417N、K417T、L452R、T478K、E484K、E484Q、N501Y、D614G、P681R之至少任一的高风险突变毒株。

在一个实施方式中，所述毒株包含B.1毒株、B.1.351毒株、B.1.1.7毒株、P.1毒株、B.1.427毒株、B.1.429毒株、B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株中的至少一种。

在一个实施方式中，其中ECD抗原和选自以下的一种或多种佐剂共同施予受试者：铝佐剂、油乳佐剂、Toll样受体(TLR)激动剂、免疫增强剂的组合、微生物类佐剂、蜂胶佐剂、左旋咪唑佐剂、脂质体佐剂、中药佐剂及小肽类佐剂；优选地，油乳佐剂包含角鲨烯成分；Toll样受体(TLR)激动剂包含吸附在铝盐上的CpG或单磷酰脂质A(MPL)；和免疫增强剂的组合，包含QS-21和/或MPL。

本发明还提供一种提高SARS-CoV-2高风险突变毒株ECD抗原免疫原性/抗原三聚体稳定性的方法，该方法通过构建编码包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12之所示的至少任一氨基酸序列或其免疫原性片段和/或免疫原性变体的多核苷酸，从而表达稳定的prefusion构象的三聚体形式ECD。

在一个实施方式中，所述突变毒株包含B.1毒株、B.1.351毒株、B.1.1.7毒株、P.1毒株、B.1.427毒株、B.1.429毒株、B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株中的至少一种。

本发明提供一种免疫原性/抗原三聚体稳定性提高的SARS-CoV-2突变毒株ECD免疫原性蛋白/肽，所述免疫原性蛋白/肽包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12所示的至少之任一的氨基酸序列,或其免疫原性片段和/或免疫原性变体，该ECD免疫原性蛋白/肽为稳定的prefusion构象的三聚体形式。

本发明还提供编码如上所述的免疫原性/抗原三聚体稳定性提高的SARS-CoV-2突变毒株ECD免疫原性蛋白/肽的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸包含SEQ ID No:7或SEQ ID No:11所示的的核苷酸序列。

本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含a.至少一种如上所述的免疫原性蛋白/肽或其免疫原性片段和/或免疫原性变体，或至少一种编码如上所述的免疫原性/抗原三聚体稳定性提高的免疫原性蛋白/肽的多核苷酸，和

b.药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合；

任选地，所述免疫原性组合物包含c.佐剂。

进一步地，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含选自a)、b)或c)的任一组的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体，

a.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20和SEQ ID No:8所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体；

b.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20和SEQ ID No:12所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体；或

c.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20、SEQ ID No:8和SEQ ID No:12所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体。

更进一步地，所述佐剂为选自以下的一种或多种：铝佐剂、油乳佐剂、Toll样受体(TLR)激动剂、免疫增强剂的组合、微生物类佐剂、蜂胶佐剂、左旋咪唑佐剂、脂质体佐剂、中药佐剂及小肽类佐剂；

优选地，油乳佐剂包含角鲨烯成分；Toll样受体(TLR)激动剂包含吸附在铝盐上的CpG或单磷酰脂质A(MPL)；和免疫增强剂的组合包含QS-21和/或MPL。

本发明还提供了将如上所述的免疫原性蛋白/肽、编码如上所述免疫原性蛋白/肽的多核苷酸和/或包含如上所述的免疫原性蛋白/肽或编码所述免疫原性蛋白/肽的多核苷酸的免疫原性组合物应用于预防或治疗SARS-CoV-2突变毒株引起的疾病的用途。

同时，本发明还提供了将如上所述的免疫原性蛋白/肽、编码如上所述免疫原性蛋白/肽的多核苷酸和/或包含如上所述的免疫原性蛋白/肽或编码所述免疫原性蛋白/肽的多核苷酸的免疫原性组合物应用于制备预防或治疗SARS-CoV-2突变毒株引起的疾病的疫苗或药物中的用途。

