CN117264967A - 一种银杏GbWOX3A基因及其在植物组织培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏GbWOX3A基因及其在植物组织培养中的应用，涉及植物基因工程技术领域。银杏GbWOX3A基因来源于银杏种胚，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。银杏GbWOX3A基因在银杏种胚发育及愈伤组织再生过程中的表达具有特异性，通过转基因功能验证实验证实了过表达GbWOX3A能够促进植物组培再生过程中不定芽的再生。因此，银杏GbWOX3A基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，尤其对于提高裸子植物再生效率方面扮演着重要的角色。

Description

一种银杏GbWOX3A基因及其在植物组织培养中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种银杏GbWOX3A基因及其在植物组织培养中的应用。

背景技术

银杏在世界自然保护名录中属于濒危物种，在自然条件下繁殖困难，人工繁殖手段主要集中在扦插、分蘖、嫁接以及人工播种等方式，其繁殖周期长、成本高且容易受到环境影响。从银杏各种离体组织通过组织培养方式获得大量再生苗能够解决其周期长、成本高等缺点，减少工作量，短时间内获得大量银杏苗，提高育苗效率。因此，银杏分子育种迫切需要建立高效的组培再生体系。然而到目前为止，在组培再生过程中胚性愈伤组织诱导率低且愈伤组织极易褐化，无胚性愈伤组织诱导不定芽，间接体胚发生困难。银杏遗传转化体系同样未成功建立，难以通过转基因技术助力银杏再生，提高再生效率。因此，明晰银杏组培再生过程的调控机制，促进银杏离体组织再生极为重要。

WOX基因家族是真核生物中同源盒(Homeobox)家族的一员，是植物中独特的转录因子。该家族成员都有保守的Homeodomain同源域(HD)，编码60-66个氨基酸，形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构与DNA结合。该结构在维持Homeodomain功能完整性上发挥重要作用，其在不同物种中均非常保守。研究表明，WOX基因具有调节植物胚胎发育和极化、分生组织干细胞的维持、侧向器官和花器官的形成、应激反应等功能，尤其是在调控细胞增殖和分化促进植物组织再生方面发挥重要作用。

目前，体外再生的困难限制了大多数木本植物(尤其是裸子植物)的繁殖和基因改良，且裸子植物的WOX基因在促进植物组织培养再生过程中功能研究尚未有报道，因此挖掘裸子植物中提高组织培养再生过程的关键基因极为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于银杏种胚的GbWOX3A基因，其次在于提供GbWOX3A基因在植物组织培养中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明的第一目的在于，提供了一种银杏GbWOX3A基因，所述银杏GbWOX3A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步改进在于，所述银杏GbWOX3A基因来源于银杏种胚。

进一步改进在于，所述银杏GbWOX3A基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二目的在于，提供了一种银杏GbWOX3A基因在在植物组织培养中的应用。

进一步改进在于，所述应用为，在植物组织培养过程中，过表达银杏GbWOX3A基因促进植物组培再生过程中不定芽的再生。

进一步改进在于，所述植物为84K杨。

进一步改进在于，所述促进84K杨组培再生过程中不定芽的再生的方法为，先构建pCAMBIA1302-GbWOX3A过表达载体，再将过表达载体转化至农杆菌EHA105感受态中，最后利用农杆菌介导法转化84K杨的离体叶片。

本发明提具有如下有益效果：

本发明从银杏种胚中克隆得到银杏WOX家族的GbWOX3A基因CDS全长，该基因在银杏种胚发育及愈伤组织再生过程中的表达具有特异性，通过转基因功能验证实验证实了过表达GbWOX3A能够促进植物组培再生过程中不定芽的再生。因此，GbWOX3A基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，尤其对于提高裸子植物再生效率方面扮演着重要的角色。

附图说明

图1为GbWOX3A的克隆全长条带(图中：M为DL2000 DNA Marker)；

图2为GbWOX3A克隆序列与基因组预测序列对比图；

图3为pCAMBIA1302-GbWOX3A过表达载体图谱；

图4为GbWOX3A在不同阶段的胚及愈伤组织中的表达模式；

图5为在84K杨中过表达GbWOX3A与pCAMBIA1302-GFP空载体转化过程中的对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料与试剂

本实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

银杏种胚是于2021年10月在南京林业大学校园内园林实验实训中心内一棵树龄约40年的银杏雌株上收集。

RNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，其货号分别为R6827和D6943；逆转录试剂购自Monad公司，其货号为：MR05101M；克隆PCR所使用的高保真酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；胶回收试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，货号为DC301；普通PCR反应的2×Rapid Taq Master Mix购自诺唯赞生物科技有限公司，其货号为P222；限制性内切酶NcoⅠ和SpeⅠ购自全式金生物技术有限公司，其货号分别为JN101和JS601；同源重组酶购自诺唯赞生物科技有限公司，其货号为C112；植物表达载体为pCAMBIA1302-GFP；大肠杆菌DH5α以及农杆菌EHA105均购自北京擎科生物有限公司，其货号分别为TSC-C14和TSC-A03；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。