附图说明

图1为经过改造的S-ECD的一级结构(A)及高级结构(B，参考PDB:6XLR)的示意图。

图2为SCTV01C-TM28三聚体纯度分析，其中(A)非还原SDS-PAGE代表性图谱；(B) SEC-HPLC代表性图谱。

图3示出了SCTV01C-TM27、SCTV01C-TM28单价以及多价疫苗免疫C57BL/6小鼠后血清抗体效价检测(GeoMean±SD)。

图4示出了SCTV01C-TM27、SCTV01C-TM28单价以及多价疫苗免疫C57BL/6小鼠后血清中和效价检测(GeoMean±SD)。

具体实施方式

定义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，进一步定义以下术语。

当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。

术语“包括”、“包含”是指包括具体成分而不排除任何其他的成分。诸如“基本上由……组成”允许包括不损害本发明的新颖或基本特征的其他成分或步骤，即，它们排除损害本发明的新颖或基本的特征的其他未列举的成分或步骤。术语“由……组成”是指包括具体成分或成分组并且排除所有其他成分。

术语“抗原”是指一种由抗体或T细胞受体所识别(特异性结合)的外源物质，但是其不能确定性地诱导免疫应答。诱导特异性免疫的外源性物质称为“免疫性抗原”或“免疫原”。“半抗原”是指一种本身不能引发免疫应答(尽管几个分子半抗原的结合物，或半抗原与大分子载体的结合物可引发免疫应答)的抗原。

“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答并且涉及引入和生成以一定亲和力识别和结合本发明的免疫原性组合物中的抗原的抗体，“细胞介导的免疫应答”是由T细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是通过提供与主要组织相容性复合物(MHC)的I类或II类分子、CD1或其他非典型MHC样分子相关的抗原表位而诱发的。

术语“免疫原性组合物”是指含有抗原如微生物或其组分的任何药物组合物，该组合物可用于在个体中诱发免疫应答。

如本文所使用的“免疫原性”意指抗原(或抗原的表位)例如冠状病毒棘突蛋白受体结合区或免疫原性组合物在宿主(例如哺乳动物)中诱发体液或细胞介导的免疫应答或二者的能力。

“保护性”免疫应答是指免疫原性组合物诱发用于保护个体免于感染的体液或细胞介导的免疫应答或两者的能力。所提供的保护不必是绝对的，即，不必完全阻止或根除感染，只要相对于对照个体群体(例如未给药疫苗或免疫原性组合物的受感染动物)存在统计学上显著的改进即可。保护可限于缓和感染症状的严重性或发作快速性。

“免疫原性量”和“免疫有效量”二者在本文可交换使用，是指抗原或免疫原性组合物足以引发免疫应答(细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答或二者，如通过本领域技术人员已知的标准测定所测量的)的量。

抗原作为免疫原的有效性可通过例如增殖测定、通过细胞溶解测定、或通过测量B细胞活性水平来测量。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，诸如含有经修饰的骨架的那些。应当理解，本发明提供了包含与本文所述序列互补的序列的多核苷酸。本发明中考虑的“多核苷酸”包括正向链(5'至3')和反向互补链(3'至5')。根据本发明的多核苷酸可以以不同方式(例如通过化学合成，通过基因克隆等)制备，并且可采取各种形式(例如直链或支链的，单链或双链的，或其杂合体，引物，探针等)。

术语“免疫原性蛋白/肽”包括在一旦向宿主施用，其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上，具有免疫活性的多肽。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。

术语“免疫原性蛋白/肽”还涵盖了对序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫反应的作用即可，即“免疫原性变体”。

本发明提供的SCTV01C重组蛋白疫苗，是基于SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域(ECD，含S1和S2部分)改造而来。已知的SARS-CoV-2的天然刺突蛋白为三聚体结构，在其产生和行使侵染功能的过程中，膜融合过程的完成是通过S1和S2间存在的RRAR位点而易被高尔基体中以及细胞表面的蛋白酶切开，随后发生S1的脱落，进一步地S2结构由prefusion构象转变为postfusion构象，从而完成膜融合(Cai,Y.,J.Zhang,and T.Xiao,Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.2020.369(6511):p.1586-1592.)。

为了获得稳定的prefusion构象的ECD三聚体，本发明在不同毒株变体的S蛋白基础上，进行了如下三部分改造(见表1)：

1)目前发现，具有较高中和活性的抗体都结合于S1区域(具体来说结合于S1中的NTD和RBD区域)。保持S1部分的完整，对于新冠疫苗诱导中和抗体的产生至关重要。本发明在SCTV01C重组蛋白疫苗中改造去除了Furin位点，即将679至688位的氨基酸序列固定为NSPGSASSVA，以降低S1断裂与脱落的可能性。