本实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

2、方法

2.1、GbWOX3A的全长克隆

用RNA提取试剂盒提取银杏种胚的RNA，提取出来的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检查RNA的完整性；然后，通过NanoDrop 2000检测RNA的浓度及纯度，后将其置于-80℃备用。用Monad公司的反转录试剂进行逆转录得到种胚的cDNA。在银杏全基因组CDS文件中查找GbWOX3A的CDS序列信息，根据序列信息使用Oligo软件设计克隆全长的正向引物：5′-ATGCCGATAACCAAAAATTACTTAGGCC-3′；和反向引物：5′-TCATAAGCCACTACACAGTGGAAAC-3′，以及在线网站(https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html)上设计带有同源臂的正向引物：5′-acgggggactcttgaccATGCCGATAACCAAAAATTACTTAGGC-3′和反向引物：5′-aagttcttctcctttactagtTAAGCCACTACACAGTGGAAAC-3′。

以cDNA为模板，使用高保真酶进行扩增，PCR反应的程序为：98℃3min，然后是35个循环，即98℃10s，58℃5s，72℃1min，最后是72℃5min。PCR结束后对产物进行电泳检测(图1)，并使用胶回收试剂盒回收产物，具体操作见说明书。回收后的片段用同源臂引物以相同的程序进行二次PCR并回收。表达载体pCAMBIA1302-GFP使用限制性内切酶NcoⅠ和SpeⅠ进行双酶切，双酶切反应程序为：37℃孵育15min后80℃加热20min终止反应。线性化的pCAMBIA1302-GFP载体与第二次PCR后的产物在同源重组酶的作用下37℃进行重组连接30min，反应结束后将连接产物转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化步骤见说明书，最后将复苏液均匀的涂布到带有Kana抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。待培养结束挑取培养基上的单克隆进行鉴定，首先是用无菌牙签挑取单克隆于10μL无菌水中混匀，然后吸取2μL菌液用于菌液PCR鉴定，剩余8μL保存在4℃。菌液PCR鉴定使用2×Rapid TaqMaster Mix，PCR反应程序为：95℃3min，

然后进行35个循环，即95℃15s，58℃15s，72℃15s，最后是72℃5min。将PCR鉴定成功的剩余8μL菌液送擎科公司测序鉴定目的片段是否完全克隆成功。用DNAMAN软件进行序列比对(图2)，比对成功的菌液在37℃，200rpm进行扩大培养后进行质粒提取，质粒提取步骤见说明书，获得的pCAMBIA1302-GbWOX3A质粒(图3)保存于-20℃。扩增的目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长561bp，编码186个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.2、GbWOX3A在银杏种胚发育及体外再生过程中的表达模式

在南京林业大学校园内园林实验实训中心内一棵树龄约40年的雌株银杏，于2021年收集其9-11月份的种子，按照胚的长度将种子分成5个等级。将第五阶段的胚接种到MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+30g/L Sucrose+7g/L Agar培养基上进行愈伤组织的诱导，pH为5.8，25℃，暗培养15天后进行光照培养。采集五个阶段的愈伤组织样本，包括愈伤组织形成前的子叶发育期(接种后7天)、愈伤组织形成初期(接种后15天)以及愈伤组织增殖阶段(接种后25天、36天和54天)。总共对五个阶段的胚(Em1-5)、两个阶段的胚乳(En1，En5)和五个阶段的愈伤组织(C1-5)进行了取样，每个有三个生物学重复，在液氮中快速冷冻并保存到-80℃冰箱。然后将它们用于转录组测序和Gb WOX3A表达的定量实时PCR分析。

RNA提取及反转录步骤同2.1，根据MonAmp^TM Green qPCR Mix(None/Low/High ROX)(货号为MQ10201)说明书用ABI 7500Real time PCR Systems(AppliedBiosystems)进行qRT-PCR。实验设置三个生物学重复和三个技术重复。以银杏GADPH基因作为内参基因，内参qRT-PCR的上游引物为：5′-ATCCACGGGAGTCTTCAC-3′，下游引物为：5′-CTCATTCACGCCAACAAC-3′；用PrimerPremier6设计的GbWOX3A的qRT-PCR的上游引物为：5′-CCAGAATCACAAAGCCAGGGATAGG-3′，下游引物为：5′-TCCATTCCTTCTTCACCTCATCTGC-3′。qRT-PCR反应体系如表1：

表1.qRT-PCR反应体系

qRT-PCR程序设置为：95℃预变形30s，95℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸30s，其中变性、退火、延伸设置为40个循环。荧光定量结果通过2-ΔΔCT方法计算测定GbW OX3A的相对定量表达水平。结果显示如图4，GbWOX3A基因主要在胚胎的早期发育阶段及愈伤组织形成初期表达。

3、过表达GbWOX3A基因对84K杨离体再生的影响

3.1、重组质粒pCAMBIA1302-GbWOX3A转化到农杆菌EHA105

参考擎科公司的EHA105 Chemically Competent Cell说明书，采用冻融法将pCAMB IA1302-GbWOX3A转化EHA105农杆菌感受态中，具体步骤如下：

(1)将-80℃保存的农杆菌感受态置于冰上融化成冰水混合状态加入1μL重组质粒，轻轻混匀后依次冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(2)向离心管中加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后28℃，200rpm复苏3h。

(3)吸取复苏液均匀涂布到含Kana和Rif抗性的LB固体培养基上，将平板倒置放于28℃暗培养3天后挑单克隆鉴定，鉴定步骤同2.1。

能扩增得到目的条带的菌落为阳性克隆，在含50mg/LKan LB液体培养基上培养至OD600为1左右，加入50％无菌甘油，液氮速冻2min，-80℃保存备用。

3.2、农杆菌介导的84K杨叶片遗传转化

取84K杨(Populus alba×P.glandulosa)无菌苗幼苗的顶端前5个叶片，切成1cm²大小(含叶脉)接种于WPM+0.1mg/L KT+1.5mg/L 2,4-D+0.5g/L MES+20g/L Sucr ose+7g/LAgar，25℃避光预培养2天。采用农杆菌侵染法进行转化，将农杆菌菌液在28℃摇至OD600为0.6左右，用MS液体等体积重悬。将预培结束的叶片置于重悬液中侵染10-15min后，吸干表面多余菌液，接种至WPM+0.1mg/L KT+1.5mg/L 2,4-D+0.5g/L MES+20g/L Sucrose 7g/LAgar+100μM AS，25℃避光共培养。2天后，将它们转移到WPM+0.1mg/L KT+1.5mg/L 2,4-D+0.5g/L MES+20g/L Sucrose+7g/L Agar+2mg/L Hyg+200mg/L Cef+200mg/L timentin.进行愈伤组织诱导筛选。30天后，将它们转移到MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L MES+20g/L Sucrose+7g/L Ag ar+1.5mg/L Hyg+200mg/L Cef+200mg/L timentin进行分化培养。侵染15天后统计出愈率(愈伤组织块数/外植体数)，76天后统计不定芽诱导率(不定芽数量/外植体数)，数据统计结果如表2所示。

表2.愈伤组织形成及不定芽再生的数据统计表

3.3、过表达GbWOX3A对84K杨组培再生过程的影响

如图5所示，pCAMBIA1302-GFP空载对照组(EV)和pCAMBIA1302-GbWOX3A转基因组在出愈时间和不定芽形成时间上一致，但在再生的不定芽数量上有差异。愈伤组织在侵染15天后被诱导出来，并在35天左右大多数外植体均形成愈伤组织，在农杆菌侵染后约76天，再生出杨树不定芽。EV和GbWOX3A基因使得愈伤组织质地和体积适中，颜色青绿色，出愈率均为100％。

然而，如表2所示，GbWOX3A基因在不定芽诱导方面作用突出，出芽率高达47.2％；而EV的出芽率为24.7％。同时，值得注意的是，GbWOX3A使得每个外植体诱导出的不定芽数量是EV的5-6倍。这一结果证明了GbWOX3A在体外再生诱导不定芽过程中的重要功能，从而为改善银杏组培再生提供了可能。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种银杏GbWOX3A基因，其特征在于，所述银杏GbWOX3A基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种银杏GbWOX3A基因，其特征在于，所述银杏GbWOX3A基因来源于银杏种胚。

3.根据权利要求1所述的一种银杏GbWOX3A基因，其特征在于，所述银杏GbWOX3A基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1-3任一所述的银杏GbWOX3A基因在植物组织培养中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为，在植物组织培养过程中，过表达银杏GbWOX3A基因促进植物组培再生过程中不定芽的再生。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为84K杨。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述促进84K杨组培再生过程中不定芽的再生的方法为，先构建pCAMBIA1302-GbWOX3A过表达载体，再将过表达载体转化至农杆菌EHA105感受态中，最后利用农杆菌介导法转化84K杨的离体叶片。