2)由于S2自身的变构倾向，使得刺突蛋白的prefusion构象不稳定，而有效地诱发中和抗体需要保持prefusion构象稳定，这在RSV和HIV-1疫苗研究中已经被证实(McLellan, J.S.,et al.,Structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus.Science,2013.342(6158):p.592-8.；Frey,G.,et al.,Distinct conformational states of HIV-1 gp41 are recognized by neutralizing and non-neutralizing antibodies.Nat Struct Mol Biol,2010.17(12):p.1486-91.)。当前的上市疫苗中，普遍采用了S-2P(即将986和987位氨基酸突变为脯氨酸)改造方案(Tian,J.H.,et al.,SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 immunogenicity in baboons and protection in mice.2021.12(1):p.372.；Mercado,N.B.,et al.,Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques.2020.586(7830):p.583-588.；Corbett,K.S.,et al.,SARS-CoV-2 mRNA Vaccine Development Enabled by Prototype Pathogen Preparedness.bioRxiv,2020.)。此外，本发明还引入了能有效提升稳定性且不影响其三维结构的HexaPro突变(即除了S-2P突变外，又将817，892，899和942位氨基酸突变为脯氨酸)(Hsieh,C.L.,et al.,Structure-based Design of Prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spikes.bioRxiv,2020.)。这些突变位点都位于S2中的α-螺旋N端或Loop区，突变为具有该二级结构倾向的脯氨酸(P)类型后，可以有效的降低S2的变构倾向从而稳定S2的prefusion构象。

3)最后，为了进一步稳定S-ECD三聚体结构，本发明在疫苗分子的C端加入了三聚化模块T4foldon。该模块来源于T4噬菌体的纤维蛋白的C端结构域，具有27个氨基酸。T4foldon曾被用于过RSV候选疫苗中，并在临床I期研究中被证明安全性良好(Crank,M.C.,A proof of concept for structure-based vaccine design targeting RSV in humans.2019.365(6452):p.505-509.)。

在使用经上述改造后的重组S-ECD三聚体蛋白抗原重组进表达载体、并对表达出的重组S-ECD三聚体蛋白进行常规纯度和稳定性分析后，制备成相应的疫苗，即Kappa(B.1.617.1)毒株SCTV01C-TM27疫苗和Delta(B.1.617.2)毒株SCTV01C-TM28疫苗。

表1 SCTV01C-TM27和SCTV01C-TM28疫苗分子结构设计改造

表2本发明相关的SARS-CoV-2变异株的S蛋白突变

Pango谱系	WHO标签	感兴趣的S蛋白突变
B.1		D614G
B.1.351*	Beta	K417N、E484K、N501Y
B.1.1.7*	Alpha	N501Y
P.1*	Gamma	K417T、E484K、N501Y
B.1.617.2*	Delta	L452R、T478K、P681R**

B.1.427/B.1.429*	Epsilon	L452R
B.1.617.1*	Kappa	L452R、E484Q

*https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants

**https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110829

本发明的ECD三聚体免疫原性蛋白/肽在小鼠中显示出优异的免疫原性，可维持长时程的体液免疫和细胞免疫反应。

使用制备出的Kappa毒株SCTV01C-TM27、Delta毒株SCTV01C-TM28、Alpha毒株SCTV01C-TM22和Beta毒株SCTV01C-TM23疫苗免疫小鼠后进行免疫学测定均显示本发明制备的这两种疫苗能够在实验动物体内诱导高效价的抗体免疫反应；SCTV01C-TM22+SCTV01C-TM23二价疫苗可诱导剂量相关的免疫反应，在TM22+TM23二价疫苗基础上加入TM27或TM28组成的三价疫苗或四价疫苗同相同剂量的单价或二价疫苗相比具有相近或略高的中和效价，说明三价或四价疫苗中的各组分均具有免疫原性。在本发明的TM22+TM23+TM28三价疫苗以及TM22+TM23+TM27+TM28对不同毒株均具有较高且相近中和效价，说明这两种多价疫苗具有更优秀的诱导广谱中和抗体的能力。

实施例

实施例1：新冠病毒重组刺突蛋白胞外区(S-ECD)三聚体蛋白抗原设计、表达载体的构建及蛋白生产

1.1基于Kappa毒株(B.1.617.1)序列(EPI_ISL_1704611)的S-ECD三聚体蛋白(SCTV01C-TM27)表达载体的构建

SCTV01C-TM27包含3708bp的基因片段，通过PCR拼接从模板pD2535nt-CoV2-S-ECDTM8-T4F-trimer扩增中获得SCTV01C-TM27基因片段。通过In-fusion方法构建到Hind III+EcoR I酶切的pXC-17.5稳定株表达载体中，获得pXC-CoV2-S-ECDTM27-T4F-trimer表达载体。

扩增引物

1.2基于Delta毒株(B.1.617.2)序列(EPI_ISL_1999775)的S-ECD三聚体蛋白(SCTV01C-TM28)表达载体的构建

SCTV01C-TM28包含3702bp的基因片段，通过PCR拼接从模板pCMV3-CoV2-B.1.617.2、pD2535nt-CoV2-S-ECDTM8-T4F-trimer、pD2535nt-CoV2-S-ECDTM28-T4F-trimer中扩增获得SCTV01C-TM28基因片段。通过In-fusion方法构建到Hind III+EcoR I酶切的pXC-17.5稳定株表达载体中，获得pXC-CoV2-S-ECDTM28-T4F-trimer表达载体。

扩增引物

F8(SEQ ID NO:35)	ACTAAAAGCCAAAGCCGCCACCATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCTG
R8(SEQ ID NO:36)	GTTGGTCTGGGTCTGGTAGGAGG
F9(SEQ ID NO:37)	CCTCCTACCAGACCCAGACCAAC
R9(SEQ ID NO:38)	GTCAGAGCCCTGTTAAGTTGGGTACA
F10(SEQ ID NO:39)	TGTACCCAACTTAACAGGGCTCTGAC
R6(SEQ ID NO:32)	GATGTCTAGTGGAGGCGCGCC TTTACAGGAAGGTGCTCAGCAGC
F7(SEQ ID NO:33)	GTCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGCCGCCACCATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCTG
R7(SEQ ID NO:34)	TGGCTGATTATGATCAATGAATTCTTTACAGGAAGGTGCTCAGCAGC

1.3 S-ECD三聚体蛋白的表达和纯化

将上述构建的目的基因通过化学法转入到HEK-293细胞中(来源：Invitrogen),培养表达7天，经过离心和过滤获得培养上清液。培养上清液首先采用阳离子交换层析(POROS XS，Thermo)捕获，用高盐缓冲液进行洗脱；然后采用阴离子层析(NanoGel-50Q，Nano Micro)结合模式和混合阴离子层析(Diamond MIX-A，博格隆)流穿模式进行进一步的精纯，去除与产品和工艺相关杂质。S-ECD三聚体表达水平>60mg/L。

实施例2：新冠病毒重组刺突蛋白胞外区(S-ECD)三聚体蛋白纯度及稳定性分析

2.1重组S-ECD三聚体蛋白纯度分析

将上述纯化后重组S-ECD三聚体蛋白原液置于含20mM Tris,35mM NaCl，pH7.0-7.5缓冲液中，浓度约1.0mg/mL，应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析一级结构纯度和分子排阻高效液相色谱(size-exclusion high performance liquid chromatograph，SEC-HPLC)分析其三聚体含量，应用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)检测其形态学特征。

SDS-PAGE具体操作步骤：(1)SDS-PAGE胶配制：3.9％浓缩胶，7.5％分离胶；(2)样品100℃煮沸2min，离心后上样8μg；(3)考马斯亮蓝染色后脱色。SEC-HPLC操作步骤为：(1)仪器：液相色谱系统(Agilent公司，型号：Agilent1260)，水溶性体积排阻色谱柱(Sepax公司，型号：SRT-C SEC-500色谱柱)；(2)流动相：200mM NaH ₂PO ₄，100mM Arginine，pH 6.5，0.01％异丙醇(IPA)；(3)上样量为80μg；(3)检测波长280nM，分析时间为35min，流速为0.15mL/min。

DLS具体操作步骤：(1)仪器：动态光散射仪(Wyatt Technology公司，型号：DynaPro NanoStar)；(2)上样量为50μL；(3)采集数据后，应用Dynamics 7.1.8软件分析数据。

重组SCTV01C-TM27和SCTV01C-TM28蛋白由于其非共价疏水作用为同源三聚体结构。经非还原SDS-PAGE处理后成为分子量大小约148KDa的单体分子(图2)，纯度分别为89.3％和91.0％；SEC-HPLC显示主峰纯度分别为94.9％和96.7％，其聚集体与片段比例含量均低于5％，其主峰分子量平均为530KDa，图2是SCTV01C-TM28的代表性检测结果。动态光散射结果显示重组SCTV01C-TM27和SCTV01C-TM28三聚体蛋白分子平均半径分别为10.2nm和9.2nm(表3)。

表3重组S-ECD三聚体纯度分析

2.2重组S-ECD三聚体蛋白稳定性评价

以重组SCTV01C-TM28三聚体蛋白为例，评价其热加速稳定性和冻融稳定性。将重组SCTV01C-TM28三聚体蛋白分别置于37℃中保存2周(37T2W)，-80℃条件保存8h后转移至25℃条件解冻0.5h(F/T-5C)，如此进行5次反复冻融，应用SDS-PAGE、SEC-HPLC分析其三聚体含量变化，数据见表4。

结果如表4所示，重组SCTV01C-TM28三聚体蛋白37℃加速2周后和5次反复冻融后，SEC-HPLC三聚体含量变化均在1.5％以内，聚集体与片段无显著增加，表现出了良好的热加速稳定性和冻融稳定性。

表4重组S-ECD三聚体蛋白稳定性评价

实施例3：SCTV01C-TM27、SCTV01C-TM28单价疫苗及多价疫苗在小鼠的免疫学评价

3.1疫苗制备及免疫分组

SCTV01C-TM22(B.1.1.7毒株EPI_ISL_764238)和SCTV01C-TM23(B.1.351毒株EPI_ISL_736940)三聚体蛋白的表达及纯化参见《一种提高SARS-CoV-2突变毒株ECD抗原免疫原性/抗原三聚体稳定性的方法》(国际专利申请PCT/CN2022/095609，因提及而在此全文引入)。申请人在该专利中详细阐述了TM22+TM23组成的二价苗相比TM22以及TM23单价疫苗具有更优秀的广谱中和能力。为进一步扩宽疫苗的广谱中和效果，特别是针对Kappa(B.1.617.1)和Delta(B.1.617.2)变异株的中和效果，申请人在TM22+TM23二价苗的基础上加入了TM27或TM28成分，组成了三价或四价疫苗。

根据最终免疫剂量(表5)将纯化获得的SCTV01C-TM22、SCTV01C-TM23、SCTV01C-TM27和SCTV01C-TM28三聚体蛋白用PBS进行预稀释后与MF59(2×，来源：神州细胞工程有限公司，下文同)等体积混合制备单价或多价疫苗样品。

表5免疫分组信息汇总

3.2小鼠免疫

6-8周C57BL/6小鼠(来源：北京维通利华实验动物技术有限公司)，肌肉注射0.1mL含MF59佐剂的疫苗样品。共进行2次免疫，免疫间隔为14天。首次免疫14天(1免14天)及2次免疫后7天(2免7天)进行眼眶采血，4500rpm离心15分钟取血清，进行后续血清学免疫分析。

3.3小鼠免疫血清抗体效价及中和效价的测定

将浓度为5μg/mL的SCTV01C-TM22、SCTV01C-TM23、SCTV01C-TM27或SCTV01C-TM28三聚体蛋白100μL/孔包被于96孔板，2～8℃过夜包被。酶标板洗净拍干后加入含2％BSA的封闭液320μL/孔，室温封闭1h以上。使用含0.1％BSA的TBST样品稀释剂将单价或多价疫苗小鼠免疫血清进行梯度稀释(如8000×、16000×、32000×、64000×、128000×、256000×、512000×等)，以相同梯度稀释的未免疫小鼠血清作为阴性对照血清。96孔酶标板加入梯度稀释后的血清100μL/孔，室温孵育1～2h。洗板3遍，加入80ng/mL的兔抗鼠IgG F(ab) ₂/HRP检测二抗(来源：Jackson ImmunoResearch，下文同)100μL/孔，室温孵育1h。洗板5遍，加入底物显色液进行显色10～15min，2M H ₂SO ₄终止后酶标仪读取OD ₄₅₀，计算免疫抗体效价。抗体效价＝大于阴性血清OD ₄₅₀×2.1的最大稀释倍数。

将不同稀释倍数的2免7天免疫血清50μL/孔加入96孔板，然后50μL/孔加入100～200TCID ₅₀的Alpha毒株(B.1.1.7)、Beta毒株(B.1.351)、Kappa毒株(B.1.617.1)和Delta毒株(B.1.617.2)假病毒(假病毒是以病毒基因组中VSV-G蛋白基因替换为荧光素酶报告基因的复制缺陷型水疱性口炎病毒(即VSV△G-Luc-G)为载体，在表达Spike及其突变体蛋白的细胞系中进行扩增制备，由神州细胞工程有限公司制备，下文同)，混匀后置于37℃、5％CO ₂培养箱孵育1h。以加入假病毒不含免疫血清的细胞孔作为阳性对照，以不含免疫血清和假病毒的细胞孔为阴性对照。孵育结束后，100μL/孔接种2×10 ⁴个Huh-7细胞，混匀后置于37℃、5％CO ₂培养箱中静置培养约20h。培养结束后，去掉培养上清，50μL/孔加入1×Passive lysis buffer，混匀裂解细胞。取40μL/孔转入96孔全白化学发光板，采用LB960微孔板式发光检测仪40μL/孔加入荧光素酶底物并检测发光值(RLU)，计算中和率。中和率％＝(阳性对照RLUs–样品RLUs)/(阳性对照RLUs–阴性对照RLUs)×100％，根据Reed-Muench公式计算IC ₅₀，即为中和效价NAT ₅₀。

免疫后抗体效价结果如图3A所示，TM27和TM28单价疫苗在C57BL/6小鼠可诱导高效价的抗体免疫反应，且1μg免疫剂量同3μg免疫剂量抗体效价相近。TM22+TM23二价疫苗可诱导剂量相关的免疫反应(图3B)。在TM22+TM23二价疫苗基础上加入TM27或TM28组成的三价疫苗或四价疫苗同相同剂量的单价或二价疫苗相比具有相近或略高的中和效价，说明三价或四价疫苗中的各组分均具有免疫原性(图3C，图3D，表6)。

表6 SCTV01C-TM27、SCTV01C-TM28单价以及多价疫苗免疫C57BL/6小鼠后血清抗体效价log10值

多种假病毒中和效价结果如图4所示，TM27单价疫苗免疫血清对Kappa毒株假病毒中和效价较高，而对Alpha毒株、Beta毒株和Delta毒株中和能力降低，下降倍数约包含Kappa毒株中和效价的5.7-16.4倍(1μg/价)和8.7-18.4倍(3μg/价)(图4A)。TM28单价疫苗免疫血清对Delta毒株假病毒中和效价较高，而对Alpha毒株、Beta毒株及Kappa毒株中和能力降低，下降倍数约包含Delta毒株中和效价的2.9-12.7倍(1μg/价)和2.3-15.1倍(3μg/价)(图4A)。TM22+TM23二价疫苗对Alpha毒株、Beta毒株及Kappa毒株中和能力相近，而对Delta毒株中和效价降低约2.6倍(图4B)。TM22+TM23+TM27三价疫苗同TM22+TM23二价疫苗相似，对Alpha毒株、Beta毒株及Kappa毒株中和能力相近，而对Delta毒株中和效价降低2～3倍(图4C)。相比之下，TM22+TM23+TM28三价疫苗以及TM22+TM23+TM27+TM28对不同毒株均具有较高且相近中和效价，说明这两种多价疫苗具有更优秀的诱导广谱中和抗体的能力(图4C，图4D，表7)。

表7 SCTV01C-TM27、SCTV01C-TM28单价以及多价疫苗免疫C57BL/6小鼠后血清多种变异株中和NAT50

综上所述，相比单价疫苗，二价疫苗针对不同变异株具有广谱的中和能力，有希望对多种变异毒株产生交叉保护能力，提高对变异株感染的保护率。

虽然前述已经用说明和实施例的方式对本发明进行了细节描述，但其目的在于理解方便，本领域普通技术人员显然可以对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，而不会偏离附加的权利要求的精神或范围。

序列表

Claims

一种提高SARS-CoV-2突变毒株ECD抗原免疫原性/抗原三聚体稳定性的方法，该方法通过构建包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12所示氨基酸序列,或其免疫原性片段和/或免疫原性变体的ECD抗原，从而ECD为稳定的prefusion构象的三聚体形式。
权利要求1的方法，其中突变毒株为含有K417N、K417T、L452R、T478K、E484K、E484Q、N501Y、D614G、P681R之至少任一的高风险突变毒株。
权利要求1或2的方法，其中该毒株包含B.1毒株、B.1.351毒株、B.1.1.7毒株、P.1毒株、B.1.427毒株、B.1.429毒株、B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株中的至少一种。
权利要求1的方法，其中ECD抗原和选自以下一种或多种佐剂共同施予受试者：

铝佐剂、油乳佐剂、Toll样受体(TLR)激动剂、免疫增强剂的组合、微生物类佐剂、蜂胶佐剂、左旋咪唑佐剂、脂质体佐剂、中药佐剂及小肽类佐剂；

优选地，油乳佐剂包含角鲨烯成分；

Toll样受体(TLR)激动剂包含吸附在铝盐上的CpG或单磷酰脂质A(MPL)；和

免疫增强剂的组合包含QS-21和/或MPL。
一种提高SARS-CoV-2突变毒株ECD抗原免疫原性//抗原三聚体稳定性的方法，该方法通过构建编码包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12之所示的至少任一氨基酸序列,或其免疫原性片段和/或免疫原性变体的多核苷酸，

从而表达稳定的prefusion构象的三聚体形式ECD。
权利要求5的方法，其中突变毒株为含有K417N、K417T、L452R、T478K、E484K、E484Q、N501Y、D614G、P681R之至少任一的高风险突变毒株。
权利要求5或6的方法，其中该毒株包含B.1毒株、B.1.351毒株、B.1.1.7毒株、P.1毒株、B.1.427毒株、B.1.429毒株、B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株中的至少一种。
一种免疫原性/抗原三聚体稳定性提高的SARS-CoV-2突变毒株ECD免疫原性蛋白/肽，其特征在于，该免疫原性蛋白/肽包含SEQ ID No:8或SEQ ID No:12所示的至少之任一的氨基酸序列,或其免疫原性片段和/或免疫原性变体，

该ECD免疫原性蛋白/肽为稳定的prefusion构象的三聚体形式。
权利要求8的免疫原性蛋白/肽，其中的突变毒株为含有K417N、K417T、L452R、T478K、E484K、E484Q、N501Y、D614G、P681R之至少任一的高风险突变毒株。
权利要求8或9的免疫原性蛋白/肽，其中该毒株包含B.1毒株、B.1.351毒株、B.1.1.7毒株、P.1毒株、B.1.427毒株、B.1.429毒株、B.1.617.1毒株和B.1.617.2毒株中的至少一种。
一种多核苷酸，编码如权利要求8所述的免疫原性蛋白/肽，

优选地，包含SEQ ID No:7或SEQ ID No:11所示的至少之任一的核苷酸序列。
一种免疫原性组合物，其特征在于，包含

a.至少一种如权利要求8所述的免疫原性蛋白/肽或其免疫原性片段和/或免疫原性变体，或

至少一种如权利要求11所述的多核苷酸，和

b.药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合；

任选地，c.包含佐剂。
权利要求的12的免疫原性组合物，其特征在于，包含选自a)、b)或c)的任一组的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体，

a.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20和SEQ ID No:8所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体；

b.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20和SEQ ID No:12所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体；或

c.SEQ ID No:16、SEQ ID No:20、SEQ ID No:8和SEQ ID No:12所示的氨基酸序列的免疫原性蛋白/肽或其免疫片段和/或免疫原性变体。
权利要求的12或13的免疫原性组合物，其特征在于，佐剂选自以下的一种或多种：

铝佐剂、油乳佐剂、Toll样受体(TLR)激动剂、免疫增强剂的组合、微生物类佐剂、蜂胶佐剂、左旋咪唑佐剂、脂质体佐剂、中药佐剂及小肽类佐剂；

优选地，油乳佐剂包含角鲨烯成分；

Toll样受体(TLR)激动剂包含吸附在铝盐上的CpG或单磷酰脂质A(MPL)；和

免疫增强剂的组合包含QS-21和/或MPL。
权利要求8所述的免疫原性蛋白/肽、权利要求11所述的多核苷酸和权利要求12-14之任一所述的免疫原性复合物在预防或治疗SARS-CoV-2突变毒株引起的疾病的用途。
权利要求8所述的免疫原性蛋白/肽、权利要求11所述的多核苷酸和权利要求12-14之任一所述的免疫复合物在制备预防或治疗SARS-CoV-2突变毒株引起的疾病的疫苗或药物中的用途。